Viện Đại Học Mở Hà Nội
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI NẤM CÓ HOẠT TÍNH
KHÁNG SINH ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ MẪU TRẦM TÍCH THU THẬP Ở
VÙNG BIỂN THANH HÓA-QUẢNG BÌNH-QUẢNG TRỊ

Người hướng dẫn 1: TS. Lê Thị Hồng Minh
Người hướng dẫn 2: ThS. Nguyễn Mai Anh
Sinh viên thực hiện: Đỗ Thị Huệ
Lớp

: ĐH 13-01

HÀ NỘI-2017
Đỗ Thị Huệ


Viện Đại Học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ
trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Với lòng biết
ơn sâu sắc, em xin cảm ơn sâu sắc đến toàn bộ Ban Giám Hiệu Trường Viện Đại
Học Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học đã dạy
dỗ em trong suốt 4 năm học vừa qua và tạo điều kiện cho em thực hiện bài khóa
luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến giáo viên hướng dẫn

TS Lê Thị Hồng Minh- Trưởng phòng Công nghệ Sinh học-Viện Hóa sinh biểnViện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, ThS Nguyễn Mai Anh và TS Vũ
Thị Quyên – những người đã truyền cho em phương pháp học tập, nghiên cứu khoa
học, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian thực tập của em
vừa qua.
Đồng thời, em gửi lời cảm ơn cô chú, anh chị trong Phòng Công nghê Sinh
học - Viện Hóa Sinh Biển, đặc biệt là bạn Thúy Ngân đã giúp đỡ em rất nhiều trong
thời gian thực tập vừa qua. Cuối cũng em xin gửi đến lời cảm ơn tới gia đình bạn bè
luôn ủng hộ động viên em trong suốt thời gian em thực tập.
Sau cùng, em xin kính chúc các thầy cô trong Viện Đại học mở Hà Nội nói
chung và khoa Công nghệ Sinh học nói riêng thật nhiều sức khỏe, niềm tin để thực
hiện nhiệm vụ cao cả của mình là truyền kiến thức cho thế hê mai sau.
Trân trọng !

Sinh viên

Đỗ Thị Huệ


Viện Đại Học Mở Hà Nội
Đỗ Thị Huệ

MỤC LỤC
PHẦN 1:MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề ............................................................................................................................. 1

1.2.

Mục tiêu của đề tài ............................................................................................................... 2


1.3.

Ý nghĩa của đề tài ................................................................................................................. 2

PHẦN 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................. 3
2.1

Vi nấm ( microfungi )........................................................................................................... 3

2.1.1 Vị trí của vi nấm trong vi sinh vật và đặc điểm chung của vi nấm.................................. 3
2.1.2 Hình thái và cấu tạo của vi nấm. ........................................................................................ 4
2.1.2.1 Hình thái và cấu tạo của nấm men ..................................................................................... 4
2.1.2.2 Hình thái và cấu tạo của nấm sợi ........................................................................................ 4
2.1.3 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của vi nấm ............................................................... 5
2.1.4 Ứng dụng của vi nấm và các chất kháng sinh từ vi nấm .................................................. 7
2.2

Các đặc tính độc đáo của môi trường biển ...................................................................... 10

2.3
biển

Các nghiên cứu ngoài nước về các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ nấm
.............................................................................................................................................. 10

2.4

Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................................... 13


PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 17
3.1

Vật liệu và hóa chất ............................................................................................................ 17

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................................ 17
3.1.2 Hóa chất và thiết bị. ........................................................................................................... 17
3.2

Phương pháp nghiên cứu................................................................................................... 20

3.2.1 Thu thập các mẫu trầm tích biển ..................................................................................... 20
3.2.2 Phương pháp phân lập nấm: Theo (Atlas et al,2004) để phân lập vi nấm từ trầm tích
biển .............................................................................................................................................. 20
3.2.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
(Nguyễn Lân Dũng và cs 1997) ..................................................................................................... 21
3.2.4 Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu:(Nguyễn Lân
Dũng và cs 1997) ............................................................................................................................ 22
3.2.4.1 Khả năng thủy phân tinh bột tan...................................................................................... 22
3.2.4.2 Khả năng thủy phân Casein .............................................................................................. 22
3.2.4.3 Khả năng thủy phân Cellulose (CMC) ............................................................................. 22
Đỗ Thị Huệ


Viện Đại Học Mở Hà Nội
3.2.5 Phương pháp phân loại nấm bằng kĩ thuật sinh học phân tử ........................................ 23
3.2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ nấm biển ......................................................... 23
3.2.5.2 Phương pháp PCR ............................................................................................................ 23
3.2.5.3 Giải trình tự ....................................................................................................................... 25
PHẦN 4:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................................ 26

3.1
Kết quả lấy mẫu trầm tích thu được ở khu vực vùng biển Thanh Hóa-Quảng BìnhQuảng Trị........................................................................................................................................ 26
4.2

Phân lập nấm từ trầm tích biển ........................................................................................ 26

4.3

Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định ........................................................ 28

4.4

Khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu .......................................................... 30

4.4.1 Khả năng thủy phân tinh bột tan...................................................................................... 30
4.4.2 Khả năng thủy phân protein (casein) ............................................................................... 31
4.4.3 Khả năng thủy phân cellulose (CMC) .............................................................................. 32
4.5

Kết quả định danh bằng sinh học phân tử của các chủng vi nấm nghiên cứu ............. 33

4.5.1 Tách chiết ADN tổng số từ nấm ........................................................................................ 33
4.5.2 Nhân gen 18S ADN riboxom ............................................................................................. 34
4.5.3 Kết quả giải trình tự gene 18S của 3 chủng vi nấm......................................................... 35
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 39
5.1

Kết luận ............................................................................................................................... 39

5.2


Kiến nghị ............................................................................................................................. 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 40

Đỗ Thị Huệ


Viện Đại Học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chú thích

ADN

Axit deoxyribonucleotit

ARN

Axit ribonucleotit

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CKS

Chất kháng sinh


CMC

Carboxymethyl cellulose

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

G(-)

Gram âm

G(+)

