ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


VÕ TRẦN KHÁNH HUYỀN

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NARINGENIN
GLUCOSIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI
CẤY HỖN HỢP HAI CHỦNG VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN

Chuyên Ngành :

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã Ngành

60420201

:

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Đà Nẵng – Năm 2017


Công trình được hoàn thành tại
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học 1: TS. NGUYỄN HUY THUẦN
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. ĐẶNG ĐỨC LONG

Phản biện 1: PGS.TS TRẦN THỊ XÔ

Phản biện 2: TS. NGUYỄN HOÀNG MINH

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp
thạc sĩ kỹ thuật họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 29 tháng 12 năm
2017.

Có thể tìm hiểu luận văn tại:
Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, nhu cầu sử dụng các loại thực vật làm dược liệu và
chăm sóc sức khỏe con người ngày càng tăng cao. Do đó việc khai
thác các hợp chất quý giá này đang trở thành một vấn đề quan trọng
mang tính toàn cầu và ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn.
Tuy nhiên, phương pháp tách chiết hoạt chất trực tiếp từ thực vật hay
tổng hợp bằng hóa học các hợp chất quý, trong đó có glycoside này
rất khó khăn do phải phụ thuộc vào thời gian sinh trưởng của cây,
khó nuôi cấy, năng suất thấp, chi phí cho công nghệ sản xuất cao và
có những thành phần hóa chất thải gây độc môi trường, con người.
Với sự phát triển công nghệ sinh học ngày nay, các thành tựu
của kỹ thuật di truyền, protein tái tổ hợp và cải biến trao đổi chất đã
được kết hợp với nhau và ứng dụng rộng rãi trong việc tổng hợp các
hợp chất thứ cấp tự nhiên nói chung và tổng hợp flavonoid glycoside

nói riêng theo kiểu in-vitro hoặc in-vivo. Phương pháp sinh tổng hợp
này có thể khắc phục được các nhược điểm nói trên, vì có tính đặc
hiệu rất cao, năng suất tốt và tiết kiệm thời gian, chi phí vận hành, dễ
dàng gia tăng sản xuất với quy mô lớn (Lim và cs. 2004), (Noguchi
và cs. 2009), (Offen và cs. 2006). Vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn là
nguồn vi sinh vật được sử dụng chủ yếu để sản xuất các hợp chất
mong muốn trong phương pháp sinh học. Trong đó, vi khuẩn
Escherichia coli là loại cơ bản và phổ biến nhất thường được ứng
dụng làm vật chủ (host) trong các thí nghiệm tổng hợp hoạt chất tự
nhiên hoặc chất mới. Nguyên nhân là người ta đã biết rất rõ các đặc
điểm sinh lý, sinh hóa, di truyền cũng như khả năng nhân đôi mạnh
mẽ, nguồn phân lập phong phú của loài E. coli này (Liu và cs 2010).


2

Trước đây, người ta chủ yếu nuôi cấy lên men chỉ với một
chủng vi khuẩn duy nhất trong suốt quá trình sinh tổng hợp các hợp
chất tự nhiên, phương pháp này được gọi là nuôi cấy đơn (monoculture). Hình thức sinh tổng hợp này tuy đơn giản, dễ thực hiện
nhưng cũng hạn chế phạm vi ứng dụng của kỹ thuật di truyền và
protein tái tổ hợp. Ví dụ, nếu đưa nhiều tái tổ hợp di truyền vào trong
vi sinh vật chủ sẽ làm giảm hiệu suất biểu hiện của các chuỗi gene
mã hóa enzyme của chúng và xuất hiện nhiều hợp chất phụ không
mong muốn có khả năng gây ức chế cảm ứng, làm giảm sự sinh
trưởng, phát triển của vi khuẩn, hoặc thậm chí gây chết tế bào
(Santala, 2014). Do đó, gần đây đã xuất hiện xu hướng nghiên cứu
sinh tổng hợp hoạt chất bằng nuôi cấy hỗn hợp hai hoặc nhiều chủng
vi sinh vật để tổng hợp các hợp chất như axit hữu cơ, flavnonoid,v.v.
Các kết quả bước đầu cho thấy nuôi cấy hỗn hợp có kết quả tốt trong
quy mô phòng thí nghiệm và có tiềm năng ứng dụng lớn trong công

nghiệp.
Do đó, xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu sinh tổng hợp naringenin glucoside bằng phương
pháp nuôi cấy hỗn hợp hai chủng vi khuẩn Escherichia coli cải
biến di truyền”.
2. Mục đích nghiên cứu
Trong luận văn này, chúng tôi đề xuất các thí nghiệm thực
hiện phương pháp nuôi cấy hỗn hợp hai chủng vi khuẩn E. coli tái tổ
hợp để tổng hợp naringenin glucoside với mục tiêu tạo ra một công
cụ tổng hợp giúp làm giảm thao tác di truyền phức tạp và nâng cao
hiệu quả tổng hợp hoạt chất.


