TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN TRẦN PHƯƠNG THẢO

ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC KHÁNG SINH
ENROFLOXACINE VÀ CIPROFLOXACINE ĐẾN ENZYME
CHOLINESTERASE VÀ CATALASE CỦA CÁ RÔ PHI
(Oreochromis niloticus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN TRẦN PHƯƠNG THẢO

ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC KHÁNG SINH
ENROFLOXACINE VÀ CIPROFLOXACINE ĐẾN ENZYME
CHOLINESTERASE VÀ CATALASE CỦA CÁ RÔ PHI
(Oreochromis niloticus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs. Ts. NGUYỄN THANH PHƯƠNG

Ths. NGUYỄN THỊ KIM HÀ

2012


LỜI CẢM TẠ
Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGs.Ts. Nguyễn Thanh
Phương và cô PGs. Ts. Đỗ Thị Thanh Hương đã quan tâm, hướng dẫn và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận
văn tốt nghiệp.
Xin gởi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Kim Hà, anh Trần Minh Phú,
anh Nguyễn Thanh Phong và chị Nguyễn Thị Kim Khá công tác tại Bộ môn
Dinh dưỡng và chế biến thuỷ sản đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong thời
gian thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn Andrew Margot, người đã cùng tôi thực hiện đề tài.
Cảm ơn các bạn Lê Thị Tuyết Anh, Trần Thị Hương Diễm, Dư Hữu
Trọng đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô và bạn bè đã
chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại
trường.
Xin chân thành cảm ơn!

i


TÓM TẮT
Enrofloxacine và Ciprofloxacine là 2 loại kháng sinh thuộc nhóm
Fluoroquinolone từng được sử dụng rộng rãi trong thời gian dài. Tuy nhiên,
hiện nay Bộ Nông nghiệp & PTNT đã đưa 2 loại thuốc kháng sinh trên vào
danh mục thuốc thú y – thuỷ sản bị cấm sử dụng. Nguyên nhân là do 2 loại

kháng sinh này tồn lưu trong cơ thể động vật trong thời gian dài và có thể ảnh
hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng. Nghiên cứu này nhằm đưa ra những
nhận định về ảnh hưởng của 2 loại thuốc kháng sinh này đến sự phát triển của
cá rô phi (Oreochromis niloticus), khả năng hồi phục hoạt tính của enzyme
Cholinesterase (ChE) và Catalase (CAT).
Đối tượng nghiên cứu là cá rô phi (Oreochromis niloticus) có kích cỡ 8
– 10 g/con. Nghiên cứu được tiến hành với 2 loại kháng sinh Enrofloxacine
và Ciprofloxacine trong 14 ngày. Liên tục trong 5 ngày đầu của thí nghiệm,
hai kháng sinh này lần lượt sẽ gây nhiễm theo 2 cách: trộn vào thức ăn và bổ
sung vào nước. Đối với thí nghiệm trộn kháng sinh vào thức ăn, 5 nồng độ của
Enrofloxacine là 0, 1 g/kg, 2,5 g/kg, 5 g/kg và 10 g/kg; Ciprofloxacine là 0,
0,5 g/kg, 1,25 g/kg, 2,5 g/kg và 5 g/kg. Đối với thí nghiệm bổ sung kháng sinh
vào nước, Enrofloxacine được sử dụng ở các nồng độ 0, 0,1 mg/L, 0,8 mg/L,
10 mg/L và 100 mg/L; Ciprofloxacine là 0, 0,05 mg/L, 0,4 mg/L, 5 mg/L và
50 mg/L. Trong quá trình thí nghiệm, tiến hành thu mẫu não và cơ ở ngày 1
(trước khi gây nhiễm kháng sinh), ngày 3, ngày 5 và ngày 14. Sau đó phân tích
ChE trong não và CAT trong cơ để đánh giá sự ảnh hưởng của kháng sinh lên
hoạt tính của ChE và CAT.
Kết quả cho thấy ở tất cả các thí nghiệm, Enrofloxacine và
Ciprofloxacine làm tăng hoạt tính của ChE ở não và giảm hoạt tính của CAT ở
cơ cá rô phi trong 5 ngày đầu tiến hành thí nghiệm ở các nồng độ 5 g/kg, 10
g/kg, 10 mg/L và 50 mg/L. Sau 5 ngày hoạt tính của ChE và CAT có dấu hiệu
phục hồi trở lại. Trong thí nghiệm bổ sung kháng sinh vào nước ở nồng độ
kháng sinh cao nhất (50 mg/L và 100 mg/L), cá chết đồng loạt nguyên nhân có
thể là do cá gặp khó khăn trong quá trình hô hấp, gây thiếu oxy trong máu
hoặc do các enzyme bị ức chế quá giới hạn cho phép. Như vậy, có thể sử dụng
hoạt tính men ChE như là một đánh dấu sinh học chỉ thị môi trường bị nhiễm
thuốc kháng sinh.

ii



MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................. i
TÓM TẮT...................................................................................................... ii
MỤC LỤC .................................................................................................... iii
DANH SÁCH BẢNG .................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH..................................................................................... vi
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT...................................................................... vii
Phần 1 ............................................................................................................ 1
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
Phần 2 ............................................................................................................ 3
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU............................................................................... 3
2.1. Đặc điểm sinh học cá rô phi (Oreochromis niloticus)......................... 3
2.1.1. Phân loại................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý ........................................................ 3
2.1.3.Đặc điểm dinh dưỡng.................................................................. 4
2.1.4. Đặc diểm sinh trưởng ................................................................ 4
2.2.Tình hình nuôi cá rô phi trên thế giới và trong nước............................ 4
2.2.1.Tình hình nuôi cá rô phi trên thế giới.......................................... 4
2.2.2.Tình hình nuôi cá rô phi ở Việt Nam........................................... 5
2.3. Sơ lược về Enrofloxacine và Ciprofloxacine................................................ 6
2.3.1. Sơ lược về Enrofloxacine.................................................................... 6
2.3.2. Sơ lược về Ciprofloxacine .................................................................. 6
2.3.3. Nguồn gốc của Enrofloxacine và Ciprofloxacine trong đối tượng thủy
sản........................................................................................................................... 7

