TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN HỒNG ÁI

HIỆU QUẢ CỦA NAA, BA VÀ TDZ TRÊN CHỒI
CÂY PHÚ QUÝ (Aglaonema sp.) IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: HOA VIÊN & CÂY CẢNH

CẦN THƠ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN HỒNG ÁI

HIỆU QUẢ CỦA NAA, BA VÀ TDZ TRÊN CHỒI
CÂY PHÚ QUÝ (Aglaonema sp.) IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: HOA VIÊN & CÂY CẢNH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. LÂM NGỌC PHƯƠNG

CẦN THƠ, 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ VÀ SINH HÓA

Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Hoa Viên & Cây Cảnh với đề tài:

“HIỆU QUẢ CỦA NAA, BA VÀ TDZ TRÊN CHỒI CÂY
PHÚ QUÝ (Aglaonema sp.) IN VITRO”

Do sinh viên NGUYỄN HỒNG ÁI thực hiện kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt
nghiệp.

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2011
Cán bộ hướng dẫn

Ts. Lâm Ngọc Phương

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ VÀ SINH HÓA

Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp với đề tài:

“HIỆU QUẢ CỦA NAA, BA VÀ TDZ TRÊN CHỒI CÂY
PHÚ QUÝ (Aglaonema sp.) IN VITRO”
Do sinh viên NGUYỄN HỒNG ÁI thực hiện và bảo vệ trước hội đồng.

Luận văn đã được hội đồng chấp thuận và đánh giá ở mức: ……………
Ý kiến hội đồng:
……………………………………………………………………………………………
…..…………………………………………………………………………………………
……..………………………………………………………………….……………………
……….

Duyệt Khoa

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2011

Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Thành viên 1

Thành viên 2

Thành viên 3

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả được
trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Nguyễn Hồng Ái


iii


LỜI CẢM TẠ
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
Cô Lâm Ngọc Phương đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện
đề tài luận văn tốt nghiệp.
Thầy cố vấn Lê Văn Bé, cô Lê Hồng Giang cùng với quí thầy cô Khoa Nông Nghiệp và
Sinh Học Ứng Dụng đã tận tâm, dìu dắt, rèn luyện tôi suốt những năm học tại trường Đại
Học Cần Thơ.
Cha mẹ, em trai và những người thân trong gia đình đã yêu thương và động viên tôi rất
nhiều trong cuộc sống.
Chân thành cảm ơn
Cô Phạm Thị Bích Thủy, Chị Lê Minh Lý và cùng với các anh chị, các bạn sinh viên
trong phòng thí nghiệm, Bộ Môn Sinh Lý-Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp đỡ.
Các bạn sinh viên lớp Hoa viên & Cây cảnh Khóa 33 đã giúp đỡ động viên tôi trong
những năm tháng trên giảng đường Đại Học.

iv


TIỂU SỬ CÁ NHÂN
1. LÝ LỊCH
Họ và Tên:

Nguyễn Hồng Ái

Ngày sinh:


27/03/1985

Nơi sinh:

Kiên Giang

Họ và Tên Cha:

Nguyễn Thiện Triều

Nghề nghiệp:

Buôn bán

Họ và Tên Mẹ:

Ngũ Hồng Thu

Nghề nghiệp

Buôn bán

Quê quán:

Rạch Giá – Kiên Giang

Giới tính:

Nữ


Năm sinh:

1959

Năm sinh:

1960

Nơi ở hiện nay: 76 Nguyễn Thoại Hầu, khu phố III, phường Vĩnh Thanh Vân, thành
phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang.
2. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
1991-1996 :

Trường Tiểu B Vĩnh Thanh Vân, tỉnh Kiên Giang.

1996-2000 :

Trường THCS Hùng Vương, tỉnh Kiên Giang.

2000-2003 :

Trường THPT Nguyễn Trung Trực, tỉnh Kiên Giang.

2007-2011 :

Trường Đại Học Cần Thơ, ngành Hoa Viên & Cây Cảnh, khóa 33, khoa

Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng.


Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2011
Nguyễn Hồng Ái

v


MỤC LỤC

Chương

Nội dung

Trang

Trang phụ bìa

Chương 1

Lời cam đoan

iii

Lời cảm tạ

iv

Tiểu sử cá nhân

v


Mục lục

vi

Danh sách bảng

viii

Danh sách hình

xi

Danh sách chữ viết tắt

xii

Tóm lược

xiii

MỞ ĐẦU

1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2

1.1 Đặc điểm thực vật của cây Phú quý (Aglaonema sp.)