3

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
➢ Đối tượng nghiên cứu:
- Chủng vi khuẩn Escherichia coli XL1 (tách dòng) và chủng
vi khuẩn Escherichia coli BL21 (DE3) (biểu hiện) cung cấp bởi công
ty Promega, Mỹ được cải biến di truyền.
- Hợp chất pCA (axit p-coumaric), NRN (naringenin) và NGS
(naringenin glucoside) được cung cấp bởi công ty hóa chất SigmaAldrich, Mỹ.
➢ 3.2. Phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm thực hiện: Toàn bộ quá trình thiết kế và tiến hành
thí nghiệm được thực hiện tại Trung tâm Sinh học phân tử - Viện
Nghiên cứu và phát triển công nghệ cao – Trường Đại học Duy Tân
– Đà Nẵng.
- Thời gian thực hiện: 02/2017 - 12/2017
4. Phương pháp nghiên cứu
➢ Phương pháp sinh học phân tử

- Phương pháp di truyền phân tử: cắt, nối DNA, phản ứng PCR
được thực hiện theo protocol chuẩn của Sambrook và cs (2001)
➢ Phương pháp nuôi cấy đơn và nuôi cấy hỗn hợp
Nuôi cấy vi khuẩn E. coli trên môi trường đĩa thạch và môi
trường lỏng (ống nghiệm và bình tam giác) có sử dụng kháng sinh
với nồng độ phù hợp.
➢ Phương pháp hóa sinh
Tách chiết hợp chất NRN và NGS bằng phương pháp chiết
pha lỏng – pha lỏng sử dụng ethylacetate làm dung môi. Đông khô
mẫu trên máy sấy thăng hoa.
Định tính, định lượng bằng kỹ thuật HPLC và LC- ESI/MS.


4

5. Ý nghiã khoa ho ̣c và thư ̣c tiễn của đề tài
➢ Ý nghĩa khoa học của đề tài
Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học và có
tính hệ thống về nuôi cấy tổng hợp hoạt chất ở vi sinh vật tái tổ hợp
theo phương pháp đồng nuôi cấy in-vivo.
➢ Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả của đề tài luận văn là cơ sở khoa học để phát triển
hệ thống nuôi cấy – lên men huyền phù tế bào vi sinh vật nhằm tổng
hợp nhanh hợp chất ở qui mô lớn hơn (pilot). Các loại hoạt chất tổng
hợp có thể thuộc các loại như thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm chức
năng.
6. Bố cục của luận văn
Nội dung luận văn gồm những chương mục chính sau:
- Mở đầu
- Chương 1: Tổng quan tài liệu

- Chương 2: Những nghiên cứu thực nghiệm
- Chương 3: Kết quả và thảo luận
- Kết luận và kiến nghị
- Tài liệu tham khảo
- Phụ lục


5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID
Các hợp chất flavonoid rất phổ biến ở thực vật có mạch
(vascular plant) và có vai trò rất quan trọng trong sinh lý và sự tương
tác của cây đối với môi trường. Flavonoid là thuật ngữ chung chỉ
nhóm các hợp chất thiên nhiên thứ cấp có dạng polyphenol ở thực
vật. Cấu tạo khung của flavonoid là chuỗi cacbon C6-C3-C6 (C15)
gồm hai vòng thơm (vòng A và B) được nối với nhau bởi “cầu nối”
dị vòng 3-Cacbon (vòng C) (Hình 1.1) (Fraga và cs, 2010).

Hình 1.1. Cấu trúc khung của flavonoid
Naringenin (4’,5,7-trihydroxyflavanone; CTPT: C15H12O5) là
một flavonoid thuộc phân nhóm flavanone (Hình 1.4). NRN tự nhiên
chủ yếu được tìm thấy trong nho, vỏ khoai tây, cam, bưởi và các loại
trái cây có múi khác. Khi tiêu thụ nông sản có chứa NRN thì hoạt
tính sinh học của nó có tác động đáng kể đến sức khỏe con người.
NRN là một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư mạnh
và làm giảm lượng cholesterol trong cơ thể (Bugianesi và cs. 2002).

Hình 1.4. Cấu trúc của naringenin.



