BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA CÔNG NGHỆ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÀM LƢỢNG
ENROFLOXACIN VÀ THIAMPHENICOL
TRONG HUYẾT TƢƠNG HEO THEO THỜI
GIAN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

ThS. Phạm Văn Dũng

Nguyễn Minh Điện
MSSV: 2072136
Ngành: Công Nghệ Hóa Học
Khóa 33

Tháng 4/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA CÔNG NGHỆ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÀM LƢỢNG
ENROFLOXACIN VÀ THIAMPHENICOL
TRONG HUYẾT TƢƠNG HEO THEO THỜI
GIAN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

ThS. Phạm Văn Dũng

Nguyễn Minh Điện
MSSV: 2072136
Ngành: Công Nghệ Hóa Học
Khóa 33

Tháng 4/2011


NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................

......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................


NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................

......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................



LỜI CÁM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô đặc biệt là Thầy Cô Bộ Môn Công
Nghệ Hóa Học, Khoa Công Nghệ trƣờng Đại Học Cần Thơ. Các Thầy, Cô đã tận
tình truyền đạt cho em kiến thức và kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian em
theo học tại trƣờng.
Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành cảm ơn chú Phạm
Văn Dũng – phòng R&D, Công ty Vemedim đã chỉ bảo tận tình và truyền đạt cho
em những kiến thức, kinh nghiệm vô cùng quý báu trong suốt thời gian em thực
hiện Luận Văn Tốt Nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Vemedim đã chấp nhận và
tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn quý Cô, Chú, Anh Chị công tác tại phòng R&D
đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.
Một lần nữa con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình đã động
viên giúp đỡ con thực hiện luận văn này. Cùng tất cả các bạn sinh viên ngành Công
nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ, Trƣờng Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ nhiệt tình và
giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Cần thơ, ngày 15 tháng 4 năm 2011
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Minh Điện

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... i
MỤC LỤC ............................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................v

DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT............................................................................... vii
LỜI MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
PHẦN 1 TỔNG QUAN ...........................................................................................2
CHƢƠNG I SƠ LƢỢC THIAMPHENICOL VÀ ENROFLOXACIN .............3
1 Sơ lƣợc về Thiamphenicol ...................................................................................3
1 1 Cấu tạo.................................................................................................................3
1.2 Tính chất ..............................................................................................................3
1 3 Ứng dụng .............................................................................................................4
2 Sơ lƣợc về Enrofloxacin .......................................................................................4
2 1 Cấu tạo.................................................................................................................4
2 2 Tính chất ..............................................................................................................5
2 3 Ứng dụng .............................................................................................................6
CHƢƠNG II PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH ...................................................7
1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu ................................................................................7
2 Phƣơng pháp chiết mẫu .......................................................................................7
2.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (Liquid – liquid extration) ........................................7
2.2 Kỹ thuật chiết lỏng - rắn ...................................................................................8
2.2.1 Chiết bằng phƣơng pháp xay trộn với dung môi ............................................8
2.2.2 Chiết bằng phƣơng pháp cơ học trộn rung (Vortex) .......................................9
2.2.3 Chiết bằng phƣơng pháp chiết Soxhlet mẫu rắn .............................................9
2.2.4 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method) .....................10
2.2.5 Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) ...................................11
CHƢƠNG III PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ..................................................19
1 Sơ lƣợc về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ..........................19
ii


1.1 Lịch sử phát triển của HPLC .........................................................................19
1.2 Khái niệm và nguyên tắc hoạt động của HPLC ...........................................20

1 2 1 Khái niệm .......................................................................................................20
1.2 2 Nguyên tắc hoạt động.....................................................................................20
1.3 Cách phân loại sắc ký trong HPLC ...............................................................22
1.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC .........................................................................22
1.4.1 Dung môi .......................................................................................................23
1 4 2 Bộ khử khí Degasse .....................................................................................23
1 4 3 Bơm (Pump) ...................................................................................................23
1 4 4 Hệ thống tiêm mẫu (injector) .........................................................................23
1 4 5 Cột (Column) .................................................................................................24
1 4 6 Đầu dò (Detector) ...........................................................................................24
1 4 7 Hệ dữ liệu (Data system) ................................................................................25
2 Phân tích định tính ............................................................................................25
3 Phân tích định lƣợng .........................................................................................27
3.1 Dựng đƣờng chuẩn .........................................................................................27
3.2 Hiệu suất thu hồi .............................................................................................27
3.3 Xác định RSD, LOD, LOQ ............................................................................28
PHẦN 2 THỰC NGHIỆM ...................................................................................30
CHƢƠNG IV THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ................................................31
1 Phƣơng tiện nghiên cứu ....................................................................................31
1.1 Hóa chất ...........................................................................................................31
1.2 Dụng cụ ............................................................................................................31
1.3 Thiết bị .............................................................................................................31
2 Địa điểm tiến hành .............................................................................................31
3 Thực nghiệm – Kết quả .....................................................................................32
3.1 Định tính Thiamphenicol và Enrofloxacin bằng phƣơng pháp sắc
ký lớp mỏng. ..........................................................................................................32
3 1 1 Định tính Thiamphenicol ..............................................................................32

