VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------*_*----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm
nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5”
--------------------------------------------

Giáo viên hướng dẫn : Ts.Hồ Tuyên
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Diệu Linh
Lớp

: 1302

Hà Nội-2017


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------*_*----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm
nattokinase từ Bacillus subtilis natto 5”
--------------------------------------------

Giáo viên hướng dẫn : Ts.Hồ Tuyên
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Diệu Linh

Lớp

: 1302

Hà Nội-2017


LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện được tốt đề tài nghiên cứu này, tôi đã nhận được nhiều sự
quan tâm và giúp đỡ tận tình từ phía gia đình, thầy cô và bạn bè.
Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Hồ Tuyên là người hướng dẫn
chính giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp cùng với các cán bộ, nhân
viên, các sinh viên thực tập tại phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo và giúp
đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học,
Viện đại học Mở Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, cảm ơn anh
chị em, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Diệu Linh

i



MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................... v
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
PHẦN 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4
1.1 Giới thiệu về nattokinase ......................................................................... 4
1.1.1 Nguồn gốc đặc tính của nattokinase .................................................. 4
1.1.2 Cơ chế hoạt động của nattokinase ..................................................... 7
1.1.3 Ứng dụng của nattokinase ................................................................. 9
1.1.4 Nguồn gốc thu nhận nattokinase...................................................... 10
1.2 Tình hình nghiên cứu nattokinase trên Thế giới và tại Việt Nam ......... 11
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới ................................................. 11
1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ................................................. 12
1.3 Giới thiệu về Bacillus Subtilis natto 5 ................................................... 14
1.3.1 Hệ thống phân loại và sự phân bố trong tự nhiên ............................ 14
1.3.2 Đặc điểm hình thái ........................................................................... 15
1.3.3 Đặc điểm sinh hóa............................................................................ 16
1.3.4 Đặc điểm nuôi cấy ........................................................................... 17
1.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ tới sự sinh trưởng và phát triển
của vi sinh vật .............................................................................................. 18
1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon .......................................................... 18
1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................. 19
1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận nattokinase .................... 19
1.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................... 19
1.5.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường ........................................... 20
1.5.3 Ảnh hưởng của pH môi trường ........................................................ 20


ii


1.5.4 Ảnh hưởng thời gian lên men .......................................................... 20
1.5.5 Độ thông khí .................................................................................... 21
PHẦN 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 22
2.1 Vật liệu ................................................................................................... 22
2.1.1 Chủng giống ..................................................................................... 22
2.1.2 Môi trường và hóa chất .................................................................... 22
2.1.3 Chất mang ........................................................................................ 23
2.1.4 Thiết bị ............................................................................................. 24
2.2 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 25
2.2.1 Phương pháp xác định môi trường có nguồn carbon và nguồn nitơ
tối ưu sử dụng trong lên men Baccilus subtilis natto 5 ............................ 25
2.2.2 Phương pháp kết tủa nattokinase bằng muối ammonium sulphate . 26
2.2.3 Phương pháp kết tủa nattokinase bằng acetone ............................... 27
2.2.4 Phương pháp đông khô để thu nhận enzyme tạo chế phẩm ............ 28
PHẦN 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 30
3.1 Lựa chọn môi trường lên men có nguồn carbon và nguồn nitơ thích hợp
cho sinh tổng hợp nattokinase của Bacillus Subtilis Natto 5 ....................... 30
3.1.1 Nguồn carbon ................................................................................... 30
3.1.2 Nguồn nitơ ....................................................................................... 31
3.2 Kết quả xác định điều kiện thu hồi enzyme nattokinase ....................... 32
3.2.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 thích hợp để kết tủa nattokinase có
trong dịch lên men .................................................................................... 32
3.2.2 Xác định nồng độ acetone thích hợp để kết tủa nattokinase có trong
dịch lên men .............................................................................................. 32
3.3 Xác định điều kiện và quy trình tạo chế phẩm nattokinase ................... 34
3.3.1 Chất mang tạo chế phẩm.................................................................. 34
3.3.2 Quy trình công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm nattokinase từ

B.subtilis natto 5 ....................................................................................... 36
PHẦN 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................... 39

iii


4.1 Kết luận .................................................................................................. 39
4.2 Kiến nghị ................................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 40