Gram dương

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

LB

Lauria Betani

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS


Sodium dodecyl sulfate

SEM

Scanning Electron Microscope

UV

Ultraviolet

VSV

Vi sinh vật

VSVKĐ

Vi sinh vật kiểm định

Đỗ Thị Huệ


Viện Đại Học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.3. Các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ nấm biển
Bảng 3.1.Thành phần phản ứng PCR
Bảng 3.2. Chu trình chạy PCR
Bảng 4.1. Danh sách các mẫu trầm tích thu thập được tại vùng biển Thanh HóaQuảng Bình-Quảng Trị
Bảng 4.2. Danh sách 13 chủng nấm phân lập được

Bảng 4.3. Kết quả thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định
Bảng 4.4. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của ba chủng nấm có
hoạt tính cao

Đỗ Thị Huệ


Viện Đại Học Mở Hà Nội
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 4.1. Một số hình ảnh nơi lấy mẫu và các mẫu thu được
Hình 4.2. Hình ảnh phân lập và làm sạch một số các chủng nấm
Hình 4.4. Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng VSVKĐ
Hình 4.5. Kết quả thử khả năng phân giải tinh bột
Hình 4.6. Kết quả thử khả năng phân giải casein
Hình 4.7. Kết quả thử khả năng phân giải CMC
Hình 4.8: Kết quả điện di đồ ADN tổng số của ba chủng nấm
Hình 4.9: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 18S rADN của 3 chủng

Đỗ Thị Huệ


Viện Đại Học Mở Hà Nội

PHẦN 1:MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trầm tích biển là bề mặt dồi dào dinh dưỡng, nó trở thành thuộc địa cho vi sinh
vật sinh trưởng và phát triển. Ngoài ra, môi trường biển với các đặc điểm về áp suất,
độ mặn, nhiệt độ, độ sâu...đã góp phần vào sự phát triển độc đáo và cung cấp nguồn
vi sinh vật phong phú. Với độ đa dạng sinh học cao, các vi sinh vật biển đóng vai
trò quan trọng đối với vòng tuần hoàn sinh địa hóa các nguyên tố cơ bản. Những vi

sinh vật này có thể tìm thấy ở bất kỳ nơi nào ở các đại dương từ trên bề mặt đến
dưới thềm đáy biển, trên cơ thể các sinh vật biển hay cả giữa những dòng hải lưu.
Vi sinh vật biển từ lâu đã được biết đến như một trong số các nguồn tài nguyên
quan trọng sản sinh các chất hữu cơ với cấu trúc hóa học đa dạng và có hoạt tính
sinh học thú vị (Rahman et al.2010), được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực của đời sống nhờ các tính chất đặc hiệu của chúng.
Thuốc kháng sinh là một trong những đột phá lớn của y học hiện đại. Do sự gia
tăng các bệnh mới, số nhóm vi sinh vật kháng thuốc và độc tính của một số thuốc
kháng sinh bán tổng hợp đang được sử dụng, các nhà khoa học đã chuyển hướng
nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất có giá trị dược học từ vi sinh vật biển. Đến
nay, với số lượng lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học được phát hiện, vi sinh vật
biển trở thành mục tiêu quan trọng đối với ngành Sinh học, Hóa học và Y dược trên
con đường tìm kiếm và sản xuất các loại thuốc mới, các hoạt chất kháng khuẩn và
chống ung thư.
Môi trường biển Việt Nam, với những nghiên cứu về các nhóm vi sinh vật như
vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam, nấm mốc có khả năng sinh chất kháng khuẩn và
ức chế tế bào ung thư còn chưa nhiều, nhưng những kết quả đánh giá về độ đa dạng
sinh học và mức độ chọn lọc thu được cho thấy, vi sinh vật từ các hệ sinh thái ở
những vùng biển của Việt Nam sẽ là nguồn nguyên liệu tiềm năng hứa hẹn nhiều
triển vọng. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:”Nghiên cứu sàng lọc các
chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh được phân lập từ mẫu trầm tích thu thập ở
vùng biển Thanh Hóa-Quảng Bình-Quảng Trị”. Nhằm tạo tiền đề cho các nghiên
Đỗ Thị Huệ

1


Viện Đại Học Mở Hà Nội
cứu tiếp theo về các hợp chất thứ cấp từ vi nấm, từ đó xác định một số chất có hoạt
tính sinh học có khả năng ứng dụng trong y dược cũng như trong đời sống.

1.2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và nghiên cứu hoạt tính sinh học của các vi nấm (hoạt tính kháng sinh
và khả năng sinh enzyme) để từ đó có thể tuyển chọn một số chủng có nhiều triển
vọng ứng dụng thực tế.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
Bước đầu tiến hành nghiên cứu về vi nấm từ trầm tích biển và từ đó tiến tới
khai thác nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật biển nói chung và vi nấm từ trầm tích
biển nói riêng.

Đỗ Thị Huệ

2


Viện Đại Học Mở Hà Nội
PHẦN 2:TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vi nấm ( microfungi )
2.1.1 Vị trí của vi nấm trong vi sinh vật và đặc điểm chung của vi nấm
Vi nấm là nhóm nấm có kích thước hiển vi. Vi nấm khác với vi khuẩn và xạ
khuẩn, chúng có cấu tạo nhân điển hình, vì vậy chúng được xếp vào nhóm
Eukaryotes. Vi nấm gồm 2 nhóm lớn: nấm men (Yeast) và nấm sợi (Filamentous
fungi), nấm men có cấu trúc đơn bào, nấm sợi có cấu trúc đa bào. Nấm sợi còn gọi
là nấm mốc. Vi nấm được xếp loại trong giới nấm bao gồm cả nấm lớn.
Nấm có rất nhiều đặc điểm chung với các vi sinh vật nhân thật nhất là về cấu
tạo. Nấm khác hẳn về nhiều mặt so với các vi sinh vật thuộc nhóm nhân nguyên
thủy như vi khuẩn và vi khuẩn lam. Cơ thể là một tản (thallus) tức là một cơ thể có
bộ máy dinh dưỡng chưa phân hóa thành các cơ quan riêng biệt. Tản của nấm có thể
là đơn bào hay đa bào, đa số có dạng sợi gọi là sợi nấm hay khuẩn ti (hypha). Sợi
nấm có thể có hay không có vách ngăn (sept). Sợi nấm có đường kính trung bình 510µm. Có sợi nấm trong suốt không màu, có sợi có màu. Một số sợi nấm có thể tiết
ra các hợp chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm. Đa số sợi nấm phân nhánh