iii



3 1 2 Định tính Enrofloxacin ..................................................................................33
3.2 Lựa chọn quy trình phân tích Enrofloxacin và Thiamphenicol bằng
phƣơng pháp HPLC ..............................................................................................34
3 2 1 Mục đích .........................................................................................................34
3 2 2 Phƣơng pháp tiến hành ...................................................................................34
3.2 3 Lựa chọn quy trình ........................................................................................35
3.2 3 1 Lựa chọn quy trình phân tích Thiamphenicol .............................................35
a) Quy trình phân tích Thiamphenicol theo sự chiết tách lỏng – lỏng ....................35
b) Quy trình phân tích Thiamphenicol theo sự chiết tách pha rắn SPE ..................39
3.2 3 2 Lựa chọn quy trình phân tích Enrofloxacin ................................................41
a) Quy trình phân tích Enrofloxacin theo sự chiết tách lỏng – lỏng .......................41
b) Quy trình phân tích Enrofloxacin theo sự chiết tách pha rắn SPE .....................45
3.2.4 Đánh giá quy trình ..........................................................................................47
3.3 Khảo sát sự thay đổi hàm lƣợng của Enrofloxacin và
Thiamphenicol .......................................................................................................48
3 3 1 Mục đích .........................................................................................................48
3 3 2 Phƣơng pháp tiến hành khảo sát ....................................................................48
3 3 2 1 Khảo sát hàm lƣợng của Thiamphenicol.....................................................48
3 3 2 2 Khảo sát hàm lƣợng của Enrofloxacin ........................................................51
PHẦN 3 NHẬN XÉT – KIẾN NGHỊ ..................................................................55
CHƢƠNG V KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ...........................................................56
1 Kết luận ...............................................................................................................56
2 Kiến nghị .............................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................58
PHỤ LỤC: HÌNH ẢNH MỘT SỐ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH
THỰC HIỆN LUẬN VĂN TẠI CÔNG TY VEMEDIM .......................................60
ĐỀ CƢƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ...........................................................63

iv



DANH MỤC HÌNH
Hình 1 1 Công thức cấu tạo Thiamphenicol ............................................................3
Hình 1 2 Công thức cấu tạo Enrofloxacin ................................................................4
Hình 2 1 Sơ đồ chiết Soxhlet ...................................................................................9
Hình 2 2 Hình dạng cột SPE ..................................................................................12
Hình 2 3 Cấu tạo bộ chiết SPE ...............................................................................13
Hình 2 4 Các bƣớc tiến hành kỹ thuât chiết SPE ...................................................15
Hình 3 1 Hệ thống HPLC .......................................................................................22
Hình 3 2 Bình sắc ký lớp mỏng ..............................................................................25
Hình 3 3 Mô hình chấm sắc ký ..............................................................................26
Hình 4 1 Chuẩn bị bản mỏng định tính ..................................................................32
Hình 4 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ............................................................................33
Hình 4.3 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phƣơng pháp chiết
lỏng – lỏng ..............................................................................................................36
Hình 4 4 Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Thiamphenicol ......................................38
Hình 4 5 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phƣơng pháp chiết
tách SPE .................................................................................................................39
Hình 4.6 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phƣơng pháp chiết
lỏng – lỏng ..............................................................................................................42
Hình 4 7 Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Enrofloxacin .........................................44
Hình 4 8 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phƣơng pháp chiết
tách SPE .................................................................................................................46
Hình 4 9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ Thiamphenicol
trong huyết tƣơng theo thời gian ...........................................................................50
Hình 4 10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ Enrofloxacin
còn lại trong huyết tƣơng theo thời gian ...............................................................53