2

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

2

1.1.2 Đặc điểm thực vật

2

1.1.3 Cách trồng và chăm sóc

3

1.2 Sơ lược nuôi cấy mô thực vật

3

1.2.1 Cơ sở sinh lý của công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật

3

1.2.2 Thuận lợi và bất lợi của vi nhân giống

3

1.2.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vât

4


vi


1.2.4 Phương pháp vi nhân giống

4

1.2.5 Môi trường nuôi cấy mô thực vật

5

1.2.6 Kích thích mầm ngủ chồi bên phát triển

9

1.2.7 Mô phân sinh ngọn và sự phát triển của chồi

10

1.2.8 Chồi nách (chồi bên) và các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình nhân chồi bên

12

1.3 Một số nghiên cứu về họ Araceae

Chương 2

Chương 3


13

1.3.1 Những nghiên cứu trong nước

13

1.3.2 Những nghiên cứu ngoài nước

14

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

15

2.1 Phương tiện thí nghiệm

15

2.2 Phương pháp thí nghiệm

15

2.2.1 Chuẩn bị môi trường

15

2.2.2 Thu mẫu và khử trùng mẫu

16


2.2.3 Bố trí thí nghiệm

16

2.2.4 Cách lấy chỉ tiêu

18

2.2.5 Khảo sát hình thái và cấu trúc giải phẫu chồi của cây
Phú quý trong nuôi cấy mô và ngoài nhà lưới

18

2.3 Phương pháp xử lý số liệu

19

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

20

3.1 Ghi nhận tổng quát về giai đoạn vô trùng mẫu

20

3.2 Hiệu quả của BA trên chồi Phú quý ở giai đoạn khởi đầu

20

vii



3.2.1 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

20

3.2.2 Tỷ lệ mẫu bật chồi (%)

21

3.2.3 Chiều cao chồi gia tăng (cm)

21

3.3 Hiệu quả của BA trên sự nhân chồi cây Phú quý

Chương 4

24

3.3.1 Chiều cao gia tăng tương đối (%)

24

3.3.2 Số chồi gia tăng

25

3.3.3 Trọng lượng tươi chồi gia tăng tương đối (%)


26

3.4 Hiệu quả của BA và TDZ trên sự nhân chồi cây Phú quý

27

3.4.1 Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%)

27

3.4.2 Số chồi gia tăng

31

3.4.3 Trọng lượng tươi chồi gia tăng tương đối (%)

35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

37

4.1 Kết luận

37

4.2 Đề nghị

37


TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƯƠNG 1
PHỤ CHƯƠNG 2

viii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng

Tựa bảng

Trang

2.1

Tổ hợp các nghiệm thức của thí nghiệm 3

18

3.1

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) của cây Phú quý môi trường MS có bổ sung
các nồng độ BA khác nhau ở 1, 2 và 3 TSKC

20

3.2

Tỷ lệ bật chồi (%) của Phú quý môi trường MS có bổ sung các

nồng độ BA khác nhau ở 1, 2 và 3 TSKC

21

3.3

Chiều cao chồi gia tăng (cm) của cây Phú quý trong môi trường
MS có bổ sung các nồng độ BA khác nhau ở 2, 4, 6 và 8 TSKC

22

3.4

Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) của cây Phú quý trong môi
trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l và các nồng độ BA khác
nhau ở 3 và 5 TSKC

24

3.5

Trọng lượng tươi chồi gia tăng tương đối (%) của cây Phú quý
trong môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l các nồng độ BA
khác nhau ở 5 TSKC

27

3.6

Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) của cây Phú quý trong môi

trường MS có bổ sung BA và TDZ khác nhau ở 1 TSKC

28

3.7

Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) của cây Phú quý trong môi
trường MS có bổ sung BA và TDZ khác nhau ở 2 TSKC

29

3.8

Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) của cây Phú quý trong môi
trường MS có bổ sung BA và TDZ ở 3 TSKC

30

3.9

Chiều cao chồi gia tăng tương đối của cây Phú quý trong môi
trường MS có bổ sung BA và TDZ khác nhau ở 4 TSKC

31

3.10

Số chồi gia tăng của cây Phú quý trong môi trường MS có bổ
sung nồng độ BA và TDZ khác nhau ở 3 TSKC


32

ix


3.11

Số chồi gia tăng của cây Phú quý trong môi trường MS có bổ
sung nồng độ BA và TDZ khác nhau ở 4 TSKC

33

3.12

Trọng lượng tươi gia tăng tương đối (%) của cây Phú quý trong
môi trường MS có bổ sung nồng độ BA và TDZ khác nhau ở 4
TSKC

37

x


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tựa hình

Trang


1.1

Cây Phú quý (Aglaonema sp.)