2.4. Sơ lược về Acethylcholine và Catalase............................................... 7
2.4.1. Enzyme Acethylcholine (AChE)................................................ 7
2.4.2. Enzyme Catalase (CAT) ............................................................ 8

2.5. Một số nghiên cứu sinh hoá trên cá .................................................... 8
Phần 3 .......................................................................................................... 10
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 10
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài............................................... 10
3.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................. 10
3.2.1.Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ...................................................... 10
3.2.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................. 10
3.2.3. Thức ăn.................................................................................... 11
3.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................. 11
3.3.1 Trộn kháng sinh vào thức ăn ..................................................... 11
3.3.2 Bổ sung kháng sinh vào nước ................................................... 12
iii


3.4. Phương pháp thu mẫu ...................................................................... 13
3.5. Phương pháp phân tích enzyme ................................................................. 13

3.5.1. Nghiền mẫu ............................................................................. 13
3.5.2. Phương pháp phân tích ............................................................ 14
3.6. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 18

Phần 4 .......................................................................................................... 19
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................... 19
4.1. Các yếu tố môi trường...................................................................... 19
4.2. Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh đến hoạt tính của enzyme CAT và
ChE trên cá rô phi.............................................................................. 19
4.2.1. Trộn kháng sinh vào thức ăn .................................................... 19
4.2.2. Bổ sung kháng sinh vào nước .................................................. 25
Phần 5 .......................................................................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................... 31

5.1 Kết luận ............................................................................................ 31
5.2 Đề xuất ............................................................................................. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 32
PHỤ LỤC .................................................................................................... 35

iv


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1: Nhiệt độ, Oxy, pH trung bình trong quá trình thí nghiệm ..................19
Bảng 4.2 Nồng độ Enrofloxacine trong nước ....................................................19
Bảng 4.3 Nồng độ Ciprofloxacine trong nước...................................................20

v


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Sản lượng nuôi cá rô phi trên thế giới (FAO, 2010) ..............................5
Hình 4.1 Sự biến đổi hoạt tính của enzyme ChE trong não của cá rô phi khi trộn
kháng sinh vào thức ăn......................................................................................22
Hình 4.2 Sự biến đổi hoạt tính của enzyme CAT trong cơ của cá rô phi khi trộn
kháng sinh vào thức ăn......................................................................................24
Hình 4.3 Sự thay đổi nồng độ Enrofloxacine trong thí nghiệm theo thời gian....25
Hình 4.4 Sự thay đổi nồng độ Ciprofloxacine trong thí nghiệm theo thời gian ..25
Hình 4.5 Nghiệm thức đối chứng ......................................................................26
Hình 4.6 Bể thí nghiệm chứa kháng sinh Enrofloxacine (100 mg/L)/
Ciprofloxacine (50 mg/L) .................................................................................26
Hình 4.7 Sự biến đổi hoạt tính của enzyme ChE trong não của cá rô phi khi bổ
sung kháng sinh vào nước .................................................................................28
Hình 4.8 Sự biến đổi hoạt tính của enzyme CAT trong cơ của cá rô phi khi bổ

sung kháng sinh vào nước .................................................................................30

vi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ChE

Cholinesterase

CAT

Catalase

AChE

Acetylcholinesterase

AChI

Acetylcholinesterase iodide

BSA

Albumine bovine Sigma

DTNB

Dithiobisnitrobenzoate


HPLC

High-Performance Liquid Chromatography

KS

Kháng sinh

vii


Phần 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Cá rô phi (Oreochromis niloticus) là loài thủy sản được nuôi rộng rãi
trên 100 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới nhờ vào đặc tính thích nghi tốt
với các điều kiện môi trường, lớn nhanh, ít bệnh, đẻ nhiều… Ngoài ra thịt cá
rô phi thơm ngon nên được rất nhiều các thị trường lớn nhỏ trên thế giới ưa
chuộng đặc biệt là thị trường Mỹ và thị trường EU ( />Ở nước ta, cá rô phi đang được nuôi khá phổ biến do chúng có thể nuôi
ở các hệ thống nuôi khác nhau, có thể nuôi đơn hay nuôi ghép với các loài
thủy sản khác để gia tăng sản lượng, hạn chế dịch bệnh, tăng thu nhập... Trong
đó, phần lớn sản lượng cá rô phi được nuôi ở ao, lồng bè trên sông, hồ chứa
nước ngọt (Phạm Anh Tuấn và ctv (2008) trích bởi Đỗ Văn Bước (2010))
Hiên nay, cùng với sự phát triển của ngành nuôi trồng thủy sản, các loại
thuốc kháng sinh ngày càng trở nên đa dạng và phong phú với nhiều tên
thương mại khác nhau. Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc kháng sinh nói chung
và nhóm Fluoroquinolone nói riêng có thể làm nguồn thực phẩm cung cấp cho
con người còn chứa một lượng nhỏ chất kháng sinh. Điều này gây ảnh hưởng
không nhỏ đến chất lượng sản phẩm xuất khẩu cũng như giá trị xuất khẩu thủy
sản của cả nước. Theo thống kê của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản

Việt Nam, từ đầu năm 2011 đến tháng 11/2011, có tổng cộng 43 lô tôm Việt
Nam bị Nhật Bản cảnh báo nhiễm Enrofloxacine. Riêng 2 tháng đầu năm 2012
đã có 19 lô hàng xuất khẩu thủy sản bị nhiễm chất này. Trước tình hình đó Bộ
Nông nghiệp & PTNT đã ban hành Thông tư số 20/2010/TT-BNNPTNT sửa
đổi, bổ sung Thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17/3/2009, trong đó đã bổ
sung Enrofloxacine và Ciprofloxacine vào Danh mục hóa chất, kháng sinh
cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản.
Tuy nhiên, các nghiên cứu mang tính chất cơ bản về sinh lý học của cá
rô phi như phản ứng của cơ thể với các điều kiện sống hay stress với thuốc trừ
sâu, thuốc kháng sinh vẫn chưa được quan tâm và tiến hành, mặc dù nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra rằng tình trạng sinh lý học của một số đối tượng thủy sản
chịu ảnh hưởng nhiều bởi môi trường sống: mật độ nuôi, nhiệt độ, độc chất…
Vì vậy đề tài “Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh Enrofloxacine và
Ciprofloxacine đến enzyme cholinesterase và catalase của cá rô phi
(Oreochromis niloticus)” được đề xuất thực hiện.

8


1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm hiểu mức độ ảnh hưởng của 2 loại thuốc kháng sinh Enrofloxacine
và Ciprofloxacine đến sự thay đổi hoạt tính của cholinesterase ở não và
catalase ở cơ của cá rô phi (Oreochromis niloticus). Từ đó có thể cung cấp
những số liệu khoa học cơ bản về những đặc điểm sinh hoá của cá rô phi, đưa
ra những khuyến cáo hợp lý trong việc sử dụng thuốc nhằm làm giảm mức độ
ảnh hưởng của thuốc kháng sinh đến sự phát triển của cá nuôi, đồng thời làm
cơ sở cho các nghiên cứu khoa học tiếp theo.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá sự ảnh hưởng của Enrofloxacine và Ciprofloxacine lên sự
thay đổi hoạt tính của các enzyme ChE (Cholinesterase) trong não và CAT

(Catalase) trong cơ của cá rô phi trong điều kiện thí nghiệm: trộn kháng sinh
vào thức ăn và bổ sung kháng sinh vào nước.
1.4. Thời gian thực hiện nghiên cứu
Thời gian thực hiện: Từ tháng 2 năm 2012 đến tháng 8 năm 2012

9


Phần 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm sinh học cá rô phi (Oreochromis niloticus):
2.1.1. Phân loại
Cá rô phi Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1958) được phân loại như
sau:
Giới: Animalia (giới động vật)
Ngành: Chordata (có dây sống)
Lớp: Actinopterygii (lớp phụ cá vây tia)
Bộ: Perciformes (cá vược)
Họ: Cichlidae
Giống: Oreochromis
Loài: Oreochromis niloticus
Dựa vào đặc điểm của hình thái bên ngoài và tập tính sinh sản cá rô phi
được phân thành 3 giống: Tilapia gồm những loài ấp trứng trên giá thể; giống
Sarotherodon gồm các loài ngậm trứng và cá con trong miệng; giống
Oreochromis là loại cá đực làm tổ đẻ, chỉ có cá cái ấp trứng trong miệng
(Phạm Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2004)
2.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý
Cá rô phi (Oreochromis niloticus) có đặc điểm toàn thân phủ vẩy, ở
phần lưng có màu xám nhạt và phần bụng có màu xám ngà hoặc xanh nhạt.
Trên thân có từ 7 – 9 vạch chạy từ phía lưng xuống bụng.. Vây lưng của cá

chạy dài liên lục gồm 15 – 18 gai cứng và 11 – 13 tia mềm. Vây hậu môn có 3
gai và 9 – 11 tia mềm (). Cá có kích cỡ thương phẩm
tương đối lớn, tăng trưởng nhanh.
Các loài cá rô phi được nuôi hiện nay đều có khả năng chịu đựng và
thích ứng cao với sự thay đổi của môi trường, có thể sống ở cả nước ngọt lẫn
nước lợ. Khoảng pH thích hợp cho sự phát triển của cá là 7 – 8, khi pH từ 5 –
10 cá vẫn có thể sống được. Cá có thể chịu đựng được trong môi trường có
nồng độ oxy hòa tan thấp (dưới 1 mg/L) (Đoàn Khắc Độ, 2008). Theo
Harrison (2006) trích bởi Đỗ Văn Bước (2010), cá rô phi sẽ tăng trưởng tốt khi
nhiệt độ dao động từ 25 – 32 oC, cá sẽ ngừng ăn khi nhiệt độ giảm thấp đến 20
o
C và chết nếu nhiệt độ xuống dưới mức 11 oC.

10


2.1.3.Đặc điểm dinh dưỡng
Cá rô phi là loài cá ăn tạp thiêng về thực vật, thức ăn chủ yếu là tảo và
mùn bả hữu cơ. Tuy nhiên, tính ăn của cá sẽ thay đổi theo từng giai đoạn phát
triển khác nhau của cơ thể và điều kiện môi trường. Tính ăn của loài chỉ được
thể hiện rõ từ giai đoạn cá hương.
Ngoài ra, cá còn có thể ăn được thức ăn bổ sung như cám gạo, bột gỗ,
đỗ tương, bột cá và các loại phụ phẩm nông nghiệp khác. Theo kết quả nghiên
cứu của Trần Lê Cẩm Tú và ctv (2008) cá rô phi có khả năng tiêu hóa được
khoai ngọt tương đương với cám sấy, có thể phối hợp lượng khoai ngọt trong
khẩu phần công thức thức ăn cho cá rô phi là 20%.
2.1.4. Đặc diểm sinh trưởng
Tốc độ tăng trưởng của cá rô phi phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ môi
trường, thức ăn, mật độ thả và kỹ thuật chăm sóc. Khi nuôi thâm canh cá lớn
nhanh hơn khi nuôi bán thâm canh hay là nuôi ghép. Trong ao nuôi cá từ