v



DANH MỤC BẢNG
Bảng 2 1 Các chất hấp phụ dùng trong kỹ thuật chiết pha rắn ...............................14
Bảng 2 2 Các dung môi thƣờng dùng trong chiết pha rắn có tính phân
cực tăng dần dựa vào hằng số điện môi ................................................................16
Bảng 4 1 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của Thiamphenicol ..............................37
Bảng 4 2 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Thiamphenicol
trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng ........................................38
Bảng 4 3 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Thiamphenicol
trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết SPE ...................................................40
Bảng 4 4 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của Enrofloxacin .................................44
Bảng 4 5 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Enrofloxacin
trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết tách lỏng – lỏng ................................45
Bảng 4 6 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Enrofloxacin
trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết SPE ...................................................47
Bảng 4 7 Kết quả phân tích hàm lƣợng Thiamphenicol trung bình trong
huyết tƣơng với thuốc của Công ty Vemedim ......................................................49
Bảng 4 8 Kết quả phân tích hàm lƣợng Thiamphenicol trung bình trong
huyết tƣơng với thuốc của Công ty khác ...............................................................50
Bảng 4 9 Kết quả phân tích hàm lƣợng Enrofloxacin trung bình trong
huyết tƣơng Với thuốc của Công ty Vemedim ......................................................52
Bảng 4 10 Kết quả phân tích hàm lƣợng Enrofloxacin trung bình trong
huyết tƣơng với thuốc của Công ty khác ...............................................................53

vi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu


Tên

Nghĩa

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

Nồng độ tối thiểu kiềm khuẩn

SPE

Solid phase extraction

Kỹ thuật chiết pha rắn

Solid phase micro extraction

Kỹ thuật vi ly trích trên pha rắn

GC

Gas Chromatography


Kỹ thuật sắc ký khí

LC

Liquid chromatography

Kỹ thuật sắc ký lỏng

TLC

Think Layer Chromatography

Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

ACN

Acetonitrile

HPLC

SPME

MeOH

Methanol

EDTA

Etilendiamin tetraaxetic axit
Standard Deviation


Độ lệch chuẩn

RSD

Relactive Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lƣợng

MRL

Maximum Residue Limits

Giới hạn dƣ lƣợng tối đa

Mẫu T

Mẫu trắng


SD

Mẫu PT Mẫu phân tích
ppm

parts per million

Phần triệu, mg/L

vii


LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, thuốc kháng sinh đƣợc sử dụng ngày càng nhiều vào các mục đích khác
nhau: phòng, điều trị bệnh và kích thích tăng trọng cho vật nuôi Tuy nhiên, do
thiếu hiểu biết, ngƣời chăn nuôi đã sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị chƣa
đúng nguyên tắc, không có cơ sở khoa học dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng
nhƣ:
Giảm hiệu lực của thuốc, tạo sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, gây khó
khăn cho công tác phòng và điều trị
Ngoài việc có thể gây độc hại cho gia súc, thuốc kháng sinh còn tồn lƣu
trong thịt, trứng, sữa ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm chăn nuôi và
gây hại cho sức khoẻ ngƣời tiêu dùng
Trong số rất nhiều các loại kháng sinh đang lƣu hành trên thị trƣờng, Enrofloxacin
là loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolon và Thiamphenicol là loại thuốc
kháng sinh thuộc nhóm Phenicol có hoạt phổ kháng khuẩn rộng đang đƣợc sử dụng
rộng rãi trong việc phòng trị bệnh cho vật nuôi, đặc biệt ở heo.
Vấn đề đặt ra là tồn dƣ của loại kháng sinh trong heo ảnh hƣởng xấu đến sức khoẻ
cộng đồng và môi trƣờng, là một trong những nguyên nhân gây bệnh cho con ngƣời

và làm tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật, đặc
biệt vi sinh vật gây bệnh Xuất phát từ nhu cầu trên của thực tiễn, em tiến hành
nghiên cứu đề tài “Khảo sát sự thay đổi hàm lƣợng của Enrofloxacin và
Thiamphenicol trong huyết tƣơng heo theo thời gian bằng phƣơng pháp High
Performance Liquid Chromatography (HPLC)” với sự giúp đỡ của Công ty Cổ
Phần Kinh Doanh Vật Tƣ và Thuốc Thú Y (Vemedim).

