TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN BÉ TÂM

ẢNH HƯỞNG CỦA HgCl2 1‰ VÀ THỜI GIAN
KHỬ TRÙNG ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ TÁC ĐỘNG
CỦA BA, NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ
NHÂN CHỒI CÂY LINH SAM
(Desmodium unifoliatum)
IN VITRO

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: HOA VIÊN - CÂY CẢNH

Cần Thơ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: HOA VIÊN - CÂY CẢNH

ẢNH HƯỞNG CỦA HgCl2 1‰ VÀ THỜI GIAN
KHỬ TRÙNG ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ TÁC ĐỘNG
CỦA BA, NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ
NHÂN CHỒI CÂY LINH SAM
(Desmodium unifoliatum)
IN VITRO

Cán bộ hướng dẫn
ThS. Nguyễn Văn Ây

Sinh viên thực hiện
Trần Bé Tâm
MSSV: 3087745

Cần Thơ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ- SINH HÓA

Luận văn tốt nghiệp ngành Hoa viên - cây cảnh với đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA
HgCl2 1‰ VÀ THỜI GIAN KHỬ TRÙNG ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ TÁC
ĐỘNG CỦA BA, NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ NHÂN CHỒI CÂY LINH
SAM (Desmodium unifoliatum) IN VITRO”

Do sinh viên TRẦN BÉ TÂM thực hiện, kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt
nghiệp.

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2012
Cán bộ hướng dẫn

ThS. Nguyễn Văn Ây

i



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ- SINH HÓA

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp đính kèm với
tên đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA HgCl2 1‰ VÀ THỜI GIAN KHỬ TRÙNG
ĐẾN TỶ LỆ SỐNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA BA, NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ
NHÂN CHỒI CÂY LINH SAM (Desmodium unifoliatum) IN VITRO”, do sinh
viên TRẦN BÉ TÂM thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp
và đã được thông qua.

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ……… điểm.
Ý kiến hội đồng: …………………………………………………………………...
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2012
Chữ ký của thành viên hội đồng

Thành viên 1

Thành viên 2

……………………

……………………

Duyệt của khoa
Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD


ii

Thành viên 3

……………………


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn. Các
số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Trần Bé Tâm

iii


LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!
Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tương lai của con
Xin tỏ lòng biết ơn đến!
- Thầy Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
- Thầy cố vấn Phạm Phước Nhẫn và cô Lê Minh Lý, cùng với quý thầy cô khoa
Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã dìu dắt, rèn luyện trong thời gian tôi học

tại trường Đại Học Cần Thơ.
Chân thành cám ơn!
- Cô Lê Hồng Giang, anh Mai Vũ Duy, cùng với các anh chị và các bạn sinh viên
trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đã quan tâm và nhiệt tình giúp đỡ.
- Bạn Phạm Thị Ngọc Duyên đã động viên, tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua.
- Các bạn sinh viên lớp Hoa viên – cây cảnh, k34 đã giúp đỡ tôi trong giảng đường
đại học.

iv


TIỂU SỬ CÁ NHÂN

1. LÝ LỊCH SƠ LƯỢC
Họ và Tên: Trần Bé Tâm
Giới tính: Nữ
Ngày, tháng, năm sinh: 1988
Dân tộc: Kinh
Nơi sinh: Xã Vị Thanh, huyện Vị Thanh, tỉnh Cần Thơ
Địa chỉ: 134/65, ấp 5, xã Vị Thanh, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu Giang
Họ và tên cha: Trần Văn Quang
Họ và tên mẹ: Nguyễn Thị Nương
2. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
- Năm 1996-2001: Học sinh trường tiểu học Vị Thanh 1, xã Vị Thanh, huyện Vị
Thủy, tỉnh Hậu giang
- Năm 2001-2005: Học sinh trường trung học cơ sở Vị Thanh, xã Vị Thanh,
huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu giang
- Năm 2005-2008: Học sinh trường trung học phổ thông Lê Hồng Phong, xã Vị
Thanh, huyện Vị Thủy, tỉnh Hậu giang

- Năm 2008-2012: Sinh viên ngành Hoa viên – cây cảnh khóa 34, khoa Nông
Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ, khu II, đường 3/2,
phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2012
Người khai ký tên

Trần Bé Tâm

v


MỤC LỤC

Nội dung

Chương

Chương 1

LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM TẠ
TIỂU SỬ CÁ NHÂN
MỤC LỤC
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH HÌNH
TÓM LƯỢC
MỞ ĐẦU
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1
Sơ lược về cây linh sam
1.2
Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật
1.2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô
1.2.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô
1.2.3 Các giai đoạn của nuôi cấy mô thực vật
1.2.4 Thành phần môi trường
1.2.4.1 Nước
1.2.4.2 Khoáng đa lượng
1.2.4.3 Khoáng vi lượng
1.2.4.4 Nguồn carbohydrate
1.2.4.5 Vitamin
1.2.4.6 Agar
1.2.4.7 Nước dừa
1.2.4.8 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
1.2.4.9 Giá trị pH
1.2.5 Một số hóa chất khử trùng thông dụng
1.3