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT

Từ viết tắt

Tên đầy đủ

1

AA

Amino acid

2

ACE


Angiotensin converting enzyme

3

B.natto

Bacillus natto

4

B.subtilis

Bacillus subtilis

5

BSD

Bột sắn dây

6

DNA

Deoxyribonucleic acid

7

HATT


Huyết áp tâm thu

8

HATTr

Huyết áp tâm trương

9

LDL

Low-density lipoprotein

10

MT

Môi trường

11

NK

Nattokinase

12

PAI-1


Plasminogen-Activator Inhibitor

13

Pr

Protein

14

THA

Tăng huyết áp

15

t-PA

Tissue plasminogen activator

16

UK

Urokinase

17

VSV


Vi sinh vật

18

WHO

Tổ chức Y tế Thế giới

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc điểm của nattokinase.................................................................. 6
Bảng 1.2 Phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis .......................................... 17
Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu ...... 22
Bảng 2.2 Thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu ............................... 24
Bảng 2.3 Thành phần nguồn carbon và nitơ của môi trường MT2 ................ 25

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Natto truyền thống Nhật Bản............................................................. 5
Hình 1.2 Mô phỏng cấu trúc không gian của nattokinase. ............................... 5
Hình 1.3 Huyết khối được hình thành thông qua các nút tiểu cầu. .................. 7
Hình 1.4 Các tác dụng sinh lý của nattokinase trên fibrin. .............................. 8
Hình 1.5 Mô phỏng hệ thống phân loại của Bacillus subtilis natto 5. ........... 14
Hình 1.6 Hình thái của Bacillus subtilis. ........................................................ 16
Hình 3.1 Ảnh hưởng của các nguồn carbon trong môi trường lên men đến

hoạt tính nattokinase của B.subtilis natto 5. ............................................. 30
Hình 3.2 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ trong môi trường lên men đến hoạt
tính nattokinase của B.subtilis natto 5. ..................................................... 31
Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện hoạt tính của nattokinase sau khi tủa bằng
(NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau. ....................................................... 32
Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện hoạt tính của nattokinase sau khi tủa bằng acetone
ở các tỷ lệ khác nhau. ................................................................................ 33
Hình 3.5 Ảnh hưởng của loại, tỉ lệ chất mang tới khả năng làm tan huyết khối
của chế phẩm nattokinase được tạo từ enzyme trộn với chất mang sau đó
đông khô.................................................................................................... 34
Hình 3.6 Ảnh hưởng của loại, tỉ lệ chất mang tới khả năng làm tan huyết khối
của chế phẩm nattokinase được tạo từ cặn enzyme đông khô sau đó trộn
với chất mang. ........................................................................................... 35
Hình 3.7 Quy trình công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm nattokinase từ
Bacillus subtilis natto 5............................................................................. 38

vii


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Trong thời gian gần đây, chúng ta nghe nhắc nhiều đến nattokinase với
nhiều tác dụng khác nhau, đặc biệt có thể mang tới cho chúng ta một sức khỏe
tốt hơn, nâng cao chất lượng sống của con người. Vậy nattokinase là gì?
Nattokinase là một enzyme được tìm thấy trong sản phẩm “Natto” - một
món ăn truyền thống của người Nhật Bản. Nattokinase là protease chuỗi đơn
chứa 275 amino acid đã được Hyroyuki Sumi phát hiện và thấy được khả
năng làm tan huyết khối vào năm 1980

[11]


. Huyết khối là hiện tượng máu

đông trong các động mạch hay tĩnh mạch nằm bên trong cơ thể. Cục huyết
khối là sản phẩm cuối cùng của quá trình đông máu. Bình thường nó có tác
dụng cầm máu trong các trường hợp chảy máu do tổn thương mạch máu (đứt
rách). Khi quá trình đông máu xảy ra trong mạch máu không bị đứt rách thì
được gọi là chứng huyết khối bệnh lý và có thể dẫn tới các bệnh tim mạch
như: nhồi máu cơ tim, tắc nghẽn mạch máu não, đột quỵ…và nguy hiểm hơn
là dẫn đến tử vong đột ngột.
Theo WHO mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người tử vong do mắc phải
các bệnh tim mạch và dự đoán đến 2020 con số này có thể đạt tới 25 triệu
người, mà nguyên nhân là hậu quả của các cục máu đông (huyết khối). Theo
ước tính thị trường toàn cầu về các thuốc làm tan huyết khối là gần 14 tỉ USD
[12]