1


PHẦN 1
TỔNG QUAN

2


CHƢƠNG I
SƠ LƢỢC THIAMPHENICOL VÀ ENROFLOXACIN
1 Sơ lƣợc về Thiamphenicol [6,7,10]
1.1 Cấu tạo
Công thức phân tử: C12H15Cl2NO5S
Khối lƣợng phân tử : 356 23
Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo Thiamphenicol
Tên hóa học: 2,2 – dichloro – N – [(1R,2R) – 2 – hydroxy – 1 – (hydroxymethyl)
– 2 – [4 – (methylsulphonyl)phenyl]ethyl]acetamide
Tên thông dụng: Dextrosulphenidol, Thiophenicol, Win 5063-2, CV8053,
Thiamphenicol
1.2 Tính chất

Thiamphenicol là dẫn xuất tổng hợp, cấu trúc khác chloramphenicol do nhóm nitro
thơm trong phân tử chloramphenicol đƣợc thay bằng nhóm methyl sulfon
Thiamphenicol khác với Chloramphenicol là độc tính rất thấp
Là chất bột tinh thể hay dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt
Nhiệt độ nóng chảy : 165 3oC
Thiamphenicol có khả năng hòa tan tốt trong dimethyl acetamide tỉ lệ (1:1), tan
trong dimethyl formamide và acetonitrile theo tỉ lệ (1:10), trong methanol với tỉ lê
(1:20), tan ít trong nƣớc, ethanol 95% và acetone
Dƣợc động học:
Hấp thu: Thiamphenicol hấp thu cả đƣờng uống và đƣờng tiêm

3


Chương I Sơ lược Thiamphenicol và Enrofloxacin

Phân bố: thuốc phân bố rộng rãi vào các mô và dịch cơ thể, qua nhau thai, sữa mẹ
và dịch não tuỷ
Chuyển hoá: thuốc ít chuyển hoá qua gan
Thải trừ: chủ yếu thận dƣới dạng không đổi
Tác dụng:
Thiamphenicol là kháng sinh phổ rộng, có tác dụng lên nhiều vi khuẩn gram dƣơng
và âm Thuốc có tác dụng tốt với Salmonella, Salmonella typhi, Shigella, Vibrio
cholerae và các vi khuẩn kị khí gram âm nhƣ bacteroides fragilis, nhƣng không có
tác dụng trên P.aeruginosa.
Thuốc thấm nhiều vào phế quản nên hay dùng điều trị các nhiễm khuẩn ở phổi, khí
phế quản, nhất là vi khuẩn đã kháng các kháng sinh khác
Thuốc ít chuyển hoá qua gan nên ít gây hội chứng xanh xám ở trẻ sơ sinh
Thuốc thải trừ chủ yếu qua thận dƣới dạng còn hoạt tính nên còn đƣợc dùng điều trị
nhiễm khuẩn tiết niệu, sinh dục

Độc tính: có thể gây suy tủy xƣơng, suy thận
1.3 Ứng dụng
Thiamphenicol dùng điều trị nhiễm trùng hô hấp, tiêu hóa, niệu dục, thƣơng hàn,
viêm màng não do Hoemophilus, Gonococcus gây ra.
Liều dùng 30 – 100mg/kg thể trọng/ngày

2 Sơ lƣợc về Enrofloxacin [11]
2.1 Cấu tạo
Công thức phân tử: C19H22O3FN3
Khối lƣợng phân tử : 359 39
Công thức cấu tạo:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Enrofloxacin

SVTH Nguyễn Minh Điện

4


Chương I Sơ lược Thiamphenicol và Enrofloxacin

Tên hóa học:
1 – Cyclopropyl – 7 – (4 – ethyl – 1 – piperazinyl) – 6 – fluoro – 1,4 – dihydro – 4 –
oxo – 3 – quinolinecarboxylic acid
Tên thông dụng: Baytril, Enrofloxacin, Quinoex (Sanofi)
2.2 Tính chất
Tinh thể màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 220oC
Tan ít trong nƣớc ở pH 7
Dƣợc động học:
Sự hấp thu: Enrofloxacin đƣợc hấp thu tốt cả trong và ngoài đƣờng tiêu hóa Nếu