Chương 2

Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô trên cây thân
gỗ

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1
Phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Vật liệu thí nghiệm
2.1.2 Dụng cụ và hóa chất


vi

Trang
iii
iv
v
vi
ix
x
xi
xii
1
2
2
3
3
4
5
8
8
8
9
10
10
11
11
11
12
13

14
16
16
16
16


Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
Điều kiện thí nghiệm
Phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị môi trường
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời
gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy linh
sam
2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BA trên sự tạo chồi
in vitro cây linh sam
2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA và NAA trên sự
nhân chồi in vitro cây linh sam

16
16
16
16
17
17

2.2.3 Xử lý số liệu
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1

Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng
đến tỷ lệ sống của mẫu cấy linh sam

20
21
21

3.1.1
3.1.2
3.2

21
23
26

2.1.3
2.1.4
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.2.1

Chương 3

3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.3


Chương 4

Tỷ lệ (%) mẫu chết
Tỷ lệ (%) mẫu sống
Ảnh hưởng của BA trên sự tạo chồi in vitro cây
linh sam
Số chồi/mẫu linh sam
Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi
Chiều cao chồi linh sam
Số lá/mẫu linh sam
Ảnh hưởng của BA và NAA trên sự nhân chồi in
vitro cây linh sam

3.3.1 Số chồi gia tăng
3.3.2 Số lá gia tăng
3.3.3 Chiều cao gia tăng
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1
Kết luận
4.2
Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƯƠNG 1
PHỤ CHƯƠNG 2

vii

18
19


26
29
29
30
32
32
35
36
38
38
38
39


DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

MS:
BA:
NAA:
SKC:
HgCl2:
ctv.:

Murashige và Skoog
Benzyl adenine
Naphthalene acetic acid
Sau khi cấy
Clorua thủy ngân
Cộng tác viên


viii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng

Tựa bảng

Trang

3.1

Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng lên tỷ lệ (%) chết
mẫu cấy linh sam vào thời điểm 1 và 2 tuần sau khi cấy

22

3.2

Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng lên tỷ lệ (%) sống
mẫu cấy linh sam vào thời điểm 1 và 2 tuần sau khi cấy

24

3.3

Ảnh hưởng của BA lên số chồi/mẫu linh sam in vitro theo thời gian

27


3.4

Ảnh hưởng của BA lên tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi linh sam in vitro theo
thời gian

29

3.5

Ảnh hưởng của BA lên chiều cao (cm) chồi linh sam in vitro theo
thời gian

30

3.6

Ảnh hưởng của BA lên số lá/mẫu linh sam in vitro theo thời gian

31

3.7

Chồi linh sam in vitro gia tăng trên môi trường có nồng độ BA &
NAA khác nhau theo thời gian

32

3.8

Số lá linh sam in vitro gia tăng trên môi trường có nồng độ BA &

NAA khác nhau theo thời gian

35

3.9

Chiều cao (cm) chồi linh sam in vitro gia tăng trên môi trường có
nồng độ BA & NAA khác nhau theo thời gian

37

ix


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tựa hình

1.1

Cây và hoa linh sam (Desmodium unifoliatum)

2.1
2.2
3.1
3.2
3.3

Vật liệu dùng để bố trí thí nghiệm

Chồi cây linh sam in vitro
Mẫu cấy linh sam in vitro chết vào thời điểm 1 tuần sau khi cấy
Mẫu cấy linh sam in vitro vào thời điểm 2 tuần sau khi cấy
Chồi linh sam phát sinh từ mầm ngủ ở 3 tuần sau khi cấy trên
môi trường có các nồng độ BA khác nhau
Sự sinh trưởng chồi linh sam vào thời điểm 6 tuần sau khi cấy
trên môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

3.4

x

Trang
2
18
20
23
25
28
34


TRẦN BÉ TÂM, 2012. “Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng đến tỷ
lệ sống và tác động của BA, NAA lên sự tạo chồi và nhân chồi cây linh sam
(Desmodium unifoliatum) in vitro”. Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Hoa viên cây cảnh, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
Cán bộ hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Ây.

TÓM LƯỢC
Đề tài “Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống và tác
động của BA, NAA lên sự tạo chồi và nhân chồi cây linh sam (Desmodium

unifoliatum) in vitro” được thực hiện nhằm tìm ra thời gian khử trùng bằng dung
dịch HgCl2 1‰, nồng độ BA và NAA thích hợp trong giai đoạn tạo mẫu cấy ban đầu
và nhân chồi cây linh sam in vitro. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô, bộ môn Sinh lý - Sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng,
trường Đại Học Cần Thơ, từ tháng 01 đến tháng 06/2012. Kết quả thí nghiệm cho
thấy: (i) Trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu, khử trùng bề mặt mẫu cấy cây linh
sam 2 lần bằng dung dịch HgCl2 1‰ (HgCl2 1‰ (10 phút) + HgCl2 1‰ (10 phút)) thì
mẫu cấy sinh trưởng và phát triển tốt, đạt tỷ lệ sống cao (96,0%) nhất; (ii) Sử dụng
môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l là thích hợp nhất trong giai đoạn tạo chồi; (iii)
Môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/l là thích hợp nhất trong giai đoạn nhân chồi
linh sam, cho số chồi gia tăng cao (3,0 chồi sau 6 tuần nuôi cấy) và các chồi sinh
trưởng và phát triển tốt.
Từ khóa: cây linh sam, HgCl2 1‰, BA, NAA, khử trùng, nhân chồi.