nhiều lần nhưng cũng có sợi không phân nhánh. Từ một bào tử hay một đoạn sợi
nấm gặp điều kiện thuận lợi sợi nấm sẽ phát triển theo cả ba chiều tạo thành một hệ
sợi nấm. Ở một số nấm các sợi nấm sẽ quấn chặt với nhau, thậm chí dính liền với
nhau tạo ra những hình thái nấm đặc biệt của nấm như thể đệm (stroma), hạch nấm
(aclerotium), rễ giả (synnema)..
Các vách ngang ở sợi nấm ngăn vách đều có lỗ thông. Tùy loại nấm mà vách
ngang có thể có một lỗ thông khá lớn ở chính giữa, có loại có nhiều lỗ thông tương
đối nhỏ, có loại có một lỗ thông ở chính giữa nhưng mép lỗ dày lên bề ngoài có một
màng mỏng che phủ (màng parenthesome ). Qua lỗ thông không những chất nguyên
sinh có thể đi qua mà nhân tế bào cũng có thể thót nhỏ lại để chui qua. Nhân tế bào
trong sợi nấm thường di chuyển đến những phần nấm sợi đang có hoạt động mạnh
mẽ. Như vậy ở cả sợi nấm có vách ngăn hay không có vách ngăn thực chất chỉ là
những ống dài có chứa nguyên sinh chất và nhiều nhân tế bào. Trừ các nấm men
đơn bào còn sợi nấm rõ ràng chưa có cấu tạo điển hình như ở các sinh vật nhân thật.

Đỗ Thị Huệ

3


Viện Đại Học Mở Hà Nội
Mỗi tế bào trong một sợi nấm chưa có hoạt động trao đổi chất độc lập vì chưa có
giới hạn rõ rệt [2]
2.1.2 Hình thái và cấu tạo của vi nấm.
2.1.2.1

Hình thái và cấu tạo của nấm men

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật. Tế bào nấm men thường
lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn. Tùy loại nấm men mà tế bào có hình cầu, hình

trứng, hình elip, hình ovan…Có loại nấm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả. Khuẩn
ti giả chưa thành sợi rõ rệt mà chỉ có nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài. Có
loại có thể tạo thành váng khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể.
Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm (chiếm 25% khối lượng khô của tế
bào). Đa số nấm men có thành tế bào có cấu tạo bới glucan và manna. Một số nấm
men có thành tế bào chứa kitin và manna. Trong thành tế bào nấm men còn chứa
khoảng 10% protein (tính theo khối lượng khô), trong số protein này có một phần
này có một phần là các enzyme. Trên thành tế bào còn thấy cả một lượng nhỏ lipit.
Thành phần của màng tế bào nấm men gồm: protein, lipit, hidrat cacbon. Nhân của
tế bào nấm men có cấu trúc 2 lớp và có rất nhiều lỗ thùng. Ti thể của nấm men cũng
giống với các sợi nấm và các sinh vật có nhân khác. ADN của ti thể nấm men có
một phân tử dạng vòng có khối lượng 50 x106Da, ADN của ti thể nấm men chiếm
15-23% tổng lượng ADN của toàn tế bào.
Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào. Trong không bào có chứa
enzyme thủy phân, polyphosphate, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung
gian. Ngoài tác dụng một kho dự trữ, không bào còn chứa chức năng điều hòa áp
suất thẩm thấu của tế bào [2].
2.1.2.2

Hình thái và cấu tạo của nấm sợi

Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất nguyên
sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn nhưng về đường
kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1-30µm (thông thường là 5-10 µm).
Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc
sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng,
vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh
trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào.
Đỗ Thị Huệ


4


Viện Đại Học Mở Hà Nội
Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoắn lại, người
ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi
chúng có tác dụng tiết xuất các chất nào đó. Thành tế bào (cell wall) của nấm có
thành phần hóa học khác nhau. Đây là một tiêu chí quan trọng khi định loại nấm.
Trong tế bào nấm còn có các cơ quan giống như trong tế bào các sinh vật có nhân
thực (Eukaryote) khác. Đó là ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic
reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), thể ribô (ribosome), bào nang
(vesicle) , thể Golgi sinh bào nang (Golgi body, Golgi apparatus, dictyosome), các
giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm
(microbody), các thể Vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitô đường
kính 40-70nm (chitosome)…
Ribosome của nấm thuộc loại 80S ( S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường
kính khoảng 20-25nm, gồm có 2 bán đơn vị ( subunit): bán đơn vị lớn (large subunit
) 60S (gồm 3 loại ARN- 25S; 5,8S và 5S cùng với 30-40 loại protein). Bán đơn vị
nhỏ (small subunit) 40S (gồm loại ARN 18S và 21-24 loại protein)
2.1.3 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của vi nấm
Chất kháng sinh là chất hóa học xác định, không có bản chất enzyme, có nguồn
gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là vi sinh vật) với đặc tính là ở ngay nồng độ
thấp (10-3-10-2/µg/ml) đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt một cách chọn
lọc các vi sinh vật gây bệnh hay các tế bào ung thư mà vẫn đảm bảo an toàn cho
người hay động vật được điều trị [5]
Nấm sợi là một trong những vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh đầu tiên có
ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học. Bệnh truyền nhiễm trước đây trong một
thời gian dài đã là mối đe dọa rất lớn đối với con người và các sinh vật khác. Do
vậy việc tìm kiếm thuốc chữa bệnh cho con người từ lâu đã là mơ ước của các nhà
khoa học nói riêng và nhân loại nói chung. Và đã có nhiều chất kháng sinh đã được

phát hiện từ nấm sợi như:
 Penicillin:
Chất kháng sinh penicillin được phát hiện tình cờ năm 1928, trong khi làm vệ
sinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp peptri
nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện hiện
Đỗ Thị Huệ

