TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ TRUNG HIẾU

PHỤC TRÁNG GIỐNG LÚA JASMINE 85 CÓ
CHẤT LƯỢNG TỐT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

Cần Thơ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

Tên đề tài:

PHỤC TRÁNG GIỐNG LÚA JASMINE 85 CÓ
CHẤT LƯỢNG TỐT

Giáo viên hướng dẫn
PGS.Ts Võ Công Thành
Ths. Quan Thị Ái Liên

Sinh viên thực hiện:
Lê Trung Hiếu 3087636

Cần Thơ, 2012


Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Khoa học cây trồng – Chuyên ngành
Công nghệ giống cây trồng với đề tài:

CHỌN DÒNG THUẦN TỪ GIỐNG LÚA JASMINE 85
THEO HƯỚNG THUẦN, PHẨM CHẤT TỐT

Do sinh viên Lê Trung Hiếu thực hiện.
Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày ...….tháng…….năm 2012
Cán bộ hướng dẫn

PGs.Ts. Võ Công Thành

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỀN – GIỐNG NÔNG NGHIỆP

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt Kỹ sư ngành
Khoa học cây trồng – Chuyên ngành Công nghệ giống cây trồng với đề tài:

CHỌN DÒNG THUẦN TỪ GIỐNG LÚA JASMINE 85
THEO HƯỚNG THUẦN, PHẨM CHẤT TỐT



Do sinh viên Lê Trung Hiếu thực hiện và bảo vệ trước Hội Đồng.

Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.......................................................
....................................................................................................................................
....................................................................................................................................
Luận văn tốt nghiệp được đánh giá .........................................................................

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2012
Hội đồng
...........................................

.............................................
DUYỆT KHOA
Trưởng Khoa Nông Nghiệp

ii

........................................


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu,
kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn


Lê Trung Hiếu

iii


QUÁ TRÌNH HỌC TẬP


I. LÝ LỊCH SƠ LƯỢC
Họ và tên: Lê Trung Hiếu

Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 12/08/1990

Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: TP. Cần Thơ
Địa chỉ thường trú: 379 AC2 Đường số 5 KDC Hồng Phát, Phường An
Bình, Quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ
Điện thoại: 0939604590
Email:
II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
1. Tiểu học:
Thời gian đào tạo: từ tháng 9/1996 đến tháng 5/2011
Trường: Tiểu học Trần Quốc Toản
Địa chỉ: Quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ
2. Trung học cơ sở:
Thời gian đào tạo: từ tháng 9/2011 đến tháng 5/2005
Trường: Trung học cơ sở Đoàn Thị Điểm

Địa chỉ: Quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ
3. Trung học phổ thông:
Thời gian đào tạo: từ tháng 9/2005 đến tháng 5/2008
Trường: Trung học phổ thông Châu Văn Liêm
Địa chỉ: Quận Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ.
Ngày

tháng năm 2012
Người khai

Lê Trung Hiếu
iv


CẢM TẠ

Kính dâng
 Cha, mẹ hai đấng sinh thành đã cho con hình hài và hết lòng yêu
thương, dạy dỗ và nuôi nấng con khôn lớn, nên người.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
 PGs.Ts. Võ Công Thành người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong
việc nghiên cứu và hoàn thành Luận văn tốt nghiệp này.
 Ths. Quan Thị Ái Liên đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện
cho tôi hoàn thành luận văn này.
 Ks. Nguyễn Thị Mai Hạnh và Ktv. Đái Phương Mai đã tận tình
hướng dẫn tôi thực hiện tốt các công việc trong phòng thí nghiệm.
Xin chân thành cảm ơn
 Ths. Hứa Minh Sang, Master. Trần Ngọc Quý, Ks. Nguyễn Thị
Ngọc Hân, Ks. Trần Thị Phương Thảo, Ktv. Đặng Thị Ngọc Nhiên
đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong việc phân tích mẫu trong phòng

thí nghiệm.
 Ktv. Võ Quang Trung, Ktv. Nguyễn Bùi Khiêm, Ktv. Nguyễn Thành
Tâm đã giúp đỡ tôi các công việc ngoài nhà lưới.
 Các bạn sinh viên khóa 34 và các em sinh viên khóa 35 tại phòng thí
nghiệm Chọn giống và ứng dụng CNSH, Bộ môn Di truyền Giống
Nông Nghiệp, Khoa Nông nghiệp và SHƯD – ĐHCT đã giúp đỡ tôi
rất nhiều trong quá trình thực hiện Luận văn.
 Tôi xin ghi nhớ những tình cảm thấm thiết của 67 sinh viên trong tập
thể lớp Công nghệ giống cây trồng khóa 34 những người đã cùng tôi
trải qua những năm tháng vui buồn của thời sinh viên.

v


TRẦN BẢO TRUNG, 2012. “Chọn dòng thuần từ giống Jasmine 85 theo
hướng thuần, phẩm chất tốt”. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Khoa học cây trồng Chuyên ngành Công nghệ giống cây trồng, trường đại học Cần Thơ.
Cán bộ hướng dẫn: PGs.Ts. Võ Công Thành và Ths. Quan Thị Ái Liên.