6

1.2. ĐẶC TÍNH SINH DƯỢC HỌC CỦA NARINGENIN
GLYCOSIDE
1.2.1. Giới thiệu sơ bộ về hợp chất glycoside
Glycoside là các hợp chất hữu cơ rất phổ biến và thường gặp
trong tự nhiên. Về mặt cấu trúc, glycoside gồm một hoặc nhiều nhóm
đường hay nhóm axit đường (axit uronic) (được gọi chung là
glycone) gắn vào một phân tử hữu cơ không phải dạng đường (được
gọi chung là aglycone) bằng liên kết glycosidic (Hình 1.5). Có rất
nhiều nghiên cứu so sánh cho thấy rằng thông số động lực học của
các hợp chất thứ cấp gắn thêm phân tử đường thể hiện mạnh hơn so
với aglycone tương ứng (Kren và Martinkova 2001).

Hình 1.5. Cấu trúc chung của hợp chất O-glycoside
1.2.2. Hợp chất naringenin glycoside và một số tác dụng
Trong tự nhiên, naringenin glycoside thường tồn tại chủ yếu ở
hai dạng là naringin (4',5,7-trihydroxyflavanone-7-rhamnoglucoside)
và prunin (naringenin-7-O-glucoside).
Naringin (CTPT: C27H32O14) có cấu tạo gồm thành phần
aglycone cơ bản là naringenin và hai gốc đường rhamnose – glucose
gắn vào nhóm (–OH) ở vị trí C7 của khung flavanon (Hình 1.6).
Naringin có nhiều tác dụng dược lý rất mạnh như chống oxy hóa,
làm giảm lipid máu, chống ung thư ác tính (Ho P.C 2001).


7

Hình 1.6. Cấu trúc của naringin


Hình 1.7. Cấu trúc của prunin

Prunin hay còn gọi là naringenin-7-O-glucoside (CTPT:
C21H22O10) có cấu tạo gồm thành phần cơ bản aglycone là naringenin
và một gốc đường glucose gắn vào nhóm (-OH) tại vị trí C7 của
khung flavanon (Hình 1.7). Prunin chiếm một lượng nhỏ trong khoai
tây và một số trái cây có múi như cam, chanh,.v.v. Prunin có tác
dụng ức chế doxorubicin – chất gây nên quá trình tự chết của tế bào,
ngăn chặn sự lão hóa ở con người, và có khả năng phòng chống bệnh
đau cơ tim (Han và cs. 2008).
1.3. CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP NARINGENIN VÀ
NARINGENIN GLUCOSIDE
1.3.1. Con đường sinh tổng hợp naringenin
Qua các công trình nghiên cứu, người ta đã phát hiện ra rằng
con đường sinh tổng hợp nên hợp chất flavonoid dựa trên ba hướng
trao đổi chất bao gồm con đường shikimate, phenylpropanoid và
malonate (Crozier và cs. 1998). NRN (thuộc phân nhóm flavanone)
được tổng hợp theo con đường phenylpropanoid (xem Hình 1.8).
Người ta đã thành công trong việc tách dòng, biểu hiện và tổ
hợp các thành phần gene (4CL, CHS, CHI, PAL, v.v) mã hóa cho
chuỗi sinh tổng hợp NRN và dẫn xuất của nó. Các gene này có
nguồn gốc từ nhiều loại thực vật khác nhau, sau đó được sử dụng để
tạo ra các tái tổ hợp di truyền, chèn vào vật chủ là vi khuẩn hoặc nấm


8

Hình 1.8. Con đường sinh tổng hợp naringenin ở thực vật



9

1.3.2. Quá trình tổng hợp glycoside ở thực vật và vi khuẩn: cơ
chất và enzyme xúc tác
Đường hóa (glycosylation) là một trong những quá trình hậu cải
biến phân tử hợp chất tự nhiên quan trọng nhất, trong đó phân tử đường
ở trạng thái hoạt hóa của chất cho được chuyển đến chất nhận dưới điều
kiện xúc tác của enzyme glycosyltransferase (GT), hình thành liên kết
glycosidic. Trước khi gắn phân tử đường vào thành phần aglycone, tế
bào vật chủ cần phải sử dụng ATP để thực hiện giai đoạn hoạt hóa
đường thành dạng NDP-đường, đặc biệt là UDP-D-glucose ở vi
khuẩn E. coli được minh họa cụ thể như trong hình dưới đây (Hình
1.9) (Hossain và cs. 2016).