5


Viện Đại Học Mở Hà Nội
tượng vòng vô khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm. Khi ông cấy nấm mốc trên
thử nghiệm lại với một số loài vi khuẩn gây bệnh khác thì vẫn thấy hiện tượng
tương tự xảy ra. Từ đó ông kết luận là nấm mốc đã tiết ra môi trường một chất nhất
định làm tan vi khuẩn và ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên
cho chất kháng sinh này (1929). Năm 1942, Mary Hunt tìm ra chủng Penicillium
chrysogesrum có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn gấp hai lần
Penicillium notatum tìm ra trước đó. Năm 1946-1950, hàng loạt chất kháng sinh đã
được phát hiện, hàng loạt nhà máy sản xuất kháng sinh ra đời, chủ yếu là Penicillin,
khẳng định giá trị to lớn của Penicillin trong chữa bệnh [5]
 Cephalosporin:
Năm 1948, Brotzu chiết từ chủng nấm mốc thuộc giống Cephalosporin sp có
khả năng chống được cả vi khuẩn gram (-) và gram (+), đặc biệt là Vibriocholerac.
Ngày nay người ta phát hiện nhiều loại nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn khác nhau có
khả năng tổng hợp cephalosporin. Tuy nhiên hoạt tính của Cephalosporin kém hơn
Penicillin [6]
 Griseofulvin:
Năm 1959, Oxford và động sự phát hiện do chiết được từ một số loài nấm mốc
thuộc giống Penicillin. Griseofulvin không có hoạt tính chống vi khuẩn nhưng có
khả năng chống nấm khá mạnh nên dùng để chữa bệnh nấm cho người và gia súc

 Glytoxin:
Glytoxin là chất kháng sinh từ giống Trichoderma viride, ngoài ra người ta còn
phát hiện ở Aspergillus fumgitus, một vài loài Penicillium. Glytoxin là chất kháng
sinh không bền vững và bị phân hủy nhanh trong ánh sáng. Phổ kháng sinh của nó
chống các vi khuẩn gram dương và các nấm gây bệnh. Hoạt tính kháng sinh của
Glytoxin liên quan với sự có mặt trong phân tử là nhóm chứa lưu huỳnh. Ngày nay
với sự phát triển của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều nghành khoa học
khác đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu chất kháng sinh đạt được
những thành tựu lớn lao
Các phương pháp hiện đại về kỹ thuật di truyền, công nghê gen, gây đột biến
định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần đã nâng cao
khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh trong thời gian ngắn. Những thành tựu gần
Đỗ Thị Huệ

6


Viện Đại Học Mở Hà Nội
đây trong sinh học phân tử như ADN tái tổ hợp, kĩ thuật tách dòng gen và biểu thị
sự tổng hợp ở vi khuẩn E. coli không những đem lại kết quả to lớn trong việc phát
triển chủng, giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các
chất kháng sinh. Kĩ thuật enzyme bất động được coi là một trong những nghiên cứu,
sản xuất CKS trong những năm cuối thế kỉ XX đầu thế kỉ XXI. Tuy đã có hàng
ngàn chất kháng sinh mới được phát hiện nhưng các nhà nghiên cứu trên thế giới
vẫn đang chạy đua trong việc tìm tòi và tổng hợp chất kháng sinh mới, đặc biệt là
chất kháng sinh chống virut và chống ung thư.
2.1.4 Ứng dụng của vi nấm và các chất kháng sinh từ vi nấm
 Ứng dụng kháng sinh từ vi nấm trong điều trị bệnh truyền nhiễm và hiện
tượng nhờn thuốc của vi sinh vật
Từ khi Penicillin được sản xuất và đưa vào điều trị, sự phát triển của kĩ nghệ

kháng sinh đã giúp cho thầy thuốc những công cụ hữu hiệu trong việc kiểm soát và
khống chế các bệnh nhiễm khuẩn.Việc sản xuất chất kháng sinh, sử dụng chất
kháng sinh trong trị liệu cùng với thời gian, nhiều chế phẩm tổng hợp và bán tổng
hợp ra đời. Song song với sự kiện này, con người cũng biết đến hiện tượng nhờn
thuốc mà bản chất là sự phát triển tính đề kháng kháng sinh của tác nhân gây bệnh.
Tỉ lệ đề kháng của vi khuẩn và số thuốc bị đề kháng đang ngày càng gia tăng. Hiện
nay, ngoài các vi khuẩn Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Enterococcus đã
kháng thuốc [Levy,1998] chúng ta còn phải chú ý những trường hợp nhiễm khuẩn
do S. aureus kháng Methicillin thuộc nhóm Penicillin ức chế được β-lactamase và
những chủng vi khuẩn đường ruột kháng các Cephalosporins phổ rộng. Quá trình
theo dõi mức độ đề kháng của các tác nhân trên trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm
khuẩn đường hô hấp và nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhằm báo động về hiện trạng
kháng thuốc ở bệnh viện và cung cấp vài thông tin có thể hữu dụng cho việc trị liệu
kháng sinh.
Pseudomonas aeruginosa - trực khuẩn mủ xanh gây bệnh nghiêm trọng ở các
vết mổ, viêm niệu đạo, viêm phổi, màng não mủ đã đề kháng với hầu hết các loại
kháng sinh. Khi kiểm nghiệm trên bệnh nhân và trong invitro P. aeruginosa đã đề
kháng hàng loạt kháng sinh như: mezlocillin, ceftazidin, netilmicin… hai loại kháng
sinh có thể dùng là azlocillin và ceftazedime [32].
Đỗ Thị Huệ

7


Viện Đại Học Mở Hà Nội
Staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm, gây các bệnh đường tai mũi
họng, điều trị nhiễm trùng do S.aureus thường dùng các Penicillin kháng βlactamase như nafcillin. S. aureus có các protein gắn penicillin được coi là các S.
aureus kháng methicillin, thuốc được chọn trong trường hợp này là vancomycin.
Vancomycin là loại thuốc độc gây nhiều phản ứng phụ cho cơ thể. Gần đây một số
chủng trong loài này đã kháng cả vancomycin [33].