TÓM LƯỢC

Hiện nay giống lúa Jasmine 85 là một trong những giống lúa thơm chất lượng cao
nằm trong cơ cấu giống lúa phục vụ cho việc xuất khẩu với diện tích canh tác trên
hàng chục ngàn hecta tại Đồng bằng Sông Cửu Long. Nhưng sau nhiều năm canh
tác giống lúa này đã bị thoái hóa và lẫn tạp do nhiều nguyên nhân. Vì lý do trên
nên đề tài phục tráng giống Jasmine 85 được thực hiện nhằm mục tiêu chọn được
dòng lúa Jasmine 85 thuần, thơm và phẩm chất tốt. Ứng dụng kỹ thuật điện di
protein SDS-PAGE và một số kỹ thuật phân tích phẩm chất gạo của IRRI để phục
tráng giống Jasmine 85 này và kết quả thí nghiệm đã chọn được 2 dòng lúa
Jasmine 85 thuần, thơm có phẩm chất tốt. Dòng 1 (amylose= 18.42%; protein=
9.43%; TGST= 95 ngày), dòng 3 (amylose= 16.32%; protein= 8.51%; TGST= 95

ngày).

vi


MỤC LỤC
Chương
Trang

1

2

3

4

Nội dung
Trang giới thiệu
i
Trang đánh giá của Hội đồng
ii
Lời cam đoan
iii
Cảm tạ
iv
Tiểu sử cá nhân
v
Tóm lược
vi

Mục lục
vii
Danh mục ký hiệu và chữ viết tắt
viii
Danh mục các bảng
ix
Danh mục các hình
x
MỞ ĐẦU
1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2
1.1 Ứng dụng chỉ thị phân tử cải tiến chất lượng hạt giống
2
1.1.1 Kỹ thuật SDS-PAGE protein
2
1.1.2 Những nghiên cứu liên quan đến protein hạt
3
1.1.3 Ứng dụng kỹ thuật DNA trong chọn giống
5
1.2 Sơ lược về cây lúa
8
1.3 Chỉ tiêu đánh giá phẩm chất hạt gạo
10
1.3.1 Hàm lượng Amylose
10
1.3.2 Hàm lượng Protein
11
1.3.3 Nhiệt trở hồ
13

1.3.4 Độ bền thể Gel
14
1.3.4 Tính thơm của lúa
14
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
16
2.1 Thời gian và địa điểm
16
2.2 Vật liệu thí nghiệm
16
2.3 Phương pháp
17
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu chung
17
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể
18
KẾT QUẢ-THẢO LUẬN
26
3.1 Chọn cá thể từ giống Jasmine 85 ban đầu
26
3.2 Kiểm tra tính thơm bằng kỹ thuật DNA
27
3.3 Chỉ tiêu nông học các dòng lúa Jamine 85 phục tráng
28
3.4 Phân tích chỉ tiêu phẩm chất
31
3.5 Kiểm tra độ thuần các dòng lúa bằng SDS-PAGE
33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
34

TÀI LIỆU THAM KHẢO
35

vii


DANH MỤC CÁC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt/ký hiệu
SDS-PAGE

Viết đầy đủ
Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis

ĐC

Đối chứng

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng
Trang

Tựa bảng

1.1

Các loại DNA Marker


1.2

Hàm lượng Amylose trong gạo theo thang điểm của IRRI (1980)

10

1.3

Phân cấp mùi thơm theo thang điểm của IRRI 1988

15

2.1

Công thức pha dung dịch tạo một gel

19

2.2

Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lượng Amylose cho lúa (IRRI,1988) 24

2.3

Bảng phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979)

25

2.4


Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979)

25

2.5

Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996)

26

2.6

Phân loại chiều dài hình dạng hạt gạo (Khush and Paul, 1979)

27

3.1

Chiều cao cây, tổng số chồi, số chồi hữu hiệu và thời gian sinh

6

trưởng của các dòng lúa Jasmine 85 phục tráng
3.2

29

Trọng lượng 1000 hạt, chiều dài bông, số hạt chắc trên bông và
tỷ lệ chắc các dòng Jasmine 85 phục tráng


30

3.2

Hàm lượng Amylose và Protein các dòng Jasmine 85 phục tráng

31

3.4

Độ bền thể gel các dòng lúa Jasmine 85 phục tráng

32

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình
Trang

Tựa hình

1.1

Cấu trúc hạt lúa

1.2


Phổ điện di Protein dự trữ trong nội nhũ hạt lúa

9

(Tanaka origimal, 1988)

13

2.1

Dụng cụ, thiết bị sử dụng cho điện di SDS-PAGE

17

3.1

Phổ điện di Protein tổng số giống lúa Jasmine 85 ban đầu

26

3.2

Những cá thể được trồng riêng thành dòng trong nhà lưới

27

3.3

Hình gel DNA của các dòng lúa Jasmine 85 phục tráng


27

3.4

Chiều cao cây

28

3.5

Độ bền thể gel

32

3.6

Phổ điện di protein tổng số của dòng 3 Jasmine 85 phục tráng

33

x


1

MỞ ĐẦU
Hàng nghìn năm qua, lúa gạo có tầm quan trọng sống còn đối với hơn một nửa dân số thế giới.
Nó là loại lương thực chủ yếu hiện nay của hàng tỷ người dân ở Châu Á, Châu Phi, Mỹ La
Tinh và khu vực Trung Đông. Trong tương lai, nó vẫn là loại lương thực hàng đầu.
Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp rất phát triển. Trong đó, cây lúa là cây trồng lâu