hương lên giống, cá rô phi có tốc độ sinh trưởng khá nhanh từ 15 – 20 g/tháng
và từ tháng nuôi thứ 2 đến tháng nuôi thứ 6 tăng trưởng bình quân của cá có
thể đạt 2,8 - 3,2 g/con/ngày. Cá rô phi có thể đạt trọng lượng bình quân trên
500 g/con sau 5 – 6 tháng nuôi ().
2.2.Tình hình nuôi cá rô phi trên thế giới và trong nước
2.2.1.Tình hình nuôi cá rô phi trên thế giới
Năm 2000, cá rô phi thậm chí còn chưa có tên trong danh sách 10 sản
phẩm thủy sản hàng đầu tiêu thụ tại Mỹ, nhưng đến năm 2011, nó đã ở vị trí
thứ 5 và có khả năng vượt lên hạng 2 hoặc 3 vào năm 2015 (Tạp chí Thương
mại thủy sản)
Theo thống kê của FAO, tổng sản lượng cá rô phi trên thế giới đang
tiếp tục tăng một cách ngoạn mục, trong đó sản lượng nuôi chiếm 70%.
Trong giai đoạn 5 năm từ 2003 – 2007, sản lượng cá nuôi tăng đến 60%, từ
1,58 triệu tấn lên 2,51 triệu tấn. Theo báo cáo sơ bộ của FAO, sản lượng
cá rô phi nuôi năm 2009 đã vượt quá 3 triệu tấn. Nhà sản xuất cá rô phi lớn
nhất thế giới là Trung Quốc, chiếm đến 45% tổng sản lượng toàn cầu.
Các nhà sản xuất lớn khác đáng chú ý có Ai Cập, Inđônêxia, Philippin,
Thái Lan, Braxin, Đài Loan, Honđurat, Côlômbia, Êcuađo, ... Trong sản
lượng cá rô phi nuôi, loài rô phi vằn (Oreochromis niloticus) chiếm đến 85%
(). Đến nửa đầu năm 2011, sản lượng xuất khẩu cá rô phi
củaTrung Quốc tăng 2,1% so với cùng kỳ năm 2010, đạt gần 140 ngàn tấn,

11


trong
đó
45%
là
cá

rô
( />
phi

phile

đông

lạnh

Hình 2.1 Sản lượng nuôi cá rô phi trên thế giới (FAO, 2010)

2.2.2.Tình hình nuôi cá rô phi ở Việt Nam
Năm 1973 thì cá rô phi vằn được nhập vào nước ta. So với loài rô phi
đen (Oreochromis mossambicus) thì loài này có nhiều ưu điểm hơn như lớn
nhanh, to con hơn nên người nuôi dễ chấp nhận. Chúng sống được ở cả ao hồ
nước ngọt lẫn nước lợ cửa sông. Nhiều nước trên thế giới đã chọn loài cá này
là loài nuôi chủ lực, mang lại hiệu quả kinh tế khá rõ rệt, nhất là ở các nước
Châu Á ().
Sản lượng cá rô phi ở nước ta hàng năm đều tăng, diện tích nuôi được
mở rộng. Năm 2005 thì diện tích nuôi cá rô phi đạt 29.717 ha, sản lượng đạt
54.487 tấn, chủ yếu là nuôi nước ngọt với các hình thức nuôi là quảng canh và
bán thâm canh. Sản phẩm cá rô phi tiêu thụ nội địa là 95 – 98%, trong khi đó
xuất khẩu chỉ đạt khoảng 869 tấn đạt giá trị 1,9 triệu USD. Theo kế hoạch đến
2015 thì sản lượng đạt 300 ngàn – 350 ngàn tấn, diện tích nuôi 59.150 ha và
xuất khẩu khoảng 30% sản lượng đạt giá trị 100 triệu USD
().
2.3. Sơ lược về Enrofloxacine và Ciprofloxacine
Enrofloxacine (ENR) và Ciprofloxacine (CIP) là loại kháng sinh được
dùng phổ biến trong nông nghiệp, thủy sản và cả trong y học, thuộc nhóm

kháng sinh fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi khuẩn gram dương và
gram âm. Nhóm kháng sinh này tác động lên vi khuẩn gây nhiễu quá trình

12


hình thành enzyme tổng hợp DNA rất cần thiết cho quá trình tổng hợp DNA
của vi khuẩn (Bùi Kim Tùng, 2001 trích bởi Nguyễn Ngọc Hiền)
2.3.1. Sơ lược về Enrofloxacine
a. Tên gọi
1-Cyclopropyl-7-(4-ethyl-1-piperazinyl)-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-3quinolonecarboxylic acid
Công thức hóa học: C19H22FN3O3
Công thức cấu tạo:

( />b. Tính chất vật lý của Enrofloxacine
Là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7, có
hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8-9
2.3.2. Sơ lược về Ciprofloxacine
a. Tên gọi
1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-7 (piperazin-1-YL)-quinoline-3-carboxylic acid
Công thức hóa học: C17H18FN3O3
Công thức cấu tạo: ( />
13


b. Tính chất vật lý của Ciprofloxacine
Là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong
ethanol, methylene chloride. Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai
giá trị pKa là 6,0 và 8,8
2.3.3. Nguồn gốc của Enrofloxacine và Ciprofloxacine trong đối tượng