uống hay tiêm vào bắp với liều 25mg/kg thể trọng, sau 1giờ sẽ đạt nồng độ cao
trong huyết tƣơng, uống có nồng độ 0 9mg/ mL còn tiêm đạt nồng độ 1mg/ mL
Thuốc duy trì đƣợc nồng độ hữu hiệu trong máu khoảng 1 – 6 giờ tùy theo trạng
thái bệnh lý
Phân bố: Thuốc đƣợc phân bố điều và rộng khắp các tổ chức Nồng độ thuốc trong
các tổ chức gan, tim phổi thận đều cao hơn trong huyết thanh Thuốc đƣợc chuyển
hóa chủ yếu ở tế bào gan Thời gian bán thải t1/2 khoảng 3 giờ nếu tiêm tĩnh mạch,
hay 6 giờ nếu tiêm bắp hoặc uống
Thải trừ: Thuốc thải trừ qua thận và phân, nhƣng nếu công năng của gan, thận kém
sẽ tăng thời gian t1/2 lên cao. T1/2 với chó khoảng 2 – 3 giờ bằng đƣờng uống, 3 – 5
giờ tiêm, mèo 3 – 4 giờ, cừu 5 – 6 giờ
Tác dụng :
Enrofloxacin là loại thuốc đƣợc tổng hợp đầu tiên vào năm 1983 Thuốc đƣợc dùng
rộng rãi trong thú y
Thuốc có phổ tác dụng rộng và mạnh Với các vi khuẩn Gram âm nhƣ E.coli,
Salmonella, Klebssiella, Pseudomonas, aeruginossa, Mycoplasma.spp có MIC
(Minimum Inhibitory Concentration hay nồng độ tối thiểu kiềm khuẩn) bằng 0 01 –
1 25 mg/ mL Với các vi khuẩn nhƣ Bacteroides.spp, Bordetelle bronchiseptica,
Pasteurella.spp, Treponema hyodysenteriae (vi khuẩn gây bệnh hồng lỵ tiêu chải
trên heo choai) có MIC bằng 0 05 – 2.0 mg/ mL.
Các vi khuẩn gram dƣơng nhƣ Staphyloccocus aureus, steptoccocus agalactiae,
steptoccocus dysgalactiae, Corynebacterium pyogenes, Clostridium spp với MIC
bằng 0 16 – 1 mg/ mL

SVTH Nguyễn Minh Điện

5


Chương I Sơ lược Thiamphenicol và Enrofloxacin


Thuốc dùng ƣu tiên trị các bệnh do vi khuẩn Staphyloccocus, steptoccocus với MIC
bằng 0 15mg/ mL, Mycoplasma có MIC bằng 0 5 mg/ mL Kém tác dụng với
Corynebacterium pyogenes, các vi khuẩn kỵ khí có MIC bằng 1 mg/ mL
Độc tính
Thuốc có khả năng gây ra những ảnh hƣởng từ nhẹ đến nặng nhƣ buồn nôn, nôn,
tiêu chảy, dị ứng ngoài da, tăng áp lực nội sọ (chóng mặt, nhức đầu, lú lẫn, co giật,
ảo giác) Trên trẻ nhỏ, có thể gây đau và sƣng khớp, đau cơ
Thực nghiệm trên súc vật còn non thấy mô sụn bị huỷ hoại.
2.3 Ứng dụng
Dùng trị các bệnh do Mycoplasma gây viêm phổi của trâu, bò, heo Bệnh viêm phổi
do Pneumoniae, các bệnh viêm phổi, viêm đƣờng hô hấp của động vật nuôi do
E.coli và Salmonella typhimurium.
Liều dùng 2 5 mg/kg cho uống hay tiêm Thuốc hay có tác dụng phụ trên chó, mèo
và ngựa Trong điều trị không dùng cho ngựa

SVTH Nguyễn Minh Điện

6


CHƢƠNG II
PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH
1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu [12]
Chuẩn bị mẫu là công việc đầu tiên và cần thiết cho các quá trình phân tích nhằm
mục đích tách các chất cần xác định ra khỏi nền mẫu Đây là quá trình rất quan
trọng, có thể mất chất hay nhiễm thêm chất vào làm sai kết quả phân tích
Yêu cầu chung của quá trình chuẩn bị mẫu :
Lấy hết các chất cần xác định ra khỏi mẫu phân tích
Không làm nhiễm bẩn thêm chất vào mẫu

Không đƣa thêm chất khác vào gây ảnh hƣởng cho quá trình phân tích.
Dung dịch mẫu thu đƣợc phải phù hợp cho quá trình phân tích
Làm giàu đƣợc các chất cần tách và xác định

2 Phƣơng pháp chiết mẫu
2.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (Liquid – liquid extration) [2,8]
Nguyên tắc cơ bản của quá trình chiết lỏng – lỏng là sự phân bố của một chất tan
vào hai pha lỏng, hai pha này không hòa tan vào nhau .
Khi thêm một cấu tử thứ ba vào hệ dung dịch có hai cấu tử không tan hoàn toàn vào
nhau hoặc tan có giới hạn thì sự hòa tan của cấu tử này vào hai cấu tử kia theo một
tỉ lệ nhất định ở nhiệt độ nhất định gọi là hằng số phân bố Nernst K
Hằng số phân bố của chất tan đƣợc tính theo công thức:
K=