đời, là cây lương thực chủ yếu và là nguồn thu nhập chính của người dân. Hiện nay, Việt Nam
là một quốc gia có sản lượng lúa gạo xuất khẩu đứng hàng thứ hai trên thế giới.
Những năm gần đây nhu cầu sản xuất lúa gạo chất lượng cao phục vụ cho xuất khẩu luôn là
mục tiêu hàng đầu của nền nông nghiệp Việt Nam. Gạo thơm Việt Nam xuất khẩu tăng hơn
100% trong khi gạo chất lượng thấp xuất khẩu đã giảm gần 62%. Và một trong những giống
lúa thơm chủ lực trong cơ cấu giống chất lượng cao là Jasmine 85. Được nhập vào Việt Nam
từ những năm 1990, Jasmine 85 là giống lúa ngon cơm, thơm nhưng qua nhiều năm canh tác
giống này đã bị lẫn tạp, thoái hóa do nhiều nguyên nhân.
Kỹ thuật điện di protein SDS PAGE cho phép thanh lọc được các dòng bị thoái hóa và lẫn tạp,
đồng thời kỹ thuật này cũng giúp xác định được những dòng ưu tú có chất lượng gạo đáp ứng
được các yêu cầu cho xuất khẩu cũng như tiêu thụ nội địa theo ý muốn như ngon cơm (nâng
cao cả hàm lượng protein tổng số và protein thành phần như Glutenlin hay Globulin), đồng
thời đạt được hàm lượng amylose thấp đáp ứng theo yêu cầu xuất khẩu. Vì vậy việc phục tráng
giống lúa Jasmine 85 đã thoái hóa nhằm tạo ra các dòng lúa chất lượng tốt hơn để phục vụ cho
việc xuất khẩu là yêu cầu rất cần thiết.
Xuất phát từ những yêu cầu trên đề tài thực hiện: “PHỤC TRÁNG GIỐNG LÚA JASMINE
85 CÓ CHẤT LƯỢNG TỐT”. Nhằm mục tiêu: Chọn được từ 2-3 dòng thuần, thơm có hàm
lượng amylose ≤20%, protein ≥8%.


2

CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Ứng dụng chỉ thị phân tử cải tiến chất lượng hạt giống

1.1.1 Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein

Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis) được Laemmli (1970) phát triển từ sự hiệu chỉnh bằng cách thêm 0,1% SDS

(chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Ornstein Davis (1964) nhằm xác định trọng
lượng phân tử các loại protein trong phổ điện di (Davis E. Garfin, 1985) bao gồm các bước: ly
trích protein, tinh sạch protein, và điện di. Trong dịch ly trích protein thường người ta dùng
chất đệm Tris-base (pH>10), chất tẩy SDS, 2-Mercaptoethanol. Khi đun nóng hỗn hợp protein
trong dung dịch có dung dịch đệm SDS (2%) và nhờ vào chất hóa học có gốc thiol (2mercapthoethanol) với nồng độ thường là 5%, protein sẽ bị phân cắt các cầu nối lưu huỳnh và
biến tính thành các polypeptide mà vẫn giữ cấu trúc của nó nhờ sự áo của 1,4g SDS vào 1g
polypeptide Ornstein Davis (1964).
Hơn nữa, mật độ điện tích SDS-polypeptide sẽ độc lập với pH trong khoảng từ 7 đến 10. Phân
đoạn protein trong gel bị lưới của acrylamide ngăn chặn nên tách rời các polypeptide. Dựa theo
nguyên lý trên người ta cho thêm protein chuẩn có trọng lượng phân tử biết trước để xác định
trọng lượng phân tử của các polypeptide trong phổ điện di để phát hiện protein, người ta
thường dùng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R250 (0,1-1 g) cho mỗi vạch protein
trong phổ điện di (Somith, 1974) hay nhuộm bạc 2-10 ng cho mỗi vạch protein (OrnsteinDavis 1964).


3
1.1.2 Những nghiên cứu liên quan đến protein hạt

Protein được xem là chỉ thị di truyền trong công tác chọn giống
Giống như DNA và enzyme, protein dự trữ cũng đã được dùng làm dấu phân tử trong công tác
chọn tạo giống vì:
Chúng có độ đa hình cao ngay cả bên trong và giữa các quần thể. Tập đoàn giống lúa cổ truyền
trồng ven biển ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam có độ đa dạng di truyền tương đối cao
(Vương Hỗ, 2003). Đa dạng di truyền về glutelin có trọng lượng phân tử cao ở lúa mì hoang
dại (Triticum turgidum var. dicoccoides) có phân phối bằng nhau bên trong cũng như giữa các
quần thể lúa mì trồng Paul Gepts, (1990).
Độ đa hình của chúng được xác định phần lớn là do di truyền. Bởi vì các mức độ đa hình và
tính ổn định môi trường cao nên protein dự trữ có thể dùng để xác định giống hay liên quan
đến các dấu (Marker) khác. Xác định giống thông qua protein của hạt đã áp dụng ở cây lúa mì,
đậu faba, lúa đại mạch, bắp… Độ đa hình protein dự trữ bên trong loài cũng đã được xác định