thủy sản
Enrofloxacin và Ciprofloxacin được đưa vào cơ thể động vật thủy sản
thông qua việc trộn vào thức ăn hoặc cho vào môi trường sống. Khi động vật
ăn, hoặc sống trong môi trường có thuốc kháng sinh hoặc tiêm để chữa bệnh
thì kháng sinh sẽ xâm nhập vào cơ thể
Nhóm fluoroquinolone nói chung (Ciprofloxacin, Enrofloxacin nói
riêng) là nhóm kháng sinh có độc tính cao, chỉ sử dụng với liều nhất định,
được quy định rất chặt chẽ và đều thuộc nhóm kháng sinh cấm sử dụng trong
nuôi trồng thủy sản. Trường hợp tồn dư 5 ppb fluoroquinolone, nếu một người
ăn trung bình 150 – 200 g thịt/ngày thì lượng fluoroquinolone đưa vào cơ thể
khoảng 2 μg/ngày. Với lượng này sẽ không gây độc tính ngay, nhưng nếu tích
lũy lâu dài hoặc ăn quá nhiều sẽ bị tác hại.
2.4. Sơ lược về Acethylcholine và Catalase
2.4.1. Enzyme Acethylcholine (AChE)
Cholinesterase thường được chia thành hai dạng: acetylcholinesterase
(AChE) và butyrycholinesterase (BChE) hay pseudocholinesterase (PChE)
(Masoulie et al, 1998: trích dẫn Nguyễn Trọng Hồng Phúc, 2009). Trong đó
AChE đóng vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền tín hiệu thần kinh là thuỷ
phân chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin ở khe synapse (Talesa et al., 1992,
trích dẫn Nguyễn Trọng Hồng Phúc, 2009).
Enzyme AChE là một chất hóa học thần kinh đóng vai trò như một tác
nhân dẫn truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh
(Ellman et al., 1961). AChE rất cần thiết cho các chức năng bình thường của

14


thần kinh trung ương và thần kinh ngoại biên. AChE phân bố nhiều ở mô thần
kinh và cũng có nhiều ở các mô khác. AChE khi bị ức chế dẫn đến sự tích tụ
của acethylcholine tại các synap (các khoảng trống giữa hai tế bào thần kinh),

làm mất chức năng dẫn truyền của các xung thần kinh (Hart, 1993). Trong
nghiên cứu độc học, AChE được sử dụng nhiều và có vai trò như chất đánh
dấu sinh học (bio-marker). Theo Đỗ Thị Thanh Hương (1997) thì men AChE
có thể dùng như chất chỉ thị sinh học để đánh giá cá và môi trường bị nhiễm
bẩn thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ và gốc cacbamate. Hoạt tính AChE thường
được tìm thấy trong não cao hơn so với các cơ quan khác trong cơ thể cá
(Nguyễn Văn Công và ctv, 2006).
2.4.2. Enzyme Catalase (CAT)
CAT là một trong những enzyme chống oxy hóa phân bố tại các
perixosome có vai trò quan trọng trong việc loại bỏ H2O2, chất được sinh ra
trong quá trình β-oxy hóa chuỗi axit béo mạch dài. CAT được nghiên cứu để
đánh giá sự tác động của chất độc cũng như khả năng của cơ thể chống lại các
gốc oxy hóa (ROS − Reactive Oxygen Species) do chất độc gây ra. Chance et
al. (1979) cho biết CAT là enzyme hiện diện ở hầu hết tế bào động vật và thực
vật (trích dẫn bởi Tort et al., 2005). CAT nhanh chóng kết hợp với H2O2 để
phân cắt H2O2 thành O2 và H2O (Tort et al., 2005).
2.5. Một số nghiên cứu sinh hoá trên cá
Theo Đỗ Thị Thanh Hương (1998) thì hoạt tính của men AChE trong
huyết tương của cá chép, cá rô phi và cá mè vinh bị ức chế rất mạnh trong
vòng 96 giờ đầu khi tiếp xúc với Basudin 40EC. Mức độ ức chế >80% ở nồng
độ an toàn và chỉ dẫn và >90% ở nồng độ LC50 - 96 giờ. Khả năng phục hồi
của men bắt đầu sau ngày thứ 10 và rất chậm, ở những nghiệm thức nồng độ
an toàn và chỉ dẫn đạt 70-90% và những nghiệm thức nồng độ LC50 96 giờ chỉ
đạt 60-80% so với đối chứng sau 30 ngày. Như vậy, dựa vào mức độ hoạt tính
của men AChE có thể dùng như một chất chỉ thị sinh học để đánh giá tình
trạng sức khỏe cá và môi trường bị nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ và gốc
carbamate.
Theo Trần Văn Phú (2008), ảnh hưởng của Enrofloxacine lên một số
chỉ tiêu sinh hóa của cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) trong điều kiện thí
nghiệm cho rằng sau 171 giờ cho ăn kháng sinh Enrofloxacinee đã làm biến

đổi hoạt tính 4 loại men: ChE, CAT, GST, LPO khi khảo sát ở não, mang, gan,
cơ của cá tra giai đoạn cá giống. Kháng sinh Enrofloxacine có tác động gây ức
chế làm giảm hoạt tính của ChE ở tất cả nghiệm thức. Sau khi ngừng cho ăn
kháng sinh Enrofloxacine 24 giờ, thì hoạt tính ChE có xu hướng giảm chậm và