. Các loại thuốc làm tan huyết khối như Alteplase, Streptokinase,

Urokinase… có hiệu lực tức thì sau khi tiêm vào tĩnh mạch. Tuy nhiên hiệu
lực hoạt động sinh học của các loại thuốc này chỉ là tạm thời, tồn tại không
lâu sau khi tiêm, giá cao mà chỉ tác động vào triệu chứng, không chữa được
nguyên căn của bệnh, đồng thời cũng có nguy cơ biến chứng gây xuất huyết.
Trong khi đó nattokinase được coi như một thực phẩm chức năng hỗ trợ làm
tan huyết khối sở hữu nhiều ưu điểm như an toàn, chi phí thấp dễ sử dụng
kèm theo đó là khả năng ngăn ngừa được bệnh.

1


Fibrin là protein dạng sợi không tan được hình thành do chuyển hóa của

fibrinogen dưới tác động của thrombin. Fibrin cùng với những tế bào tiểu cầu
là yếu tố chính phát triển nên cục máu đông. Nattokinase không chỉ làm giảm
hàm lượng fibrin một cách trực tiếp mà còn thúc đẩy các tế bào phát triển chất
hoạt hóa plasminogen để phân hủy fibrin. Hoạt tính làm tan huyết khối của
nattokinase tương đối mạnh và kéo dài, có thể làm giảm chứng cao huyết áp,
phân giải protein dạng amyloid liên quan đến bệnh alzhemer hay bệnh bò điên
[13]

; tăng cường hoạt hóa plasminogen và làm bất hoạt chất ức chế hoạt hóa

plasminogen

[14]

. Chính vì tác dụng dược lý to lớn của nattokinase mà ngày

nay, việc nghiên cứu thu nhận enzyme từ các nguồn khác nhau nhất là từ vi
sinh vật đang được quan tâm.
Một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh nattokinase có thể kể đến như
Bacillus spp. Bacillus có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên. Đây là vi khuẩn
Gram dương, hiếu khí và có cấu trúc bề mặt khá phức tạp, có đặc điểm kết
dính, có khả năng chống chịu được điều kiện khắc nghiệt cao. Một số chủng
Bacillus đã được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng
sinh enzyme nattokinase làm tan huyết khối cao có thể kể đến như: Bacillus
subtilis LSSE-22 từ Bắc Kinh, Trung Quốc

[15]

; Bacillus sp. CK từ


Chungkook- Jang và Bacillus sp. DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc

[16]

; hay

B.natto từ Natto, Nhật Bản [17].
Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng
chứa nattokinase dưới dạng viên nhộng nhập khẩu từ Nhật Bản, Hoa Kỳ như
Nattospes (3000 FU/g), Japato (600 FU/g), Nattokinase plusTM (3000 FU/g),
Dosaka (300 FU/g)... với đơn giá rất cao (trên 10 triệu đồng/kg). Dạng thực
phẩm truyền thống của Nhật Bản cũng được nhập khẩu nhưng không được
dùng phổ biến vì nặng mùi, nhớt, rất khó ăn, không phù hợp với khẩu vị
người Việt Nam, hoạt tính nattokinase cũng thấp [1].
Phòng Công nghệ Lên men, viện Công nghệ Sinh học, viện Hàn lâm
Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tuyển chọn và nghiên cứu thành công
2


điều kiện ban đầu thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase
của chủng B.subtilis natto 5 lần lượt là: pH 7,5; nhiệt độ 37oC; tỉ lệ giống 5%;
độ thông khí 25%. Ở thời điểm hoạt tính enzyme cao nhất theo phương pháp
Astrup và Mullertz (1952) hoạt tính protease đạt 2700 U/ml.
Tuy nhiên, để thu hồi được tối đa lượng enzyme nattokinase và ứng dụng
vào làm chế phẩm phục vụ cho con người lại là một thách thức không nhỏ đối
với các nhà nghiên cứu. Chế độ lên men, điều kiện thu nhận enzyme hay cách
thức tạo chế phẩm đều là những công đoạn có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu
suất thu hồi và hoạt tính của enzyme. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu điều kiện thu
hồi và tạo chế phẩm nattokinase từ B.subtilis natto 5” được chúng tôi quan
tâm và đi sâu nghiên cứu.