ở nhiều loài cây trồng và mối quan hệ của nó với loài hoang dại. Đậu Phaseolus, đậu phộng,
bắp, đậu nành (Mori và ctv., 1987). Kết quả so sánh với phương pháp phân tích bằng
isoenzyme, người ta thấy rằng kỹ thuật protein phát hiện đa dạng hơn gấp nhiều lần, thí dụ
trong thí nghiệm của Paul Gepts, (1990) đánh giá rằng protein dạng hordeins mức độ đa dạng
gấp 10-30 lần.
Kiểm soát di truyền về các biến dị di truyền chất lượng thì đơn giản và bao gồm một số locus
có giới hạn nằm trong bộ gen trong nhân tế bào. Gene conglycinin hay globulin 7S ở hạt đậu
nành quyết định đến phẩm chất chế biến, bao gồm protein ',  và  đều do một gen kiểm
soát (Kitamura và ctv., 1984).
Tính đồng dạng về protein dự trữ của các loài khác nhau sẽ được xác định. Các nguồn phân tử
về tính đa hình protein dự trữ đã được biết cho thấy hầu hết các thể biến dị protein là đồng nhất
và do đó có thể được xem như là các chỉ thị (marker) về tiến hóa.
Kiểm tra sự khác biệt giữa các loài
Dựa trên phân tích trọng lượng phân tử khác nhau của protein dự trữ mà người ta đánh giá tính
đa hình và phổ biến. Do vạch protein trong phổ điện di là kết quả của một chuỗi phức tạp ở
mức độ phân tử nên không có một vạch protein nào có thể xuất hiện hai lần, do đó mỗi mẫu có
một nguồn gốc riêng và các kiểu gen có cùng dạng mẫu là có nguồn gốc chung. Kết quả phân


4
tích nầy giống như kết quả phân tích trên mức độ chuỗi trình tự DNA bởi vì các protein dự trữ
được mã hóa do một số locus phức tạp có giới hạn. Hơn nữa, nghiên cứu sinh học phân tử và
hóa học của các protein dự trữ cho thấy có sự đồng dạng giữa các thành phần protein có tính
phổ biến trong hệ thống phân loại (Paul Gepts, 1990). Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein
giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền và phân biệt hai loài lúa hoang ở ĐBSCL dựa vào mức
độ ăn màu Coomassie của băng protein chỉ thị dạng glutelin và dạng prolamin (Phạm Văn
Phượng, 2006).
Nghiên cứu sự tiến hoá của loài (cây phả hệ)
Giống như mức độ biểu hiện DNA, sự biểu hiện mức độ ăn màu protein cũng được ghi nhận ở
mức độ nhị phân, có ăn màu được ghi nhận là 1, không có ăn màu do đột biến các amino acid

bên trong sẽ được ghi nhận là 0. Từ đó, dựa vào sự giống nhau hay khác biệt các băng protein
để tính theo chỉ số Jascard và chuyển đổi ma trận sự khác biệt để lập biểu đồ nhóm (cluster) để
cho ta thông tin về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài. Thông qua biểu đồ như vậy nhà chọn
giống sẽ chọn lựa và tiến hành chọn cặp cha mẹ để lai (Võ Công Thành và ctv., 2003).
Xác định độ thuần của giống cây trồng
Khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất, và tính ổn định của giống cây trồng DUS
(Distinctness, Uniformity, và Stability) thường dựa trên các phương pháp hình thái nên kết quả
thường phản ánh không chính xác do ảnh hưởng của môi trường. Các dấu hình thái thường
chưa phản ánh hết hoàn toàn tính đa dạng di truyền giữa các giống có sự giống nhau chồng
chéo về dạng hình và các mẫu giống đồng nhất về hình thái. Do đó, nhà chọn giống cần có một
công cụ mới để phân biệt được. Kỹ thuật điện di là một công cụ phân tích cho phép đánh giá
gián tiếp dò tìm bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích tính biến dị cấu trúc của các enzyme và
protein (Paul Gepts, 1990). Phương pháp phân tích nội nhũ từ ½ hạt lúa không chứa phôi bằng
Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein giúp nhà chọn giống chọn được những cá thể ưu tú chất
lượng cao từ những quần thể giống đã bị thoái hóa. Dòng 007 giống lúa Tài Nguyên mùa;
Dòng 124 giống lúa Klong Kluong; Dòng 03 giống lúa VD20 và dòng 1-2 giống lúa Nếp Bè
được chọn lọc dòng thuần từ 4 giống lúa đặc sản đã bị thoái hóa (Phạm Văn Phượng ,2006).