15


bắt đầu tăng dần trở lại sau 171 giờ. Trong khi đó kháng sinh Enrofloxacine
làm tăng hoạt tính GST, CAT, LPO ở các cơ quan như cơ, mang và gan cá.
Hoạt tính của CAT, ChE, LPO được tìm thấy cao nhất ở não và GST cao nhất
ở gan.
Nguyễn Thúy Quyên (2010), ảnh hưởng của hoạt chất quinalphos lên
hoạt tính men cholinesterase của cá chép (Cyprius carpio) cho rằng giá trị
LC50 – 96h của quinalphos lên cá chép (8 ±1 g) là 0,76 mg/l. Hoạt tính ChE
cao nhất được ghi nhận ở não cá kế đến là cơ và thấp nhất là mang. Nồng độ
quinalphos càng cao hoạt tính ChE ở não càng giảm và khác biệt có ý nghĩa
thống kê so với nghiệm thức đối chứng (p < 0,05). Sau 28 ngày, nồng độ
thuốc 0,076 mg/l và 0,152 mg/l, hoạt tính ChE ở não và mang phục hồi hoàn
toàn. Ở nồng độ 0,38 mg/l hoạt tính ChE phục hồi ở mang và não phục hồi rất
chậm sau 28 ngày. Khả năng phục hồi hoạt tính ChE ở cơ cá chép là rất chậm
đối với các nồng độ có thuốc trong thời gian thí nghiệm.
Nguyễn Ngọc Hiền (2007), nghiên cứu ảnh hưởng kép của mật độ nuôi
và cho ăn kháng sinh Enrofloxacine (cho ăn trong 171 giờ ) lên một số chỉ tiêu
sinh hóa cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) thì thấy có sự biến dộng của 4
loại men AChE, CAT, GST, LPO ở cơ mang, gan, não. Enrofloxacine làm
giảm hoạt tính của AChE ở tất cả nghiệm thức nhưng làm tăng hoạt tính cùa
GST, CAT, LPO ở cơ, mang, gan, não của cá (p < 0,05). Hoạt tính của CAT,
LPO, AChE được tìm thấy cao nhất ở não và GST cao nhất ở gan.
Hồ Thị Thanh Tuyến (2008) khảo sát một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa

của cá tra nuôi ở hai mật độ nuôi khác nhau khi sử dụng kháng sinh
Enrofloxacine thì thấy mật độ nuôi và kháng sinh làm ảnh hưởng đến chỉ tiêu
sinh hóa của cá. Hoạt tính ChE giảm và hoạt tính GST và LPO tăng sau khi cá
ăn kháng sinh và hoạt tính các enzyme này dần dần hoạt động trở lại sau khi
ăn kháng sinh 7 ngày. Hoạt tính CAT tăng lên sau khi cá ăn kháng sinh và bắt
đầu hồi phục lại sau 3 ngày ở các ao nuôi mật độ thấp và sau 7 ngày ở các ao
nuôi mật độ cao
Lê Kim Ngọc (2009) nghiên cứu, ảnh hưởng của Florfenicol lên sinh
hóa, huyết học và tồn lưu trên cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) nuôi
trong bể. Thời gian cho ăn kháng sinh Florfenicol, cá chỉ tiêu thụ 75,1 – 89,2
lượng thức ăn theo dự kiến, vì thế giảm cho ăn khi dùng kháng sinh là cần
thiết. Sử dụng kháng sinh Florfenicol trong thời gian 7 ngày liên tục gây ảnh
hưởng đến hoạt tính của các enzym. Florfenicol ức chế hoạt tính ChE ở não và
gan, đồng thời làm tăng hoạt tính của LPO, GST, CAT ở não, gan, cơ và
mang. Sau khi cá ngưng ăn kháng sinh, hoạt tính các enzym này có xu hướng

16


phục hồi. Tuy nhiên mức độ và thời gian phục hồi phụ thuộc vào nồng độ
kháng sinh và loại mô.
Qua các nghiên cứu trên cho thấy, các loài cá dễ chịu tác động của nhân
tố bên ngoài cũng như sự thay đổi của môi trường. Thông qua việc phân tích
sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa ở cá có thể đánh giá được mức độ ảnh
hưởng của các nhân tố bên ngoài đến sức khỏe cá.

17


Phần 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 02/2012 đến tháng 8/2012
- Địa điểm nghiên cứu được thực hiện tại khu thí nghiệm sinh lý của Khoa
Thuỷ Sản, trường Đại học Cần Thơ.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1.Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Bể composite thể tích 2 m 3, 4 m3 dùng để trữ và thuần dưỡng trước khi
tiến hành thí nghiệm; bể 100 lít dùng bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của
Enrofloxacine và Ciprofloxacine lên một số chỉ tiêu sinh hóa của cá rô phi.
- Máy so màu quang phổ 18 giếng (varian Cary 50 Conc, Bio-Rad). Máy
đo oxy (DO), máy đo pH và nhiệt độ
- Máy ly tâm lạnh (Mikkor 22R – hettich, Đức )
- Máy nghiền mẫu (Ultra Turax T18 basic, Mỹ)
- Máy votex (VELP Scientifica, Europe)
- Tủ lạnh trữ hóa chất (Toshiba, Nhật), tủ -20oC,
- Tủ -80 oC
- Micropipet, eppendoft, cuvet
- Cân điện tử 4 số lẻ (Metter Toledo AG245, Switzerland), máy vi tính.
- Và các loại hóa chất dùng cho các phản ứng phân tích sinh hóa.
- Nguồn nước sử dụng cho thí nghiệm cấp từ nước máy và được sục khí
liên tục.
3.2.2. Đối tượng nghiên cứu
Cá rô phi (Oreochromis niloticus) cỡ 8 - 10 g/con được mua từ trại
giống ở Cần Thơ, màu sắc tươi sáng tự nhiên, đồng đều, hoạt động khoẻ
mạnh, không bị xây xát, không dị hình và không có dấu hiệu bệnh lý để làm
thí nghiệm.
Cá sau khi mua về sẽ được trữ trong các bể composite 2 m3, 4 m 3 từ 14
- 21 ngày để quen với điều kiện sống trong bể và môi trường nước tại khu thí
nghiệm Sinh lý – Khoa Thủy Sản, khi cá ổn định thì bố trí thí nghiệm.