xi


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, nước ta đang chuyển mình vào thời kì mới với nhiều sự
thay đổi. Khi đời sống vật chất ngày một nâng cao thì đời sống tinh thần cũng dần
được quan tâm hơn. Bonsai như là một môn nghệ thuật đã từ lâu được nhiều người
biết đến. Bởi bonsai được xem như một thú chơi tao nhã, nó giúp con người quên đi
mọi sự mệt mỏi, lo toan của cuộc sống mà trở về với thiên nhiên tươi đẹp.
Hiện nay, có nhiều loại cây kiểng được người ta chọn làm cây bonsai như nguyệt
quới, si, sanh, sơn tùng,... Trong đó, cây linh sam được chọn làm cây kiểng bonsai
rất phổ biến. Bởi cây có bộ lá nhỏ, hoa đẹp, thân đẹp rất thích hợp làm cây bonsai.
Hơn nữa, cây linh sam có giá trị kinh tế cao, hoa có hương thơm nhẹ rất dễ chịu nên
nó gần như được xem là cây kiểng quý.
Đối với cây linh sam, việc nhân giống chủ yếu thường là giâm cành hoặc chiết
cành. Tuy nhiên, để tạo ra một lượng lớn cây có chất lượng cao trong thời gian ngắn

để phục vụ cho nhu cầu thị trường bằng các phương pháp truyền thống trên thì rất
khó. Hiện nay, phương pháp nhân giống in vitro đóng vai trò quan trọng trong công
tác nhân giống cây trồng. Bằng phương pháp này, người ta có thể tạo ra hệ số nhân
chồi cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất, cây con sạch bệnh và
đồng đều về độ tuổi.
Từ những lý do trên, đề tài “Ảnh hưởng của HgCl2 1‰ và thời gian khử trùng
đến tỷ lệ sống và tác động của BA, NAA lên sự tạo chồi và nhân chồi cây linh
sam (Desmodium unifoliatum) in vitro” được thực hiện nhằm tìm ra thời gian khử
trùng bằng dung dịch HgCl2 1‰, nồng độ BA và NAA thích hợp trong giai đoạn tạo
mẫu cấy ban đầu và nhân chồi cây linh sam in vitro. Đồng thời làm cơ sở cho các
nghiên cứu tiếp theo trên cây linh sam.

1


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây linh sam
Cây linh sam có tên khoa học là Desmodium unifoliatum, thuộc họ Fabaceae (họ
Đậu). Cây linh sam thuộc cây bụi nhỏ, cao 30-40 cm, thân cứng, vỏ xám, nứt mịn.
Lúc non cành không có lông, chót nhánh tạo thành gai nhọn chẻ 2-3 và có chiều dài
khoảng 2,5-5,0 cm. Lá nhỏ, có kích thước khoảng 18x6 mm, tà tròn hai đầu, dai và
cứng, gân phụ rất mịn. Cuống lá khoảng 1 mm. Hoa màu tím thẩm, mọc chùm
khoảng 1-2 cm ở đầu cành và nách lá (Hình 1.1). Cuống hoa khoảng 6 mm, dài 2
mm (Phạm Hoàng Hộ, 1999).
Cây thường ra hoa rải rác trong năm. Hoa nhỏ, chỉ nở khoảng một hoặc hai ngày rồi
tàn nhưng cái nọ nối tiếp cái kia trên từng chùm hoa và kéo dài khoảng 3-5 ngày.
Cây thường được nhân giống bằng phương pháp giâm cành. Linh sam là một trong
những loại cây được trong giới chơi bonsai đánh giá cao, ưa chuộng nhất hiện nay

và cũng không thể thiếu trong bộ sưu tập bonsai trong vườn kiểng của mọi người.
Bởi linh sam là chủng loại làm bonsai rất đẹp, từ thân, cành, lá, hoa. Đặc biệt là lũa,
gỗ linh sam làm lũa thì ít có loại gỗ nào trong nhóm cây làm bonsai sánh kịp. Linh
sam là giống cây ưa nước, ở trong rừng cây sống ven các suối. Vào mùa mưa, nước
chảy ngập hàng tháng mà cây vẫn sống khỏe (Chí Thiện, 2005).