2

1.2

Mô phân sinh ngọn thân

10

1.3

Sơ đồ tổng quát các vùng mô phân sinh ngọn

12

2.1

Vật liệu thí nghiệm (thân cây Phú quý)

16

3.1

Sự sinh trưởng của chồi Phú quý sau 8 tuần nuôi cấy trong môi
trường MS có bổ sung nồng độ BA khác nhau: (A) 0 mg/l, (B) 1
mg/l, (C) 3 mg/l và (D) 5 mg/l


23

3.2

Sự sinh trưởng của chồi Phú quý sau 5 tuần nuôi cấy trong môi
trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l và các nồng độ BA khác
nhau: (A) 1mg/l, (B) 3 mg/l, (C) 5 mg/ và (D) 7 mg/l

25

3.3

Sự sinh trưởng của chồi Phú quý sau 4 tuần nuôi cấy trong môi
trường MS có nồng độ khác nhau: (A) BA 2 mg/l + TDZ 0,5 mg/l,
(B) 3 BA mg/l + TDZ 0,5 mg/l, (C) BA 2 mg/l + TDZ 1 mg/l và
(D) BA 3 mg/l + TDZ 1 mg/l

33

3.4

(A) Lát cắt ngang chồi Phú quý in vitro ở nghiệm thức BA 3 mg/l +
TDZ 0,5 mg/l: (a) chồi, (b) nhu mô

34

(B) Lát cắt dọc chồi Phú quý in vitro ở nghiệm thức BA 3 mg/l +
TDZ 0,5 mg/l: (a) chồi nách
3.5


Lát cắt dọc chồi Phú quý in vitro ở nghiệm thức BA 2 mg/l + TDZ 1
mg/l: (a) lá mầm

34

3.6

Lát cắt dọc chồi Phú quý in vitro ở nghiệm thức BA 3 mg/l + TDZ
0,5 mg/l: (a) nách lá (b) chồi ngọn

34

3.7

Lát cắt dọc chồi Phú quý 15 tuần tuổi ở ngoài nhà lưới: (a) chồi,
(b) lá mầm

35

xi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

MS

Murashige và Skoog (1962)

CĐHSTTC


Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

BA

Benzyl adenine

BAP

6-benzyl aminopurin

NAA

1-  -naphthaleneacetic acid

TDZ

Thidiazuron

TSKC

Tuần sau khi cấy

ctv.

Cộng tác viên

xii



NGUYỄN HỒNG ÁI. “Hiệu quả của NAA, BA và TDZ trên chồi cây Phú quý
(Aglaonema sp.) in vitro”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Hoa Viên & Cây Cảnh,
Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Cán bộ hướng
dẫn: Ts. Lâm Ngọc Phương.

TÓM LƯỢC
Đề tài: “Hiệu quả của NAA, BA và TDZ trên chồi cây Phú quý (Aglaonema sp.)
in vitro”. Nhằm mục đích tìm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp trong
giai đoạn khởi đầu và nhân chồi, góp phần trong qui trình vi nhân giống loại cây này,
đáp ứng nhu cầu tiêu thụ.
Qua 3 thí nghiệm kết quả đạt được như sau: ở giai đoạn vô trùng mẫu nồng độ BA
1 mg/l chiều cao chồi đạt 0,9 cm sau 8 tuần nuôi cấy. Ở giai đoạn nhân chồi với môi
trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l và các nồng độ BA khác nhau thì kết quả không
hình thành chồi trên mẫu cấy. Tuy nhiên, chiều cao chồi ở nồng độ BA 1 mg/l đạt
chiều cao tương đối 34,63 % sau 5 tuần nuôi cấy. Tiếp tục thí nghiệm bố trí giai đoạn
nhân chồi với sự kết hợp của BA và TDZ. Qua kết quả thí nghiệm cho thấy thì ở nồng
độ BA 3 mg/l và TDZ 0,5 mg/l đạt số chồi 0,7 chồi sau 4 tuần nuôi cấy.