Trong đó

Ca S a

Cb S b

K là hằng số phân bố của chất tan
Ca là nồng độ chất tan trong pha a tại thời điểm cân bằng
Ca là nồng độ chất tan trong pha b tại thời điểm cân bằng
S1, S2: Độ tan hai cấu tử

Hằng số phân bố của một chất cho biết khả năng hòa tan của chất đó đối với hai pha
lỏng tại thời điểm cân bằng, hằng số phân bố của một chất tƣơng đối ít thay đổi theo
nhiệt độ và nồng độ của chất đó có trong dung dịch ban đầu, tuy nhiên phụ thuộc
nhiều vào dung môi (độ phân cực, đặc tính ái nƣớc của dung môi) và pH, lực ion
của dung dịch nƣớc


7


Chương II Phương pháp chiết tách

Chiết lỏng – lỏng là một kỹ thuật tách đơn giản nhất đƣợc sử dụng để làm sạch hoặc
tách một cấu tử riêng hoặc một loại cấu tử khỏi mẫu Mẫu rắn hoặc lỏng đƣợc chiết
bằng dung môi thích hợp Sự lựa chọn dung môi chiết phụ thuộc vào tính tan của
chất phân tích ở trong dung môi đó và phụ thuộc vào sự dễ dàng tách đƣợc chất cần
tách ra khỏi mẫu
Quá trình chiết lỏng lỏng tiến hành theo ba bƣớc:
Bước 1: Cho dung môi thích hợp tiếp xúc với dung dịch chứa chất phân tích
Bước 2: Phân tách thành hai pha: dịch chiết (E-extract) và dịch bã (R-raffinate).
Bước 3: Tách và thu hồi dung môi chiết từ hai pha dịch chiết và dịch bã
Sự làm giàu chất và hiệu quả của phƣơng pháp chiết phụ thuộc tỉ số thể tích của
mẫu và dung môi chiết, phụ thuộc hệ số phân bố của chất cần phân tích trong dịch
chiết và dịch bã Tỷ lệ thể tích của mẫu và dung môi không thể lấy quá rộng vì nó
ảnh hƣởng đến độ chính xác khi định lƣợng Hệ số phân bố có thể cải thiện nhờ
thay đổi pH mẫu, khử muối hoặc sử dụng ion đối…
Ƣu nhƣợc điểm:
Quá trình chiết lỏng – lỏng đƣợc ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực hóa học, thực
phẩm, dƣợc phẩm với những ƣu điểm: tiện lợi, không đòi hỏi tay nghề cao
Tuy nhiên, mất nhiều thời gian, tốn nhiều dung môi, thƣờng gặp tình trạng tạo nhũ
hoặc chiết không hết chất và cần xử lý tiếp Dịch chiết còn lẫn nhiều tạp chất
2.2 Kỹ thuật chiết lỏng - rắn
Chiết lỏng – rắn đƣợc áp dụng để tách các chất phân tích ra khỏi mẫu vật rắn nhƣ
thực vật, đất, các mẫu sinh học,… bằng dung môi thích hợp Các chất phân tích
trong mẫu rắn thƣờng nằm ở thành nang nhỏ hoặc phân tán trong chất rắn, vì vậy
cần nghiền nhỏ để tăng bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất phân tích Tùy vào

thuộc tính phân cực của chất cần tách mà lựa chọn dung môi chiết phù hợp, bắt đầu
từ những dung môi hidrocarbon nhẹ đối với những chất ít phân cực đến những dung
môi phân cực hơn nhƣ diethyl ether, acetone, ethanol kể cả nƣớc đối với những chất
phân cực
2.2.1 Chiết bằng phương pháp xay trộn với dung môi [2]
Áp dụng đối với mẫu rau cải, thịt cá Dung môi phải đi sâu đƣợc vào nền mẫu vì
vậy cần xay nhuyễn mẫu để tạo diện tích tiếp xúc lớn giữa mẫu và dung môi Sau
đó, dùng dung môi thích hợp để hòa tan chất phân tích Mục đích của quá trình này
là tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu và hạn chế đến mức tối thiểu chất đồng trích
ly.
SVTH Nguyễn Minh Điện