5
1.1.3 Ứng dụng kỹ thuật DNA trong chọn giống

Việc cải thiện những giống lúa thơm bằng cách áp dụng các biện pháp lai tạo cổ điển rất khó
thực hiện được do một số tính trạng chất lượng có thể bị mất trong quá trình thụ phấn và tạo
hợp tử. Để khắc phục hiện tượng đó kỹ thuật sinh học phân tử có thể được coi là một giải pháp
có hiệu quả. Một số thành tựu đó như là sử dụng RFLP marker RG 28 để phát triển gen mã hoá
tính thơm, hay marker RZ 323 liên quan đến sự giản nở của chiều dài hạt ở giống Basmati 370
(Ahn và ctv., 1993).
Ngoài các RFLP marker còn có kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) cũng
được sử dụng để phát hiện gen thơm của lúa. Năm 1995, Jin và ctv., đã phát hiện ra một con

mồi, Jas 1.5, có thể dùng để phân biệt giữa các giống lúa thơm và giống lúa thường.
Tìm được marker cho gen qui định mùi thơm của lúa, band thơm có trọng lượng phân tử là
257bp, band không thơm có trọng lượng phân tử là 355bp (Louis và ctv., 2005).


Các loại DNA Marker:

Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc
giống khác nhau, đều có thể xem như là một DNA marker. Các DNA marker có thể được chia
thành hai nhóm như sau:


PCR- based : ALP, AFLP, SSR, SSCP



DNA/ DNA hybridization-based : RFLP, minisatellite

Các marker thuộc nhóm PCR-based có thể được chia nhỏ thành:


MAAP



Marker ngắn, có tính ngẫu nhiên: RAPD, AP-PCR, DAF, AFLP



Amplicon đơn: ALP, SSR, SSCP


Bảng 1.1 Các loại DNA marker
Marker
RFLP
ALP
AFLP
RAPD
DAF

Tên đầy đủ
Restriction frament length polymorphism
Amplicon length polymorphism
Amplified fragment length polymorphism
Random amplified polymorphicDNA
DNA amplification fingerprinting


6
SSR
AP-PCR
SSCP
MRDHVDNA


Simple sequence repeat (microsatellite)
Arbitrary priner-PCR
Single strand conformation polymorphism
Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA
(minisatelltie)


Nguyên tắc cơ bản của PCR

Phản ứng chuỗi của polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain reaction). Đây
là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. PCR là kỹ thuật xử lý in vitro
các chuỗi mã hóa di truyền DNA bằng cách phát triển primer một cách đồng loạt trên các dây
đơn DNA. Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động
của các primer tại đầu của các dây đơn DNA này, kế đến là sự phát triển của các primer do
phản ứng DNA polymerase.
Có hai vấn đề chính trong nguyên tắc PCR:


Polymerase được sử dụng là những enzyme sống, nhạy cảm về độ nhiệt, phải được

thêm vào trong mỗi chu kỳ.

Phải có một quy trình hướng dẫn cụ thể trong khi thực hiện từng giai đoạn của chu kỳ
PCR.
Cả hai tiến trình nói trên đều nặng nhọc và bất lợi cho các nhà nghiên cứu, nếu họ có phương
tiện quá hạn chế khi áp dụng PCR.
Tuy nhiên, trong thiên nhiên vẫn có những sinh vật có thể sống ở nhiệt độ cao. Thí dụ
polymerase được phân lập từ Thermus aquaticus có khả năng là vật thể ổn định về nhiệt lượng.
Taq polymerase có hai thuận lợi chính: [i] hồi phục sau khi tác động nhiệt không cần kéo dài,
[ii] enzyme này rất hoạt động ở nhiệt độ cao, lúc đó việc tác động của các primer ở đầu dây
đơn sẽ chuyên biệt hơn và sinh tổng hợp DNA sẽ nhanh hơn.
DNA polymerase được dùng phổ biến là Taq polymerase, lấy từ Thermus aquaticus, có tính ổn
dịnh nhiệt rất cao. Một nửa chu kỳ của Taq polymerase được giữ ở nhiệt độ 940C trong vòng
40 phút Taq polymerase có một mức tối hảo về nhiệt độ cao trong sinh tổng hợp DNA [70720C]. Ở quảng nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của Taq polymerase có thể cao như 150
nucleotide/giây/enzyme. Do đó người ta phải cố gắng phát triển ở quãng nhiệt độ 70-720C
trong vòng một phút. Từ đó hàng kilo bp của các đoạn DNA có thể được tổng hợp.



7
Taq polymerase nhạy cảm với ion magnesium. Nồng độ tối hảo của Mg2+ là 1,5-2,5mM. Vì
deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) có thể gắn với Mg2+, cho nên nồng độ chính xác của
magnesium tùy thuộc vào nồng độ của dNTP. Các thành phần khác ít mẫn cảm với Taq
polymerase là KCL và Tris

Chất đệm:
Tris (pH 8.4)

10mM

KCL

50mM

MgCl2

1.5-2.0 mM

Các thành phần khác như các chất tẩy không có tính ion, gelatin, NP40, và Tween 20 được
thêm vào với số lượng nhỏ nhằm thúc đẩy hoạt động của Taq polymerase. Nồng độ diện được
dùng là 0.01% và người ta còn tiếp tục thử nghiệm.


Primer và dNTP

Trong PCR tiêu chuẩn, người ta cần có một cặp primer. Sự khuyếch đại chuyên biệt nào đối
với một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tùy thuộc các primer tương xứng. Cả hai yếu tố:
chiều dài primer và thành phần G+C đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá

trình tác động ở đầu dây đơn. Nhiệt độ này sẽ là 2x (# của A+T) + 4x(# của G+C) + 50C. nếu
có 50% G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18-20 nucleotide.
Người ta thường mua các nucleotide ở các công ty hóa chất, có chất lượng tốt. Nếu nó được
bảo quản ở dạng bột đông khô [freeze-dried powder]. Sau đó người ta phải điều chỉnh lại độ
pH, trước khi sử dụng.