Hình 1.1 Cây và hoa linh sam (Desmodium unifoliatum)
(Nguồn: />
2


1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật
1.2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô
Vào năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đã đưa ra thuyết
tế bào và nêu rõ rằng mọi cơ thể sinh vật cho dù phức tạp đến đâu cũng đều được
tạo nên bởi sự kết hợp của rất nhiều đơn vị rất nhỏ, đó là các tế bào. Haberlandt là
người đầu tiên thực hiện việc nuôi cấy tế bào thực vật vào năm 1902 và ông đã nhận
thấy có sự ảnh hưởng của các khoáng chất và điều kiện môi trường trên sự chuyển
hóa của các tế bào cô lập trên môi trường nuôi cấy. Năm 1934, White nuôi cấy
thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng có
chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nấm men trong một thời gian dài.
Cũng trong khoảng thời gian này, Gautheret ở Pháp đã tiến hành các thí nghiệm
nuôi cấy tượng tầng của một số loài cây thân gỗ. Năm 1939, Nobécourt và
Gautheret đã thành công trong việc duy trì sinh trưởng của mô sẹo ở cà rốt (Daucus
carota) trên môi trường có agar (môi trường đặc) trong thời gian vô hạn bằng cách
cấy chuyền đều đặn sáu tuần một lần. Tiếp theo, Overbeck chứng minh được khả
năng kích thích sinh trưởng phôi của cây thuộc họ cà (Datura) của nước dừa trong
quá trình nuôi cấy. Trong thời gian này, người ta đã nghiên cứu và tổng hợp thành
công nhiều chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhân tạo thuộc nhóm auxin như  naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4-dichloro phenoxy acetic acid (2,4-D). Đến
năm 1957, Skoog và Miller ghi nhận được sự hình thành cơ quan từ mô sẹo thuốc lá

chịu sự ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Về sau, dựa trên nền tảng của Haberlandt, đã có hàng loạt công trình nghiên cứu
công bố. Trong đó, Guha và Maheshwari (1964) đã chứng minh tính toàn năng của
tế bào hạt phấn, tế bào sinh dưỡng (vegetative cells) (Rashid & Street, 1974) và tế
bào sinh sản (Nguyễn Đức Thành, 2000). Như vậy, từ khi ý tưởng thực hiện nuôi
cấy mô của Haberlandt (1902) đến nay đã hơn 100 năm, kỹ thuật này đã được phát
triển mạnh mẽ và có khá nhiều ứng dụng quan trọng trong việc chọn giống, nhân
giống và phục hồi giống... Các ứng dụng này đã giúp ích cho nhiều nước phát triển
nông nghiệp, lâm nghiệp và cây cảnh theo hướng công nghệ cao, làm tăng giá trị
sản phẩm nông lâm nghiệp và tiết kiệm nhiều chi phí (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Tình hình nuôi cấy mô ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được nghiên cứu trên 30 năm.
Nhưng áp dụng vào thực tế sản xuất trong các lĩnh vực vi nhân giống cây hoa cảnh,
cây nông nghiệp, cây lâm nghiệp và cây dược liệu trong khoảng 10-20 năm trở lại.
Nhiều phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia, các trung tâm công nghệ sinh học với

3


các trang thiết bị hiện đại cũng được xây dựng ở các thành phố lớn như Hà Nội,
thành phố Hồ Chí Minh. Bên cạnh đó, có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô
và tế bào thực vật cũng được xây dựng ở các trường đại học, viện nghiên cứu, sở
khoa học và công nghệ của các tỉnh, thành phố (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Theo
Nguyễn Đức Thành (2000), phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đầu
tiên được xây dựng tại viện sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam do Lê Thị Muội
đứng đầu.
Nhiệm vụ của các phòng thí nghiệm là xây dựng và phát triển các phương pháp
nghiên cứu, đồng thời tổ chức những hướng nghiên cứu ứng dụng phù hợp với điều
kiện trang thiết bị ở Việt Nam và đã thu được những kết quả quan trọng như: vi

nhân giống dứa, khoai tây, hoa hồng, cúc, cẩm chướng… (Viện công nghệ sinh
học). Nhân giống chuối, hoa lan… (Viện nghiên cứu Đà Lạt, Đại học Nông Nghiệp
I). Nhân giống bạch đàn (Viện lâm nghiệp). Đặc biệt là các kết quả nuôi cấy bao
phấn lúa và thuốc lá, nuôi cấy tế bào trần của cây thuốc lá và khoai tây ở Viện công
nghệ sinh học và Viện sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh (Vũ Văn Vụ,
1999).
1.2.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô
Theo Vũ Văn Vụ (1999), vi nhân giống in vitro là lĩnh vực sử dụng các kỹ thuật
nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân giống cây trồng trong ống nghiệm. Vi nhân
giống có các ưu điểm như: tạo ra hệ số nhân chồi cao, rút ngắn thời gian đưa một
giống mới vào sản xuất, cây con hoàn toàn sạch bệnh và đồng đều về độ tuổi. Bên
cạnh đó, cây con tạo ra có đặc điểm di truyền giống cây mẹ, việc nhân giống được
thực hiện từ các mẫu cấy rất nhỏ và mẫu vật có thể dự trữ lâu dài (Nguyễn Bảo
Toàn, 2010).
Ngoài ra, vi nhân giống còn có thể: nhân được một số lượng cây lớn trong một diện
tích nhỏ. Trong 1 m2 nền có thể để được 18.000 cây, thuận tiện và làm hạ giá thành
vận chuyển (một thùng chứa 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15 kg). Đặc biệt, nhu cầu
về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hằng năm trên thế
giới sản xuất khoảng 50 triệu cây. Ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng
được yêu cầu thực tiễn (Nguyễn Đức Thành, 2000). Theo Lâm Ngọc Phương
(2009), các phương pháp nuôi cấy mô là nền tảng của công nghệ di truyền, một số
cây thân gỗ khó nhân giống bằng phương pháp giâm cành, chiết hoặc ghép thì có
thể được vi nhân giống. Hơn nữa, một trong những lợi ích của nhân giống vô tính
trong ống nghiệm là người ta có thể lập chương trình cho việc nuôi cấy suốt năm,
không lệ thuộc vào mùa màng. Vi nhân giống không thay thế các phương pháp nhân
giống truyền thống nhưng bản thân nó có vị trí trong các lĩnh vực chất lượng cao.

4



Theo Nguyễn Đức Thành (2000), nuôi cấy mô và tế bào thực vật còn có những khả
năng đóng góp cho những nghiên cứu và ứng dụng xa hơn thế nữa, đặc biệt là trong
cải biến di truyền (chọn dòng tế bào, đột biến tế bào, nuôi cấy bao/hạt phấn, lai tế
bào, chuyển gen) và trong công nghệ thu nhận các chất có hoạt tính sinh học. Tóm
lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản
xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh
trong ngành Trồng trọt (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
1.2.3 Các giai đoạn của nuôi cấy mô thực vật
Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành 4 giai đoạn khác
nhau (không kể giai đoạn 0), mỗi giai đoạn có một chức năng riêng (trích dẫn bởi
Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
* Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ
Cây mẹ phải sạch bệnh và đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân
giống sẽ đạt hiệu quả cao. Khi chọn cây mẹ, tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà
kính, cây phải được bón phân và phun thuốc phòng trừ sâu bệnh chu đáo (Nguyễn
Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
* Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy
Đây là giai đoạn đưa mẫu từ bên ngoài vào trong điều kiện nuôi cấy vô trùng, là
điều kiện tiên quyết cho sự thành công trong nuôi cấy in vitro. Mục tiêu của giai
đoạn này là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô trùng và vẫn còn khả năng tăng
trưởng (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Thông thường khó đạt
thành công 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Theo
Lâm Ngọc Phương (2009), phương pháp vô trùng thông dụng nhất hiện nay là dùng
các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn như: calcium hypochloride
(Ca(OCl)2), natri hypochloride (NaOCl), hydro peroxide (H2O2), clorua thủy ngân
(HgCl2),... Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý,
nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô
cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng
thời gian khử trùng mẫu phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị thủy Tiên, 2002). Để tăng tính linh động và khả

năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng
30 giây với rượu ethylic 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.
Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn (đối
với các bộ phận có nhiều bụi rác, trước khi xử lý phải rửa kỹ bằng nước xà phòng
bột và rửa sạch lại bằng nước máy). Khi xử lý xong mô cấy phải được rửa lại sạch

5


bằng nước cất vô trùng (tối thiểu 3 lần). Theo Vũ Văn Vụ (1999), kích thước của
mẫu khi vô trùng phải lớn hơn khi cấy vào môi trường vì sau đó phải cắt bớt phần bị
hủy hoại do hóa chất vô trùng gây ra. Đối với các mẫu mà bề mặt chúng được bao
phủ bởi một lớp sáp thì muốn đạt kết quả tốt cần cho thêm vào dung dịch khử trùng
một vài giọt các chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 20, Tween 80… Vì
những chất này làm tăng tính linh động của hóa chất vô trùng.
Nếu như mẫu bị nhiễm thì sẽ dễ dàng nhận ra sau 3-5 ngày kể từ khi bắt đầu nuôi
cấy. Ngược lại, tình trạng nhiễm xuất hiện sau 10 ngày thì hoặc là mẫu bị nhiễm
bên trong hoặc do có kiến hay rận hiện diện trong phòng nuôi làm lây lan nguồn gây
nhiễm. Trong trường hợp này thì vùng bị nhiễm sẽ không nằm trên mẫu cấy mà
xuất hiện ở vị trí vết cắt của mẫu nằm ngập trong môi trường hoặc trên bề mặt môi
trường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị thủy Tiên, 2002).
* Giai đoạn 2: Nhân
Đây là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng
cây thông qua con đường tạo chồi và tạo phôi vô tính. Mục đích của giai đoạn này
là tạo được số lượng cây con theo ý muốn, thường kéo dài khoảng 4-5 tuần. Tùy
vào vật liệu thực vật tạo được ở giai đoạn 1, người ta có thể vi giâm cành đối với
các cây con này, hay có thể phân lập chồi con đối với cụm chồi. Các mẫu này được
cấy chuyền nhiều lần cho đến khi đạt được số lượng cây con mong muốn (Lâm
Ngọc Phương, 2009).
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), trong giai đoạn 2, việc gia tăng số chồi phụ thuộc

nhiều vào việc sử dụng cytokinin và auxin. Sử dụng hàm lượng cytokinin cao và
auxin thấp kích thích sự phát sinh nhiều chồi bên và chồi bất định. Ngược lại, sử
dụng cytokinin thấp và auxin cao dễ phát sinh callus và chồi bất định từ callus.
Benzyl adenine (BA) là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở
nhiều loài thực vật như nhân nhanh chồi hoa cẩm chướng (môi trường MS + BA 2
mg/l), nhân chồi cây hương nhu (môi trường chứa ½ MS + BA 3 mg/l) (Nguyễn
Văn Uyển, 1993),… và cũng được đề nghị sử dụng để nhân chồi cho nhiều giống
hoa hồng khác nhau.
Theo Trịnh Đình Đạt (2007), điều kiện thích hợp để nhân nhanh là ở nhiệt độ 2527oC, thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày và cường độ chiếu sáng khoảng 20004000 lux. Tuy nhiên, tùy theo từng loài mà có chế độ môi trường cũng như điều
kiện khác nhau. Ví dụ, nhân nhanh các loài hoa thập tự (súp lơ, su hào…) chỉ cần
thời gian chếu sáng 9-10 giờ/ngày; còn nhân các loài hoa phong lan thì giai đoạn
đầu lại để trong tối. Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), toàn bộ quá trình nhân giống
in vitro xét cho cùng chỉ nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy,

6


giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Có 3 phương pháp nhân
chồi là phát sinh chồi bất định từ mô sẹo nhận được từ mô sinh vật nuôi cấy, phát
sinh chồi bất định trực tiếp từ mô sinh vật không thông qua mô sẹo và phương pháp
nhân chồi bên (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị thủy Tiên, 2002).
Theo Olufl và Gregogy (1995), phương pháp khá đơn giản để nhân nhanh số chồi là
phương pháp nhân chồi bên. Phương pháp này có ý nghĩa rất quan trọng trong thực
tế vì nó đơn giản hơn các phương pháp khác, tốc độ nhân giống cao, sản phẩm ổn
định về mặt di truyền và cây con tăng trưởng rất tốt có lẽ là do đã được trẻ hóa.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này chính là kích thích sự tái sinh chồi từ các
mầm ngủ. Mầm ngủ thực chất có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng thân. Do tính
ưu thế chồi ngọn, các mầm bên ở trạng thái miên trạng và không phát triển. Do đó
khi các chồi bên được xử lý chất điều hòa sinh trưởng sẽ phá vỡ miên trạng và phát
triển thành những chồi có lá đầy đủ như thân chính. Các chồi có thể được tách ra,

đưa vào môi trường tạo rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh hay sử dụng cho quá trình
nhân giống trở lại.
* Giai đoạn 3: Tạo rễ và phát triển
Theo Lâm Ngọc Phương (2009), mục đích của giai đoạn này là chuẩn bị những cây
con sẵn sàng cho sự chuyển ra ngoài. Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm
khi có được tỷ lệ cây con sống tốt cao sau khi ra khỏi giai đoạn nuôi cấy vô trùng và
chuyển trồng nơi vườn ươm. Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), giai đoạn 3 sẽ được
chia thành 2 giai đoạn sau:
Giai đoạn 3a: Kéo dài
- Trong nhiều trường hợp, sự kéo dài là một yêu cầu cho sự tạo rễ đầy đủ.
- Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hoặc một cytokinin yếu hơn
cytokinin đã sử dụng trong giai đoạn 2.
- Có thể cần thiết thêm than hoạt tính để trung hòa hiệu quả cytokinin còn lại trong
giai đoạn 2.
Tùy thuộc vào kiểu cây, sự kéo dài có thể xảy ra trên các chồi đơn hoặc cụm chồi.
Giai đoạn 3b: Kích thích rễ và tiền thuần dưỡng
- Auxin thường được sử dụng để kích thích tạo rễ. Tạo rễ tốt nhất thường đạt trên
môi trường có hàm lượng khoáng thấp.
- Các rễ phát triển trong in vitro luôn luôn không thích nghi với điều kiện nhà lưới
và rễ quá dài sẽ gặp khó khăn khi trồng.
- Kích thích rễ có thể xảy ra trên chồi đơn hay cụm chồi.

7


* Giai đoạn 4: Sự thuần dưỡng
Đây là giai đoạn chuyển cây ra nhà ươm để chuẩn bị cây con sẵn sàng cung cấp cho
sản xuất. Chất lượng cuối cùng của kế hoạch in vitro tùy thuộc một phần vào việc
thuần dưỡng. Thông thường các rễ non được tạo ra trong ống nghiệm có một biểu bì
yếu ớt, nên khi đặt tiếp xúc với chất nền trong nhà ươm, chúng trở nên khô héo

nhanh chóng và chết (Lâm Ngọc Phương, 2009). Vì vậy, mục đích của giai đoạn
này là làm giảm tối thiểu chết cây con, khi chuyển từ in vitro sang nhà lưới hoặc
điều kiện ngoài đồng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
1.2.4 Thành phần môi trường
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), một trong những yếu tố
quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực
vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi
cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng
một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng
sẽ thay đổi. Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy. Tuy
nhiên, tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm các thành phần như: nước,
khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, nguồn carbohydrate, vitamin, chất điều hòa sinh
trưởng thực vật.
Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino
acid, EDTA,…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch
chiết nấm men… nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy
(Vũ Văn Vụ, 1999).
1.2.4.1 Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong nuôi
cấy mô thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp người ta cũng sử dụng
nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
1.2.4.2 Khoáng đa lượng
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), nhu cầu khoáng của mô, tế
bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên.
Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là nitrogen, potassium, magnesium,
calcium,…
Nitrogen (N)
Mô, tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium
và nitrate, đồng thời cũng sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid.


8


Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc
NH4NO3. Ammonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3 (Nguyễn
Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Theo Vũ Văn Vụ và ctv. (2006), trong môi
trường MS (Murashige và Skoog, 1962), amon được cung cấp ở dạng muối
NH4NO3, còn môi trường B5 của Gamborg có amon ở dạng muối (NH4)2SO4.
Phosphorus (P)
Phosphorus thường được đưa vào môi trường ở dạng muối phosphate và hai loại
hợp chất thường được dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4. Hàm lượng phosphorus
trong môi trường nuôi cấy dao động 0,15-0,40 mM (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
Potassium (K)
Potassium là thành phần xúc tác của nhiều enzym và được mô cây hấp thu ở dạng
ion K+ (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Kali được cung cấp cho môi trường nuôi cấy
dưới dạng KNO3, KCl và KH2PO4. Nồng độ kali trong môi trường nuôi cấy thay đổi
2-25 mM (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
Magnesium (Mg)
Magnesium là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố. Môi trường nuôi
cấy mô thực vật thường chứa Mg với nồng độ không thay đổi nhiều (trung bình 6,8
mM hoặc 5,3 mM). Thường MgSO4 là nguồn duy nhất bổ sung nguồn ion Mg2+ cho
mô nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
1.2.4.3 Khoáng vi lượng
Theo Vũ Văn Vụ và ctv. (2006), yêu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật
trong nuôi cấy khá phức tạp và ít được nghiên cứu. Tuy nhiên, trong nhiều loại môi
trường cơ bản đã được xây dựng, các tác giả đều cung cấp cho môi trường hầu hết
các nguyên tố vi lượng cần thiết nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của
mẫu nuôi cấy. Sau đây là một số khoáng vi lượng thông dụng cung cấp cho mô thực
vật:
Mangan (Mn)

Mangan là một trong những nguyên tố vi lượng quan trọng trong môi trường nuôi
cấy, là thành phần trong quang phân ly nước và cũng là thành phần hoạt hóa cho
nhiều enzym. Mô cây hấp thu mangan ở dạng Mn2+ (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), trong nuôi cấy mô, sự vắng
mặt của Mn2+ trong môi trường làm giảm sự khởi tạo chồi trên mẫu cấy tử diệp xà
lách.

9


Sắt (Fe)
Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2005), sắt là nguyên tố cần thiết bởi vì nó
đóng vai trò then chốt của hệ thống enzym. Sắt không là thành phần của diệp lục tố
nhưng nó rất cần cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố. Thiếu sắt, cây sẽ thiếu diệp lục
tố. Theo Vũ Văn Vụ và ctv. (2006), sắt là nguyên tố vi lượng được đưa vào môi
trường ở dạng muối FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3… nhưng chúng sẽ bị kết tủa và mẫu
nuôi cấy rất khó hấp thụ các loại muối này. Do đó, phải cho thêm vào môi trường
nuôi cấy Na2EDTA (Sodium ethylene diamine tetraacetate), để tạo ra muối phức
NaFeEDTA (dạng chelate) có chứa cả Na, Fe và được mô nuôi cấy hấp thụ dễ dàng.
1.2.4.4 Nguồn carbohydrate
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng
nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn chất hữu cơ là điều bắt
buộc. Đường không chỉ điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường mà còn là nguồn
carbohydrate tốt nhất cung cấp cho mô và tế bào. Nhưng khi hàm lượng chất hữu cơ
quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của mô cây (Lâm Ngọc Phương, 2009).
Hai dạng đường thường gặp nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và
sucrose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Một số loài thực vật
tăng trưởng tốt trong môi trường có sucrose được hấp tiệt trùng so với môi trường
có sucrose được lọc vô trùng và người ta cho rằng khi tế bào được nuôi trong môi
trường có sucrose được hấp tiệt trùng thì nó được cung cấp vừa sucrose vừa glucose

(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
1.2.4.5 Vitamin
Vitamin được sử dụng như là coenzym và được sử dụng một lượng rất nhỏ (mg/l)
(Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002),
các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin,
nicotinic acid, pyridoxin.
- Thiamine (B1) là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế
bào. Thiamin thường được sử dụng với nồng độ 0,1-10 mg/l.
- Nicotinic acid (B3, PP, niacin) tham gia tạo coenzym của chuỗi hô hấp, hàm lượng
sử dụng 0,1-5,0 mg/l.
- Pyridoxin (B6) là một coenzym quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất, sử
dụng 0,1-1,0 mg/l (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).

10


1.2.4.6 Agar
Agar (thạch) là sản phẩm tự nhiên được trích từ tảo. Nó là một polysaccharide
(Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Agar được dùng để chuẩn bị môi trường đặc. Agar tan ở
100oC và đông đặc ở 45oC. Trong môi trường acid, agar không thể đông đặc. Nồng
độ thường dùng từ 0,6% đến 0,7% tùy theo loại agar (Nguyễn Đức Thành, 2000).
1.2.4.7 Nước dừa
Nước dừa là nội nhũ lỏng cung cấp các chất dinh dưỡng nuôi phôi dừa. Trong nuôi
cấy mô và tế bào thực vật thường sử dụng nước từ quả bánh tẻ và quả già. Thành
phần của nước dừa khá phong phú nhưng có chứa inositol và các chất thuộc nhóm
cytokinin như zeatin… Các thành phần này có hàm lượng thay đổi, khác nhau giữa
quả non, quả già, thậm chí khác nhau giữa những quả cùng độ tuổi. Vì nước dừa là
một thành phần phức hợp không xác định. Hàm lượng sử dụng của nước dừa 1020% (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
1.2.4.8 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi

cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu
quả tác động của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, hoạt
tính vốn có của chất điều hòa sinh trưởng và mẫu nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và ctv.,
2006). Có hai nhóm chất được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin (Vũ Văn Vụ,
1999).
Auxin
Auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích hình thành rễ, thúc đẩy
sự sinh trưởng và giản nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao
đổi chất (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
Theo Vũ Văn Vụ (1999), các auxin đều có hiệu quả ở nồng độ thấp, phạm vi sử
dụng từ 0,1-1,0 mg/l tùy theo mục đích và vật liệu nuôi cấy. Hàm lượng auxin thấp
sẽ kích hoạt sự phân hóa rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ phát động sự tạo mô sẹo
(callus). Trong một vài trường hợp, bản thân mẫu nuôi cấy tạo ra đủ lượng auxin
cho nhu cầu của chúng và không cần đến auxin ngoại sinh. Ngoài ra, auxin cũng ức
chế tạo rễ ở nồng độ cao (Nguyễn Minh Chơn, 2010).
Theo Vũ Văn Vụ (1999), những chất thuộc nhóm auxin hay dùng là indol-3-butyric
axid (IBA),  -naphthalene acetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) và 2,4dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D). 2,4-D sử dụng rất có hiệu quả trong việc tạo
mô sẹo ở nhiều loài thực vật, nó không được dùng trong môi trường tái sinh cơ
quan. IBA và NAA dùng cho quá trình tạo rễ ở đa số các loài cây. Theo Nguyễn

11


Minh Chơn (2010), các chất tổng hợp như IBA và NAA đã cho hiệu quả kích thích
tạo rễ hơn cả IAA. Hơn nữa, IAA do kém bền nhiệt nên ít được sử dụng (Vũ Văn
Vụ, 1999).
Cytokinin
Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, nó kích thích sự phân chia tế
bào. Cytokinin có nhiều nhất trong miền phân sinh và vùng tế bào phát triển liên tục
bao gồm rễ, lá non, trái đang phát triển và hạt (Nguyễn Minh Chơn, 2010). Theo Lê

Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2005), người ta cũng phát hiện nồng độ cytokinin
cao xuất hiện vào mùa xuân trong nhựa cây. Đỉnh rễ là vị trí chính yếu của sự tạo
hormone ở những cây con. Từ đó nó được vận chuyển trong mô mạch đến thân
chồi.
Theo Vũ Văn Vụ (1999), cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ
hóa của các cơ quan làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi
từ mô sẹo nuôi cấy… Các cytokinin thường dùng trong nuôi cấy bao gồm: 6-(4hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino)purine (zeatin), 6-furfurylamino purine (kinetin),
6-bezyl amino purine (BAP), benzyl adenine (BA), thidiazuron (TDZ), isopentenyl
adenine (2-ip).
Hàm lượng sử dụng của các loại cytokinin dao động từ 0,1-2,0 mg/l. Ở những nồng
độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định,
đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại cytokinin nói
trên, kinetin và BA là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả. BA là cytokinin tổng
hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin. Kinetin và BA cùng có tác dụng
kích thích sự phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và
làm hạn chế sự hóa già của tế bào cũng như có tác dụng lên quá trình trao đổi chất,
quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số
enzym (Nguyễn Đức Thành, 2000).
1.2.4.9 Giá trị pH
pH môi trường được điều chỉnh trước khi hấp tiệt trùng, nhiệt độ cao sẽ làm tăng
tính acid của môi trường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Trong
quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống, do một số mẫu thực vật
sản sinh ra các acid hữu cơ (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). pH thường được điều chỉnh
trong khoảng 5,5 và 6 trước khi hấp khử trùng. pH quyết định sự hòa tan của
khoáng trong môi trường. pH còn ảnh hưởng sự hấp thu khoáng trong môi trường
và ảnh hưởng trên sự tạo gel của agar khi hấp khử trùng. pH thấp (<4,5) môi trường
có agar rất khó tạo gel (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).

12