xiii


MỞ ĐẦU
Hiện nay, nước ta song song với sự phát triển của nền kinh tế, đô thị mới ngày
một gia tăng, đời sống của người dân càng được nâng cao, nhu cầu cây xanh càng
nhiều, góp phần cải thiện khí hậu, giải quyết vấn đề kỹ thuật môi sinh. Hơn nữa, cây
xanh còn có thể dùng trong trang trí cảnh quan, nội ngoại thất...giúp chất lượng
cuộc sống vật chất cũng như tinh thần của người dân được tốt hơn.
Cây Phú quý (Aglaonema sp.) là một loại cây nhập ngoại, ưa bóng râm rất
thích hợp để dùng trong trang trí nội thất, cây có hình dáng và bộ lá đẹp, việc chăm
sóc không tốn nhiều thời gian. Tuy nhiên, ở nước ta cây này chỉ được nhân giống

truyền thống bằng cách cắt ngang phần thân có mang mầm ngủ và rễ để giâm, nên
số lượng cây chưa đủ để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, cũng vì thế giá thành
của cây rất cao.
Nuôi cấy mô là một kỹ thuật đã giúp ta có thể tạo ra được những giống cây
trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu bệnh, hạn hán
và điều kiện nghèo phân bón...Đối với các loại cây trồng có giá trị thương mại lớn,
kỹ thuật nuôi cấy mô đã đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt do hệ số nhân
giống rất cao, thường đạt 36 – 1012/ năm (Nguyễn Xuân Linh, 1998). Hiện nay có
nhiều nghiên cứu nuôi cấy in vitro đã được áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng
khác nhau trong đó có cây hoa kiểng; kỹ thuật này giúp ích rất nhiều trong công tác
chọn giống và nhân giống sạch bệnh. Đối với họ Ráy (Araceae), có các nghiên cứu
trên cây Diffenbachia maculata (Lodd) bằng kỹ thuật cắt lát mỏng phần thân (Võ
Quân Vũ, 2007); cây Aglaonema commutatum bằng cắt lát mỏng có mang mầm ngủ
(Lê Hồng Giang, 2006); cây Aglaonema var. Cochin bằng nhân cụm chồi (Totik,
2011); cây Aglaonema simplex nhân chồi bằng chồi đỉnh (Laohavisuti, 2005).
Đề tài “Hiệu quả của NAA, BA và TZD trên chồi cây Phú quý (Aglaonema
sp.) in vitro” được thực hiện nhằm tìm nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích
hợp trong giai đoạn khởi đầu và nhân chồi, góp phần trong qui trình vi nhân giống
loại cây này, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ.


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY PHÚ QUÝ (Aglaonema sp.)
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố
Cây Phú quý có tên khoa học (Aglaonema sp.), có tên là Siam Aurora. Chi
Aglaonema thuộc họ Ráy (Araceae) và gồm hơn 20 loài, sống ở vùng Đông Nam Á,
Bắc Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Inđônexia và Đông Malayxia (Hay, 1998).
Aglaonema được trồng nhiều ở Trung Quốc và nhiều nước Đông Nam Á khác. Vì
vậy, tên thông thường sử dụng phổ biến được gọi là “Chinese evergreen” (Chen và

ctv., 2003). Bên cạnh đó, Aglaonema còn là một trong số những cây cảnh phổ biến
dùng trong trang trí trên thế giới, do màu sắc; hoa văn khác nhau trên những phiến
lá. Phần lớn giống lai tập trung ở Thái Lan và Inđônêsia.
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Cây Phú quý (Aglaonema sp.), thuộc loại cây thân thảo, cây mọc thành bụi,
cao khoảng 25-30 cm. Lá mọc cách trên thân, phiến lá có hình bầu dục và nhọn ở
đầu, dài 15-25 cm, rộng 7-10 cm, ngoài phiến lá có viền màu đỏ, trung tâm lá có
màu xanh đốm đỏ, có bẹ lá và ôm ở gốc, cuốn lá có rãnh, thân cây màu hồng. Hoa
mo màu trắng. Rễ cây có màu trắng.

Hình 1.1 Cây Phú quý (Aglaonema sp.)