18


3.2.3. Thức ăn
Trong thời gian thuần dưỡng cá cũng như trong thí nghiệm sinh hóa
cho cá ăn thức ăn viên nổi Cargill có hàm lượng đạm 30% cho ăn 2 lần /ngày
theo nhu cầu.
3.3. Bố trí thí nghiệm
Khi cá khỏe mạnh ta tiến hành bố trí cá vào các bể composite 100 lít,
tiếp tục thuần dưỡng cá trong môi trường bể mới trong thời gian 5 – 7 ngày
sau đó bắt đầu thí nghiệm.
Trong thí nghiệm, Enrofloxacin và Ciprofloxacin lần lượt sẽ được gây
nhiễm theo 2 cách khác nhau: trộn với thức ăn và bổ sung trực tiếp vào nước.
3.3.1 Trộn kháng sinh với thức ăn
Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức trong đó có 1 nghiệm thức đối chứng
và 4 nghiệm thức có nồng độ thuốc khác nhau. Nồng độ kháng sinh được lựa
chọn dựa trên liều lượng Enrofloxacine và Ciprofloxacine thường được sử
dụng trong các trang trại cá da trơn: 5 g/kg thức ăn (Tu et al., 2006 trích bởi
Tu et al., 2009). Mỗi nồng độ tương ứng với một nghiệm thức được bố trí
hoàn toàn ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Bố trí với mật độ 24 con/bể (8 – 10
g/con) với 60 lít nước. Thời gian thí nghiệm là 14 ngày.
Chuẩn bị thức ăn có trộn kháng sinh: kháng sinh có dạng bột sẽ được
hoà tan vào nước. Sau đó phun đều lên thức ăn rồi để ráo ở nhiệt độ phòng.
 Thí nghiệm 1: Sử dụng kháng sinh Enrofloxacin
Các nghiệm thức bao gồm:
Nghiệm thức 1: Nghiệm thức đối chứng (không có thuốc)
Nghiệm thức 2: 1 g/kg thức ăn
Nghiệm thức 3: 2,5 g/kg thức ăn
Nghiệm thức 4: 5 g/kg thức ăn

Nghiệm thức 5: 10 g/kg thức ăn
Trong 5 ngày đầu, cá sẽ được cho ăn thức ăn có trộn thuốc kháng sinh.
Mỗi ngày cho cá ăn 2 lần (3% trọng lượng thân) sáng – chiều. Sau 5 ngày, ta
ngừng cho ăn thức ăn có trộn thuốc kháng sinh và tăng khẩu phần ăn lên 5%
trọng lượng thân.
 Thí nghiệm 2: Sử dụng kháng sinh Ciprofloxacin
Các nghiệm thức bao gồm:
19


Nghiệm thức 1: Nghiệm thức đối chứng (không có thuốc)
Nghiệm thức 2: 0,5 g/kg thức ăn
Nghiệm thức 3: 1,12 g/kg thức ăn
Nghiệm thức 4: 2,5 g/kg thức ăn
Nghiệm thức 5: 5 g/kg thức ăn
Quá trình tiến hành thí nghiệm tương tự như đối với kháng sinh
Enrofloxacine
* Chăm sóc cá thí nghiệm
Trong thời gian thí nghiệm, các bể sục khí liên tục và được hút cặn
hàng ngày. Từ ngày thứ 2 tiến hành thay 30% lượng nước trong bể.
Theo dõi các hoạt động của cá ghi nhận số cá chết và bắt ra khỏi bể thí
nghiệm (nếu có) để tránh làm ảnh hưởng đến chất lượng nước.
3.3.2 Bổ sung kháng sinh vào nước
Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức và được bố trí tương tự như khi trộn
kháng sinh vào nước. Bố trí thí nghiệm với mật độ 24 con/bể với 60 lít nước.
Thời gian thí nghiệm là 14 ngày.
 Thí nghiệm 3: Sử dụng kháng sinh Enrofloxacin
Các nghiệm thức bao gồm:
Nghiệm thức 1: Nghiệm thức đối chứng (không có thuốc)
Nghiệm thức 2: 0,1 mg/L

Nghiệm thức 3: 0,8 mg/L
Nghiệm thức 4: 10 mg/L
Nghiệm thức 5: 100 mg/L
Trong 5 ngày đầu, mỗi ngày thay 30% nước sau đó sẽ thêm thuốc
kháng sinh vào bể với nồng độ giống với khi bắt đầu thí nghiệm. Mỗi ngày
cho cá ăn 2 lần (3% trọng lượng thân) sáng – chiều. Bắt đầu từ ngày thứ 6 sẽ
ngưng việc bổ sung kháng sinh vào nước, cho cá ăn khẩu phần ăn 5% trọng
lượng thân và thay 30% nước 1 lần/ngày.
 Thí nghiệm 4: Sử dụng kháng sinh Ciprofloxacin
Các nghiệm thức bao gồm:
Nghiệm thức 1: Nghiệm thức đối chứng (không có thuốc)

20


Nghiệm thức 2: 0,05 mg/L
Nghiệm thức 3: 0,4 mg/L
Nghiệm thức 4: 5 mg/L
Nghiệm thức 5: 50 mg/L
Quá trình tiến hành thí nghiệm tương tự như đối với kháng sinh
Enrofloxacine
3.4.

Phương pháp thu mẫu

Thu mẫu cá 3 con/lần/bể vào các thời điểm: ngày 1 (trước khi gây
nhiễm Enrofloxacine/Ciprofloxacine) và sau khi gây nhiễm sẽ thu mẫu vào
ngày 3, ngày 5 và ngày 14.
Cá được thu mẫu ngẫu nhiên từ các bể thí nghiệm bằng vợt lưới. Mỗi
bể thu 3 con và thu tất cả các nghiệm thức.

Thu mẫu phân tích sinh hóa: tất cả dụng cụ thu mẫu và mẫu đều được
đặt trên nước đá để giữ lạnh trong quá trình thu mẫu.
+ Não: Não là cơ quan được thu trước gỡ bỏ các chỉ máu bao quanh
não được lấy từ đầu cá, chuyển sang đĩa petri sạch và lạnh. Máu cá động trên
não được tách ra bằng cách lăn trên giấy thấm, não được đựng trong eppendoft
1,5ml
+ Sau đó tiến hành thu cơ: cắt nhuyễn cơ cá (không lấy da), trộn đều cơ
của tất cả cá trong cùng 1 bể (3 con) cho vào ependorf, mẫu được giữ ở tủ âm
có nhiệt độ -800C cho đến khi phân tích
+ Trong đó: não được dùng để phân tích ChE và cơ dùng để phân tích
CAT.
Các yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, Oxy) được thu cùng thời điểm với
thu các chỉ tiêu sinh hóa.
3.5. Phương pháp phân tích enzyme
3.5.1. Nghiền mẫu
Trước khi phân tích hoạt tính men, toàn bộ mẫu cơ, não được giải đông
và được nghiền bằng máy nghiền mẫu. Cân trọng lượng mẫu (từ 0,1-0,3g) sau
đó cho từng bộ phận cá thu được là cơ và não vào ống thủy tinh sạch chứa 1ml
dung dịch đệm KH2PO4/K2HPO4 có pH=7,5. Nghiền mẫu trong các điều kiện
lạnh, thêm 1ml dung dịch đệm để duy trì độ lạnh và thêm 1ml dung dịch đệm
để tráng máy nghiền. Chuyển dung dịch vừa mới nghiền sang eppendoft 1,5ml
để tiến hành ly tâm ở điều kiện 4 0C, vận tốc 10000 vòng trong 10 phút. Sau đó
21


hút lấy phần nước trong nổi ở trên và giữ trong eppendoft 1,5ml ở -800C cho
đến khi phân tích.
3.5.2. Phương pháp phân tích
a) Cholynesterase (ChE)
Phân tích theo phương pháp của Ellman và ctv (1961) có bổ sung.

Trong quá trình phân tích sử dụng acetylthiocholine iodide (AChI) như là cơ
chất của AChE. AChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetat bởi sự xúc
tác của AChE; những phân tử thiocholine được tạo ra sẽ phản ứng với
dithiobisnotrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng, cường độ màu
đậm dần theo thời gian. Hoạt tính ChE được đo bằng máy so màu quang phổ.
Phương trình phản ứng minh họa:
Acetylthiocholine iodide ========> thiocholine + acetate
Thiocholine + dithiobisnotrobenzoate ====> sản phẩm có màu vàng.
Qui trình phân tích:
+ Chuẩn bị hóa chất:
Sodium phosphate (Na2HPO4/NaH2PO4) nồng độ 50 mM, pH = 7,4
1,4 g/250mL H2O Na2HPO4
0,358 g/250mL H2O NaH2PO4
DTNB (5,5 dithiobis 2nitrobenzoic a-xit) 167 µM, M = 396,3g
DTNB 167mM: 66,1 mg/ml Sodium phosphate 50 mM, pH=7,4
Pha loãng 1.000 lần

DTNB 167mM

============>

DTNB 167 µM

=> 10µL DTNB 167mM + 9.990µL sodium phosphates => DTNB 167 µM
Cơ chất Acetylthiocholine iodine (ATChI, Sigma) 30 mM
8,67 mg/1ml Sodium phosphate, pH=7,5.
Bảng 3.1 : Qui trình phân tích ChE
Hóa chất

Mẫu trắng(µM)


Mẫu phân tích (µM)

DTNB (nồng độ cuối 150 µM)

900

900

Sodium phosphate

50

/

/

50

Mẫu

22


Cơ chất (nồng độ cuối 1,5 mM)

50

50


Đọc ở bước sóng 412 nm trong 10 phút

Công thức tính:
Hệ số hấp thu * pha loãng
A = -------------------------------------------(thể tích mẫu (ml) * 0,0136)

(3.1)

R= A/protein (mg/ml)
R = số mole cơ chất thủy phân/phút/mg protein
0,0136 là hệ số ATChI chuyển thành thiocholine và acetat.
b) Catalase (CAT)
Phân tích theo phương pháp của Baudhuin et al. (1964) có bổ sung.
Catalase là enzyme hiện diện trong peroxisom của hầu hết các tế bào hiếu khí
và có chức năng bảo vệ tế bào chống lại độc chất hydrogen peroxide bằng việc
phân hủy H2O2.
2H2O2 ========>

2H2O

+ O2

Nguyên lý: Phương pháp thông thường xác định CAT dựa trên sự thay
đổi của dung dịch đo ở bước sóng 420 nm. Phương pháp yêu cầu trong đo
quang phổ phải sử dụng curvet thạch anh để tránh sự nhiễu. Titanium
oxisulfate (TiOSO4) phản ứng với H2O2 mà không bị khử bởi CAT sau 6 phút.
Qui trình phân tích:
Trước tiên, dung dịch đầu BC được chuẩn bị gồm 1 g Albumin bovine
(BSA, sigma); 100 mL Imidazol buffer 0,02M (1,3616g/l), pH 7,0.
Chuẩn bị dung dịch TiOSO4: 1,7 g TiOSO4 pha trong 500mL H2SO4

2N. Đun sôi trong 10 phút và để nguội dung dịch đến ngày hôm sau. Pha loãng
1,5 lần với H2SO4 2N.
Sau đó cho 50 µL H2O2 30% vào 250 mL BC ===> dung dịch SC
Tiếp đến, thêm 0,75 mL TiOSO4 vào 1,25 mL SC và đọc ở bước sóng
420 nm. Độ hấp thụ phải nằm trong khoảng 0,75 – 0,95 và là độ hấp thụ cao
nhất (H2O2 không bị khử bởi CAT) nếu không thay đổi thể tích H2O2.
Kế đến qui trình tiến hành tiếp tục theo bảng sau:

23