Candida albicans là tác nhân gây nhiều bệnh đặc biệt là niêm mạc miệng, lưỡi,
dạ dày. Hiện nay 25% bệnh tai mũi họng do Candida albicans trở lên không kiểm
soát nổi do đã đề kháng với các kháng sinh chống nấm như nystatin, amphotericin
B…
Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis nỗi kinh hoàng của loài người từ
những thế kỉ trước đã vĩnh viễn bị chặn lại từ khi phát hiện ra Steptomycin. Nhưng
nó đang trở lại và là nỗi lo không của riêng ai, đe dọa tính mạng toàn nhân loại đặc
biệt là các bệnh nhân AIDS vì M. tuberculosis đã đề kháng được nhiều loại kháng
sinh hiện có. Các kháng sinh được dùng trong chữa lao hiệu quả là streptomycin,
muối Para-amino của salicylic acid (PAS) và ionicotinic acid Hydrazide (INH). Tổ
hợp các chất streptomycin, PAS, INH là tổ hợp chống lao hiệu quả nhất mà nhân
loại có trong nhiều năm qua, nay cũng đã giảm hiệu quả.
Vì vậy nhiều biện pháp đang được nghiên cứu để chống lại sự nhờn thuốc của
các vi sinh vật gây bệnh. Một trong số các biện pháp hữu hiệu là tìm các kháng sinh
mới từ các loài vi sinh vật trong thiên nhiên. Ngày nay các nhà khoa hoc đang quay
lại nhóm vi sinh vật đầu tiên sinh ra chất kháng sinh - đó là nấm sợi nói riêng và
nấm nói chung. Đối tượng bị hấp dẫn đó chính là nấm biển và nấm rừng ngập mặn
là nguồn vi sinh vật có tiềm năng sinh kháng sinh mới chống các vi sinh vật nhờn
kháng sinh, hay các tế bào gây ung thư. Các nhà nghiên cứu tin rằng trong môi
trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của vi sinh vật sẽ khác hơn các vi
sinh vật trên cạn, nên sẽ có các chất trao đổi khác hơn trong đó có các hoạt chất quý
kể cả chất kháng sinh [32].
 Sử dụng kháng sinh và vi nấm trong phòng chống nấm bệnh hại cây trồng
Trong số các” Biện pháp đấu tranh sinh học” trong bảo vệ thực vật theo Cook và
Baker (1853) là sử dụng một hay nhiều vi sinh vật để kiềm chế bệnh thực vật. Chất
Đỗ Thị Huệ

8



Viện Đại Học Mở Hà Nội
kháng sinh và dịch lên men các chủng kháng sinh được dùng để xử lý hạt giống với
mục đích tiêu diệt nguồn bệnh bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh ở các bộ phận nằm
trên đất của cây và khử trùng đất. Kháng sinh diệt nấm sử dụng trong nông nghiệp
có hiệu quả cao như Strobilurin phân lập từ Strobilurus tenacellus (Anke, et
al.,1977). Các chế phẩm từ nấm Trichoderma được sử dụng phòng trừ nhiều loại vi
sinh vật gây bệnh như Rhizoctonia, Fusarium, Aspergillus…gây bệnh lở cổ rễ, thói
gốc rễ héo rũ ở nhiều loại cây trồng khác nhau [4]. Người ta sử dụng chất kháng
sinh để kiểm soát dịch bệnh do VSV gây ra cho cây trồng, CKS có tác dụng nhanh
dễ phân hủy lại có tác dụng chọn lọc cao. Dịch lên men của một số chủng sinh chất
kháng sinh không chỉ chống bệnh cho cây mà còn dùng để xử lí hạt giống tiêu diệt
mầm bệnh, có thể kích thích cây sinh trưởng và tăng số lượng vi sinh vật có ích cho
vùng rễ. Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc phối trộn vào phân
hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp chất dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả
năng kháng bệnh của cây [7]. Theo Emxep V.T (1989) cho biết nấm Trichoderma
không chỉ tiêu diệt nhiều loài nấm gây bệnh cho cây trồng trong đất mà còn có tác
dụng cải thiện cấu trúc và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển các vi
khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển cây
trồng. Các VSV đối kháng không chỉ ức chế các VSV gây bệnh ở vùng rễ mà những
chất kháng sinh do chúng tiết ra (Trichodermin, Glitoxin) có thể xâm nhập vào mô
cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng. Vì vậy một số chủng nấm
Trichoderma theo các nhà khoa học các nước thì hoàn toàn có thể sử dụng trong
đấu tranh sinh học [16]. Chủng nấm sợi như Trichoderma ssp trong các chế phẩm
phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp nguồn phân bón an toàn và hiệu quả mà
còn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được các ổ sinh thái phòng
bệnh lâu dài trong tự nhiên.
 Sử dụng kháng sinh và vi nấm trong phòng chống côn trùng gây hại cây
trồng [8][9]
Việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học để diệt các loại côn trùng gây hại
tuy hiệu quả nhanh và cao nhưng lại rất độc hại cho môi trường. Ngày nay các biện

pháp kiểm soát sinh học các loại côn trùng gây hại có hiệu quả và an toàn cho môi
trường đang được quan tâm. Có nhiều loại vi sinh vật đang được sử dụng trong
Đỗ Thị Huệ

9


Viện Đại Học Mở Hà Nội
kiểm soát sinh học như vi khuẩn, nấm sợi và virut. Ở Úc thử nghiệm diệt sâu hại
mía, diệt loài mối Coptotemes bằng M.anisopliae
2.2 Các đặc tính độc đáo của môi trường biển
Các đặc tính độc đáo của môi trường biển được coi là quan trọng với ngành hải
dương học bởi nhiều lí do:
+ Sự thích ứng tốt của hệ sinh thái ở môi trường biển sẽ giúp đỡ trong việc phát
triển các hệ gen mới.
+ Quy trình sản xuất công nghệ sinh học luôn bị ảnh hưởng bởi sự thích nghi đặc
biệt của sinh vật với môi trường của chúng, ở đây là môi trường biển.
Các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến nấm biển:
-

Độ mặn và pH

-

Nồng độ các ion Natri cao.

-

Nhiệt độ thấp


-

Điều kiện thiếu dinh dưỡng.

-

Áp suất thủy tĩnh cao; ba thông số cuối chỉ tính cho môi trường biển sâu [19]
[27]

2.3 Các nghiên cứu ngoài nước về các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn
gốc từ nấm biển
Nhấn mạnh chính của phần này là dựa trên các hợp chất có hoạt tính sinh học
mà nấm biển tạo ra và hoạt động của chúng. Chất chuyển hóa thứ cấp ở biển có thể
dễ dàng ngăn cản các vi sinh vật khác (Jeffrey et., 2011) [8]. Trong số các vi sinh
vật biển, đặc biệt là nấm đã có một vai trò quan trọng như là một nguồn gốc của
chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học (Amira et al., 2009). Nấm biển là
nguồn tài nguyên phong phú trong các sản phẩm tự nhiên. Nhưng nấm biển chỉ
được nghiên cứu ở một phạm vi hạn chế nào đó. Nấm biển thực sự có khả năng phát
triển và sinh bào tử riêng trong nước biển, nơi mà nấm biển có thể thích nghi một
cách nhanh chóng.
Trong những năm gần đây, nấm biển đã được nghiên cứu một cách mạnh mẽ
hơn để có được các hợp chất có hoạt tính sinh học mới khi đem so sánh với Sponges
và vi khuẩn. Tuy nhiên nấm biển vẫn còn ít được khám phá và thành công trong
nghiên cứu. Cephalosporin C là hợp chất có hoạt tính sinh học đầu tiên từ
Đỗ Thị Huệ