2


1.1.3 Cách trồng và chăm sóc
Để cây trồng đạt chất lượng cao người ta có trồng vào giá thể gồm có rêu dớn,
vỏ cây thông. Ẩm độ 50-70% và độ thoáng khí 10-20%. pH môi trường từ 6,0-6,5.
Cây thích hợp trồng trong bóng râm từ 70-90%. Hầu hết lá sẽ mất màu khi người
trồng đặt chúng ở những vị trí ánh sáng không thích hợp (Chen và ctv., 2003).
1.2 SƠ LƯỢC NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Nuôi cây mô tế bào thực vật (hay nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình nuôi
cây thực vật trong ống nghiệm, khác với nuôi cấy in vivo là quá trình nuôi cấy thực
vật trong điều kiện tự nhiên.
1.2.1 Cơ sở sinh lý của công nghệ nuôi cây tế bào thực vật
Nuôi cấy mô – tế bào thực vật in vitro đã hình thành từ vài thập kỷ trước mà cơ
sở của nó là giả thuyết của nhà thực vật học người Đức Haberland năm 1902. Ông
cho rằng tất cả tế bào của cây đều có tính toàn năng, nghĩa là mỗi tế bào đều mang
toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể. Hơn nữa, tế bào ấy có khả năng phát
triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi (Vũ Văn Vụ, 1999).

Tế bào thực vật có khả năng phân hóa và mất phân hóa. Tế bào thực vật phân
hóa để hình thành nên các mô, các cơ quan chuyên hóa nhưng cũng có khả năng
mất phân hóa và chuyển sang trạng thái phân chia (như tế bào mô phân sinh)
(Nguyễn Như Khanh, 2007).
1.2.2 Thuận lợi và bất lợi của vi nhân giống
 Thuận lợi của vi nhân giống
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác tạo
giống (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất.
Không lệ thuộc vào thời tiết hay mùa vụ (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ.
Thuận tiện bảo quản và hạ giá thành vận chuyển (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Có thể nhân một số lượng cây con sạch bệnh từ một cá thể ban đầu trong thời
gian ngắn (Bùi Bá Bổng, 1995).
Các phương pháp nuôi cấy mô là nền tảng của công nghệ di truyền (Lâm Ngọc
Phương, 2010).

3


 Bất lợi của vi nhân giống
Vi nhân giống nhìn chung còn đắt tiền hơn các phương pháp vô tính khác.
Không phải tất cả các loài đều có thể vi nhân giống.
Cây in vitro có sức sống yếu hơn cây trồng bên ngoài trong giai đoạn đầu để
cây thích nghi (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Một số loài có thể có biến dị di truyền hoặc không di truyền khi vi nhân giống
(Lâm Ngọc Phương, 2010).
1.2.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) quá trình nhân giống in
vitro được chia thành các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1 (chuẩn bị cây mẹ): Cây mẹ cần phải sạch bệnh và phải trong giai
đoạn tăng trưởng mạnh thì khi nhân giống sẽ đạt kết quả cao.
Giai đoạn 2 (giai đoạn khởi đầu): khử trùng mẫu cấy. Một phần thích hợp
của thực vật được khử trùng và chuyển vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô
trùng. Những mẫu cấy còn sống sẽ được chuyển sang giai đoạn 3.
Giai đoạn 3 (giai đoạn tăng sinh mô): mục tiêu của giai đoạn này là tăng
nhanh cá thể bằng sự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên và tạo chồi bất định.
Các chồi tăng trưởng nhạnh, đạt chiều cao thích hợp được chuyển sang giai đoạn ra
rễ in vitro.
Giai đoạn 4 (giai đoạn ra rễ in vitro và tiền thuần dưỡng): ra rễ in vitro.
Những chồi đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang môi trường kích thích rễ.
Trong môi trường này cần phải bổ sung auxin để cảm ứng rễ và nồng độ khoáng
thường giảm hơn so với môi trường tăng sinh.
Giai đoạn 5 (giai đoạn ra rễ in vivo): giai đoạn thuần dưỡng. Những cây
không ra rễ sẽ chuyển ra vườn ươm để ra rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
1.2.4 Phương pháp vi nhân giống
 Phương pháp nhân chồi bên
Về phương pháp thì phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt
đơn thân. Điều khác nhau lớn nhất là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có
sự kéo dài chồi, thân và thường không cần đến cytokinin để phát triển.
Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi ngọn được cô lập trên môi trường dinh
dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin ở
nồng độ cao. Vai trò cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để cho các chồi bên
có thể phát triển. Các chồi bên này có thể tiếp tục chuyển sang môi trường mới có
4


bổ sung cytokinin thì các chồi bên mới lại tiếp tục được tạo ra (Nguyễn Đức Lượng
và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
 Ưu điểm của phương pháp này:

- Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp nhân giống khác
- Tốc độ nhân giống cao
- Sản phẩm ổn định về mặt di truyền
- Cây con tăng trưởng rất tốt, có lẻ là do đã được trẻ hóa.
- Đối với một số loại cây, số lần cấy chuyền càng nhiều thì nhu cầu cytokinin
càng giảm là do cây đã quen với cytokinin và mô đã được trẻ hóa (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
1.2.5 Môi trường nuôi cấy mô thực vật
Lựa chọn môi trường dinh dưỡng nuôi cấy là một yếu tố rất quan trọng ảnh
hưởng đến sự thành công trong nhân giống. Thực vật phụ thuộc rất nhiều vào sự lựa
chọn thành phần môi trường dinh dưỡng. Do nhu cầu dinh dưỡng cho sinh trưởng
tối ưu của các loài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một
cơ thể ít nhiều có sự khác nhau (Murashige Skoog, 1962). Vì vậy, môi trường thay
đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Môi trường còn thay đổi tùy theo sự phân hóa
của mô cấy, tùy theo mục đích nghiên cứu muốn duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo
rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh, môi trường nuôi cấy phải thay đổi
nhiều hay ít (Vũ Văn Vụ, 1999).
Môi trường nuôi cấy bao gồm 5 thành phần: đường, các muối khoáng đa
lượng, các muối khoáng vi lượng, các vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng.
Ngoài ra các nhà nghiên cứu còn thêm một số chất hữu cơ có thành phần hóa
học xác định (acid amin, EDTA,…) hoặc không xác định ( nước dừa, chất trích men
(yeast extract),…). Bên cạnh đó, cần một số chất vô cơ đặc biệt như vitamin (B1,
B6, B3…).
 Đường
Phần lớn các mô cấy là dị dưỡng không có khả năng tổng hợp carbon (Nguyễn
Đức Thành, 2000). Đường được sử dụng làm nguồn carbon cung cấp năng lượng
chủ yếu trong nuôi cấy nhiều loại thực vật. Đường còn đóng vai trò là chất thẩm
thấu chính của môi trường. Loại đường hay sử dụng là saccharose và glucose.
Nhưng hiện nay saccharose được dùng phổ biến hơn. Tùy theo mục đích nuôi cấy
nồng độ saccharose biến đổi từ 1-6 % (w/v) thông dụng nhất là 2% tương ứng với

58,4 mM (1mM) (Lâm Ngọc Phương, 2010).

5


 Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với
cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Vì vậy trồng môi trường nuôi cấy cần phải được
cung cấp đủ các loại muối khoáng sau:
 Khoáng đa lượng
Khoáng đa lượng là những thành phần yêu cầu với số lượng lớn cho sự sinh
trưởng và phát triển của cây trồng. Các thành phần như nitơ, photpho, kali, magiê,
canxi, lưu huỳnh được xem là những nguyên tố đa lượng.
Nitơ thì thông thường được cung cấp như ion nitrat (từ KNO3) và ion amonium
(từ NH4NO3). Về mặt lý thuyết, có sự thuận lợi khi cung cấp nitơ từ ion amonium
và nitrat nhưng thực tế thì hàm lượng nitơ cần phải được giảm khi kết hợp với các
phân tử đa lượng vì nếu như nồng độ cao ion amonium sẽ gây độc cho cây trồng
(Butenko, 1964; trích bởi Nguyễn Đức Thành, 2000).
Photpho thường được cung cấp dưới dạng ion photphat của muối natri và muối
kali. Nồng độ photphat cao có thể gây kết tủa môi trường hoặc là không hòa tan
được muối photphat.
 Khoáng vi lượng
Khoáng vi lượng là những thành phần yêu cầu rất ít cho sự sinh trưởng và phát
triển của cây và có nhiều vai trò khác nhau. Các thành phần vi lượng gồm có
mangan, đồng, sắt, coban, kẽm, bo, molypđen.
Sắt được thêm vào dưới dạng muối vô cơ (FeCl3, Fe2SO4). Nhiều nhà nghiên
cứu và trên thực tế cho thấy sắt kết hợp với các chất chelat (EDTA- ethylendiamintetraacetic acid) làm tăng khả năng trao đổi chất của sắt.
 Các Vitamin
Vitamin có vai trò xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào, cho
nên muốn đạt được sự sinh trưởng tốt nhất của mô nuôi cấy thì cần phải đưa vào

môi trường một số vitamin như: thiamin (vitamin B1), acid nicotinic (vitamin B3),
pyridoxin (vitamin B6), vitamin B5. Trong đó, vitamin B1 được coi là vitamin thiết
yếu đối với sự sinh trưởng của tế bào thực vật (Vũ Văn Vụ, 1999).
 Myo-inositol
Myo-inositol là thành phần của phosphatidyl inositol và phytic acid (Nguyễn
Bảo Toàn, 2010), nó cũng được chứng minh kích thích cho sự tăng trưởng của tế
bào đa số loài thực vật. Myo-inositol thường được sử dụng trong môi trường nuôi
cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 100 ppm.