Hình 1.9. Quá trình đường hóa các hợp chất aglycone tạo glycoside
Vị trí gắn đường hoạt hóa vào NRN thường xảy ra ở nhóm
hydroxyl hoặc đính trực tiếp vào nguyên tử carbon của bộ khung phân
tử và do enzyme glycosyltransferase xúc tác (Pandey và cs. 2013).
Cho tới nay, người ta đã nghiên cứu, phân lập và công bố rất nhiều
loại enzyme GT từ thực vật và vi sinh vật. Ví dụ như, người ta đã


10

tách dòng được đoạn gen mã hóa YjiC từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis có nhiệm vụ xúc tác quá trình gắn đường hoạt hóa vào
thành phần aglycone, đặc biệt là các cơ chất flavonoid như
narnigenin, quercetin, apigenin (Pandey và cs. 2014).Do đó, GT trở
thành công cụ quan trọng để tổng hợp nhân tạo nhiều hợp chất

glycoside mới (Zhang, Wang, và Zhan 2017).
1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI SINH TỔNG HỢP
CHẤT THỨ CẤP
1.4.1. Sinh tổng hợp theo phương pháp nuôi cấy đơn (monoculture)
1.4.2. Sinh tổng hợp theo phương pháp nuôi cấy hỗn hợp
Năm 2004, nhóm Banerjee đồng nuôi cấy nấm – nấm
(Rhizopus oryzae - Aspergillus foetidus), chuyển hóa cơ chất giàu
tannin tạo thành enzyme tannase (hoạt độ 41,3 U/ml) và sản phẩm
chính là axit gallic chiếm 94,8% trong dịch nuôi sau 48 giờ (Banerjee
và cs. 2005).
Năm 2008, nhóm nghiên cứu Fukuda thực hiện đồng nuôi cấy
nấm – vi khuẩn (Rhizopus peka - Bacillus subtilis) tạo kháng sinh
pestalone, nisin, nisin Z và biphenomycin A có hàm lượng tăng gấp
2,5 lần so với chuyển hóa đơn nấm Rhizopus peka (Fukuda, 2008).
Năm 2016, nhóm José M. Camacho‑Zaragoza đã chuyển hóa
resveretrol từ glycerol thông qua đồng nuôi cấy E. coli – E.coli
(Camacho-Zaragoza và cs. 2016).
Ở Việt Nam, các hợp chất thứ cấp thiên nhiên thuộc nhóm
flavonoid và flavonoid glucoside hầu hết đều được sinh tổng hợp và
tách chiết trực tiếp từ thực vật ở quy mô phòng thí nghiệm. Các
nghiên cứu về vi sinh vật cải biến di truyền tạo đường hóa hợp chất
thiên nhiên nói chung và thông qua phương pháp nuôi cấy hỗn hợp
nói riêng chưa được thực hiện và cho tới nay, chúng tôi chưa tìm
được công bố nào tương tự.


11

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1. Hệ thống chủng vi khuẩn, vector và plasmid tái tổ hợp
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) (EC1).
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) (EC2).
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) (ECNGS).
2.1.2. Môi trường nuôi cấy: TB và M9
2.1.3. Hóa chất và phương tiện nghiên cứu
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nội dung thứ nhất
Kiểm tra các thành phần của hệ thống kép
2.2.2. Nội dung thứ hai
Khả năng chuyển hóa cơ chất của các chủng E. coli EC1, EC2
và NGS thông qua nuôi cấy đơn.
2.2.3. Nội dung thứ ba
Nghiên cứu phối hợp tỷ lệ hai thành phần của hệ thống để tổng
hợp nên được hợp chất NGS từ cơ chất là axit p-coumaric và ảnh
hưởng của chủng loại dịch nuôi là TB và M9. So sánh và đánh giá
kết quả trong mỗi trường hợp.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa trên nội dung nghiên cứu đề ra trong luận án này, các
phương pháp thí nghiệm và khảo sát yếu tố cần thiết được thiết kế và
thực hiện theo quy trình như (Hình 2.1).
2.3.1. Phương pháp sinh học phân tử
2.3.2. Các phương pháp tổng hợp naringenin và naringenin
glucoside trong điều kiện in-vivo


12

Vector
pETDuetTM-1 –

CHS_CHI (Amp)

Vector
pCDFDuetTM-1
– 4CL (Sm)

(EC1)
Chủng
E.coli
BL21/
4CL/
CHS_CHI
(Amp-Sm)

Vector pET32a(+) – YjiC
(Amp)

(ECNGS)
Chủng
E.coli
BL21/4CL/
CHS_CHI/
YjiC
(Amp-Sm)

