TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ NHƯ THƠ

VI NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG
GIÁ THÀNH THẤP
(Zingiber officinale Rosc.)

Luận văn tốt nghiệp Đại học
Ngành: NÔNG HỌC

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Đại học
Ngành: NÔNG HỌC

VI NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG
GIÁ THÀNH THẤP
(Zingiber officinale Rosc.)

Giảng viên hướng dẫn:
TS. Lê Văn Bé

Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Thị Như Thơ
MSSV: 3073203

Lớp: Nông học K33

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Chứng nhận luận văn tốt nghiệp với đề tài: “VI NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG
(ZINGIBER OFFICINALE Rosc.)”. Do sinh viên NGUYỄN THỊ NHƯ THƠ thực
hiện và đề nạp.
Kính trình Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày…..tháng ….. năm 2011.

TS. Lê Văn Bé

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp kèm theo với đề tài: “VI NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG
(ZINGIBER OFFICINALE Rosc.)”, do sinh viên Nguyễn Thị Như Thơ thực hiện
và bảo vệ trước Hội Đồng chấm luận văn tốt nghiệp và đã được thông qua.
Luận văn tốt nghiệp được Hội đồng đánh giá ở mức: ..................................................
Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp: ..........................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................

......................................................................................................................................
......................................................................................................................................

Duyệt Khoa

Cần Thơ, ngày…..tháng ..…năm 2011.

Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Chủ tịch Hội đồng

ii


TIỂU SỬ CÁ NHÂN
Họ và tên: Nguyễn Thị Như Thơ
Ngày sinh: 05/09/1988
Địa chỉ: Ấp Ô Tre Nhỏ, xã Thanh Mỹ, huyện Châu Thành, tỉnh Trà Vinh.
Họ và tên cha: Nguyễn Thế Phong
Họ và tên mẹ: Bùi Thị Út Lớn
Quá trình học tập:
v 1994 – 1999: Trường Tiểu học Mỹ Chánh A.
v 1999 – 2003: Trường Cấp II, III Châu Thành.
v 2003 – 2006: Trường Trung Học Phổ Thông Châu Thành.
v 2007 – 2011: Trường Đại Học Cần Thơ. Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng. Ngành Nông Học. Khóa 33.

Cần Thơ, ngày ….. tháng …..năm 2011

NGUYỄN THỊ NHƯ THƠ


iii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Tất cả các số liệu, kết
quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố
ở bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

NGUYỄN THỊ NHƯ THƠ

iv


LỜI CẢM ƠN
Kính dâng!
Cha mẹ đã cho con những gì tốt đẹp nhất.
Xin tỏ lòng tri ân sâu sắc!
Thầy Lê Văn Bé, Cô Lê Thị Điểu, anh Nguyễn Văn Kha, chị Lê Thanh
Giang đã tận tình hướng dẫn, và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt
quá trình thực hiện đề tài.
Thầy cố vấn học tập Nguyễn Phước Đằng, Quý Thầy Cô Khoa Nông nghiệp
và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy, truyền đạt
những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt khóa học.
Chân thành cảm ơn!
Các anh chị khóa trước, lớp Nông học K33, các bạn: Thành Nhân, An Suyên,
Phương Thư cùng các em lớp Nông học K34….đã nhiệt tình giúp đỡ, luôn gắn bó,

động viên, chia sẻ những khó khăn cũng như vui, buồn trong suốt quá trình học tập
và làm luận văn.
Thân gửi đến mọi người lời chúc sức khỏe và thành công trong cuộc sống!
NGUYỄN THỊ NHƯ THƠ

v


NGUYỄN THỊ NHƯ THƠ. 2011. “VI NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG (Zingiber
officinale Rosc.)”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Nông học. Khoa Nông Nghiệp &
Sinh học ứng dụng – Đại học Cần Thơ. 30 trang. Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ
VĂN BÉ

TÓM LƯỢC
Cây gừng là một trong những cây gia vị được sử dụng rất nhiều làm dược liệu trong y
học cổ truyền cũng như nguyên dược liệu trong ngành công nghiệp dược. Hiện nay nhu
cầu sử dụng cây gừng rất cao. Việc trồng gừng bằng phương pháp truyền thống còn gặp
nhiều hạn chế trong khi nhân giống gừng bằng phương pháp cấy mô có thể khắc phục
những hạn chế này. Tuy nhiên giá thành của cây cấy mô lại cao vì vậy việc giảm giá
thành cây cấy mô là cần thiết. Giai đoạn vi nhân chồi và ra rễ chồi gừng in vitro được
thực hiện trong hai điều kiện môi trường ngoại cảnh khác nhau là phòng tăng trưởng có
ánh sáng nhiệt độ nhân tạo (1.000 – 2.000 lux, 27 ± 3oC) và ngoài phòng tăng trưởng
(lồng kiếng) với nguồn sáng, nhiệt độ tự nhiên (6.000 – 12.000 lux, 31 ± 3oC). Kết quả
cho thấy nghiệm thức có bổ sung BA ở liều lượng 2 mg/lít + 20% nước dừa là thích hợp
cho nhân chồi gừng in vitro. Sau 8 tuần nuôi cấy từ một chồi ban đầu cho ra khoảng 3,3
chồi. Môi trường MS có bổ sung 20% nước dừa + 0,5 mgNAA/lít là thích hợp cho rễ chồi
gừng in vitro, trung bình 16 rễ/cụm chồi. Các chồi được nuôi cấy trong lồng kính không
những sinh trưởng tốt hơn mà còn giảm được 23% chi phí sản xuất từ chi phí điện.
Từ khóa: Vi nhân giống cây gừng, giảm chi phí