DNA mục tiêu (Target DNA)

Người ta cần phải có các đoạn DNA mang mật mã đã biết trước, được gọi với thuật ngữ “target
DNA” trong kỹ thuật PCR người ta sẽ nhận được những kết quả tốt nhất, nếu DNA thật sự
thuần khiết, DNA từ mô lá. Số lượng DNA cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 510 ngDNA thuần khiết, đủ để cho những kết quả theo mong muốn. Người ta cần có ethanol
trong lần cuối của quy trình chuẩn bị DNA. Với 10% ethanol, nó vẫn chưa có thể gây ảnh
hưởng đến hoạt động của Taq polymerase.


8
Điều ghi nhận quan trọng là: phải có một mM EDTA trong chất đệm TE trong khi sử dụng để
hòa tan DNA. EDTA sẽ gắn với Mg2+, sao cho thể tích của DNA mục tiêu không vượt quá 1/5
của thể tích PCR.


Phát hiện DNA có tính đa hình nhờ PCR

Sản phẩm của PCR là những đoạn mã DNA. Khi DNA xuất phát từ hai dòng lai với nhau được
khuếch đại lên nhờ các primer tại locus đặc biệt nào đó, thì trọng lượng phân tử của sản phẩm
PCR này có thể rất khác nhau, vì có những thay đổi vật lý trên chuỗi mã DNA, nghĩa là, sự
mất đoạn hay thêm đoạn DNA sẽ xảy ra trong vùng bị khuyếch đại nầy. Thể đa hình này được
gọi là “amplicon length polymorphism” [ALP] phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể/
các dòng lai/ các giống lúa. Thuận lợi của ALP so với RFLP trong việc phát hiện này là:(1) nó

rất nhanh, chỉ cần một ngày giúp ta tìm ra kết quả, (2) không có chất đồng vị, (3) rẻ tiền, (4)
cần rất ít DNA. Bất lợi của ALP là người ta phải biết rõ chuỗi mã DNA đầu tiên khi tổng hợp
primer.

1.1 Sơ lược về cây lúa

Đặc điểm hình thái cây lúa
 Rễ
Rễ lúa thuộc loại rễ chùm, có chức năng giữ vững cây trong đất và hút nước, dinh dưỡng để
nuôi cây. Rễ lúa có hai loại: rễ mầm và rễ phụ. Khi hạt nảy mầm, rễ xuất hiện đầu tiên là rễ
mầm. Tiếp theo là các rễ khác mọc ra từ các đốt thân (rễ phụ) và khi cây lúa có một lá thật thì
cây lúa đã có 4-6 rễ mới. Càng về sau số lượng rễ càng nhiều. Số lượng rễ nhiều hay ít tùy
thuộc vào số mắt ở đốt thân. Bộ rễ lúa thường có khoảng 500-800 rễ với tổng chiều dài 168 m.
Số rễ đạt tối đa ở giai đoạn trước trổ bông và giảm khi vào thời kỳ chín (Đinh Thế Lộc, 2006).

 Thân
Thân lúa gồm hai loại: thân giả và thân thật. Thân giả do bẹ lá kết hợp lại với nhau. Thân thật
được tạo nên bởi các đốt lóng kế tiếp nhau. Nó được hình thành kể từ khi cây lúa phân hóa đốt
và là kết quả của sự vươn dài của các đốt. Số đốt của thân nhiều hay ít tùy giống và ít thay đổi
do điều kiện của môi trường (Đinh Thế Lộc, 2006).
 Lá


9
Lúa là cây đơn tử diệp, gân lá song song. Có ba loại lá: lá bao mầm, lá không hoàn toàn và lá
thật. Một lá thật có các bộ phận: phiến lá, thìa lá, cổ lá, tai lá, bẹ lá và ở một số giống còn có
lông trên lá. Trong đó, phiến lá giữ vai trò quan trọng vì đây là nơi diễn ra quá trình quang
hợp. Hình dạng và màu sắc lá khác nhau tùy giống. Lá ra sau cùng là lá đòng. Lá đòng có vai
trò nuôi dưỡng bông lúa sau khi trổ (Đinh Thế Lộc, 2006)
 Hạt

Hạt là cơ quan sinh sản duy trì nòi giống. Hạt lúa gồm có hai phần: vỏ trấu và hạt gạo

Râu hạt
Vỏ trấu nhỏ

Vỏ trấu lớn

Aleuron
Nội nhũ

Phôi hạt

Tiểu đĩnh

Hình 1.1 Cấu trúc hạt lúa

 Vỏ trấu
Vỏ trấu gồm có hai mảnh. Một mảnh to và một mảnh nhỏ ôm lấy nhau. Ở gốc hai vỏ trấu gắn
với nhau có mang hai tiểu dĩnh. Màu sắc vỏ trấu khác nhau tùy giống. Phần vỏ này chiếm 20%
trọng lượng hạt (Đinh Thế Lộc, 2006).
 Hạt gạo


10
Hạt gạo gồm nội nhũ và phôi. Nội nhũ được bọc bởi một lớp vỏ cám. Màu sắc vỏ cám khác
nhau tùy giống. Bên ngoài còn được bọc bởi một lớp aleuron. Tùy theo giống mà độ dày tầng
aleuron khác nhau. Nội nhũ là nơi dự trữ dinh dưỡng nuôi phôi. Phôi là nơi dự trữ chất dinh
dưỡng và nảy mầm tạo cây mới khi gặp điều kiện thuận lợi (Đinh Thế Lộc, 2006).