(EC2)
Chủng
E.coli
BL21/
YjiC

(Amp)

Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli cải biến di truyền
ĐƠN TỔNG HỢP VÀ ĐỒNG TỔNG HỢP (EC1 + EC2)

Tách chiết sản phẩm trong dịch nuôi bằng
dung môi hữu cơ
Định tính - định lượng naringenin glucoside
tạo thành bằng HPLC, LC-ESI/MS

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng naringenin
glucose tạo thành khi nuôi cấy hỗn hợp
Môi
trường
nuôi

Tỷ lệ
phối
trộn

Phân tích, so sánh, đánh giá kết quả
Hình 2.1. Sơ đồ thể hiện quy trình chung tiến hành thí nghiệm


13

Sơ đồ hoạt động của hệ thống vi khuẩn E. coli tái tổ hợp theo
phương pháp nuôi cấy hỗn hợp này được minh họa trong (Hình 2.2).

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp và phương

thức hoạt động tạo ra NGS từ cơ chất p-coumaric
a. Phương pháp nuôi cấy hỗn hợp (co-culture)
Hai chủng vi khuẩn E. coli EC1 và EC2 bảo quản trong ống
giống ở -80oC được cấy chuyền, nhân giống trong mỗi ống nghiệm
với 4 ml môi trường lỏng TB đã bổ sung kháng sinh tương ứng theo
tỷ lệ 1:125 (v/v) và tiếp tục được chuyển sang bình tam giác với 15
ml môi trường TB lỏng (có kháng sinh tương ứng). Sau đó, bắt đầu
tiến hành song song nuôi cấy huyền phù tế bào hai chủng EC1 và
EC2 ở nhiệt độ 37oC, 220 vòng/phút đến khi tế bào đạt được mật độ
quang OD600nm= 0,6. Tiếp theo, bổ sung thêm IPTG vào dịch nuôi
sao cho nồng độ cuối cùng đạt 1 mM và tiếp tục nuôi ở nhiệt độ 32oC
trong vòng 3 giờ để các protein tái tổ hợp biểu hiện. Khi mật độ
quang học (OD600nm) của các chủng đo được vào khoảng 2,2-2,4, tiến
hành phối trộn hai chủng vi khuẩn E. coli EC1 và EC2 (pha loãng
nếu cần thiết để có cùng giá trị mật độ quang học) theo tỷ lệ nhất
định bao gồm EC1:EC2 = 1:1; 1:4; 1:8 và 1:16 (v/v) (ký hiệu tương


14

ứng là R1, R2, R3 và R4) sao cho tổng thể tích dịch nuôi cuối cùng
đạt được 15 ml trong bình tam giác và mật độ quang khởi điểm
(OD600nm) từ 0,2-0,4. Tương tự, giữ nguyên tỷ lệ của EC2 và thay đổi
thành phần EC1 theo công thức sau: EC1:EC2 = 4:1; 8:1 và 16:1
(v/v) (ký hiệu tương ứng là R1’; R2’ và R3’). Bổ sung cơ chất pCA
vào mỗi bình dịch nuôi đến nồng độ cuối cùng là 10 µM và tiếp tục
nuôi ở nhiệt độ 32oC, chế độ lắc 220 vòng/phút trong vòng 48 giờ để
các enzyme của mỗi chủng vi khuẩn cải biến di truyền thực hiện
chuyển hóa thành sản phẩm NGS.
b. Phương pháp nuôi cấy đơn (mono-culture)

Bên cạnh thử nghiệm phương pháp đồng nuôi cấy, chúng tôi
cũng tiến hành nuôi cấy đơn các chủng vi khuẩn E. coli EC1
(4CL/CHS_CHI), E. coli EC2 và E. coli ECNGS song song. Mỗi
chủng giống được hoạt hóa và cấy chuyền sang bình tam giác với 15
ml môi trường TB có kháng sinh tương ứng. Tất cả được thực hiện
trong điều kiện nhiệt độ 37oC và tốc độ lắc 220 vòng/phút cho đến
khi mật độ quang đạt được OD600nm= 0,6. Sau đó, bổ sung IPTG vào
mỗi dịch nuôi sao cho nồng độ cuối cùng đạt 1 mM, hạ nhiệt độ
xuống 32oC, tiếp tục nuôi lắc (220 vòng/phút) trong vòng 3 giờ. Bổ
sung 10 µM cơ chất tương ứng với mỗi chủng. Trong vòng 48 giờ
sau, toàn bộ các mẫu đối chứng này tiếp tục nuôi song song với mẫu
thử ở nhiệt độ 32oC, lắc 220 vòng/phút cùng điều kiện.
Các sản phẩm được tách chiết từ dịch nuôi. Sau đó được phân
tích định tính, định lượng trong từng trường hợp và so sánh với nhau.
2.3.3. Các phương pháp phổ ứng dụng trong phân tích sản phẩm
chuyển hóa
a. Kỹ thuật tách chiết sản phẩm
b. Định tính và định lượng sản phẩm
➢ Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
➢ Kỹ thuật phân tích LC-ESI/MS
2.3.4. Xử lý, phân tích số liệu và dữ kiện


15

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TỔNG HỢP NRN VÀ NGS BẰNG NUÔI CẤY ĐƠN TỔNG
HỢP (MONO-CULTURE)
3.1.1. Kết quả tổng hợp NRN từ cơ chất pCA
Dựa trên giản đồ HPLC của ba chất chuẩn pCA, NRN và

NGS (Hình 3.6A) và kết quả định tính chuyển hóa của chủng EC1
cho thấy sản phẩm NRN tạo ra và dư lượng pCA có thời gian lưu lần
lượt là 19,2 và 12,3 phút so với mẫu đối chứng (không bổ sung cơ
chất pCA) (Hình 3.6). Phân tích định lượng cho thấy hàm lượng
NRN được tạo ra trong 15 ml môi trường nuôi cấy là 5,23 µM, trong
khi dư lượng NRN còn lại là 4,5 µM (Hình 3.1). Hiệu suất chuyển
hóa đạt được của chủng EC1 trong môi trường TB là 52,3%.

Hình 3.1. Chuyển hóa cơ chất pCA thành NRN ở chủng vi khuẩn E.
coli EC1
3.1.2. Kết quả đường hóa cơ chất NRN thành NGS
Dựa trên kết quả HPLC cho thấy NGS tạo thành và dư lượng
NRN có thời gian lưu lần lượt là 13,5 và 19,2 phút (Hình 3.6B) so
với mẫu đối chứng không bổ sung cơ chất NRN (Hình 3.6C). Tương
tự, sản phẩm NGS được tạo ra trong 15 ml môi trường là 7,41 µM và
dư lượng NRN còn lại là 2,52 µM (Hình 3.2). Hiệu suất chuyển hóa
đạt được của chủng EC2 trong môi trường TB là 74,1%.


16

Hình 3.2. Chuyển hóa cơ chất NRN thành NGS ở chủng vi khuẩn E.
coli EC2
3.1.3. Kết quả chuyển hóa tổng hợp NRN trung gian và sản
phẩm NGS từ cơ chất Pca
Kết quả phân tích HPLC dịch chiết sau 48 giờ nuôi cấy cho
thấy sự có mặt của cơ chất pCA, NRN trung gian và sản phẩm cuối
cùng NGS với thời gian lưu lần lượt là 12,3; 19,2 và 13,5 phút (Hình
3.6D). Hàm lượng của NRN trung gian và sản phẩm NGS sinh ra lần
lượt là 1,55 µM và 5,11 µM trong 15 ml môi trường nuôi cấy. Trong

khi đó, hàm lượng còn lại của dư lượng pCA là 3,21 µM. Tất cả số
liệu kết quả được biểu diễn bằng đồ thị Hình 3.3. Hiệu suất chuyển
hóa đạt được của chủng ECNGS trong môi trường TB là 51,1%.

Hình 3.3. Tổng hợp NGS từ cơ chất pCA ở chủng vi khuẩn ECNGS
Như vậy, từ ba thí nghiệm tổng hợp trên, các gen YjiC, 4CL,
CHS_CHI đều hoạt động tốt trong điều kiện nuôi cấy đơn. Bên cạnh
đó, ta có thể thấy rằng hiệu suất chuyển hóa của chủng E. coli
ECNGS (51,1%) thấp hơn hiệu suất chuyển hóa của chủng E. coli


17

EC1 (52,3%) và EC2 (74,1%). Qua kết quả này thể hiện khả năng
chuyển hóa của vật chủ sẽ giảm nếu như biến nạp nhiều vector mang
gen cần thiết vào trong cùng một chủng. Do đó, chúng tôi khảo sát
tiến trình sinh tổng hợp sản phẩm NGS trực tiếp từ cơ chất pCA bằng
phương pháp đồng nuôi cấy hai chủng E. coli EC1 và EC2.
3.2. TỔNG HỢP NGS TỪ CƠ CHẤT PCA BẰNG NUÔI CẤY
HỖN HỢP
3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nuôi cấy đến hiệu suất sản phẩm NGS
trong môi trường TB lỏng
Kết quả phân tích định tính bằng HPLC cho thấy có sự xuất
hiện sản phẩm của NRN trung gian và NGS đích (Hình 3.6F) so với
mẫu đối chứng không bổ sung pCA (Hình 3.6E). Tuy nhiên, tỷ lệ
phối trộn khác nhau cũng dẫn tới kết quả tổng hợp NRN và NGS
khác nhau, điều này được biểu diễn bằng đồ thị Hình 3.4. Qua đó, ta
thấy rằng khi thành phần EC1 giữ nguyên và tăng thành phần EC2
thì hàm lượng NGS tăng dần và đạt mức cao nhất ở tỷ lệ R3 (4,82
µM) sau đó lại giảm xuống ở tỷ lệ R4 (4,56 µM).


Hình 3.4. Tổng hợp NGS sử dụng nuôi cấy hỗn hợp với các tỷ lệ
phối trộn (R1, R2, R3, R4) trong môi trường TB.
Trong khi đó, dư lượng pCA trong môi trường nuôi cấy giảm
dần và tại tỷ lệ R4 có mức thấp nhất là 1,61 µM. Đối với hàm lượng


18

chất trung gian NRN tạo ra giữa các giá trị tỷ lệ có giá trị biến thiên
trong khoảng từ 3,5 – 3,8 µM và có sự chênh lệch không đáng kể.
Tương tự, đối với tỷ lệ EC1:EC2 = 4:1; 8:1 và 16:1 (ký hiệu tương
ứng là R1’; R2’ và R3’) có kết quả tổng hợp được trình bày bằng đồ
thị Hình 3.5 cho thấy khi tăng thành phần EC1 thì dư lượng pCA sẽ
giảm dần lần lượt theo tỷ lệ R1, R1’, R2’ và R3’. Trong khi đó, hàm
lượng chất trung gian NRN được tạo ra lớn hơn so với khi thực hiện
tỷ lệ giữ EC1 và tăng EC2. Cụ thể, ở tỷ lệ R2’ dư lượng NRN đạt
mức cao nhất là 6,45 µM và cao gấp 1,7 lần so với dư lượng NRN ở
tỷ lệ R4 (3,72 µM). Tuy nhiên, hàm lượng của NGS tạo ra trong
nhóm tỷ lệ này thấp hơn đáng kể. Cụ thể, nồng độ NGS đạt mức cao
nhất là 3,02 µM với tỷ lệ R1’. Vậy, hiệu suất chuyển hóa tạo sản
phẩm NGS cao nhất bằng phương pháp nuôi cấy hỗn hợp trong môi
trường nuôi cấy TB là 48,2% với tỷ lệ EC1:EC2= 1:8 (R3).

Hình 3.5. Tổng hợp NGS sử dụng nuôi cấy hỗn hợp với các tỷ lệ
phối trộn (R1’, R2’, R3’) trong môi trường TB.
Kết quả thu được cho thấy cơ chất pCA, NRN và NGS được
tìm thấy trong sắc ký đồ HPLC dưới bước sóng 260 nm có thời gian
lưu (retention time) lần lượt là 12,3; 19,2 và 13,5 (Hình 3.6).



19

NRN
NGS

pCA
NGS

NRN

pCA
NGS
NGS

NRN

Hình 3.6. Phổ HPLC định tính cơ chất và các sản phẩm tạo
thành từ chuyển hóa sinh học.


20

Trong đó: (A)- Chất chuẩn, axit p-coumaric (pCA), naringenin
(NRN) và naringenin glucoside (NGS). (B)- Chuyển hóa NRN tổng
hợp NGS. (C)- Chủng vi khuẩn E. coli mang YjiC đối chứng (không
bổ sung cơ chất). (D)- Chuyển hóa pCA tổng hợp NRN và NGS
thông qua nuôi cấy đơn. (E)- Nuôi cấy hỗn hợp đối chứng (không bổ
sung cơ chất). (F)- Nuôi cấy hỗn hợp hai chủng EC1 và EC2 tổng
NGS (tỷ lệ 1:4, R2, môi trường TB).

3.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nuôi cấy đến hiệu suất sản phẩm NGS
trong môi trường M9 lỏng (+ 2% glucose)
Dữ liệu thực nghiệm cho thấy, với tỷ lệ EC1:EC2 = 1:1; 1:4;
1:8 và 1:16 (ký hiệu tương ứng R1, R2, R3 và R4) được nghiên cứu,
hàm lượng NGS tạo ra trong 15 ml môi trường nuôi cấy đạt cao nhất
ở tỷ lệ R2 với mức 3,05 µM. Tuy nhiên, nồng độ NGS giảm dần ở tỷ
lệ R3 (2,78 µM) và R4 (2,12 µM) trong khi dư lượng pCA tăng dần
từ 2,78 µM đến 4,01 µM mặc dù vẫn giữ nguyên mức thành phần
EC1 và tăng thành phần EC2. Kết quả được thể hiện cụ thể ở bằng
đồ thị Hình 3.7.

Hình 3.7. Tổng hợp NGS sử dụng nuôi cấy hỗn hợp với các tỷ lệ
phối trộn (R1, R2, R3, R4) trong môi trường M9.


21

Ngoài ra, tiếp tục nghiên cứu các tỷ lệ EC1:EC2 theo hướng
giữ nguyên EC2 và thay đổi EC1 = 4:1; 8:1 và 16:1 (ký hiệu tương
ứng là R1’, R2’và R3’). Kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng
NGS đạt cao nhất với tỷ lệ R1’ là 2,02 µM trong 15 ml môi trường
nuôi cấy và giảm dần tới R3’ (Hình 3.8). Tuy nhiên, nồng độ NGS
cao nhất trong nhóm tỷ lệ này vẫn thấp hơn 1,5 lần so với tỷ lệ R2.
Vậy hiệu suất chuyển hóa thu được nhiều NGS nhất bằng phương
pháp nuôi cấy hỗn hợp trong môi trường nuôi cấy M9 lỏng (+ 2%
glucose) là 30,5% với tỷ lệ EC1:EC2= 1:4 (R2).
Bên cạnh đó, dữ liệu đồ thị còn cho thấy rằng lượng chất trung
gian NRN còn lại thu được trong môi trường tăng dần từ tỷ lệ R1’,
R2’ và R3’ trong khi tăng lượng chủng EC1 và giữ nguyên thành
phần EC2. Đối với dư lượng pCA thì hầu như có sự chênh lệch đáng

kể giữa các tỷ lệ.

Hình 3.8. Tổng hợp NGS sử dụng nuôi cấy hỗn hợp với các tỷ lệ
phối trộn (R1’, R2’, R3’) trong môi trường M9.
Dựa trên các kết quả thu được, chúng tôi so sánh hiệu quả tổng
hợp NGS của các tỷ lệ phối trộn EC1 và EC2 trong hai môi trường
TB và M9. Dữ liệu được trình bày cụ thể trong Hình 3.9. Cụ thể, tỷ


22

lệ R3 nuôi trong môi trường TB cho hàm lượng NGS đạt mức 4,82
µM cao hơn 1,58 lần so với tỷ lệ R2 nuôi trong môi trường M9 (+
2% glucose) (3,05 µM). Đồng thời, dư lượng NRN trong môi trường
M9 (3,93 µM) lại cao hơn 1,14 lần so với TB (3,45 µM). Như vậy,
có thể thấy rằng tỷ lệ chủng giống và chủng loại môi trường nuôi cấy
trong nghiên cứu có ảnh hưởng rõ rệt tới năng suất sản phẩm đích.

Hình 3.9. So sánh hiệu suất tổng hợp NGS của nuôi cấy hỗn hợp
trong môi trường TB và M9 (+2% glucose).
Dữ liệu LC-ESI/MS, bổ trợ cho dữ liệu HPLC, nhằm xác định
khối lượng phân tử của pCA, NRN và NGS cho thấy khối lượng
phân tử chính xác của cơ chất pCA, dạng [M+H] có m/z = 165,1498
(Hình 3.10A), sản phẩm trung gian NRN, dạng [M+H] có m/z =
273,2375 (Hình 3.10B) và sản phẩm cuối cùng NGS, dạng [M+H] có
m/z = 435,2934 (Hình 3.10C). Kết hợp với dữ liệu HPLC có thể
khẳng định chắc chắn là thí nghiệm tổng hợp NRN và NGS đã thành
công. Sản phẩm đường hóa trong bài báo này, dựa trên dữ liệu HPLC
và LC-ESI/MS cho thấy rằng nhóm đường glucoside hoạt hóa được
gắn vào vị trí nhóm –OH ở C7 tạo thành sản phẩm cuối cùng là

narigenin 7-O-glucoside.


23

Hình 3.10. Kết quả phân tích LC-ESI-MS (positive mode) cho
thấy (A)- khối lượng phân tử của pCA, (B)- khối lượng phân tử của
naringenin, (C)- khối lượng phân tử của naringenin -7-O-glucoside
(NGS).