vi


MỤC LỤC
Trang
TÓM LƯỢC .............................................................................................................. vi
MỤC LỤC ................................................................................................................ vii
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT................................................................................... ix
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. x
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. xi
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 2
1.1. Sơ lược về cây gừng ........................................................................................ 2
1.1.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 2
1.1.2. Phân bố ..................................................................................................... 2
1.1.3. Hoạt tính và tác dụng dược lý của gừng: ................................................. 2
1.2. Sơ lược về vi nhân giống ................................................................................. 3
1.2.1. Các giai đoạn của vi nhân giống .............................................................. 3
1.2.2. Ưu và khuyết điểm của phương pháp vi nhân giống ................................ 5
1.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng đến quá trình vi nhân giống.......... 6
1.3. Một số nghiên cứu sử dụng ánh sáng tự nhiên để vi nhân giống .................... 7
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................ 8
2.1. Phương tiện ...................................................................................................... 8
2.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................ 8
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 8
2.1.3. Điều kiện môi trường ngoại cảnh nuôi cấy .............................................. 8
2.2. Phương pháp ...................................................................................................... 10
vii



2.2.1. Giai đoạn tạo mẫu ban đầu .................................................................... 10
2.2.2. Giai đoạn bố trí thí nghiệm .................................................................... 11
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA và điều kiện nuôi cấy
đến quá trình nhân chồi cây gừng in vitro ................................................... 11
2.2.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và điều kiện nuôi cấy
đến quá trình tạo rễ của chồi gừng in vitro.................................................. 12
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................... 13
3.1. Ghi nhận tổng quát ........................................................................................ 13
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BA và điều kiện nuôi cấy đến quá trình nhân chồi
gừng in vitro ......................................................................................................... 13
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA và điều kiện nuôi cấy đến sự tạo rễ in vitro cây
gừng ...................................................................................................................... 18
3.4. Thảo luận hiệu quả sử dụng ánh sáng lồng kiếng đến vi nhân giống .................. 20
3.5. Ước tính chi phí sản xuất chồi gừng cấy mô ................................................. 20
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 24
4.1. Kết luận .......................................................................................................... 24
4.2. Đề nghị........................................................................................................... 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 25
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

BA

benzyladenin

NAA


naphthalene acetic acid

IBA

indole-3-butyric acid

IAA

indole acetic acid

HgCl2

Clorua thủy ngân

MS

môi trường Murashige & Skoog (1962)

ANOVA

Analysis of variance

ĐBSCL

đồng bằng sông Cửu Long

CHĐHST

chất điều hòa sinh trưởng


ix


DANH SÁCH BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Ảnh hưởng của liều lượng BA và điều kiện nuôi cấy đến sự
tạo chồi gừng sau 8 tuần nuôi cấy

3.2

Ảnh hưởng của liều lượng BA và điều kiện nuôi cấy đến số lá
15
trung bình của chồi gừng sau 8 tuần nuôi cấy

3.3

Ảnh hưởng của liều lượng BA và điều kiện nuôi cấy đến
chiều cao của chồi gừng sau 8 tuần nuôi cấy

16


3.4

Ảnh hưởng của liều lượng BA và điều kiện nuôi cấy đến
trọng lượng trung bình của chồi gừng sau 8 tuần nuôi cấy

17

3.5

Ảnh hưởng của liều lượng NAA và điều kiện nuôi cấy đến số
rễ/cụm chồi cây gừng in vitro sau 6 tuần nuôi cấy

19

3.6

Ảnh hưởng của liều lượng NAA và điều kiện nuôi cấy đến
chiều dài rễ cây gừng in vitro sau 6 tuần nuôi cấy

20

3.7

Ước tính giá thành sản xuất một cây gừng cấy mô

24
25

x


14


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

2.1

Phòng tăng trưởng

9

2.2

Lồng kính

9

2.3

Mầm chồi từ củ gừng giống xuất hiện sau khi ươm 1 tháng

10

3.1


Chồi gừng mới vô mẫu và chồi gừng hình thành sau 8 tuần

13

3.2

Chồi gừng cấy mô 8 tuần sau khi cấy

15

3.3

Chồi gừng 8 tuần sau khi cấy ứng với các mức nồng độ BA khác
nhau

17

3.4

Chồi gừng ra rễ sau 6 tuần nuôi cấy

19

xi


MỞ ĐẦU
Cây gừng (Zingiber offcinale Rosc.) là một trong những cây gia vị được biết đến
sớm nhất ở Phương Đông và được sử dụng rất nhiều làm dược liệu trong y học cổ

truyền (Datta và Biswas, 1985; Ramachandran và Chandrasekharan, 1992; Đỗ Tất
Lợi, 2003). Ngoài ra hiện nay củ gừng còn được sử dụng dạng thô để làm hương
liệu cho ngành sản xuất nước giải khát và công nghiệp dược (Jamil et al., 2007).
Nhu cầu sử dụng củ gừng để làm thực phẩm hàng ngày và nguyên dược liệu trong y
học là rất lớn. Chính vì thế, trong những năm gần đây cây gừng trở thành cây có giá
trị kinh tế cao.
Theo một số thông tin gần đây cho biết diện tích trồng cây gừng ở đồng bằng sông
Cửu Long (ĐBSCL) tăng lên rất nhanh, nhưng nguồn giồng chủ yếu để cung cấp
cho sản xuất là củ. Theo Jamil et al., (2007) cho rằng, phương pháp nhân giống
truyền thống cây gừng từ củ có hệ số nhân giống thấp và củ giống không đủ chất
lượng do tích lũy nhiều mầm bệnh gây hại quan trọng như nấm, vi khuẩn và tuyến
trùng gây thối củ là nguyên nhân dẫn đến hiện tượng cây giống bị thoái hóa. Hiện
nay,áp dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật đóng vai trò rất quan trọng trong công
tác nhân giống và phục tráng giống trồng trong nông nghiệp. Nuôi cấy mô hay nuôi
cấy tế bào thực vật có nhiều ưu điểm mà các phương pháp nhân giống truyền thống
khác không có được như có hệ số nhân giống cao trong một thời gian ngắn, cây con
vẫn giữ được những đặc tính tốt của cây mẹ, sạch bệnh và độ đồng đều của cây con
cao. Tuy nhiên, khuyết điểm của phương pháp này là giá thành để tạo ra cây con
khá cao do tiêu tốn điện năng để cung cấp ánh sáng và máy điều hòa nhiệt độ cho
phòng nuôi cấy cao. Hiện nay, có nhiều nghiên cứu đã ứng dụng ánh sáng tự nhiên
thay cho ánh sáng nhân tạo để vi nhân giống nhiều loại cây trồng trong nông nghiệp
và giảm được giá thành sản xuất như cây khóm (Be và Debergh, 2006); cây Chuối
(Kodym và Arias, 2001; Lê Phương Thư, 2011); cây Nghệ Đen (Trần Thị Mỹ
Khuê, 2010); cây Cúc (Tống Hồ Nam, 2010), cây môn kiểng (Nguyễn Thị Huyền
Trang, 2011)...
Hiện nay vẫn chưa có bất kỳ một công trình nghiên cứu nào sử dụng ánh sáng tự
nhiên trong vi nhân giống cây gừng nhằm làm giảm chi phí sản xuất để có thể cung
cấp cho thực tế sản xuất. Chính vì thế đề tài đề tài “Vi nhân giống cây gừng
(Zingiber officinale Rosc.)” được thực hiện để đáp ứng mục tiêu trên.


1


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về cây gừng
Gừng còn gọi là khương, có tên khoa học là Zingiber offcinale Rosc. thuộc họ Gừng
(Zingiberaceae). Bộ phận dùng là thân rễ, thường gọi là củ (Võ Văn Chi, 2000).
1.1.1. Đặc điểm hình thái
Gừng là loại cây nhỏ, sống lâu năm, cao khoảng 0,6 – 1 m. Thân rễ mẫn lên thành
củ, lâu dần thành xơ. Lá mọc so le, không cuống, có bẹ, hình mác dài 15 – 20 cm,
rộng chừng 2 cm, mặt bóng nhẵn, gân giữa hơi trắng nhạt, vò có mùi thơm. Trục
hoa xuất phát từ gốc, dài tới 20 cm, cụm hoa thành bông mọc sít nhau, hoa dài 5
cm, rộng 2 – 3 cm, lá bắc hình trứng,dài 2,5cm, mép lưng màu vàng, đài hoa dài
khoảng 1 cm, có 3 răng ngắn, 3 cành hoa dài khoảng 2 cm, màu vàng xanh, mép
cánh hoa màu tím, nhị cũng tím. Loài gừng trồng rất ít khi ra hoa (Đỗ Tất Lợi,
2003).
1.1.2. Phân bố
Chi Zingiber Boehmer ở châu Á có khoảng 45 loài, trong đó Việt Nam 11 loài.
Gừng là loại cây gia vị cổ điển được trồng ở nhiều nước trong vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới, từ Đông Á đến Đông Nam Á và Nam Á. Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản
là những nước trồng nhiều gừng nhất thế giới. Ở Việt Nam, gừng được trồng từ thế
kỷ thứ II trước Công nguyên. Hiện nay, cây được trồng ở khắp các địa phương, từ
vùng núi cao đến đồng bằng và ngoài các hải đảo. Gừng thích hợp ở vùng khí hậu
nóng ẩm (Đỗ Huy Bích et al., 2004).
1.1.3. Hoạt tính và tác dụng dược lý của gừng:
Trong củ gừng có chứa từ 2-3% tinh dầu. Ngoài ra còn có chất nhựa dầu khoảng
5%, chất béo (3,7%), tinh bột và các chất cay (zingeron, zingerola, và shogaola) (Đỗ
Tất Lợi, 2003).
Theo Đỗ Huy Bích et al. (2004) tinh dầu với các thành phần chủ yếu là hợp chất

hydrocarbon sesquiterpenic: β-zingiberen (35%), ar-curcumenen (17%), β-farnesen
(10%) và một lượng nhỏ các hợp chất alcol monoterpenic như geraniol, linalol,
borneol. Ngoài ra, trong tinh dầu gừng còn chứa α-camphen, β-phelvàren,
eucalyptol và các gingerol.

2


Củ gừng vừa là gia vị vừa là thuốc chữa bệnh. Y học dân tộc sử dụng gừng dưới
những dạng chế biến khác nhau với tính vị và tác dụng khác nhau. Gừng tươi (sinh
khương) vị cay, tính hơi ấm, vào phế, tỳ, vị có tác dụng phát tán, nhẹ khí, khai
khiếu và tiêu trệ, ôn trung, thường dùng làm thuốc giúp tiêu hóa, trạng thái kém ăn,
ăn uống không tiêu, cảm lạnh, nôn mửa, ho có đờm,… Dùng ngoài, đem gừng giã
nhỏ đắp vào chỗ tụ huyết, đau ngực thâm tím (Võ Văn Chi, 2005).
Theo Đỗ Huy Bích et al. (2004) gừng có tác dụng:
Ức chế thần kinh trung ương, làm giảm vận động tự nhiên và tăng thời gian gây ngủ
của thuốc barbituric. Sử dụng gừng tươi có tác dụng kích thích tiết nước bọt.
Cao chiết gừng khô, gingerol và shogaol có tác dụng chống co thắt, giảm đau, giảm
ho, kích ứng da mạnh, gây ban đỏ nhưng không gây phồng giộp da, nên gừng có thể
dùng làm thuốc gây sung huyết da.
Cineol trong gừng có tác dụng kích thích khi sử dụng tại chỗ và diệt khuẩn trên
nhiều vi khuẩn.
Zingiberen và 6-gingerol là những thành phần quan trọng trong những thuốc làm dễ
tiêu có gừng.
1.2. Sơ lược về vi nhân giống
1.2.1. Các giai đoạn của vi nhân giống
Sự thành công của vi nhân giống chỉ đạt được khi hoàn thành 5 giai đoạn:
Giai đoạn 0: chuẩn bị cây mẹ
Theo Debergh và Zimmerman (1991), giai đoạn này góp phần rất lớn vào sự thành
công của các giai đoạn sau. Do đó, cây mẹ cần phải sạch bệnh và đang ở trong giai

đoạn tăng trưởng mạnh thì khi nhân giống sẽ đạt hiệu quả cao.
Giai đoạn 1: khử trùng, tạo chồi mô nuôi cấy
Mục đích giai đoạn này là mẫu cấy sống và không bị nhiễm. Thông thường tỷ lệ
mẫu sạch còn sống sau mỗi đợt khử trùng rất biến động, rất khó đạt mức cao. Trong
sản xuất để sớm có hàng loạt cây giống đưa ra cần rất nhiều vật liệu đưa vào khử
trùng (Debegh và Zimmerman, 1991).
Thông thường một đợt khử trùng mẫu cấy được chuyển vào môi trường trong cùng
một thời gian. Sau một thời gian nuôi cấy, bất kỳ mẫu nào bị phát hiện nhiễm vi
sinh vật đều bị loại bỏ. Giai đoạn này được xem là thành công nếu có đủ số lượng
mẫu sống sót và phát triển mà không hề nhiễm vi sinh vật (George, 1993).
Giai đoạn 2: nhân chồi

3


Số lượng cây sẽ được nhân nhanh thông qua số lần cấy chuyền sang môi trường mới
(Debergh và Read, 1991; Altman, 2000).Toàn bộ quá trình vi nhân giống nhằm mục
đích tạo ra hệ số nhân cao nhất, chính vì thế đây là giai đoạn then chốt của quá
trình.
Để tăng hệ số nhân, ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo
các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…) các chất bổ sung
khác như: nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thủy phân casein,… kết hợp với các
yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta
có thể nhân nhanh số lượng từ sự kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh
sinh trưởng, chồi chính, chồi bên hoặc tái sinh phôi vô tính từ các bộ phận không
chứa đỉnh sinh trưởng. Phương pháp để gia tăng số chồi ở giai đoạn 2 là cấy chồi
đỉnh hoặc chồi bên (cấy đoạn thân).
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là kích thích sự tái sinh chồi từ các mầm
ngủ. Mầm ngủ thực chất có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng thân. Do tính ưu
thế chồi ngọn, các chồi bên ở trạng thái miên trạng và không phát triển. Do đó, khi

các chồi bên được xử lý với chất điều hòa sinh trưởng sẽ phá vỡ miên trạng và phát
triển thành những chồi có đầy đủ như than chính. Các chồi có thể được tách ra, đưa
vào môi trường tạo rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh hay sử dụng cho quá trình nhân
giống trở lại (Oluf và Gregory, 1995).
Giai đoạn 3: Debergh và Manene (1981) đã chia giai đoạn này thành hai giai đoạn
nhỏ:
+ Giai đoạn 3a: Kéo dài các mầm chồi đã hình thành trong giai đoạn 2 đến một
kích thướt phù hợp cho giai đoạn 3b.
+ Giai đoạn 3b: Ra rễ cho những chồi ở giai đoạn 3a trong điều kiện in vitro
hoặc extra vitrum.
Giai đoạn này giúp cây con phát triển hoàn chỉnh trước khi chuyển ra điều kiện bên
ngoài (Debergh và Read, 1991; Altman, 2000).
Khi cây đạt kích thước nhất định, các chồi được chuyển sang môi trường tạo rễ.
Thường sau 2-3 tuần từ những chồi riêng biệt sẽ hình thành rễ và trở thành cây hoàn
chỉnh. Giai đoạn này sử dụng chủ yếu các auxin là nhóm hormone thực vật quan
trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA,
NAA được sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi in vitro.
Giai đoạn 4: thuần dưỡng
Mục đích của giai đoạn này là giảm tối thiểu sự chết cây con, khi chuyển từ in vitro
sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng. Trong suốt tiến trình này cây con phải
4


thích nghi với điều kiện môi trường mới như ẩm độ tương đối thấp, cường độ ánh
sáng cao, những biến động về nhiệt độ và các tác nhân gây bệnh (Preece và Sutter,
1991). Chất lượng cây con trong giai đoạn in vitro là một trong những nhân tố quan
trọng nhất quyết định tỷ lệ thành công trong suốt quá trình thuần dưỡng
(Huylenbroeck và Debergh, 1996). Để tăng khả năng sống của cây con ngoài nhà
lưới thì cây con nhất thiết phải trãi qua thời gian tập quen dần với điều kiện gần
giống như bên ngoài như tăng dần ánh sáng, nhiệt độ (Debergh và Zimmerman,

1991).
1.2.2. Ưu và khuyết điểm của phương pháp vi nhân giống
* Ưu điểm (George, 1993)
− Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo. Có thể tạo
được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo do nhân giống in
vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô.
− Sự tăng truởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn
những cây nhân giống vô tính in vivo vì những cây này đã được trẻ hóa và
sạch bệnh.
− Việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh do có sự chọn
lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa vào nuôi cấy đồng thời cũng có thể xử lý
mẫu cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi
cấy. Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho
nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng.
− Việc nhân giống in vitro giúp làm giảm không gian sử dụng so với nhân
giống in vivo và giảm các chi phí về năng lượng đối với các trường hợp các
loại cây cần được nhân giống trong nhà kính. Do cây in vitro được nuôi cấy
trong điều kiện hoàn toàn thích hợp nên có thể sản xuất cây con quanh năm
− Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây đầu dòng cho các bước
nhân giống kế tiếp, có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy.
Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ngân hàng gen.
Các tế bào trần và tế bào huyền phù là những đối tượng hữu dụng trong việc
lai soma.
− Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây
bất dục đực, cây bất thụ do đột biến,… có thể được duy trì và nhân giống
bằng phương pháp nhân giống in vitro.
* Khuyết điểm
Theo George (1993) thì bất lợi chủ yếu của phương pháp vi nhân giống là cần phải
có kỹ năng vận hành thành công, đòi hỏi kỹ thuật cao, trang thiết bị đắt tiền. Hơn
nữa kết quả nhân giống in vitro thường:

5


− Cây con ban đầu còn nhỏ và đôi khi mang những tính trạng không tốt.
− Để sống trong điều kiện in vitro, mẫu cấy cần được nuôi trong môi trường
chứa đường và một số nguồn carbon khác. Ban đầu chúng không có khả
năng tạo ra những hợp chất cần thiết hay những hợp chất hữu cơ từ quang
hợp (không thể tự dưỡng) và chúng phải chịu đựng một thời gian chuyển đổi
trước khi có khả năng phát triển độc lập.
− Khi cây con được nuôi trong bình chứa bằng thủy tinh hay nhựa có ẩm độ
tương đối cao, thường sự quang hợp tổng không đủ, cây con thường mẫn
cảm, mất nhiều nước khi đưa ra môi trường bên ngoài.
− Khả năng tạo ra những cây trồng bị biến dạng di truyền có thể tăng.
− Đòi hỏi kỹ thuật cao và các trang thiết bị đắc tiền.
1.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng đến quá trình vi nhân giống
Ánh sáng
Ánh sáng là nhân tố môi trường quan trọng kiểm soát sự sinh trưởng và phát triển
của thực vật, vì nó liên quan đến quang hợp, sự quang dưỡng và sự phát sinh hình
thái (Salisbury và Ross, 1994; Read và Preece, 2003). Theo George (1993), hầu hết
cây trồng đều cần ánh sáng kích thích để khởi đầu sự phân hóa của lục lạp và thành
lập diệp lục tố, có thể là cả một vài hệ thống sắc tố. Các đặc tính của ánh sáng ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng in vitro là: độ dài sóng, cường độ sáng và thời gian chiếu
sáng hay chu kỳ sáng. Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004), cường độ ánh sáng thích hợp
là khoảng 30 µmol.m-2.s-1.
Ánh sáng còn ảnh hưởng đến sự thành lập chồi và rễ trong ống nghiệm. Tùy theo
loài mà yêu cầu cường độ sáng khác nhau trong giai đoạn nhân chồi. Theo
Haramaki (1971), cây Gloxinia tạo chồi ở cường độ sáng khoảng 3.200 lux, nhưng
khi tăng cường độ ánh sáng lên 10.700 lux thì sự sinh trưởng của chồi bị giới hạn.
Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng ánh sáng làm tăng sự thành lập rễ và sự sinh
trưởng của chồi (Cabeleiro và Economou, 1992; Cui et al., 2000; Lian et al., 2002;

Kumar et al., 2003).
Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng khác nhau lên tiến trình sinh lý như hô hấp và quang hợp.
Từ lâu người ta đã biết nó ảnh hưởng rất lớn đến nuôi cấy mô thực vật và vi nhân
giống (Altman, 2000; Read và Preece, 2003). Về mặt thực hành có thể tối ưu hóa
nhiệt độ cho mỗi loài và mỗi giai đoạn sinh trưởng. Nhiệt độ chung cho tất cả các
phòng thường được điều chỉnh 22 ± 2oC (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
6


1.3. Một số nghiên cứu sử dụng ánh sáng tự nhiên để vi nhân giống
Sản xuất khóm cấy mô (Ananas comosus (L.) Merr.)
Lê Văn Bé et al., (2006) đã sử dụng hai điều kiện môi trường nuôi cấy trong sản
xuất khóm cấy mô và có một số kết luận sau: trong quy trình nuôi cấy mô khóm,
giai đoạn nhân chồi và ra rễ có thể tiến hành trong điều kiện nhà lưới sử dụng nhiệt
độ và ánh sáng tự nhiên (6.000-8.000 lux, 30-31oC) thay cho điều kiện nhiệt độ và
ánh sáng trong phòng tăng trưởng (2.000 lux, 24oC). Do vậy, chi phí sản xuất ra cây
con giảm 18,78% do không phải chi cho khoảng tiền điện và trang thiết bị như của
điều kiện phòng tăng trưởng.
Vi nhân giống cỏ Vetiver (Vetiveria zizanioides L)
Qui trình vi nhân giống cỏ Vetiver sử dụng môi trường MS có bổ sung BA nồng độ
2-4 mg/l cho hiệu quả nhân giống tốt nhất, trung bình khoảng 8 chồi mới/chồi ban
đầu sau 6 tuần nuôi cấy. Giai đoạn nhân chồi và giai đoạn ra rễ in vitro có thể thực
hiện ngoài điều kiện môi trường tự nhiên của nhà lưới thay vì trong phòng tăng
trưởng. Không có sự khác biệt thống kê về sinh trưởng của cây giữa 2 điều kiện
ngoại cảnh nuôi cấy cỏ Vetiver và khả năng sống sót gần 100% sau 10 tuần đem ra
ngoài nhà lưới. Sử dụng môi trường tự nhiên để nhân giống bằng phương pháp cấy
mô so với cây được nhân trong phòng tăng trưởng được ước tính rẻ hơn khoảng
22% giá thành sản xuất (Lê Văn Bé et al., 2006).
Vi nhân giống cây hoa Cúc “Đài Loan” vàng (Chrysanthemum sp.).

Điều kiện nuôi cấy trong và ngoài phòng tăng trưởng không làm ảnh hưởng đến quá
trình vi nhân giống câu hoa Cúc. Tỷ lệ sống của cây con ở ngoài phòng tăng trưởng
khi đem ra thuần dưỡng cũng khá cao 84%, cao hơn trong phòng tăng trưởng 70%.
Sản xuất cây cúc cấy mô theo qui trình và sử dụng điều kiện ngoài phòng tăng
trưởng (lồng kiếng) thay cho phòng tăng trưởng, chi phí sản xuất giảm được 38%
(Tống Hồ Nam, 2010).
Một số nghiên cứu về vi nhân giống thuộc họ Zingiberaceae
Quá trình vi nhân giống cây nghệ Hồng Đào (Curcuma longa L. cv. ‘Hong Dao’),
và cây nghệ Đen (Curcuma zedoaria (Berg) Rosc.) cũng được tiến hành trong hai
điều kiện nuôi cấy hoàn toàn khác nhau (ánh sáng tự nhiên của lồng kiếng và ánh
sáng nhân tạo của phòng tăng trưởng). Các chỉ tiêu về sinh trưởng và phát triển của
chồi như số chồi/cụm, trọng lượng cụm chồi, chiều cao chồi trong lồng kiếng là cao
hơn có ý nghĩa thống kê so với chồi con nuôi trong phòng tăng trưởng. Hơn nữa tỷ
lệ sống sót của cây con cũng rất cao (100%) trong suốt thời gian thuần dưỡng nhà
lưới. Vi nhân chồi cây nghệ có thể thực hiện được trong lồng kiếng, chi phí sản xuất
sẽ giảm nếu áp dụng phương pháp này (Nguyễn Thị Tố Uyên, 2008). Tuy nhiên khi
sử dụng ánh sáng của lồng kiếng giúp giảm 28% chi phí sản xuất (Trần Mỹ Khuê,
2010).
7


CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. PHƯƠNG TIỆN
2.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
- Thời gian thực hiện: thí nghiệm được tiến hành từ tháng 11/2009 đến tháng
2/2011.
- Địa điểm: phòng nuôi cấy mô và nhà lưới bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Nông
Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng-Trường Đại Học Cần Thơ.
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm

- Nguồn giống: củ gừng giống được chọn từ xã Thanh Mỹ, huyện Châu Thành, tỉnh
Trà Vinh và sau đó được ươm tại vườn ươm của nhà lưới thuộc bộ môn Sinh lýSinh hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng-Trường Đại Học Cần Thơ.
- Thiết bị: Tủ cấy, tủ lạnh, máy điều hòa, máy đo pH, nồi khử trùng nhiệt ướt, bếp
điện, cân điện tử (LIBROR EB-3300HW), máy đo cường độ ánh sáng (L1-250
Light Meter), máy chụp ảnh, máy đo nhiệt độ và độ ẩm, keo thủy tinh (6x12 cm) có
nắp nhựa và các thiết bị khác của phòng thí nghiệm.
- Hóa chất:
Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), khoáng vi lượng, vitamin B1
(Thiamine), B6 (Pyridoxine), Fe-EDTA.
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 6-Benzyl adanine (BA), 1naphthaleneacetic acid (NAA).
Đường (sucrose), nước dừa, agar, nước cất.
Hóa chất khử trùng: xà phòng, nước rửa chén, dung dịch HgCl2 1%, cồn 70o,
Javel, chất kháng sinh (Oxytetracycline hydrochloride 55% + Streptomycin sulfate
35%).
2.1.3. Điều kiện môi trường ngoại cảnh nuôi cấy
* Phòng tăng trưởng: Phòng nuôi cấy mô chuẩn có diện tích 45 m2, có nhiệt độ 27
± 3oC, đèn néon cường độ chiếu sáng 30 µmol.m-2.s-1, thời gian chiếu sáng 12
giờ/ngày (Hình 2.1).
Ưu điểm:
+ Điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng luôn ổn định.
+ Thích hợp để nuôi cấy hầu hết các loại cây trồng.
+ Tỷ lệ nhiễm nấm và vi khuẩn thấp.
8


Khuyết điểm:
+ Đầu tư nhiều trang thiết bị
+ Tốn nhiều chi phí (máy điều hòa, đèn, điện)
+ Góp phần gây ô nhiễm môi trường.
* Lồng kiếng: Lồng kiếng sử dụng trong thí nghiệm có diện tích 10 m2, đặt tại nhà

lưới bộ môn Sinh lý-Sinh hóa được bao xung quanh bằng kiếng (Hình 2.2), sử dụng
hoàn toàn ánh sáng tự nhiên nhưng tránh ánh sáng trực tiếp gây ra hiệu ứng nhà
kính, nhiệt độ 31±3oC cường độ chiếu sáng dao động khoảng 40-100 µmol.m-2.s-1
Nguyên tắc hoạt động của lồng kiếng: Lồng kiếng được thiết kế gồm có 2 máy
quạt. Một cái quạt hút để lấy không khí từ ngoài vào, và một cái quạt đẩy không khí
ra ngoài để giảm hiệu ứng nhà kính. Không khí đi vào phải qua hai màng lọc bụi và
màng lọc ẩm. Màng lọc bụi để lọc bớt bụi bảo đảm không khí ít dơ bẩn. Màng lọc
ẩm có nhiệm vụ cung cấp ẩm độ làm mát không khí bên trong
Ưu điểm:
+ Tập cho cây con thích nghi dần với điều kiện ngoài đồng
+ Tiết kiệm chi phí sản xuất
+ Thân thiện với môi trường
+ Đơn giản, dễ thực hiện
Khuyết điểm:
+ Chỉ thích hợp với những loại cây có khả năng thích ứng ở nhiệt độ cao
+ Phụ thuộc vào ánh sáng mặt trời

Hình 2.1 Phòng tăng trưởng

Hình 2.2 Lồng kiếng

9


2.2. Phương pháp
2.2.1. Giai đoạn tạo mẫu ban đầu
Củ gừng giống được đặt trong giá thể trấu, phun nước ẩm để kích thích mầm chồi
xuất hiện. Các chồi con trên củ sẽ hình thành sau 1 tuần ươm (Hình 2.3). Những
chồi non trên củ được sử dụng để làm vật liệu tạo chồi ban đầu trong điều kiện in
vitro.


Hình 2.3. Mầm chồi từ củ gừng
giống xuất hiện sau khi
ươm 1 tháng

- Phương pháp khử trùng bề mặt mẫu cấy: Mầm chồi được cắt từ củ và rửa dưới
vòi nước chảy, sau đó ngâm và lắc nhẹ các chồi trong dung dịch nước rửa chén (2-3
giọt/100ml H2O) khoảng 1-2 phút, rửa sạch mẫu lại dưới vòi nước chảy. Tiếp tục
ngâm mẫu trong dung dịch Javel 20% 15 phút và sau đó rửa lại nhiều lần trước khi
ngâm trong dung dịch kháng sinh 0,2% trong 1 giờ 30 phút; và cuối cùng chuyển
mẫu vào dung dịch HgCl2 1% trong 20 phút. Các mẫu cấy được rửa sạch 3 lần với nước
cất vô trùng trước khi cấy.
Tách lấy phần đỉnh sinh trưởng của các chồi sau khi được khử trùng và cấy vào môi
trường cơ bản MS không có chất điều hòa sinh trưởng. Tất cả các mẫu cấy được đặt
trong phòng tăng trưởng nhiệt độ 24±2oC, cường độ chiếu sáng 30µmol.m-2.s-, thời
gian chiếu sáng 12 giờ/ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: quan sát và ghi nhận tỷ lệ mẫu bị nhiễm hoặc chết ở thời điểm 4
tuần sau khi cấy.
Chồi mới sẽ hình thành sau 4 tuần cấy nếu mẫu khi bị nhiễm hoặc chết. Các chồi
này được chuyển sang môi trường MS + 1 mgBA/lít để tạo nguồn chồi làm vật liệu
bố trí các thí nghiệm sau.

10


2.2.2. Giai đoạn bố trí thí nghiệm
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của liều lượng BA và điều kiện nuôi cấy đến
quá trình nhân chồi cây gừng in vitro
Mục tiêu: Xác định nồng độ BA và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự nhân chồi
cây gừng in vitro.

Vật liệu: các chồi gừng in vitro từ giai đoạn tạo mẫu ban đầu. Chọn chồi có chiều
cao khoảng 6 cm cắt bỏ hết lá và rễ, chừa lại mỗi chồi cao khoảng 2-3 cm để đảm bảo
tính đồng nhất của các mẫu cấy ở thời điểm ban đầu.
Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên 2
nhân tố là điều kiện nuôi cấy (phòng tăng trưởng và lồng kiếng) và nồng độ BA
(mg/lít). Gồm 6 nghiệm thức với 5 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1 keo và cấy 2 chồi/keo.
Các chồi được cấy vào môi trường MS + 7 gram agar /lít + 20% nước dừa + 30% đường
sucrose và BA với 6 liều lượng khác nhau như sau:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Đối chứng (0 mgBA/lít)
1 mgBA/lít
2 mgBA/lít
3 mgBA/lít
4 mgBA/lít
5 mgBA/lít

Chỉ tiêu theo dõi: các chỉ tiêu về sinh trưởng của chồi hình thành được ghi nhận vào thời
điểm 8 tuần sau khi cấy
- Số chồi/cụm
- Số lá/chồi
- Chiều cao chồi (cm)
- Trọng lượng tươi của cụm chồi (g)
- Tính hệ số nhân chồi theo công thức George (1993)
K = (N/No)T/t

Trong đó:
K: số chồi
No: số chồi ban đầu
N: số chồi thu được sau 1 lần cấy
T: tổng thời gian cần để thực hiện (tuần)

11


t : thời gian giữa hai lần cấy chuyền (tuần)
Nhiệt độ và cường độ ánh sáng: được đo hai lần mỗi ngày (lúc 10 giờ sáng và 15
giờ chiều).
2.2.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của liều lượng NAA và điều kiện nuôi cấy đến
quá trình tạo rễ của chồi gừng in vitro
Mục tiêu: Xác định nồng độ NAA và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tạo rễ
chồi gừng in vitro
Vật liệu thí nghiệm: chồi gừng in vitro từ thí nghiệm nhân chồi. Các chồi cũng
được cắt bỏ hết lá và rễ để các mẫu được đồng nhất.
Phương pháp: thí nghiệm này được tiến hành tương tự như thí nghiệm nhân chồi,
gồm 2 nhân tố là điều kiện nuôi cấy và nồng độ NAA (mg/lít).
Gồm 5 nghiệm thức với 5 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1 keo và mỗi keo cấy 2 chồi. Các
chồi này được cấy vào môi trường MS + 7 g agar /lít + 20% nước dừa + 40 g đường/lít
và NAA ở các liều lượng khác nhau.
1.

Đối chứng (0 mgNAA/lít)

2.

0,5 mgNAA/lít


3.

1 mgNAA/lít

4.

1,5 mgNAA/lít

5.

2 mgNAA/lít

Chỉ tiêu theo dõi: các chỉ tiêu được ghi nhận vào thời điểm 6 tuần sau khi cấy bao gồm
- Tổng số rễ/cụm chồi
- Chiều dài rễ dài nhất trong cụm chồi (cm)
Nhiệt độ và cường độ ánh sáng: được đo hai lần mỗi ngày (10 giờ sáng và 15 giờ
chiều).
Xử lý số liệu: Các số liệu thí nghiệm được xử lý bằng Microsoft Excel và phân tích
thống kê bằng phần mềm SPSS version 16.

12