8


Chương II Phương pháp chiết tách

2.1.2.2 Chiết bằng phương pháp cơ học trộn rung (Vortex) [2]
Áp dụng cho rau cải đã xắt nhuyễn, hạt nhỏ, chất lỏng Mẫu đƣợc trộn đều với dung
môi ở tốc độ cao, với tác động mạnh của lực cơ học, dung môi sẽ thấm sâu vào bên
trong các cơ thịt, mô tế bào làm phá vỡ cấu trúc của chúng thành những mảnh vụn
Do đó chất phân tích dễ dàng phân bố vào pha hữu cơ hơn Dịch chiết thu đƣợc sau
quá trình này cần phải xử lý tiếp để loại tạp chất
2.2.3 Chiết bằng phương pháp chiết Soxhlet mẫu rắn [8]
Nguyên tắc: chƣng cất hồi lƣu liên tục mẫu với dung môi hữu cơ, làm chất phân tích
trong mẫu tan vào dung môi hữu cơ
Chất phân tích phải tan tốt vào trong dung môi hữu cơ, pha chiết phải tinh khiết,
bền, không làm hỏng chất phân tích, nhiệt độ thích hợp
Thích hợp cho các mẫu rắn nhƣ lá cây, rau quả, đất…


Hình 2.1 Sơ đồ chiết Soxhlet
Bếp đun: cung cấp nhiệt độ cho dung môi bay hơi và hòa tan chất phân tích vào
dung môi.
Dung môi: hòa tan chất phân tích, tách chất cần phân tích ra khỏi mẫu ban đầu
Nƣớc vào và ra: làm dung môi ngƣng tụ trở lại thu dịch chiết và hồi lƣu một phần
dịch chiết về bình chiết
Ƣu điểm:

SVTH Nguyễn Minh Điện

9


Chương II Phương pháp chiết tách

Tiết kiệm dung môi, không phải tốn công lọc và bổ sung thêm dung môi mới
nhƣ các kỹ thuật chiết khác
Tƣơng đối trích đƣợc hết chất
Ly trích tự động liên tục.
Nhƣợc điểm:
Không chiết đƣợc lƣợng lớn mẫu.
Không chiết đƣợc các chất kém bền nhiệt do dịch lƣợng mẫu chiết phụ thuộc
vào kích thƣớc của máy Soxhlet chiết liên tục bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của
dung môi.
Giá thành thiết bị khá cao, dễ hƣ hỏng, dễ vỡ và khó thay thế
2.2.4 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method) [8]
Tuy đã đƣợc biết đến cách đây rất lâu (1879) nhƣng mãi đến thập niên 1980,
phƣơng pháp này mới đƣợc áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật chiết các hợp chất thiên
nhiên ra khỏi thục vật nhƣ tinh dầu cà phê, trà, gia vị…
Một hợp chất sẽ hiện diện ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ và áp

suất cao hơn giá trị tới hạn tƣơng ứng của nó
Ƣu điểm
Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng khuếch tán thấm vào bên trong mẫu chiết
nhiều so với sự chiết bằng dung môi theo các phƣơng pháp khác Chất lỏng
siêu tới hạn có độ nhớt thấp, có áp suất hơi cao
Có sự chọn lọc cao đối với chất cần chiết tách
Phù hợp với loại hợp chất nhạy với nhiệt độ
Phƣơng pháp thân thiện với môi trƣờng
Nhƣợc điểm
Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền
Sự hiện diên của nƣớc trong mẫu chiết thƣờng gây khó khăn cho quá trình
chiết Phƣơng pháp này không thích hợp đối với mẫu chiết ở dạng lỏng
Phƣơng pháp này thƣờng sử dụng dung môi là CO2 lỏng nên không phù hợp
để chiết các hợp chất có tính phân cực

SVTH Nguyễn Minh Điện

10


Chương II Phương pháp chiết tách

2.2.5 Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) [2,8]
Ngày nay hơn 50% các phƣơng pháp làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký đều sử
dụng kỹ thuật chiết pha rắn Ứng dụng cho nhiều loại nền mẫu khác nhau nhƣ: các
loại mẫu môi trƣờng, mẫu dƣợc phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu thực phẩm…
Kỹ thuật chiết pha rắn là sự tƣơng tác giữa các chất tan (solutes) trong một dung
dịch lên trên chất hấp thu (adsorbent)
Kỹ thuật chiết pha rắn thƣờng đƣợc áp dụng nhằm các mục đích sau:
Xác định mức độ phân cực của một hợp chất chƣa biết