10


Viện Đại Học Mở Hà Nội

Cephalosporium acremonium được phân lập từ một đường cống nước thải ở bờ biển
Sardinian. Nấm biển đã được thăm dò ở mức độ ít hơn nhiều so với các loại nấm
trên cạn.
Nghiên cứu trước đây cho thấy nấm có nguồn gốc từ biển đã được công nhận là
nguồn khai thác các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học mới bao gồm chống
khối u, kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm, kháng viêm, hoạt động chống ung thư
và các hợp chất ức chế enzyme. Clodepsipeptide được phân lập từ nấm biển,
Clonostachys sp có khả năng chống lại hoạt động ung thư (Samuel et al., 2011).
Chi nấm Aspergillus đã được ghi nhận là nguồn sản xuất một lượng đáng kể các
chất gây độc tế bào cũng như các hợp chất có hoạt tính sinh học khác như
Aspergiolide A là một anthraquinone được phân lập từ dịch nuôi cấy của một loài
nấm Aspergillus glaucus có nguồn gốc từ môi trường biển. Kết quả nghiên cứu về
hoạt tính kháng u cho thấy Aspergiolide thể hiện hoạt tính gây độc tế bào chống lại
các dòng tế bào A-549, HL-60, BEL-7402 và P388. Gần đây, các thử nghiệm trên
động vật cũng cho thấy aspergiolide A có thể ức chế sự tăng trưởng khối u hiệu quả
trên mô hình chuột thí nghiệm (Xueqian et al., 2010, 2009). Protulactones A và B cũng
là hai polyketide mới có nguồn gốc từ chất trao đổi của nấm, được phân lập từ dịch
chiết EtOAc của nấm có nguồn gốc từ biển Aspergillus sp. SF-5044 (Jae et al, 2010).
Giữa năm 2000 và năm 2005 có khoảng 100 chất chuyển hóa từ nấm biển đã
được mô tả từ năm 2006 đến năm 2010 đã có 690 sản phẩm tự nhiên đã được phân
lập từ nấm trong môi trường biển (Katia et al., 2012). Nấm biển đã thu hút sự chú ý
đáng kể như là nguồn tài nguyên lớn chỉ vài thập kỉ này. Điều tra gần đây trên sợi
nấm biển nhằm tìm kiếm các hoạt tính sinh học của các chất chuyển hóa thứ cấp
cho thấy tiềm năng của chúng như một nguồn thuốc mới thậm chí chất chuyển hóa
chỉ ở nồng độ thấp (Swathi et al., 2013) [31]. Điều tra liên tục chứng minh rằng vi
sinh vật biển là một nguồn cung cấp không giới hạn các chất chuyển hóa thứ cấp có
hoạt tính sinh học mới. Nấm có nguồn gốc từ biển, đặc biệt đã mang lại số lượng
ngày càng tăng các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học [10][11][13][14][15].
Trong một nghiên cứu các chủng nấm có nguồn gốc từ biển, Miriam và cs
(2012) đã phân lập được chủng Penicillium paxilli MaG)K từ loài Hải miên M.

angulosa, dịch chiết của chủng nấm phân lập có khả năng gây độc tế bào đối với
Đỗ Thị Huệ

11


Viện Đại Học Mở Hà Nội
dòng tế bào ung thư ruột kết HCT8, dòng tế bào ung thư thần kinh trung ương CNS
295 và dòng tế bào bạch cầu HL60, ba hợp chất 2-pyrones đã được phân lập, trong
đó có 1 hợp chất mới là Pyrenocine I và hai hợp chất đã biết là Pyrenocine A và B.
Hai hợp chất Pyrenocine A và B đã được phân lập lần đầu tiên từ chủng nấm
Pyrenochaeta terrestris [17]
Nghiên cứu điều tra về các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học mới từ nấm
biển được thu thập từ vùng biển phía Nam Trung Quốc, một trong những chất trao
đổi thứ cấp của nấm biển là chrodrimanin B, cùng với năm loại sesquiterpenoid mới
được phân lập từ dịch lên men của Aspergillus sp. Đây là ghi nhận đầu tiên về sự
phân lập chrodrimanin B từ vi sinh vật biển (Mei-Yan et al.,2011) [30]. Từ chủng
Myceliophthora lutea Costantin được phân lập từ các mẫu trầm tích biển của vinh
biển Sakhalin thuộc Okhotsk, hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào
đã được phân lập đó là isoacremine D và acremin. Đây là các hợp chất được tìm
thấy lần đầu tiên từ nấm biển Myceliophthora lutea.
Một nghiên cứu khác về các chủng nấm được phân lập từ trầm tích thu thập ở
các vùng ven biển khác nhau của Kanyakumari thuộc phía Nam Ấn Độ, hoạt tính
kháng khuẩn của các chủng nấm phân lập đối với 6 tác nhân gây bệnh ở người là
Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Bacillus subtinis,
Staphylococcus aureus và Klebsiella pneumoniae cũng đã được khảo sát. Hoạt tính
gây độc tế bào ung thư của dịch chiết xuất từ Aspergillus protuberus SP1 đã được
thử nghiệm, kết quả cho thấy chúng có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư thanh
quản Hep 2 ( Mathal et el., 2011) [29]


Đỗ Thị Huệ

12


Viện Đại Học Mở Hà Nội
Bảng 2.3 Các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ nấm biển[12]
Nấm