6


 Các chất điều hòa sinh trưởng
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một
hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần
thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức
sống tốt cho mô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi
tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của
chúng.
 Auxin
Trong nuôi cấy in vitro auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu qua hoạt hóa sự
phân chia mô và kéo dài tế bào. Năm 1953, Went và Thimann chứng minh rằng
auxin (IAA) kích thích sự tạo rễ (trích bởi Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Các auxin có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp từ 0,1-1 mg/l tùy theo mục đích và vật
liệu nuôi cấy. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, ngược lại ở hàm
lượng auxin cao sẽ tạo mô sẹo (Vũ Văn Vụ, 1999). Hơn nữa, auxin điều hòa sự phát
sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin.
Những chất thuộc nhóm auxin là IAA (indole-3-acetic acid), IBA (indole-3và 2,4-D (2,4butyric acid), NAA (  -naphthaleneacetic acid),
dichlorophenoxyacetic acid). IAA là auxin tự nhiên do kém bền bởi nhiệt nên ít
dùng, IBA và NAA dùng cho quá trình tạo rễ ở đa số các loại cây. 2,4-D sử dụng có

hiệu quả trong tạo mô sẹo ở nhiều loại thực vật, nếu dùng ở nồng độ cao thì phát
sinh phôi vô tính (Vikrant và Raskid, 2003), tuy nhiên không được dùng trong môi
trường tái sinh cơ quan (Vũ Văn Vụ, 1999). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ
yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi
trường ra chồi. Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp.
 Cytokinin
Cytokin là dẫn xuất adenine, đây là hormone liên quan chủ yếu đến sự phân
chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô và được
Folke Skoog và ctv. (1950) phát hiện ra. Người ta thường bổ sung một hoặc vài loại
cytokinin vào môi trường nuôi cấy ở giai đoạn II, cách này cảm ứng được sư tăng
trưởng của một vài chồi nhỏ từ mỗi mẫu cấy sau khoảng 4 đến 6 tuần. Nồng độ
cytokinin quá cao sẽ kích thích hình thành nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này
không thể kéo dài ra, hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều
nước (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Cytokinin thường găp là Kinetin, 2ip (isopentenyl adenine), BAP (6-benzyl
aminopurin) – hợp chất nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn Kinetin.

7


Những hoạt động đặc trưng của cytokinin trong nuôi cấy chồi: hầu hết những
bằng chứng về nhu cầu cytokinin đặc biệt đều được thực hiện trong nuôi cấy chồi
của nhiều loại thực vật khác nhau. BAP kích thích sự tăng sinh chồi bên của cây
Castanca (Vieitez, 1980; trích bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Trong khi
kinetin không có ảnh hưởng gì cả. Zeatin thì có khuynh hướng kích thích sự tăng
trưởng của chồi chính và chỉ làm tăng nhẹ sự nảy chồi bên. Tương tự, 2ip và kinetin
chỉ kích thích sự tạo chồi bên trong quá trình nuôi cấy chồi Prunus và để tăng chồi
cần sử dụng BAP. Đối với một số loài thực vật thì phối hợp hai loại hợp chất này
với nhau thì sẽ có kết quả tốt hơn là khi sử dụng một loại riêng lẻ (Eccher và Noe,
1989).