1.3 Chỉ tiêu đánh giá phẩm chất hạt gạo


1.3.1 Hàm lượng Amylose

Hàm lượng amylose là kết quả của kiểu gene và một vài thay đổi của môi trường (Heu and
Part, 1976). Nó có thể biến động đến 6% khi trồng ở nơi này so với nơi khác từ vụ này sang vụ
khác, nhiệt độ cao khi lúa chín cũng làm giảm lượng amylose (Jennings et al.,1979). Hàm
lượng amylose trong hạt gạo là một yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến phẩm chất của cơm,
nó tương quan nghịch với độ dẻo, độ mềm, độ bóng của cơm (Bao et al., 2001).

Bảng 1.2 Hàm lượng amylose trong hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1980)

Stt
1
2
3
4
5

Hàm lượng Amylose (%)
0-2
3-10
11-19
20-25
>25

Đánh giá
Nếp
Rất thấp
Thấp
Trung bình

Cao

Phân loại gạo
Nếp
Gạo dẻo
Gạo dẻo
Mềm cơm
Cứng cơm

Hàm lượng amylose trong hạt gạo tương quan với chiều dài hạt gạo và nhiệt độ. Lúa dạng hạt
dài (chiều dài hạt gạo dài hơn 3-4 lần so với chiều rộng hạt gạo) tương quan với hàm lượng
amylose cao trên 20%. Lúa dạng hạt trung bình (chiều dài hạt gạo dài hơn 2-2.9 lần chiều rộng
hạt gạo) tương quan với hàm lượng amylose thấp, 10-18% (Traore, 2005). Juliano and Pascual
(1980) đã kết luận rằng nhiệt độ môi trường có thể làm biến đổi 6% hàm lượng amylose. Theo
Traore (2005) trích dẫn của Lisle et al. (2000) cho rằng nhiệt độ cao trong suốt quá trình phát
triển của hạt lúa có thể làm giảm hàm lượng amylose. Traore (2005) trích dẫn của Larkin and
William (1999) cho rằng ở nhóm Japonica có hàm lượng amylose cao khi sự phát triển của hạt
lúa trong điều kiện nhiệt độ thấp từ 15-20 0C và không có sự tương quan giữa nhiệt độ và hàm


11
lượng amylose ở nhóm Indica. Cơ chế di truyền về hàm lượng amylose chưa được biết rõ.
Heda and Reddy (1986) kết luận rằng hàm lượng amylose bị chi phối bởi hai cặp gene, hàm
lượng amylose cao trội so với hàm lượng amylose thấp.
Ở hạt lúa amylose có trọng lượng phân tử là 100-200 kDa, chuỗi amylose tạo thành có dạng
xoắn ló xo với 6 gốc glucose trên một vòng và mỗi vòng có thể hấp thu một phân tử iodine vào
bên trong bởi các nhóm carbohydrate tạo ra dung dịch có màu xanh, người ta dựa vào đặc tính
này để xác định hàm lượng amylose.
Hàm lượng amylose là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gen và điều kiện môi trường
(Sectharaman, 1959; Juliano at al., 1964; Kahlon, 1965; Ghosh và Govindaswamy, 1972;

Bollick và Webb, 1973; Somrich, 1974; Heu và Park, 1976). Tuy nhiên hàm lượng amylose
cao là trội hoàn toàn so với hàm lượng amylose thấp, nó được kiểm soát bởi một gen chủ yếu
và nhiều gen phụ mang tính chất cải biên (Ghosh và Govindaswamy, 1972; Bollick và Webb,
1973; Somrich, 1974; Heu và Park, 1976; Trương Bá Thảo, 2006)
Hàm lượng amylose được qui định bởi yếu tố di truyền, ở lúa locus Waxy nằm trên nhiễm sắc
thể (NST) thứ ba, kiểm soát sản phẩm amylose tạo thành trong nội nhũ (Khush,1979). Hàm
lượng amylose được kiểm soát bởi một gene chính, tính dẻo được kiểm soát bởi một gene lặn
waxy, wx (Li, 1999). Nội nhũ của gạo nếp chỉ chứa amylopectin với kiểu gene 3n=wx wx wx,
ngược lại ở gạo tẻ bao gồm cả amylose và amylopectin được kiểm soát bởi gene trội Wx, số
lượng gene trội Wx ảnh hưởng đến hàm lượng amylose trong nội nhũ (IRRI, 1976; Heu và
Park, 1976)

1.3.2 Hàm lượng Protein

Theo Higgins et al (1984) protein dự trữ là tất cả các protein tích lũy với hàm lượng đáng kể
trong quá trình phát triển của hạt lúa. Khi hạt nảy mầm, chúng sẽ thủy phân cung cấp đạm cho
cây. Chúng được tổng hợp chủ yếu trong giai đoạn phát triển sớm (Zhu, 1995) và chúng không
biểu hiện hoạt tính của một enzyme (Shewry et al., 1999).
Theo Jennings et al. (1979) hàm lượng protein trong hạt tùy thuộc vào sự chuyển vị đạm trong
hạt đang phát triển. Chúng chịu ảnh hưởng trầm trọng bởi điều kiện môi trường, mức độ bón
phân và thời gian sinh trưởng. Hàm lượng protein ở nhóm Japonica và Indica cũng có sự khác
biệt. Ở nhóm Indica, hàm lượng protein biến động từ 4.9-19.3%. Ở nhóm Japonica, hàm lượng
protein biến động từ 5.9-16.5% (Traore, 2005).