Hoạt tính sinh học

Penicillium expansum

Gây độc tế bào

Penicillium citrinum

Gây độc tế bào
Khả năng kháng cầu trùng

Penicillium griseofulvum Y19-07

Gây độc tế bào

Ascomycetous

Hoạt tính kháng virut

Fusarium sp


Gây độc tế bào

Penicillium Viridicatum

Hoạt tính kháng khuẩn chống hoạt
động của nấm

Trichoderma koningii

Hoạt tính kháng nấm

Penicillium citreonigrum

Gây độc cho hoạt động thần kinh

Aspergillus versico

Gây độc tế bào
Hoạt tính kháng khuẩn

Pycnidiophora dispersa

Gây độc cho hoạt động thần kinh

Scopulariopsis sp

Gây độc tế bào

Hypocrea vinosa


Gây độc tế bào

Phoma sp

Gây độc cho hoạt động thần kinh

Chrysosporium queenlandicum

Gây độc cho hoạt động thần kinh

Coniothyrium cereale

Kháng khuẩn

Nodulisporium sp. CRIF1

Kháng ký sinh trùng sốt rét

2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong vòng 50 năm kể từ năm 1963 đến nay, các đối tượng sinh vật biển như
hải miên - ngành Porifera; Động vật ruột khoang (san hô mềm, hải quỳ..) ngành Cnidaria, nấm biển - ngành Ascomycota; Tảo - ngành Rhodophyla; động vật
da gai – ngành Echinodermata; rong nâu - ngành Ochrophyta; động vật thân mềm ngành Mollusca; động vật có sương sống - ngành Chordata; xạ khuẩn Actinobacteria; vi khuẩn –Cyanobacteria đã và đang được các nhà khoa học trên
thế giới quan tâm và tập trung nghiên cứu.Trong khuôn khổ nhiệm vụ Trọng điểm
nghiên cứu về dược liệu biển thuộc loài Hải miên trong đề án “Nghiên cứu tiềm
Đỗ Thị Huệ

13


Viện Đại Học Mở Hà Nội

năng về dược liệu biển vùng Đông Bắc Việt Nam” đang được tiến hành tại Viện
Hàn lâm KH&CN VN, 07 loài hải miên bao gồm Dysidea fragilis, Haliclona
oculata, Haliclona varia, Ircinia echinata, Ircinia sp, Acanthella obtusa, Tethya
aurantium đã và đang được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.
Trong đó đáng chú ý có 5 hợp chất mới dysinidine I , dysinidine II , dysinidine III ,
dysinidin A và dysinidin B đã được phân lập và xác định cấu trúc từ loài hải
miên Dysidea fragilis. Kết quả này đã được công bố trên 02 công trình quốc tế ISI
[20][21]. Từ loài hải miên Haliclona oculata (Linnaeus, 1759) năm hợp chất steroit
và hai lipit bị brom hóa là 3β-hydroxy-5-cholenic acid methyl ester, stigmasta5,24(28)-dien-3β,29-diol, 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol,cholest-5-en-3β,7βdiol, 24-vinylcholest-5-en-3β,24-diol, xestospongiene A và xestospongiene J đã
được phân lập và xác định cấu trúc. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên
08 dòng tế bào ung thư là HepG-2, KB, LU-1, MCF-7, LNCaP, HL-60, SK-Mel2 và
PC-3 cho thấy: Hợp chất stigmasta-5,24(28)-dien-3β,29-diol thể hiện hoạt tính khá
mạnh trên tất cả 02 dòng tế bào ung thư được thử nghiệm là KB và LU-1 với giá trị
IC50 tương ứng là 8,74 và 9,32 µM [22].
Năm 2007-2008, PGS TS Lại Thúy Hiền,Viện Công nghệ Sinh học đã phân lập
được 11 chủng nấm men và 13 chủng vi khuẩn có khả năng tạo các chất hoạt hóa bề
mặt sinh học từ vùng biển Việt Nam và nghiên cứu các đặc tính sinh học của chúng
trong khuôn khổ đề tài độc lập cấp Nhà nước. Đề tài trong Chương trình khoa học
trọng điểm cấp Nhà nước KC.09.09/06-19: Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt
tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào và chống oxy hóa từ sinh
vật biển nhằm tạo các sản phẩm có giá trị dược dụng (2007-2008), do GS Châu Văn
Minh chủ trì đã nghiên cứu một số sinh vật biển có chất kháng sinh, gây độc tế bào
và chống oxy hóa và đăng ký 3 thực phẩm chức năng tại Cục Vệ sinh an toàn thực
phẩm - Bộ Y tế.
Trong Chương trình nghiên cứu Cơ bản có định hướng ứng dụng (2006-2008),
Viện Công nghệ Sinh học đã thực hiện Đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi
sinh vật biển có khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng
nấm, gây độc tế bào) có khả năng ứng dụng làm nguyên liệu thuốc và thức ăn bổ
sung. Năm 2010-2011, Viện Tài nguyên và Môi trường biển đã thực hiện đề tài:
Đỗ Thị Huệ


14


Viện Đại Học Mở Hà Nội
Nghiên cứu cấu trúc và biến động quần xã vi rút và vi khuẩn nổi trong môi trường
ven biển phía bắc Việt Nam nhằm kiểm soát, xử lý ô nhiễm, cân bằng và phát triển
các hệ sinh thái biển bền vững (ĐT cấp viện HLKHVN). (www.vast.ac.vn; các đề
tài nghiên cứu KH)
Hướng nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật biển lần đầu tiên được
nghiên cứu bài bản, nhiệm vụ nghiên cứu Trọng điểm “Nghiên cứu phát hiện các
hợp chất kháng lao từ nguồn vi sinh vật đáy biển vùng Đông bắc Việt Nam”, nhóm
nghiên cứu đã phân lập và sàng lọc được 15 chủng vi sinh vật biển có hoạt tính cao
nhất để nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trong đó có 2 chủng
vi khuẩn bao gồm 1 chủng thuộc chi Photobacterium sp và chủng thuộc chi
Oceanisphaera sp,