Ngoài các loại trên cytokinin còn có Thidiazuron (TDZ) là cytokinin có hoạt
tính cao nhờ ít bị phân hủy bởi enzyme nội sinh so với các loại cytokinin khác (Mok
và ctv., 1982). Vì vậy, có hiệu quả nhân giống đối với những cây thân gỗ
(Huetteman và ctv., 1993), cho nên nó được chọn để nhân giống cho họ Oleaceae
(Einset và ctv., 1985).
Bên cạnh đó, TDZ có hiệu quả cao gia tăng hình thành chồi nách trong nhân
chồi Rhododendron (Fellman và ctv., 1987) và Malus domestica (Fasolo và ctv.,
1988).
Hiệu quả tăng nhanh chồi trong một số loài khó nhân giống như Acer fremanii
(Kerns ctv., 1986) và Pyrus communis (Singha và ctv., 1988), kết quả đạt được khi
kết hợp BA và TDZ (1 μM + 0.01 μM trên Acer và 5 μM + 0.4 mM trên Pyrus). Cả
hai trường hợp trên BA và TDZ đều có ý nghĩa tương tác lẫn nhau.
Theo bài báo của Murthy và ctv. (1998), TDZ vừa đạt hiệu quả khi áp dụng
riêng lẻ hoặc khi kết hợp với loại chất điều hòa sinh trưởng khác trong môi trường
dùng để nuôi cấy tế bào. TDZ và BA kết hợp dùng cho nhân chồi cũng đạt kết quả
cao trên nhiều loại cây trồng khác nhau (Nielsen và ctv., 1995; Khalafalla và ctv.,
1999).
 Sự tương tác giữa nhóm Auxin và Cytokinin
Skoog và Miller (1957) chứng minh rằng sự hình thành chồi từ callus trên cây
thuốc lá sử dụng môi trường có chứa auxin ở nồng độ thấp và cytokinin ở nồng độ
cao. Từ khi phát hiện này, nhiều hướng phân biệt sự khác nhau của tế bào và cơ
quan trong cấy mô. Từ đó, những bộ phân được hình thành trong cấy mô được kiểm
soát bởi những ảnh hưởng qua lại giữa nồng độ auxin và cytokinin.
Trong môi trường nuôi cấy cho thấy tỷ lệ auxin và cytokinin sẽ ảnh hưởng đến
việc tạo chồi, rễ, hay mô sẹo. Nồng độ của auxin lớn hơn cytokinin kích thích sự

8


thành lập rễ, ngược lại thì kích thích sự hình thành chồi, và nếu như tỷ lệ giữa auxin

và cytokinin cân bằng kích thích sự thành lập mô sẹo.
 Thạch (Agar)
Thạch là phức hợp polisaccharit tự nhiên được trích từ loại tảo đỏ. Dùng để
chuẩn bị môi trường đặc ở 450C. Sử dụng nồng độ thạch từ khoảng 6-8 g/l. Nếu
nồng độ thạch trong môi trường nuôi cấy cao sẽ giới hạn sự phát triển của mô sẹo
và ngược lại làm hạn chế sự trao đổi chất giữa môi trường và mô nuôi cấy (Lâm
Ngọc Phương, 2010).
 Nước dừa
Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van
Overbeek và ctv. (1941). Nước dừa (nội nhủ lỏng) đã được xác định là rất giàu các
hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993). Nước
dừa kích thích sự phân bào là do sự hiện diện của zeatin riboside (Lê Văn Hòa và
ctv., 2004). Đối với đa số mẫu vật nuôi cấy, lượng nước dừa phù hợp nhất là từ 15
đến 20 % theo thể tích môi trường (Vũ Văn Vụ, 1999).
 pH
Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong
nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần
thiết của thí nghiệm. Độ pH ảnh hưởng đến sự hòa tan của các ion trong môi trường
khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Vì vậy, xác định pH là
điều cần thiết. Murashige và Shoog (1962) nhận thấy rằng pH 5,7-5,8 thích hợp để
duy trì sự hòa tan chất khoáng trong môi trường nuôi cấy MS. Độ pH cao hơn sẽ
làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar.
Độ pH của môi trường được điều chỉnh bằng dung dịch 10% KOH, NaOH, HCl. Có
thể đo pH bằng máy để bàn hoặc máy đo pH cầm tay. Thường thì nhiệt độ cao sẽ
làm tăng tính pH của môi trường.
1.2.6 Kích thích mầm ngủ chồi bên phát triển
Chồi ngủ là những chồi nách ở trong trạng nghỉ, không hoạt động trong thời
gian dài, nó có thể là chồi dinh dưỡng hoặc là chồi hoa. Mỗi đốt thân mang một
mầm ngủ, để phát triển thành chồi phải phá vở miên trạng của mầm ngủ. Đây là
phương pháp thường được áp dụng nhất trong nhân giống in vitro. Tách nách lá sau

đó cấy vào môi trường dinh dưỡng với điều kiện thích hợp chúng phát triển thành
chồi, tăng trưởng nhiều lá, chuyển sang môi trường tạo rễ thành cây hoàn chỉnh,
chuyển sang thuần dưỡng và trồng trong đất (Pierik, 1987; trích bởi Võ Quân Vũ,
2007).

9