12
Lúa cung cấp hàm lượng protein trung bình khoảng 7% ở gạo trắng và 8% ở gạo lức (Jennings
et al., 1979). Hàm lượng protein phần lớn nằm trong hạt nên khi protein tăng thì phần lớn tập
trung trong hạt, nên lượng protein mất đi trong lúc xay trà không đáng kể và thành phần acid
amin hạt lúa cũng tương đối ổn định, điều này chứng tỏ phần lớn protein tăng thêm không nằm

trong vỏ cám (Jennings et al., 1979).
Hàm lượng protein di truyền rất phức tạp. Chỉ 25-50% sự biến thiên protein là do gene điều
khiển. IRRI (1977) cho rằng hàm lượng protein thấp có tính trội cao hơn hàm lượng protein
cao. Có ý kiến cho rằng, di truyền tính trạng protein do đa gene điều khiển, có hệ số di truyền
rất thấp, có thể do tương tác mạnh mẽ giữa kiểu gene và môi trường (Chang and Somrith,
1979). Yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng đến sự biến thiên hàm lượng protein như côn trùng,
thời tiết, phân bón, nước tưới,….
Thực hiện điện di SDS-PAGE protein đã phát hiện trong hạt gạo có trên 10 thành phần protein,
chia thành 5 nhóm polypeptide khác nhau về trọng lượng phân tử là: 57; 37; 38; 39; 26; 22-23;
16; 16; 13 và 10 kDa (Hình 1.1)
Các thành phần protein trong hạt lúa được phân ra làm 4 loại: albumin, globulin, prolamin,
glutelin.


Albumin

Albumin tan trong nước, bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4)2SO4 khá cao (70-80%). Theo
Yamagata et al (1982) trong lúa thành phần albumin có hàm lượng lysine cao nhất, kế đến là
glutelin và prolamin. Hai thành phần albumin và globulin tập trung ở lớp aleuron, không giữ
được ở gạo xay chà trắng (Tecson et al., 1971).
 Globulin
Globulin không tan hoặc tan rất ít trong nước, tan trong dung dịch muối trung hòa NaCl, KCl,
Na2SO4, K2SO4. Thành phần globulin tập trung ở lớp aleuron của hạt (Juliano, 1972).
 Prolamin
Prolamin tan trong cồn 70-80%. Nó chiếm khoảng 18-20% protein tổng trong nội nhũ của hạt
lúa và được tổng hợp ở mạng lưới nội chất (Juliano, 1972).
 Glutelin
Glutelin tan trong dung dịch kiềm và acide loãng. Đây là thành phần protein chiếm tỷ lệ cao
nhất trong tổng số protein trong nội nhũ (Juliano, 1972).



13
Trong công tác lai tạo giống, hai loại protein được quan tâm nhất là prolamin và glutelin vì
chúng có mối quan hệ nghịch với nhau. Để tăng hàm lượng lysine trong gạo thì người ta chọn
những giống có hàm lượng glutelin tăng và prolamin giảm (Ogawa et al., 1987)
Protein dự trữ trong hạt lúa chủ yếu là glutelin, đây là thành phần dự trữ quan trọng nhất trong
nội nhũ hạt lúa, chiếm khoảng 80% protein tổng số, khi nó được cắt bởi enzyme protein
disulfide isomerrase để tạo thành hai tiểu đơn vị β-glutelin có trọng lượng phân tử từ 22-23
kDa và λ-glutelin có trọng lượng phân tử tứ 37-39 kDa (Masumura et al., 1989). Trên phổ điện
di polypeptide λ-glutelin có ba tiểu đơn vị với trọng lượng phân tử là 37 kDa, 38 kDa và 39
kDa; polypeptide β-glutelin có hai tiểu đơn vị với trọng lượng phân tử là 22 kDa và 23 kDa
(Tanaka và Ogawa,1985; Ogawa et al.,1987)

Hình 1.2 Phổ điện di protein dự trữ trong nội nhũ hạt lúa (Tanaka origimal, 1988)

1.3.3 Nhiệt trở hồ

Nhiệt trở hồ trung bình của tinh bột hạt gạo là tính trạng biểu thị nhiệt độ cần thiết để gạo nấu
thành cơm và không hoàn nguyên (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).Theo Jennings et
al., (1979) thì nhiệt trở hồ là nhiệt độ mà khi nấu đến đó nước được hấp thu và hạt tinh bột
phồng lên không hoàn nguyên, đồng thời dạng tinh thể biến mất. Nhiệt trở hồ thường từ 55-75
0

C và được chia làm ba nhóm chính: