BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BÀI TIỂU LUẬN
MÔN: Ứng dụng của vsv trong
công nghệ thực phẩm
Đề tài 06: Bảo quản thực phẩm bằng màng
sinh học (Biofilm) chứa chất kháng khuẩn

GVHD: TS.Nguyễn Thị Minh Nguyệt
Lớp: DHTP9, thứ 5 tiết 5-6
SVTH: Nhóm 6

TP Hồ Chi Minh, ngày 30 tháng 03 năm 2016


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
DANH SÁCH NHÓM 6 VÀ PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ

STT

HỌ VÀ TÊN

MSSV

NHIỆM VỤ

1

Nguyễn Minh Châu

13063901

Tổng quan về Biofilm

2

Nguyễn Thị Kim Chi

13031901

Tổng quan về chất kháng khuẩn

3

Lâu Minh Cóong

13041541

Vi sinh vật định hướng và yếu tố hảnh
hưởng

4

Ngô Thị Dung (NT)

13059971

Nghiên cứu trong và ngoài nước
Tổng hợp tai liệu


5

Vũ Thị Dung

13032881

Quy trình sản xuất và ứng dụng

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 2


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................


GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 3


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
MỤC LỤC
PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ BIOFILM.............................................................................................................5
1.1.

Nguồn gốc màng sinh học (MSH)......................................................................................................5

1.2.

Cách để vi khuẩn tồn tại.....................................................................................................................5

1.3.

Cơ chế chung tạo màng sinh học.......................................................................................................6

1.4.

Những mối nguy từ MSH...................................................................................................................7

1.5.

Lợi ích của MSH..................................................................................................................................8

1.6.


Bao bì chứa chất kháng khuẩn..........................................................................................................9

1.7.

Màng sinh học trong bảo quản thực phẩm....................................................................................12

PHẦN 2: ỨNG DỤNG CỦA BIOFILM CHỨA CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG BẢO QUẢN
THỰC PHẨM....................................................................................................................................................14
2.1. Vi sinh vật định hướng...........................................................................................................................14
2.1.1.

Đặc điểm hình thái....................................................................................................................14

2.1.2.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa........................................................................................................15

2.1.3.

Cấu trúc màng BC....................................................................................................................15

2.2

Phương pháp sản xuất và bảo quản BC.........................................................................................23

2.3

Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu......................25


2.3.1

Nguyên liệu.................................................................................................................................25

2.3.2

Phương pháp nghiên cứu.........................................................................................................25

2.3.3

Qúa trình thực hiện...................................................................................................................25

2.4

Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản quả dừa tươi sơ chế tối thiểu..............26

2.4.1

Nguyên liệu.................................................................................................................................26

2.4.2

Phương pháp nghiên cứu.........................................................................................................27

2.4.3

Quy trình....................................................................................................................................27

2.5


Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản trứng vịt muối......................................29

2.6
Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng bacteriocin và màng BC hấp phụ
bacteriocin để bảo quản thực phẩm............................................................................................................32
2.6.1

Các nghiên cứu trong nước......................................................................................................32

2.6.2

Các nghiên cứu ngoài nước......................................................................................................32

PHẦN 3: ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN TRONG TƯƠNG LAI VÀ KẾT LUẬN..................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................................................35

GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 4


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
1.1.

PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ BIOFILM
Nguồn gốc màng sinh học (MSH)

Màng sinh học (biofilm) là một dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên của vi sinh
vật. Việc hình thành biofilm đem lại nhiều lợi ích cho bản thân vi sinh vật như giúp tế bào
tồn tại và chống chịu được những điều kiện bất lợi, tận dụng được nguồn dinh dưỡng của

môi trường thông qua mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong biofilm. Theo nghiên cứu của
Kokare và cộng sự trong tự nhiên tồn tại nhiều chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo biofilm bao
gồm các vi khuẩn Gram dương (Streptococcus sp., Bacillus subtilis…) và vi khuẩn Gram
âm (Escheriachia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera…)[1]
Màng sinh học biofilm là mô hình phát triển tự bảo vệ của vi khuẩn. Biofilm được quan tâm
nhiều trong môi trường, công nghiệp, y học và vệ sinh thực phẩm do các màng này chứa các
vi khuẩn gây hư hỏng và gây bệnh, làm tăng nguy cơ cho sức khỏe cộng đồng. ngoài ra, các
tế bào vi sinh trong biofilm đề kháng hơn với việc làm vệ sinh và khử trùng. Sự hình thành
màng biofilm là một quá trình phức tạp, trong đó liên quan đến các cơ chế di truyền và
nhiều yếu tố khác như các đặc tính của bề mặt bám và bề mặt tế bào vi khuẩn. [2]
Màng sinh học hiện đang được xác định là một tập hợp của tế bào vi khuẩn bề mặt
liên quan được ngậm nước kèm theo trong các chất cao phân tử ngoại bào EPSExtraPolySacchride (Sauer, Rickard, & Davies, 2007).
Polysaccharides, protein, phospholipid, teichoic và thậm chí cả axit nucleic là các thành
phần chính của EPS. Trong một số thiết lập đặc biệt, tinh thể khoáng chất, các hạt phù sa và
các thành phần được tìm thấy trong EPS của màng sinh học (Donlan, 2002). Một màng sinh
học có thể bao gồm đơn hoặc nhiều loài vi khuẩn và tạo thành một lớp duy nhất hoặc ba
chiều cấu trúc, màng sinh học trưởng thành được tổ chức rất cao của các hệ sinh thái trong
đó nước là kênh phân tán và có thể cung cấp đường đi lại để trao đổi các chất dinh dưỡng,
các chất chuyển hóa và các sản phẩm chất thải (Sauer et al., 2007).
Các bề mặt tự nhiên hay nhân tạo khi tiếp xúc với vi sinh vật, vi sinh vật đều tạo quần
thể trên bề mặt đó. Sự tạo quần thể trên bề mặt có thể thưa thớt gồm các khuẩn lạc không
thể nhìn thấy bằng mắt thường hoặc nhiều đến mức có thể nhìn thấy như những nơi nước
đọng trong nhà vệ sinh.[2]
Một màng sinh học hoàn chỉnh có thể dầy từ 600 µm – 900 µm (mỗi vi khuẩn dài
khoảng 1 µm), tức là dầy gấp mấy trăm lần một con vi khuẩn đơn lẻ. Màng sinh học không
phải là một chất vô định hình, hay một khối đặc sệt các polysaccharides và vi khuẩn như có
người đã nghĩ; nó có tổ chức và cấu trúc. Thậm chí là khu vực dầy nhất của màng sinh học
cũng cho luồng nước chảy qua. Nước chảy qua các cấu trúc hình nấm của những khối cầu vi
khuẩn, qua đó, cung cấp dinh dưỡng cho chúng và đem chất thải đi.
Vi khuẩn trong màng sinh học có nhiều thuận lợi hơn là những vi khuẩn lơ lửng tự do

trong nước. Trước hết, chúng chia sẻ thông tin di truyền và trao đổi chất cho nhau. Ví dụ
như, trong màng sinh học ở cao răng, vi khuẩn Veillonella sử dụng lắc-tát do vi khuẩn
Streptococcus sinh ra. Thứ nhì, vi khuẩn trong màng sinh học được bảo vệ khỏi kẻ thù và
các hoá chất độc hại.
Trong thế giới dưới nước, màng sinh học bảo vệ vi khuẩn khỏi bị các động vật nguyên
sinh, các loại tảo độc hại (dinoflagellates – tảo roi) và khuẩn độc (Myxobacteria – niêm
khuẩn) làm hại. [4]
1.2. Cách để vi khuẩn tồn tại
Làm thế nào để những vi khuẩn bé nhỏ tồn tại trong thế giới tự nhiên khắc nghiệt?
Nhờ cộng sinh với các loài khác để tự bảo vệ mình.
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 5


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
Các vi khuẩn sống bám và gắn kết với nhau
trên các bề mặt (giữa chất rắn và chất lỏng,
giữa không khí và chất lỏng) - vốn là nơi
tích tụ nhiều chất dinh dưỡng nhất. Theo
thời gian, tập hợp vi khuẩn và các chất do
chúng tiết ra hình thành một lớp vật chất
gọi là màng sinh học (biofilm).
Hình 1.1. Vi khuẩn bám lên các bề mặt
MSH trong thiên nhiên, đặc biệt ở những vùng có độ ẩm cao. MSH được tạo thành
trên cả bề mặt sống lẫn không sống, ở những bề mặt rắn ngập nước, trên bề mặt chất lỏng,
nơi tiếp xúc với không khí ẩm; bề mặt lá cây, thậm chí là bề mặt mô mềm trong cơ thể sống.
Loại màng này có thể phát triển ở những khu vực khắc nghiệt nhất, cả vùng nước nóng lẫn
băng giá, nước mặn lẫn nước ngọt, cả nước giàu axit hoặc kiềm.
Người ta thường bắt gặp MSH dưới dạng lớp váng trên bề mặt các hồ nước tù đọng,

nơi lớp đá sỏi ven sông, suối; những mảng bám trên thành tàu… Ở môi trường sống của con
người, MSH sinh sôi tại nơi ẩm thấp như phòng tắm, sàn nhà, đường ống nước và ống dẫn
nước thải… Trong cơ thể sống, MSH xuất hiện dưới dạng cao răng; lớp xơ hóa gây nhiễm
trùng phổi, lớp mủ nhiễm trùng trên một vết thương…Ta có thể nhìn thấy màng sinh học
bằng mắt thường.

Hình 1.2. Sự xuất hiện của màng sinh học

MSH đầu tiên được Anthony Van Leewenhoek (người Anh) nghiên cứu năm 1684 là một
mảng bám răng. Do thiếu công cụ và phương pháp, mãi đến cuối thế kỷ 20, giới khoa học
mới nhận thức hết ý nghĩa và tầm quan trọng của MSH. Từ đó đến nay, số lượng nghiên cứu
về MSH tăng vọt. Sau nhiều năm tìm hiểu, các nhà khoa học tin rằng, MSH là thành phần tự
nhiên trong hệ sinh thái Trái Đất và hình thành MSH là xu hướng chug của các lọai vi
khuẩn.[3]
Nguyên nhân hình thành
 Đây là cách tự đề kháng để gia tăng khả năng sống sót
 Biofilm cho phép tế bào duy trì ở một nơi thích hợp
 Biofilm cho phép tế bào vi khuẩn sống gần nhau hơn, thông tin giữa tế bào-tế bào tốt
hơn, tăng cơ hội sống sót
 Biofilm dường như là tế bào vi khuẩn phát triển tự nhiên.
1.3. Cơ chế chung tạo màng sinh học
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 6


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
 Giai đoạn 1 – Gắn kết: vi khuẩn trôi nổi gặp được một bề mặt ngập nước bắt đầu tiến
hành gắn kết. Trong vài phút, chúng tổng hợp các chất ngoại bào cao phân tử (EPS extracellular polysaccharides) để kết dính chặt chẽ với bề mặt.
 Giai đoạn 2 – Tăng trưởng: sau vài giờ, lớp “chất nhầy” polysaccharides do vi khuẩn

sản sinh phát triển thành cấu trúc 3 chiều, phức tạp, tạo ra lớp MSH hoàn chỉnh. Các vi
khuẩn liên tục trao đổi thông tin để đảm bảo cấu thành MSH một cách chính xác.
 Giai đoạn 3 – Phân tán: MSH đã hoàn chỉnh sẽ phân tán để xâm chiếm bề mặt mới
nhờ giải phóng các mô tế bào nhỏ (tương tự cách hạt giống phát tán). Trong điều kiện
thuận lợi, một MSH đã “trưởng thành” có lây lan với tốc độ nhanh chóng không ngờ.

Hình 1.3. Các giai đoạn phát triển của một MSH
MSH cung cấp cho vi khuẩn môi trường lý tưởng để sinh trưởng và phát triển
Dưới kính hiển vi, MSH trông như các cấu trúc hình nấm phân cách bởi những con
kênh đầy nước. Mỗi màng gồm nhiều lớp vi khuẩn sắp xếp trật tự, có độ dầy từ 600 µm –
900 µm (mỗi vi khuẩn dài khoảng 1 µm), liên kết với nhau nhờ các sợi cellulose cao phân tử
tạo thành quần thể có tổ chức với các kênh ngang, dọc, cho phép chất lỏng, chất thải và
dưỡng chất lưu thông hoàn hảo. Cấu tạo này không chỉ hỗ trợ vi khuẩn trao đổi thông tin
bằng tín hiệu sinh hóa mà còn bảo vệ chúng khỏi sự tấn công của kẻ thù và các hóa chất độc
hại khác (kháng thể, tế bào miễn dịch, thuốc…).
Vi khuẩn tồn tại trong MSH có tính chất khác biệt đáng kể so với các vi khuẩn sống
trôi nổi trong môi trường. Chúng có khuynh hướng thích nghi nhanh chóng, tăng cường sức
đề kháng với độc chất. Các vi khuẩn ở trung tâm MSH thương có khả năng kháng thuốc
mạnh nhất. Khác biệt về môi trường , về loại vi khuẩn, dưỡng chất, điều kiện sống sẽ hình
thành các loại MSH khác nhau.[3]
1.4. Những mối nguy từ MSH
Tuy giữ vai trò quan trọng trong chuỗi thức ăn của các loài thủy hải sản và động vật
không xương sống, nhưng với con người, MSH tiềm ẩn nhiều mối nguy hiểm khó lường.
Dễ nhận thấy, các MSH thường gây tắc nghẽn và ăn mòn. MSH chiếm 20% các tác
nhân gây ăn mòn đường ống dẫn dầu trên biển. Lớp MSH trên thân tàu khiến các sinh vật
như hàu dễ bám vào tàu hơn, làm giảm tốc độ của tàu, kéo dài thời gian di chuyển và tiêu tố
thêm nhiên liệu. MSH bám bên trong động cơ làm giảm hiệu suất máy móc.
Vốn tập hợp một lượng lớn vi khuẩn, MSH còn là nguồn gốc nhiều căn bệnh viêm
nhiễm ở người. Các nhà khoa học cho biết, có thể tìm thấy hơn 400 loài vi khuẩn khác nhau
trong cao răng với mật độ khoảng 10 tỷ con vi khuẩn/ mg. Khoảng 15-20% ca nhiễm trùng

đường tiết niệu có nguyên nhân bắt nguồn từ MSH trong cơ thể. Đặc biệt, MSH sẽ trở thành
nguồn lây nhiễm bệnh cực kỳ nguy hiểm nếu chúng hình thành trên các thiệt bị y tế.
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 7


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong MSH:
- Staphylococcus aureus: gây nhiễm khuẩn, áp xe.
- Salmonella typhi: gây bệnh thương hàn.
- Enterococcus faecalis: gây nhiễm trùng đường ruột.
- Pseudomonas aeruginosa: làm suy giảm miễn dịch, nhiễm trùng hệ thống hô hấp, viêm
phổi, nhiễm trùng đường tiểu, nhiễm trùng máu…
- Vi khuẩn staphylococcus trên màng sinh học.
1.5. Lợi ích của MSH
Tiểm ẩn rất nhiều hiểm nguy, nhưng MSH là lĩnh vực nghiên cứu thú vị và đầy thử
thách, mang lại kho kiến thức hữu ích về tác động của vi khuẩn đối với mọi thứ xung quanh.
Những nghiên cứu về MSH không chỉ ngăn ngừa tác hại của vi khuẩn mà còn ứng dụng
chúng trong nhiều lĩnh vực, từ công nghiệp cho đến y tế. Bằng cách chọn lựa loại vi khuẩn
đặc trưng, thay đổi tỷ lệ vi khuẩn, dung môi,… các nhà khoa học có thể tạo ra MSH với
công dụng đa dạng.
Những ứng dụng phổ biến của MSH:
 Làm sạch không khí
MSH sử dụng trong công nghệ lọc sinh học khá thông dụng, dùng vi sinh vật loại bỏ
các hợp chất khí bị nhiễm bẩn. Trong hệ thống lọc, khí ô nhiễm sẽ được khuếch tán và được
MSH hấp thụ.
 Lọc nước
MBR (Membrance Bio Reactor) tức “bể lọc sinh học bằng màng” là một trong những
công nghệ lọc nước vi sinh triển vọng hiện nay. Công nghệ này phát triển lần đầu tiên vào

thập niên 1970. Trong quy trình xử lý nước thải, vi khuẩn trong MSH sẽ giúp loại bỏ chất
hữu cơ, một số tác nhân gây bệnh và vi sinh vật trong nước. Không chỉ vậy, MSH còn có thể
loại bỏ dầu ô nhiễm trên đại dương và trong các đường ống lọc dầu trên biển.
 Làm màng trị bỏng
Khả năng che phủ và bảo vệ khiến MSH rất được “ưu ái” nghiên cứu làm màng trị
bỏng. Bằng cách chọn lọc vi khuẩn phù hợp, các nhà khoa học tạo ra được loại MSH giúp
che phủ vết thương, chống nhiễm trùng, thoát nước rất tốt và nhanh liền sẹo.

Màng sinh học lọc nước Màng sinh học trị bỏng Màng sinh học trong thực
phẩm
Hình 1.4. Các ứng dụng của màng sinh học trong
 Điều trị các bệnh nhiễm trùng
Nghiên cứu về MSH phần nào giải thích được nguyên nhân gây nhiễm trùng dai
dẳng, hiện tượng từng “làm khó” ngành y trong một thời gian dài. Từ đó, nhiều phương
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 8


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
pháp điều trị hỗ trợ miễn dịch đã ra đời. Nước súc miệng, thuốc kháng sinh, nước tẩy rửa
gia dụng, chất khử trùng,… đều ra đời từ các phòng thí nghiệm nghiên cứu MSH.
 Công nghệ thực phẩm
MSH rất thường gặp trong công nghệ thực phẩm, chẳng hạn, thạch dừa chính là
polysaccharides ngậm nước tồn tại trong trạng thái nửa rắn, một loại MSH. Sợi cellulose do
vi khuẩn tạo ra dẻo và bền hơn cellulose từ thực vật, nên nếu bổ sung thêm chất kháng
khuẩn, MSH có thể dùng bảo quản thực phẩm hoặc làm bao bì thực phẩm ăn được.
Tại Việt Nam, nghiên cứu ứng dụng MSH vẫn ở mức độ phòng thí nghiệm nhưng đã
đạt thành quả nhất định trong lĩnh vực y học và thực phẩm. Ví dụ như: đề tài "Đa dạng hóa
các môi trường sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylium" nghiên cứu khả

năng tạo MSH ở nhiều loại môi trường khác thay cho môi trường nước dừa già truyền
thống, do khoa Công nghệ Thực phẩm, Đại học Nông Lâm TP.HCM thực hiện; đề tài “Xây
dựng quy trình sản xuất và thử nghiệm lâm sàng màng sinh học từ cellulose vi khuẩn trị tổn
thương mất da” do Sở KH&CN TP.HCM quản lý và Trường Đại học Y dược TP.HCM chủ
trì thực hiện; đề tài "Một số ứng dụng của cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực thực phẩm" sử
dụng MSH làm màng bao thực phẩm, bảo quản dừa tươi (2 - 4 tuần) và thịt tươi (3 ngày) do
Đại học Bách Khoa TP.HCM thực hiện. Ngoài ra, Đại học Bách Khoa TP.HCM đã nghiên
cứu ứng dụng thành công MSH cố định bạc nano làm màng trị bỏng, đặc biệt thích hợp cho
vết bỏng nhiễm khuẩn, làm lành vết bỏng sâu đường kính 2 cm sau 21 ngày điều trị…
Trên thế giới, ngày càng nhiều công dụng độc đáo của MSH được khám phá như làm
môi trường cơ chất trong sinh học, chất mang năng lượng cho pin, làm mạch máu nhân tạo,
mặt nạ dưỡng da… Yêu cầu đặt ra cho những nghiên cứu MSH trong tương lai là sản xuất
trên quy mô công nghiệp.[3]
Nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và quy mô thí điểm đã chứng tỏ nhiều ưu
điểm các phản ứng màng sinh học trong sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng khác nhau,
đặc biệt là trong rượu vang và sản xuất axit hữu cơ. Phản ứng màng sinh học, như các phản
ứng cố định khác, không chỉ mang lại năng suất cao hơn,mà còn có tiềm năng lớn hơn so
với các phản ứng tế bào bị gián đoạn để phát triển trong môi trường liên tục (mà đáng kể
hơn là sản xuất về thời gian lên men cuối trên một đơn vị sản phẩm được sản xuất). Kết hợp
ổn định đặc biệt và nhu cầu dinh dưỡng thấp hơn, các phản ứng màng sinh học thể hiện tiềm
năng cao cho các ứng dụng trong quy mô lớn sản xuất nhiều sản phẩm như rượu, axit hữu
cơ, thuốc kháng sinh, và các enzym. Tuy nhiên, trước khi các phản ứng màng sinh học có
thể được áp dụng trong sản xuất quy mô công nghiệp, thêm nhiều nghiên cứu quy mô lên
trên nhiều thông số như điều kiện môi trường, khối lượng và hạn chế truyền nhiệt, và động
học là cần thiết.
Về nguyên tắc, có hai cách để kiểm soát các màng sinh học. Điều quan trọng nhất
chiến lược là để ngăn chặn sự hình thành của họ bằng cách áp dụng một trong những
phương pháp tiếp cận. Điều này có thể đạt được bằng cách loại bỏ vi khuẩn trước khi chúng
có thể hình thành màng sinh học hoặc bằng sử dụng kháng bề mặt để hình thành màng sinh
học. Hướng tiếp cận thứ hai này có nghĩa là tính chất hóa lý của các bề mặt được sửa đổi

hoặc tráng với một trong hai các kháng sinh hoặc các chất khác, chẳng hạn như benzyl
dimethyl dodecyl amoni clorua và bạc (Srey et al., 2013).
1.6. Bao bì chứa chất kháng khuẩn
Đặc điểm nổi bật: [5]
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 9


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
 Bao bì kháng khuẩn là đa chức năng bằng cách giảm hoạt động của vi sinh vật có hại
trong thực phẩm.
 Bao bì kháng khuẩn giúp tăng tính an toàn thực phẩm.
 Bao bì kháng khuẩn làm giảm lãng phí lương thực và cải thiện tuổi thọ thực phẩm.
 Tác nhân kháng khuẩn có trong biofilm đóng gói cung cấp thêm an toàn cho cho sức
khỏe.
Thực phẩm nhiễm bẩn dẫn đến sự hư hỏng và sự tăng trưởng của vi sinh vật gây bệnh
có thể xảy ra khi tiếp xúc với môi trường trong quá trình giết mổ, chế biến, đóng gói và vận
chuyển. Mặc dù các phương pháp bảo quản thực phẩm truyền thống như sấy khô, sưởi ấm,
làm lạnh, lên men và muối có thể mở rộng thực phẩm hạn sử dụng, nó không phải là
consummate đặc biệt là để ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật gây bệnh có thể gây nguy
hiểm cho sức khỏe người tiêu dùng. Bao bì kháng khuẩn là một sự phát triển mới mà kết
hợp tác nhân kháng khuẩn vào màng polymer để đàn áp các hoạt động của vi sinh vật mục
tiêu. Tuy nhiên, bao bì kháng khuẩn vẫn là một công nghệ cực kỳ khó khăn và chỉ có một
vài sản phẩm thương mại hóa được tìm thấy trong thị trường. Đánh giá này tập trung phân
tích sự phát triển bao bì kháng khuẩn cho những thập kỷ qua cho đến khi công nghệ gần
đây. Các thông tin về hoạt động của bao bì kháng khuẩn như hiệu suất vi trùng học và tính
chất cơ lý của màng bao bì đã được thảo luận. Dự kiến các thông tin như vậy sẽ cung cấp
một cái nhìn tổng quan cũng như thúc đẩy sự phát triển của bao bì kháng sinh trong lĩnh vực
thực phẩm liên quan và công nghiệp.

Bao bì AM (kháng khuẩn) được chia làm 2 nhóm chính gọi là bao bì phân hủy sinh
học và bao bì không phân hủy sinh học. Hầu hết các loại polyme tổng hợp là không phân
hủy và đáp ứng tốt cho việc sử dụng như vật liệu bao gói thực phẩm với những lợi thế về
chi phí thấp, mật độ thấp, trơ, đặc tính cản rất tốt, độ bền cơ học tốt, tính rõ ràng cao, có khả
năng kín nhiệt và dễ dàng được in lên trên.
Nói chung, bao bì AM phân hủy sinh học được sản xuất bởi sự có polymer tự nhiên
vốn có phản ứng AM hoặc thông qua việc bổ sung của các tác nhân AM vào polyme tự
nhiên. Ví dụ về các polyme sinh học tái tạo là polysaccharides, protein, chất keo, chất béo
và phức của chúng, xuất phát từ nguồn gốc động vật và thực vật. Hầu hết các nghiên cứu
bao bì phân hủy sinh học được tập trung vào sự pha trộn của tinh bột nhiệt dẻo (TPS) với
các polyeste phân hủy sinh học như polycaprolactone (PCL), axit polylactic (PLA),
polyhydroxybutyrate-đồng hydroxyvalerate, polybutylene succinate-adipate, poly
(butylenes adipate-co-terephtalate), và poly (hydroxyl ester ether). Trong số các thành phần
phân huỷ sinh học, PLA được sử dụng rộng rãi nhất trong các polyme. PLA là một nhựa
nhiệt dẻo phân hủy sinh học và tương thích sinh học được sản xuất bởi lên men từ các
nguồn tái tạo. Nó cũng có thể được tổng hợp bằng cách trùng hợp ngưng tụ của axit lactic
hoặc bằng polyme hóa mở vòng của lactide với sự hiện diện của một chất xúc tác (Sin et al.,
2013)
Bên cạnh các vật liệu phân hủy sinh học mà thảo luận trước đó, các bao bì ăn được
làm từ polymer sinh học (ví dụ như: protein, lipid, polysaccharides) và phụ gia thực phẩm
các cấp (ví dụ như: chất tạo dẻo, tác nhân AM, chất tạo màu, hương liệu, chất nhũ hoá) cũng
là những ứng sự lựa chọn tốt cho sự chế tạo các bao bì AM. Bằng cách kết hợp các tác
nhân AM và chất chống oxy hóa vào màng sinh học, sản phẩm thực phẩm có thể được bảo
vệ khỏi sự tăng trưởng vi khuẩn, chuyển độ ẩm và oxy hóa các chất dinh dưỡng. Các ứng
dụng của bao bì ăn được là chủ yếu vào các loại hạt, bánh kẹo và hoa quả.
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 10



Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
Một số lượng lớn nghiên cứu chỉ ra rằng có thể ngăn chặn một số loại vi sinh vật hiệu
quả khi cho một lượng nhân tố kháng khuẩn vào polymer. Tính hiệu quả của phương pháp
này tốt hơn so với phương pháp thêm trực tiếp các nhân tố bảo quản vào thức ăn do 2
nguyên nhân chính. Thứ nhất, thêm các nhân tố AM vào polime cho phép các chức năng của
nhân tố AM giải phóng chậm trong thời gian dài. Thứ 2 tính hoạt hoá của AM có thể bất
hoạt hoá bằng cách (như trung hòa, thủy phân, pha loãng và vv) của ma trận thực phẩm và
các thành phần khi được bổ sung trực tiếp vào thực phẩm (Appendini & Hotchkiss, 2002;
Muriel-Galet, Cerisuelo, Lopez-Carballo, Lara, Gavara, & Hernandez-Munoz, 2012). Bên
cạnh đó, bổ sung trực tiếp của tác nhân bảo quản vào thức ăn có thể làm giảm chất lượng
thực phẩm như là kết quả của việc thay đổi những tính chất cảm quan và kết cấu của thực
phẩm. Như vậy, bao bì AM đang đóng vai trò quan trọng để ức chế sự tăng trưởng của vi
khuẩn nhắm mục tiêu vào việc cải thiện an toàn thực phẩm và kéo dài thời hạn sử dụng mà
không ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm.
Một số chất kháng khuẩn thường sử dụng trong bao bì thực phẩm
 Bao bì kháng khuẩn với tinh dầu và chiết xuất từ thực vật
Các thành phần hoạt động của các loại tinh dầu thực vật ức chế các vi sinh vật thông
qua sự xáo trộn của các màng tế bào chất, phá vỡ các động lực proton, dòng electron, vận
chuyển tích cực và ức chế tổng hợp protein. Ví dụ về các chất chiết xuất từ thực vật và tinh
dầu kết hợp rộng rãi nhất vào bao bì thực phẩm là linalool, thymol, carvacrol, dầu cây đinh
hương, cinnamaldehyde và tinh dầu húng quế.
 Bao bì kháng khuẩn chứa enzyme
Lysozyme, thu được từ trứng gà là một enzyme được phân loại như một tác nhân
kháng khuẩn tự nhiên và thường được đưa vào các vật liệu đóng gói. Giống với các tác nhân
kháng khuẩn tự nhiên khác, lysozyme thì kém hiệu quả đối với vi khuẩn Gram âm do sự tồn
tạo lớp lipopolysaccharide (LPS) trên thành tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn Gram dương rất nhạy
cảm với lysozyme bởi vì màng của chúng được cấu tạo từ 90% peptidoglucan mà ở đó sự
thủy phân liên kết glycoside β-1-4 giữa nhóm N-acetyl của acid muramic và nhóm N-acetyl
của nhóm glucosamine diễn ra. Nhằm nâng cao hơn nữa hiệu quả kháng khuẩn của enzyme,
một vài tác nhân kháng khuẩn như chất tẩy rửa và chelators thì thường được thêm vào.

 Bao bì kháng khuẩn chứa chitosan
Chitosan rất hấp dẫn đối với các nhà nghiên cứu khoa học do một số tính chất thú vị
của nó như là một hợp chất polyne tự nhiên, không độc, khả năng tạo màng và phân hủy
sinh học (Torlak và cộng sự 2011, Cooksey 2010). Bên cạnh đó, chitosan có tính chất kháng
khuẩn và có thể vô hoạt vi khuẩn. Bởi vì phân tử chitosan tích điện dương có thể tương tác
tốt hơn với acid teichoic trong thành tế bào của vi khuẩn Gram âm.
Nghiên cứu hoạt động của màng chitosan-tinh bột ăn được với Thynus kotschyanus
được nghiên cứu bởi Mehdizadeh (2012) có khả năng ức chế chống lại L.monocytogenes,
E.Coli, S.aureus, S.typhimurium với những mức độ khác nhau. Màng không có dầu nguyên
chất thì không hiệu quả đối với S.typhimurium mà ở đó vùng ức chế không được tạo thành.
L.monocytogenes rất nhạy cảm với màng được thêm kotschyanus. Bởi vì nồng độ của
kotschyanus được tăng lên, vùng ức chế của E.Coli mở rộng có ý nghĩa. Chỉ thị kotschyanus
là một phản ứng chọn lọc trên khoảng vi khuẩn Gram âm và Gram dương.
 Bao bì kháng khuẩn chứa Bacteriocin
Khác với các tác nhân kháng khuẩn chiết xuất từ thực vật, động vật, tác nhân kháng
khuẩn được tạo thành từ vi khuẩn gọi là bacteriocin thì dần dần đạt được dân số trong môi
trường nhiệt độ cao và acid. Bacteriocin là sản phẩm đồng hóa (peptide kháng khuẩn) được
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 11


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
sản xuất bởi hệ thống phòng thủ của hầu hết các vi khuẩn. Hoạt động tự nhiên này cho phép
hoạt động của vi khuẩn chủng này ức chế sự phát triển của các chủng khác. Bacteriocin
được sản xuất bởi vi khuẩn acid lactic (LAB) được đánh giá cao bởi vì LAB là vi khuẩn lên
nen quan trọng trong nhiều thế kỉ.Ví dụ như phô mai, rượu vang, kim chi, nước tương…
Nisin, được sản xuất bởi vi khuẩn lactobacillus lactis, thường được xuất hiện trong sữa và
được công nhận bởi FDA. Nó là bacteriocin đầu tiên được tinh sạch và đặc biệt sử dụng để
ngăn chặn sự phát triển của bào tử Clostridium botulinum trong phô mai.

Bacteriocin như enterrocins A và B, Sakacin, enterocin 416K1, pediocin AcH đã
được chứng minh có khả năng kiểm soát sự gia tăng của L. monocytogenes trong thực phẩm
có chứa chất ô nhiễm nhân tạo. Siragusa và cộng sự (1999) báo cáo rằng bacteriocin bọc
màng PE chế tạo bởi quá trình kiểm tra ép đùn bao bì thịt tiêm chân không với
B.thermosphacta đã ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn này. An và cộng sự (2000)
cũng báo cáo rằng bacteriocin được bao bọc bởi màng LDPE ức chế chống lại Micrococus
flavus và L.monocytogenes. Kim và cộng sự (2002) nghiên cứu trên bacteriocin phủ LDPE
thấy rằng việc sử dụng nisin và màng bọc lacticin NK24 kéo dài tuổi thọ của sò và thịt bò
tương ứng được bảo quản tại 30C từ 10 đến 12 ngày và 9 đến 13 ngày. Trong khi đó, tuổi thọ
của sò và thịt bod kéo dài từ 5 đến 12 ngày và 5 đến 9 ngày khi được bảo quản ở 10 0C.
 Bao bì kháng khuẩn với hạt nano vô cơ
Việc sử dụng các hạt nano vô cơ như các tác nhân kháng khuẩn gần đây trở nên phổ
biến mà do sự ổn định tốt của các vật liệu này chịu được quá trình khắc nghiệt như áp lực
cao hoặc nhiệt độ trong quá trình chế tạo bằng nhựa. Các hạt nano vô cơ được nghiên cứu
rộng rãi cho mục đích kháng khuẩn là titan đioxit (TiO 2) và oxit kẽm (ZnO). Titanium
dioxide (TiO2) là không độc hại và được chấp nhận bởi FDA cho sử dụng trong thực phẩm,
thuốc và nguyên liệu thực phẩm. Đó là một xúc tác quang học được sử dụng rộng rãi để làm
bất hoạt rộng phần lớn vi sinh vật.
Việc thành lập các tác nhân - vào polymer có thể ảnh hưởng xấu đến tính chất vật lý,
tính toàn vẹn cơ học và ổn định nhiệt của bao bì khi các tác nhân _ sử dụng không tương
thích với các polymer. Trong khi đó, AM tác nhân tương thích với các vật liệu đóng gói có
thể dò ra được cũng vào không gian giữa các chuỗi polymer. Nói cách khác, nó không ảnh
hưởng đến các tính chất ,màng khi số lượng hợp lý được thêm vào (Han, 1996). Vì vậy,
nghiên cứu về hóa học và cấu trúc polymer rất quan trọng trong việc dự đoán những ảnh
hưởng của các tác nhân - đặc biệt trên bao bì. Sau đó, việc lựa chọn các tác nhân polyme
bao bì và phương pháp kết hợp có thể có hiệu quả hơn
1.7.
Màng sinh học trong bảo quản thực phẩm
Theo phương pháp sản xuất, vật liệu polymer sinh học được chia thành 3 nhóm chính:
+ Polymer được tách trực tiếp từ các nguồn tự nhiên (chủ yếu là thực vật), ví dụ như các

polysaccharit (tinh bột, cellulose) và protein (casein, gluten của bột mì).
+ Polymer được tổng hợp bằng phương pháp hóa học từ monome. Ví dụ, vật liệu polylactat
là một polyeste sinh học được polymer hóa từ monome acid lactic. Các monome này được
sản xuất nhờ lên men Cacbonhydrat tự nhiên.
+ Polyme được sản xuất nhờ vi khuẩn cấy truyền gen hoặc vi sinh vật (hay còn gọi là
Biofilm). Vật liệu polyme sinh học điển hình nhất là polyhydroxy – alkanoat, chủ yếu là
polyhydroxybutyrat (HB), và copolyme của HB và hydroxy – valerat (tên thương mại là
biopol)
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 12


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
Ba loại polyme sinh học trên có tiềm năng làm nguồn vật liệu cho bao bì trong tương
lai và gần như thay thế các loại vật liệu bao bì hiện tại có nguồn gốc dầu mỏ (như PE, PS).
Nhìn chung các polyme sinh học nói trên đều có hiệu quả cao và dễ chế biến thành màng
mỏng bằng công nghệ gia công chất dẻo thông thường nên còn hơi đắt, còn đối với polyme
đi từ từ polysaccharid và protein, vấn đề càng hiệu quả rõ ràng hơn, đặc biệt là cellulose,
nguồn polyme tự nhiên có sẵn và rất rẻ. Các loại giấy bóng kính (celophan) khá bên, nhạy
cảm với độ ẩm được sản xuất từ cellulose là một loại vật liệu rất thích hợp làm bao bì.

GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 13


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
PHẦN 2: ỨNG DỤNG CỦA BIOFILM CHỨA CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG
BẢO QUẢN THỰC PHẨM

2.1. Vi sinh vật định hướng
BC được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn khác nhau. Con đường sinh tổng hợp và
cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài tương đối giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi loài
thì khác nhau. Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm
cellulose chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ polymer hóa),
tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó. Tùy thuộc vào mỗi loài mà trạng thái kết tinh của
cellulose khác nhau, từ đó xác định các tính chất vật lý của sản phẩm như độ bền, độ hòa tan
trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân biến tính
Bảng 2.1. Cấu trúc màng BC của một số vi khuẩn.
Vi sinh vật
Acetobacter

Cấu trúc cellulose
Lớp màng ngoại bào

Vai trò sinh học

Dải cellulose

Để giữ vi khuẩn trong môi trường
hiếu khí

Achromobacter

Sợi cellulose

Sự kết bông trong nước thải

Aerobacter


Sợi cellulose

Sự kết bông trong nước thải

Agrobacterium

Sợi ngắn

Tham gia vào mô thực vật

Alcaligenes

Sợi cellulose

Sự kết bông trong nước thải

Pseudomonas

Các sợi không tách biệt

Sự kết bông trong nước thải

Rhizobium

Sợi ngắn

Tham gia vào hầu hết thực vật

Sarcina


Cellulose dị hình

Không rõ

Zoogloea

Chưa xác định rõ cấu trúc

Sự kết bông trong nước thải

Acetobacter xylinum (A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose
hữu hiệu nhất. Acetobacter orleanse váng mỏng nhưng chắc, A. pasteurianum váng khô và
nhăn nheo, A.suboxydans váng mỏng dễ tan rã, A.curvum sinh ra acid acetic với nồng độ ca
nhưng tạo váng không rắn chắc.Gần đây, nó được xếp vào giống mới Gluconacetobacter
bao gồm các loài là G. xylinum, G. europaeus, G. oboediens và G. intermedius.
2.1.1. Đặc điểm hình thái
A. xylinum là vi khuẩn hình que dài khoảng 2m, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành
chuỗi, không di động. Là vi khuẩn Gram âm, vỏ nhầy được cấu tạo bởi cellulose. A. xylinum
thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng trên bề mặt tiếp xúc giữa
môi trường lỏng và môi trường không khí.
2.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 14


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
Điều kiện tối ưu để A. xylinum sinh trưởng ở pH = 4 - 4,5, nhiệt độ từ 25-32 0C. Acid
acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của A. xylinum . Nhưng khi lượng acid
tích lũy quá cao thì sẽ ức chế chúng.

A. xylinum hấp thụ đường glucose rất tốt từ môi trường nuôi cấy. Trong tế bào vi
khuẩn, glucose sẽ kết hợp với acid béo tạo thành tiền chất nằm trên màng tế bào. Sau đó nó
được thoát ra ngoài tế bào cùng với một loại enzyme. Enzyme này có thể polymer hóa thành
cellulose. A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào nguồn
đường nào được sử dụng tốt nhất
Bảng 2.1.2. Đặc điểm sinh hóa của A. xylinum .
ST
T
1
2
4
5
6
7

Đặc điểm sinh hóa của A.xylinum

Hiện tượng

Acid acetic tạo ra kết hợp với
Oxy hóa ethanol thành acid acetic
CaCO3 làm vòng sáng rộng hơn
và tạo lớp cặn, đục rõ
Catalase
Sủi bọt khí
Chuyển hóa glucose thành acid
Vòng sáng sung quanh khuẩn lạc
Chuyển hóa glycerol thành Vòng CuO xuất hiện xung quanh
dihydroxyaceton
khuẩn lạc

Kiểm tra sinh sắc tố nâu
Không thấy sắc tố nâu
Kiểm tra tổng hợp cellulose
Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam

Kết quả
+
+
+
+
+

2.1.3. Cấu trúc màng BC
Cellulose là một polymer không phân nhánh của các liên kết -1,4 glucopyranose.
Các nghiên cứu cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống với cấu trúc của cellulose thực vật.
Tuy nhiên, cấu trúc đa phân tử và thuộc tính của cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực
vật. Các chuỗi mới sinh của BC tập hợp lại hình thành nên các siêu sợi có độ rộng khoảng
1.5nm. Các siêu sợi này lại hình thành nên các vi sợi (Jonas and Farab, 1998), sau đó chúng
được bó lại và hình thành nên các ribbon (Yamanaka và cộng sự, 2000). Kích thước của các
ribbon là 3-4 x 70-80 nm. Các BC khác nhau thường có độ polymer hóa khác nhau thường
nằm trong khoảng 2000 đến 6000, trong một số trường hợp lên đến 16000 – 20000. Trong
khi đó mức polymer hóa trung bình của thực vật thường nằm trong khoảng 13000 – 14000
2.1.3.1. Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn
- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành
phần tỉ lệ Iα cao.
- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I.
- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc.
- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và
hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể

phục hồi.
- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.
- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao,
ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao.
- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một số
sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian. Đặc biệt vi khuẩn
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 15


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ
cực nhỏ.
- Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách
tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ đó có thể kiểm
soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose.

Hình 2.1.3.1 Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001)
2.1.3.2. Yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo BC của vi khuẩn
 Kiểu nuôi cấy
Có 2 kiểu nuôi cấy thường được sử dụng để sản xuất cellulose vi khuẩn, đó là nuôi
cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo.
Nuôi cấy tĩnh
Đối với nuôi cấy tĩnh, người ta sử dụng những khay nhựa đã chuẩn bị môi trường và
tiến hành nuôi cấy chủng A. xylinum ở điều kiện tĩnh.
Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp xếp
thẳng hàng trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu xuống môi
trường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với nhau tạo thành tấm
cellulose trên bề mặt canh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu oxy.

Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tĩnh cho sản lượng thấp
và mang tính thủ công. Do đó, để sản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sản
xuất hàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn (Edwards, 1995).
Nuôi cấy có khuấy đảo
Tiến hành nuôi cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịch môi trường, có cánh khuấy,
thổi khí oxy hoặc lắc. Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển theo chiều
sâu của môi trường. Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, elip…
Đây là kĩ thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứng
dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ
mới được sản xuất với sản lượng thấp. Sản xuất cellulose từ A. xylinum bằng phương pháp
nuôi cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại, trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính không
ổn định khi nuôi cấy. Tính không ổn định được thể hiện bởi sự mất khả năng sản xuất
cellulose và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến không có khả năng
sản xuất cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et al., 1997).
Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A. xylinum được gắn
vào những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 16


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
et al. (1998) đã giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy bằng cách cung
cấp vào môi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit, silicagel, cát biển, những hạt
thủy tinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ... Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào
được tối ưu tuỳ theo mức độ khuấy, cũng như mức độ lắc của khay (Yoshinaga et al., 1997).
Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer sinh
học, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của phương
pháp nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002). Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng cellulose dày
được tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm,

cellulose lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những khối không đều, dạng viên
kết hay dạng cầu kích thước từ 10 µm đến 1000 µm.

Hình 2.1.3.2.Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (trái) và có khuấy
đảo (phải)(El-Saied et al., 2004)
Những phần tử hình cầu mịn của cellulose trong nuôi cấy chìm (Agitated bacterial
cellulose – Ag-BC) có cấu trúc mắt lưới tương tự cấu trúc mắt lưới của màng mỏng
cellulose thu được khi nuôi cấy bề mặt (Static bacterial cellulose – St-BC). Tuy nhiên có
vài sự khác biệt về hình thái trong những sợi nhỏ và trong cấu trúc này giữa St-BC và AgBC. Sợi cellulose của St-BC duỗi thẳng trong khi sợi cellulose Ag-BC cong và rối, làm cấu
trúc mắt lưới dày hơn so với cấu trúc St-BC. Bên cạnh đó, chiều rộng sợi Ag-BC mỏng hơn
so với St-BC, mặc dù rất khó xác định chính xác kích thước của mỗi sợi. Hình thái này có
được có thể do dòng chảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển không ngừng của môi trường
khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo. Những thay đổi về hình thái học có liên quan đến
những thay đổi trong cấu trúc vi mô như trọng lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần I α,
bảng 2.2 cho thấy rõ điều này.

GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 17


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
Hình 2.3. Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (a) và nuôi cấy có khuấy đảo (b)
(Watanabe et al., 1998)
Khả năng giữ nước của cellulose vi khuẩn là khối lượng nước được giữ lại trên một
đơn vị khối lượng của sợi cellulose, lượng nước này được giữ trên bề mặt và trong những
phần tử tạo nên sợi cellulose.
Giá trị của chức năng duy trì lọc được định nghĩa là lượng phân tử CaCO 3 bị giữ trên
tờ giấy cellulose. Phân tử nhỏ hơn và phân tán hơn của Ag-BC bị phân hủy có hiệu quả hơn
phân tử của St-BC trong việc giữ lại các hột nhỏ vì phân tử của Ag-BC bị phân hủy có bề

mặt hiệu dụng rộng hơn suốt quá trình lọc trong sản xuất giấy. Trong trường hợp của chất ổn
định nhũ tương, phân tử Ag-BC bao phủ bề mặt của những giọt dầu rộng hơn và nhũ tương
chứa trong Ag-BC ổn định hơn.
Do đó, Ag-BC thể hiện nhiều đặc tính phù hợp hơn cho những ứng dụng công nghiệp
hơn St-BC (Watanabe et al., 1998).
 Ảnh hưởng của thiết bị đến năng suất tạo thành cellulose vi khuẩn
Phương pháp sản xuất cellulose vi khuẩn truyền thống là nuôi cấy tĩnh, nhưng
phương pháp này đòi hỏi phải có diện tích lên men lớn và thời gian lên men dài. Do đó một
số phương pháp khác được khảo sát để thay thế cho phương pháp nuôi cấy tĩnh.
Thùng lên men khuấy trộn được dùng rộng rãi trong sản xuất cellulose vi khuẩn, nuôi
cấy liên tục có bổ sung ethanol làm tăng tốc độ tổng hợp cellulose gấp 2 lần so với nuôi cấy
mẻ. Hơn nữa trong điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo, dễ dàng kiểm soát các yếu tố môi
trường. Tuy nhiên, khó khăn của quá trình nuôi cấy lắc là cellulose sinh ra tích lũy trong
môi trường làm cho môi trường có độ nhớt cao dẫn đến khó kiểm soát quá trình khuấy trộn
và sục khí. Các viên huyền phù cellulose có độ giữ nước cao, nhanh chóng choáng hết thể
tích môi trường, gây khó khăn cho vi sinh vật phát triển tạo cellulose (Klemm et al., 2001;
Yoshinaga et al., 1997).
Một số thiết bị lên men sản xuất cellulose vi khuẩn
a. Ajinomoto
Được đặt tên theo tên một công ty, phương pháp này sử dụng môi trường bề mặt
nhằm cải thiện sự tổng hợp của cellulose. Các tế bào đầu tiên được nhân giống trong thiết bị
có sục khí trước khi được cho vào các khay tĩnh. Sau 3 ngày trong thiết bị suc khí, mật độ tế
bào vào khoảng 2x107 (tế bào/ml). Lúc này, dịch lên men được chuyển vào các khay có sục
khí. So sánh với quá trình lên men thông thường tạo cellulose thì thiết bị nay fcho năng suất
cao hơn 140%. Sản phẩm có khả năng giữ nước thấp và chứa khoảng 10% lượng sucrose
ban đầu (Okiyama et al., 1992).
b. Weyerhauser
Được đặt tên theo tên của một công ty Mỹ phát minh ra, một quá trình được phát
triển để sản xuất sợi có kích thước nhỏ, khoảng 1/300 kích thước của bột gỗ. Sử dụng các
chất gây đột biến đổi hóa học để thay đổi các mức độ tác động của enzyme, chủng A.

xylinum được phân lập để làm giảm lượng chất phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, bao
gồm gluconic acid với việc điều chỉnh pH thấp hơn. Rõ rằng hơn, chủng vi sinh vật được
phân lập để sản xuất cellulose khi khuấy đảo. Trước đây, khuấy đảo một dịch lên men để
cung cấp oxy, và sự trao đổi chất, tổng hợ cellulose không ngừng. Tuy nhiên, sản phẩm tạo
ra từ phương pháp này là một dịch huyền phù sệt, nhớt, tên thương mại là Cellulon (Black
et al., 1990).
ICI
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 18


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
ICI (Imperial Chemical Industry) bao gồm 4 bước và sản xuất một chất sệt giống với
hệ thống Weyerhauser. Bước đầu tiên là bước tích lũy. Khi đó vi khuẩn được phép phát triển
trong một thiết bị phản ứng có khuấy đảo đến khi nguồn carbon được tiêu thụ hết. Sau đó bổ
sung nguồn carbon với tốc độ phù hợp cho sự tổng hợp cellulose. Bước cuối cùng là loại đi
các huyền phù từ thiết bị phản ứng và sau đó tách các tế bào vi sinh vật ra khỏi sản phẩm
(Serafica et al.,1998).
c. Gengiflex®, Biofill® và BASYC®
Chủng A. xylinum thích hợp được đưa vào một thiết bị, trong đó tạo điều kiện tối ưu
cho chúng phát triển. Các điều kiện tối ưu cho sự sản xuất cellulose sau đó được áp dụng
cho dịch lên men. Tất cả các quy trình đều được phát triển trên môi trường cơ bản của
Schramm và Hestrin (1954).
Gengiflex® được áp dụng trong công nghiệp nha khoa, cụ thể là được áp dụng để
giúp hồi phục lại mô bao quanh răng (Novaes et al., 1997).
Biofill®, được sử dụng như là một dải băng, có thể được ứng dụng băng các vết
thương trong trường hợp bị phỏng hay bị loét. Biofill® được sử dụng như da nhân tạo cho
con người. Mặt hạn chế lớn nhất của sản phẩm là bị giới hạn bởi tính co giãn khi ứng dụng
để làm các vết băng tai những vùng có cường độ vận động cao. Ngược lại, ưu điểm của nó

là giúp hồi phục nhanh chóng vết thương, và khả năng chống nhiễm trùng tốt. Cellulose
trong suốt cho phép kiểm tra, theo dõi vết thương dẽ dàng trong khi Biofill® sẽ tách ra khi
vết thương hồi phục. Với việc rút ngắn thời gian và chi phí điều trị, Biofill® được đánh giá
rất cao (Fontana et al,. 1990).
Một nhóm các nhà hóa học, sinh vật học và giải phẫu học đã phát triển một sản phẩm
gọi là BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose). BASYC® là một sản phẩm dạng ống
dùng thay cho các mạch máu. Các ống có đường kính trong khoảng 1mm và dài 5mm, được
sử dụng thay thế cho mạch máu. Công dụng khác của loại sản phẩm này là bề mặt trong của
ống BASYC® nhẵn và trơn hơn các vật liệu tổng hợp khác khi sử dụng cùng mục đích
(Klemm et al,. 2001).
d. Thiết bị thu nhận cellulose liên tục
Thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm. Sử dụng một dụng cụ có độ sâu
không lớn để lượng môi trường cần thiết là tối thiểu, các sợi cellulose được thu bởi một trục
quay liên tục với tốc độ 35 mmh-1. Sau một thời gian thu nhận cellulose thì đem cellulose đi
xử lý. Ưu điểm lớn nhất của dạng thiết bị này là cellulose có thể được thu nhân liên tục và
môi trường mới được bổ sung sau mỗi 12 giờ (Sakairi et al., 1997).
e. Thiết bị phản ứng có sục khí tuần hoàn và khuấy đảo
Trong môi trường tĩnh, thời gian nhân đôi số lượng tế bào là từ 8 – 10 giờ, trong khi
trong điều kiện có lắc đảo, thời gian này là 4 – 6 giờ (Canon và Anderson, 1991). Bằng cách
tăng khuấy đảo và cung cấp oxy cho môi trường nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng tế bào cũng
tăng lên. Do đó, khả năng sản xuất với tỷ lệ lớn là có thể, thiết bị lên men có khuấy đảo và
có sục khí được nghiên cứu và mong muốn tạo ra cellulose dạng II. Độ nhớt cao của môi
trường và sức cản mạnh là trở ngại của phương pháp. Với phương pháp này thì sợi cellulose
tạo ra có cấu trúc không bình thường (Kouda et al., 1997).
 Ảnh hưởng của áp suất oxy đến quá trình tổng hợp cellulose vi khuẩn
Sự hình thành cellulose diễn ra tại vị trí mặt phân cách giữa không khí và lớp màng
cellulose chứ không phải tại mặt phân cách giữa môi trường và cellulose. Do đó oxy là nhân
tố quan trọng cho quá trình tổng hợp cellulose (Borzano & Desouza et al., 1995).
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt


Page 19


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
Watanabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy ảnh hưởng đến cả sự hình
thành cellulose cũng như sức sản xuất màng. Cellulose tăng trưởng dưới áp suất oxy thấp có
sự phân nhánh nhiều hơn so với cellulose tăng trưởng trong điều kiện áp suất cao hơn. Điều
này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến tính dai của lớp màng. Hơn nữa, với áp suất oxy là 10%
tính sản xuất cellulose cao hơn 25% mà không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào. Sự
tổng hợp cellulose tại áp suất 10% và 15% cao hơn so với điều kiện áp suất khí quyển. Tuy
nhiên, hàm lượng oxy cao trên 50% lại hạn chế khả năng tổng hợp cellulose của vi sinh vật.
(Yamanaka & Watanabe et al., 1995).
 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sản phẩm cellulose vi khuẩn
Ảnh hưởng của pH
Sự chuyển hóa glucose thành acid gluconic trong quá trình tổng hợp cellulose là
nguyên nhân chính của sự giảm pH của môi trường lên men. pH ảnh hưởng rất lớn đến sự
phát triển của tế bào và sự hình thành cellulose (Hwang, J.W et al., 1999). Các báo cáo
trước đây đã đưa ra các kết luận cho thấy pH tối ưu cho sự tổng hợp cellulose từ A. xylinum
là trong khoảng 4 – 7. Trong khi đó, trong báo cáo của mình, Fiedler et al. (1989) đưa ra
khảng pH tối ưu là 5 – 7 (Masaoka et al 1993) thì thấy rằng khoảng này là 4 - 6. Qua các kết
quả nghiên cứu đó cho chúng ta kết luận rằng pH thấp hơn 7 là thích hợp cho sự tổng hợp
cellulose và sự phát triển của tế bào vi sinh vật A. xylinum.
A. xylinum đồng thời tổng hợp cả cellulose và cellulase. Cellulase ít được tổng hợp ở
pH thấp (pH < 5) và được tổng hợp nhiều hơn ở pH cao. Độ bền cơ học của tấm cellulose
nuôi cấy tại pH 4 cao hơn độ bền của tấm cellulose nuôi ở pH 6 (Toda et al., 1997).
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sự tổng hợp cellulose phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ. Nhiệt độ từ 25 - 30 0C là
thích hợp cho sự tổng hợp cellulose (Canon & Anderson, 1991). Hầu hết các nghiên cứu đều
sử dụng khoảng nhiệt độ từ 25 - 300C.
Sự thay đổi nhiệt độ không những chỉ thay đổi hiệu suất tổng hợp cellulose mà còn

thay đổi cả cấu trúc của cellulose, đặc biệt là khả năng giữ nước và mức độ polymer hóa.
cellulose được sản xuất ở 300C có mức độ polymer hóa thấp hơn và khả năng giữ nước cao
hơn so với cellulose được sản xuất ở nhiệt độ thấp hơn (Geyer et al., 1994).
Nhiệt độ cao (khoảng 1000C trong 3 giờ) không gây ảnh hưởng cho cấu trúc cellulose
nhưng nhiệt độ thấp (-20 0C) sẽ làm tăng tính mềm dẻo của cellulose vi khuẩn (Zou et al.,
2006).
 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về quá trình tổng hợp cellulose của chủng A.
xylinum là môi trường do Hestrin và Schramm (1954) thiết lập, có nguồn nitơ là dịch chiết
nấm men và peptone với tỉ lệ tương ứng là 5:3. Từ khi thành phần môi trường này được đưa
ra, nó đã trở thành môi trường cơ bản cho hầu hết các nghiên cứu về sản xuất cellulose vi
khuẩn. Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã có sự thay đổi thành phần môi trường liên
quan đến phần trăm của nitơ từ các nguồn khác nhau như dịch chiết nấm men, CSL (corn
steep liquor), peptone, trypton, cao thịt, proteopeptone…Tất cả các nguồn nitơ này đều được
ứng dụng, trong đó CSL là nguồn nitơ được cho là có hiệu quả nhất, tác động tăng trưởng tế
bào và tốc độ tạo cellulose cao so với các nguồn nitơ khác và đây cũng là nguồn nitơ có giá
thành tương đối rẻ (Klemm et al., 2001; Jonas et al., 1998; Toda et al., 1997).
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 20


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
Một vài amino acid bắt buộc phải có là methionine và glutamate. Masaoka et al.
(1993) đã chứng minh methionine có tác dụng quan trọng đến sự tăng trưởng tế bào và tăng
hiệu suất tạo cellulose so với môi trường không có amino acid này.
Các vitamin pyridoxine, nicotinic acid, p-aminobezoic acid và biotin được xác định
là cần thiết cho sự tăng trưởng và tổng hợp cellulose, trong khi pantothanate và riboflavin
cho kết quả ngược lại (Yang et al., 1998).

Ảnh hưởng của nguồn carbon.
Rất nhiều cơ chất được sử dụng làm nguồn carbon cho sự hình thành cellulose bởi vi
khuẩn A. xylinum. Các chủng vi khuẩn khác nhau tổng hợp cellulose với những lượng khác
nhau đối với các cơ chất khác nhau.
Glucose được xem là nguồn carbon tốt nhất cho A. xylinum IFO 13693 tổng hợp
cellulose, lượng cellulose có thể đạt được lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau 2 - 4 ngày lên
men (Masaoka et al., 1993). Tuy nhiên, hàm lượng cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum
Ku-1 khi sử dụng nguồn cơ chất là mannitol và arabitol cao hơn 3 lần so với khi sử dụng cơ
chất là glucose (Oikawa et al., 1995). Bên cạnh đó, fructose lại là nguồn cơ chất thích hợp
nhất cho A. xylinum BPR2001 tổng hợp cellulose (Matsuoka et al., 1996).
Jonas & Farah (1998) đã so sánh lượng cellulose tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum
IFO 13693 khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau, glucose được chọn làm nguồn carbon
để đối chứng (bảng 2.3).
Bảng 2.1.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của
A. xylinum IFO 13693 (Jonas & Farah, 1998)
Nguồn Carbon
Năng suất tổng hợp cellulose (%)
Monosaccharides
D-Glucose
100
D-Fructose
92
D-Galactose
15
D-Xylose
11
D-Arabinose
14
D-Sorbose
11

Disaccharides
Lactose
16
Malnose
7
Sucrose
33
Cellobiose
7-11
Polysaccharides
Tinh bột
18
Ethanol
4
Ethylene glycol
1
Propylene glycol
8
Glycerol
93
D-Arabitol
620
D-Mannitol
380
Acid hữu cơ
Citrate
20
L-Malate
15
Succinate

12
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 21


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
Những chất khác
Glucono-lactate
O-methyl-glucose

62
0.5

 Tỷ lệ diện tích bề mặt – thể tích (S/V)
Bởi vì sự hình thành cellulose diễn ra trên mặt tiếp xúc giữa không khí và môi trường
(Masaoka et al.,1993) nên tỉ lệ diện tích bề mặt tiếp xúc và thể tích môi trường là nhân tố có
vai trò khá quan trọng trong sự hình thành và tổng hợp cellulose. Tỉ lệ tốt nhất đối với các
chủng vi khuẩn khác nhau và điều kiện môi trường đang sử dụng khác nhau là khác nhau.
Vandamme et al. (1998) đưa ra kết luận tỉ lệ S/V khoảng 2,2 cm -1 cho kết quả tốt nhất khi
khảo sát trên dải tỉ lệ từ 1 đến 3 cm -1. Trong khi đó, lượng cellulose thu được cao nhất khi
S/V bằng 0,7 cm-1 khi khảo sát trên dải tỉ lệ từ 0,27 đến 2,13 cm -1 (Krystynowicz et al.,
2002).[6]
 Tính chất hóa lý của màng S-BC
Màng S-BC có thể tạo hình dạng phù hợp với thiết bị phản ứng sinh học. Hình dạng,
kích thước của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra kích thước mong muốn.
S-BC có tính chất cơ lý bền và ổn định. Độ chịu lực của BC khá dai, gần bằng với độ chịu
lực của nhôm. Tính chất cơ lý bền và ổn định giúp BC có thể chịu được sự tác động của môi
trường như khuấy trộn hoặc các áp lực. BC không tan trong môi trường phản ứng. Giá thể
BC có độ trương nở tốt. Độ trương nở giúp cho sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm. Môi

trường trong và ngoài chất mang không có sự khác biệt. BC đã qua xử lý không gây tác
động đến chất được hấp phụ. Sau giai đoạn xử lý, BC chỉ là giá thể trơ về mặt hóa học, có
độ trương nở tốt. Màng BC có thể tái sử dụng nhiều lần trong ứng dụng làm chất mang, an
toàn cho môi trường sống.
 Con đường sinh tổng hợp BC.
Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cách
chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một lượng lớn enzyme, các chất xúc tác và protein
điều hòa. Tiến trình này bao gồm sự sinh tổng hợp urdine diphosphoglucose (UDPGIc), tiền
chất của cellulose, tiếp đến là sự polymer hóa glucose vào mỗi chuỗi -1,4-glucan và sự kết
hợp các sợi mới vào dải (ribbon), được hình thành từ hàng trăm, thậm chí hàng ngàn sợi
cellulose riêng lẻ.
Trong quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn, UDPGIc được xem là tiền chất của
cellulose. Đầu tiên glucose được phosphoryl hóa thành glucose-6-phosphate, phản ứng này
được xúc tác bởi glucokinase, tiếp theo đó phản ứng isomer hóa glucose-6-phosphate thành
glucose-1-phosphate được xúc tác bởi enzyme phosphoglucomutase. Sau đó, enzyme
UDPGIc pyrophosphorylase xúc tác phản ứng chuyển glucose-1-phosphate thành UDPglucose, tiền chất của cellulose. Cuối cùng, UDP-glucose được chuyển thành cellulose nhờ
xúc tác của enzyme cellulose sythase

GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 22


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn

Hình 2.4. Con đường sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum [11].

2.2

Phương pháp sản xuất và bảo quản BC

Giống A.xylinum

Nhân giống cấp I

Nhân giống cấp II

Cấy giống:10-20% giống

Lên men tĩnh (1-2ngày)

Thu nhận BC thô

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình thu nhận màng BC
Giống được nhân giống cấp 1 ở điều kiện nhiệt độ thường trong 24 giờ với tỷ lệ
giống là 20%. Sau đó tiếp tục nhân giống cấp 2 ở điều kiện nhiệt độ phòng trong vòng 48
giờ với tỷ lệ giống 20%. Tiếp theo, giống được lên men trong môi trường nhân giống để tạo
màng BC.
Để thu được lớp màng có bề dày mong muốn, thí nghiệm được thiết lập như sau:
giống và môi trường nhân giống được trộn với nhau, sau đó đem đổ dịch giống vào đĩa nhựa
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 23


Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
có kích thước đường kính là 10,5 cm với thể tích dịch giống là: 12ml, 14ml, 16ml, 18ml,
20ml.
Phương pháp xử lý màng BC trước khi hấp phụ
Màng BC sau khi thu được chứa một lượng lớn môi trường lên men và các sản phẩm
của quá trình trao đổi chất (acid acetic,…). Mục đích của đề tài là sử dụng màng mỏng BC

để hấp phụ nisin để gia tăng thời gian bảo quản trứng vịt muối nên việc xử lý màng BC phải
đạt những yêu cầu sau:
- Có tính chất cơ lý bền vững, độ trương nở ổn định, chịu được các tác động của môi
trường như khuấy trộn, áp lực, nhiệt độ…
- Không gây tác động đối với chất được hấp phụ và thực phẩm được bao bọc.
BC sau khi lên men xong sẽ được xử lý theo sơ đồ

Màng BC thô

Rửa và ngâm nước
(24h)

Ngâm trong NaOH 3% (10h)

Ngâm trong HCl 5% (20phút)

Rửa và ngâm nước
(24h)

Màng BC

Hấp tiệt trùng
(1210C, 15phút)

Hình 2.6. Các bước xử lý màng BC
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 24



Bảo quản thực phẩm bằng BIOFILM chứa chất kháng khuẩn
2.3 Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu

-

Thịt tươi sau khi giết mổ thường giảm chất lượng về cả chất lượng cảm quan và
chất lượng vi sinh chỉ sau 12 giờ ở nhiệt độ thường (bán ở các chợ) và sau 24 giờ ở nhiệt độ
mát (bán ở các siêu thị). Vì thế sử dụng màng cellulose vi khuẩn để bảo quản thịt.
Màng mỏng cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose - BC) là màng polymer sinh học. Màng
BC đã được nghiên cứu sử dụng để bảo quản thực phẩm. Nghiên cứu việc cố định tế bào vi
khuẩn Lactococcus lactis trên chất mang BC để ứng dụng lên men thu nhận bacteriocin và
ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu. Bước đầu sử
dụng màng mỏng cellulose vi khuẩn (BC) hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế
tối thiểu: có thể bảo quản thịt tươi đến 3 ngày bằng màng BC hấp phụ dịch bacteriocin 200
AU/m vẫn đảm bảo chất lượng thịt, theo TCVN 7046:2002.
2.3.1 Nguyên liệu
- Chủng vi khuẩn: Lactococcus lactis spp lactis 1 (Lc.lactis) phân lập từ pho mát.
- Chất mang: Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose - BC)
- Màng bao thực phẩm: Màng mỏng cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose - BC)
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu
+ Phương pháp cố định tế bào: Tế bào được cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC)
bằng phương pháp bẫy - hấp phụ (gồm 2 giai đoạn: hấp phụ vi khuẩn trên bề mặt BC và bẫy
tăng sinh trên và trong chất mang BC).
2.3.3 Qúa trình thực hiện
Hoạt hoá chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường MT1 ở 30oC, kỵ khí, 6 giờ.
Bổ sung chất mang BC vô trùng vào dịch tế bào đã hoạt hoá. Quá trình cố định trên chất
mang BC sẽ trải qua 2 giai đoạn liên tiếp:
Giai đoạn hấp phụ: trong khoảng 30 phút đầu tiên sau khi ngâm BC trong dịch tế bào, BC sẽ
trương nở về trạng thái ban đầu, đồng thời sẽ hấp phụ tế bào vào hệ thống sợi bên trong
cũng như trên bề mặt bên ngoài.

Giai đoạn bẫy tăng sinh: kế tiếp giai đoạn hấp phụ. Các tế bào đã được hấp phụ giai đoạn
trên tiếp tục phát triển và tăng sinh trên giá đỡ BC, khi tiếp tục ủ ở điều kiện tối ưu của vi
sinh vật cố định.
+ Định lượng vi khuẩn cố định trên bề mặt màng BC: Quét mẫu đại diện bằng giấy thấm
+ Dập mẫu vô trùng - Xử lý bằng cellulose - định lượng bằng phương pháp đếm gián tiếp.
+ Lên men bởi chế phẩm tế bào cố định ở quy mô phòng thí nghiệm trong fermenter (8 lít)
để thu nhận bacteriocin.
+ Xác định hoạt tính bacteriocin (AU/ml) theo phương pháp pha loãng hai lần liên tiếp
(Schilliner và Rest). Xác định độ pha loãng cao nhất cho thấy vòng vô khuẩn và xác định
hoạt tính bacteriocin (AU/ml) của dịch lên men:
AU/ml = DFi x (1/Vbactericin)
Trong đó:
AU: đơn vị hoạt tính
DFi: độ pha loãng cao nhất có vòng ức chế .
- Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin: bằng phương pháp khuếch tán
trên thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa vi sinh vật kiểm định và
vi sinh vật chỉ thị.
Thực hiện: Chủng vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy trong 50 ml môi trường MT1 ở 30 oC,
kỵ khí, 24 giờ. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 oC, thu nhận dịch nổi. Điều chỉnh
GVHD: TS Nguyễn Thị Minh Nguyệt

Page 25