13

chủng

xạ

khuẩn

bao

gồm

9


chủng

thuộc

chi Micromonospora sp, 2 chủng thuộc chi Streptomyces sp, 1 chủng thuộc
chi Nocardiopsis sp và 1 chủng thuộc chi Bacillus sp
Từ mẫu trầm tích biển tại Vịnh Hạ Long, đã phân lập được chủng vi sinh vật
biển Micromonospora sp. G006. Chủng vi sinh vật biển này có khả năng sản sinh
chloramphenicol – là hoạt chất đang được sử dụng làm thuốc kháng sinh. Đây là
phát hiện rất quan trọng, định hướng cho việc nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn
này cho việc sản xuất chloramphenicol dùng làm thuốc kháng sinh. Kết quả nghiên
cứu đã được công bố trên tạp chí khoa học quốc tế Antimicrobial Agents and
Chemotherapy
Tiếp theo các nghiên cứu bài bản nêu trên, trong khuôn khổ nhiệm vụ Trọng
điểm nghiên cứu về dược liệu biển thuộc loài động vật da gai trong đề án“Nghiên
cứu tiềm năng về dược liệu biển vùng Đông Bắc Việt Nam” đang được tiến hành tại
Viện Hàn lâm KH&CN VN, từ loài sao biển Culcita novaeguineae, hai hợp chất
asterosaponin trong đó có một chất mới: novaeguinoside E và 06 hợp chất
polyhydroxisteroit glycosit đã được phân lập. Các hợp chất halityloside A,
halityloside B, culcitoside C5 và halityloside D thể hiện hoạt tính gây độc trên 05
dòng tế bào ung thư thử nghiệm [23]. Các hợp chất này đang tiếp tục được đánh giá
theo một số hướng hoạt tính khác nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. Các
hợp chất sterol từ loài cầu gai Diadema savignyi được chứng minh có hoạt tính gây
độc tế bào [24] trong khi các dẫn xuất steroit phân lập được từ loài sao
Đỗ Thị Huệ

15



Viện Đại Học Mở Hà Nội
biển Protoreaster nodosus thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh [25]. Năm hợp chất
saponin dạng khung holostan mới là cercodemasoide A-E cùng với colochiroside A
và philinopside A được phân lập từ loài hải sâm Cercodemas anceps. Một điều rất
đáng quan tâm là các hợp chất này đều có hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh (tương
đương hoặc cao hơn chất chuẩn dương được sử dụng là ellipticine) trên năm dòng tế
bào ung thư được thử nghiệm là Hep-G2, KB, LNCaP, MCF7 và SK-Mel2. Hai hợp
chất cercodemasoide A và colochiroside A thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị
IC50 nằm trong khoảng từ 0,03±0,01-0,24±0,06 mM [26]. Điều này gợi mở cho các
nghiên cứu tiếp theo về các hợp chất này, đặc biệt là hợp chất cercodemasoide A,
theo định hướng diệt tế bào ung thư chẳng hạn như các nghiên cứu về cơ chế tác
dụng và đánh giá tác dụng trên mô hình in vivo.
Từ các mẫu ven biển, Lê Gia Hy và cs đã phân lập được chủng xạ khuẩn
Streptomycin orientalis 4912 sinh vancomycin. Các đặc điểm sinh học, điều kiện
nuôi cấy và khả năng sinh vancomycin cũng đã được nghiên cứu để tiến tới qui
trình công nghệ lên men sản xuất kháng sinh này.
Từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. G115 ở Vịnh
Hạ Long - Việt Nam, đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 11 hợp
chất là N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide, Cyclo-(Pro-Ala); Cyclo-(Leu-Pro) indole3-carbonitrile, thymine, 3-methylpiperazine-2,5-dione, axit benzoic, 4-(2-hydroxy
ethyl) phenol, 1-(pyrrolidine-2-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide, uracil, Cyclo(Pro-Gly). Trong số 11 hợp chất trên thì 2 hợp chất N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide
và 1-(pyrrolidine-2-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide là các hợp chất lần đầu tiên
phân lập từ tự nhiên.

Đỗ Thị Huệ

16


Viện Đại Học Mở Hà Nội
PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và hóa chất
3.1.1 Vật liệu nghiên cứu
Năm mẫu trầm tích được lấy từ các tọa độ khác nhau bằng hai phương pháp
dùng cuốc và Scuba từ khu vực vùng đáy biển Thanh Hóa-Quảng Bình –Quảng Trị,
được phòng Công nghệ sinh học, Viện Hóa sinh biển thu thập mẫu và bảo quản tủ
lạnh ở 0◦C - 4◦C.
3.1.2 Hóa chất và thiết bị.
 Hóa chất
-

Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi nấm: agar, cao nấm men, tinh bột tan,
peptone, NaCl, MgSO4.7H2O, MgCl2, KCL, NaHCO3…

-

Ngoài ra một số hóa chất dung trong nuôi cấy vi sinh như: NaCl 0.9%, nước
biển nhân tạo ( H2O, MgSO4.7H2O, NaHCO3, MgCl2. 6 H2O, CaCl2. 2H2O ,
KCl, NaCl,NaBr… ).

- Hóa chất gồm: Tris HCl (pH 8) 0.01M, EDTA (pH 8) 0.025m, SDS, enzyme
lysozym, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, isobutanol, ethanol, iso
propanol, cồn, NaOH pH 7,3.
- Hoá chất chạy PCR: mồi, Master mix.
- Hóa chất điện di gồm: TAE 1X, ethidium bromide, loading dye, agarose 0.8%.
 Thiết bị
STT Tên thiết bị
Box cấy vô trùng
1

Hãng sản xuất

Sanyo (Nhật)

2

Tủ lạnh

Nuaria (Mỹ)

3

Nồi hấp vô trùng

Nhật

4

Cân điện tử

Adam

5

Máy lắc

Amerex Instrument

6

Máy Vortex


Mimishaker, IKA (Đức)

7

Máy khuấy từ

Rotorab, OSI

8

Máy đo OD

UV/VIS Spectrophotomater (Nhật)

9

Máy li tâm

10

Máy PCR

Mictocentriguge- Sorvall (Mỹ)
Đức

11

Máy chạy điện di

Đức


Đỗ Thị Huệ

17


Viện Đại Học Mở Hà Nội

-

Các dụng cụ trong nghiên cứu vi sinh thông thường như: que cấy, đĩa peptri,
bình tam giác, que ria, que chang, cối sứ, giấy bạc…

 Môi trường:
•

Công thức pha nước muối biển nhân tạo
Thành phần

•

NaCl

Khối lượng
26,7g

MgCl2

2,26g


MgSO4

3,248g

CaCl2

1,153g

KCl

0,712g

NaBr

0,058g

H3BO3

0,058g

Na2SiO3

2ml

SnCl2

2ml

H3PO4


2ml

NaHCO3

2ml

NaF

2ml

NH4NO3

2ml

Môi trường phân lập và hoạt hóa vi nấm biển (g/l)(A1+ +glucoza)
Thành phần
Nước muối biển nhân tạo

Khối lượng
1 lít

Tinh bột tan

10g

Yeast extract

4g

Pepton


2g

Glucoza

2g

CaCO3

1g

FeSO4

5ml

KBr

5ml

 Môi trường thử hoạt tính sinh lí, sinh hóa của vi nấm nghiên cứu

Đỗ Thị Huệ

18