Làm giàu mẫu nhằm làm tăng độ nhạy cho quá trình phân tích mẫu, loại bỏ
các tạo chất gây nhiễu nền không mong muốn, thay đổi nền mẫu của chất
phân tích.
Phân chia hỗn hợp ban đầu chứa các hợp chất từ không phân cực đến phân
cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau
Các cấu tử cần phân tích và các chất cản trở nằm trong pha lỏng Khi cho chất lỏng
chảy qua cột nhồi chất hấp thu (conditioning of the absorbent), quá trình chiết tách
xảy ra theo các trƣờng hợp sau:
Các cấu tử cần phân tích đƣợc lƣu giữ lại trên chất hấp thu, còn các chất cản
trở không bị lƣu giữ đƣợc thải ra khỏi cột theo dòng chảy, sau đó chất cần
phân tích đƣợc rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi hoặc hệ dung môi thích
hợp
Ngƣợc lại, các chất cản trở bị lƣu giữ lại trên chất hấp thu, còn cấu tử cần
phân tích không bị lƣu giữ chảy ra khỏi cột theo dòng chảy
Trong đa số trƣờng hợp, các cấu tử cần phân tích và các chất cản trở cùng bị giữ lại
trên cột chất hấp thu Khi đó cần rửa chọn lọc bằng những dung môi đủ mạnh để
loại bỏ các chất cản trở, nhƣng lại đủ yếu để các cấu tử cần phân tích nằm lại sau,
hoặc rửa giải chọn lọc các cấu tử cần phân tích trong dung môi và để lại các chất
cản trở bị lƣu giữ mạnh trên cột chất hấp thu

SVTH Nguyễn Minh Điện

11


Chương II Phương pháp chiết tách

Cấu tạo của cột SPE: Cột gồm hai bộ phận chính:
Thân cột: có dạng giống vỏ bơm tiêm, thể tích từ 1 mL – vài chục mL, vỏ bên ngoài
đƣợc chế tạo bằng chất dẻo chịu dung môi, có ghi ký hiệu, chủng loại và tính chất

của cột
Lòng cột: từ 0 5 - vài cm chứa luợng pha rắn có khối lƣợng thƣờng từ 100 – 500
mg, kích thƣớc hạt thƣờng 5µm

3

2

1

Hình 2.2 Hình dạng cột SPE
1 Thân cột: chứa dung môi và các dung dịch cho qua cột
2 Chất hấp thu: lƣu giữ các chất phân tích lại trên cột
3 Đuôi cột: gắn kết cột vời bộ chiết

SVTH Nguyễn Minh Điện

12


Chương II Phương pháp chiết tách

2

1

5
4
3


Máy bơm
Hình 2.3 Cấu tạo bộ chiết SPE

Bộ chiết SPE gồm có:
1 Bình chiết làm bằng thủy tinh, có nắp đậy kín, trên nắp có các vị trí gắn cột
SPE vào, phía dƣới có đầu gắn nối với máy bơm
2 Van điều chỉnh tốc độ dòng chảy của dung môi và các dung dịch di qua cột
3 Đầu gắn máy bơm: máy bơm dùng để hút dung dịch thải ra khỏi bình chiết,
tạo vùng chân không trong bình để làm khô cột trong quá trình chiết
4 Van điều chỉnh áp suất: dùng để điều chỉnh độ chân không trong bình chiết
5 Đồng hồ chỉ thị độ chân không trong bình chiết

SVTH Nguyễn Minh Điện

13


Chương II Phương pháp chiết tách

Bảng 2.1 Các chất hấp phụ dùng trong kỹ thuật chiết pha rắn [8]
Loại

Cấu trúc

Tính chất

C18 – octadecyl

Không phân cực


C8 – octyl

Không phân cực vừa phải

thu

C2 – etyl

Không phân cực yếu

không

CH – cyclohexyl

Không phân cực yếu

PH – phenyl

Không phân cực vừa phải

CN – cuối dây có cyanopropyl

Không phân cực vừa phải/phân cực

Chất

CN – cyanopropyl

Không phân cực vừa phải/phân cực


hấp

2 OH – diol

Phân cực

Si – silica

Phân cực

cực

NH2 – aminopropyl

Phân cực

Chất

SCH – acid benzensulfonic

Cation mạnh

trao

PRS – acid propylsulfonic

Cation mạnh

CAB – acd carboxylic


Cation yếu

SAX – amin thứ cấp

Anion mạnh

trao

PSA – amin nhất và nhị cấp

Anion yếu/phân cực

đổi

NH2 – aminopropyl

Anion yếu/phân cực

DEA – dietylaminopropyl

Anion yếu/phân cực

Chất
hấp

phân
cực

thu
phân


đổi
cation
Chất

anion

SVTH Nguyễn Minh Điện

14