Mục tiêu chung
Xác định được điều kiện thích hợp để thu hồi và tạo chế phẩm
nattokinase từ B.subtilis natto 5 áp dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng.
Nội dung nghiên cứu
- Xác định môi trường nuôi cấy để thu nhận được nattokinase từ
B.subtilis natto 5 cao nhất;
- Xác định điều kiện thu hồi nattokinase từ B.subtilis natto 5;
- Xác định chất mang và chế độ sấy để tạo chế phẩm nattokinase có khả
năng làm tan huyết khối tốt.

3


PHẦN 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nattokinase
Nattokinase là một enzyme làm tan huyết khối được tìm thấy trong loại
đậu tương lên men Natto - món ăn truyền thống của người Nhật năm 1980.
Nattokinase có tác dụng làm tan các cục máu đông vốn là nguy cơ gây tắc
mạch máu dẫn đến tai biến, đột quỵ [18].
Hiện nay, tỉ lệ mắc bệnh tắc nghẽn động mạch do các cục máu đông như
chứng nhồi máu cơ tim hay tắc nghẽn mạch máu não đang tăng nhanh tại Việt
Nam và trên Thế giới. Chính vì thế, nattokinase được quan tâm nghiên cứu
sản xuất và sử dụng rộng rãi như một sản phẩm chức năng để phòng ngừa
bệnh tắc nghẽn mạch máu do các cục máu đông [19].
1.1.1 Nguồn gốc đặc tính của nattokinase
Nattokinase là một enzyme chiết xuất từ natto – món đậu tương lên
men của Nhật Bản từ vi khuẩn B.subtilis. Natto không chỉ nổi tiếng là món ăn
truyền thống của Nhật trong khoảng hơn 1.000 năm qua mà còn được dùng
nhưng một phương thuốc dân gian hiệu quả cho những bệnh lý về tim và

mạch máu [17]. Cũng có một số tài liệu cho rằng món ăn này được du nhập từ
Trung Hoa vào Nhật Bản với cái tên tan-shih.
Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của natto là tiến sĩ
K.Yabe, một chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tòi của ông
về sự lên men của natto vào năm 1894

[39]

. Đến năm 1980, Hiroyuki Sumi,

nhà nghiên cứu tại Đại học Chicago qua nhiều năm nghiên cứu, thí nghiệm
trên 173 mẫu thực phẩm khác nhau, ông đã thành công khi phát hiện ra một
enzyme có hoạt tính cực kỳ mạnh mẽ giúp làm tan cục máu đông. Ông đặt tên
cho nó là “nattokinase”, nghĩa là “enzyme có trong natto” [20].
Trong quá trình lên men natto sẽ hình thành chất nhầy là chất gây liên
kết cho đậu. Trong các phương pháp truyền thống, người ta lên men đậu
tương từ vi khuẩn trên rơm rạ (hình 1.1). Trong quá trình sản xuất hiện đại,
4


các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên đậu tương, vì vậy mà việc sử dụng
rơm rạ là không còn cần thiết [21].

Hình 1.1 Natto truyền thống Nhật Bản
Nattokinase là một enzyme tiêu protein thuộc nhóm Subtilisin, có trọng
lượng phân tử 27.728 Da, gồm 275 AA [39], hoạt động ở pH từ 7-10, nhiệt độ
từ 30-70 °C, có trọng lương phân tử từ 27,7 – 44 kDa, điểm đẳng điện (pI)
8,0. Cơ chế hoạt động của nattokinase là trực tiếp cắt fibrin trong huyết khối
và gián tiếp bằng cách hoạt hóa sự sản xuất urokinase và plasmin trong mô.
Nattokinase làm giảm fibrin trực tiếp, trong các xét nghiệm ly giải huyết khối

có thể so sánh với hoạt động của toplasmin [18].

Hình 1.2 Mô phỏng cấu trúc không gian của nattokinase.
Subtilisin là nhóm serine protease có khả năng thủy phân protein.
Nattokinase có sự tương đồng cao với các subtilisin và trình tự gen 16 rDNS
cho thấy 99,5% và 99,3% tương đồng với subtilisin E và amylosacchariticus
tương ứng [22].

5


Bảng 1.1 Đặc điểm của Nattokinase [16].
Đặc điểm của nattokinase
Tên protein

Tên đề xuất: Subtilisin NAT, EC =
3.4.21.62
Tên thay thế: Nattokinase; Cardiokinase

Tên hệ gen

aprN

Vi sinh vật

B.subtilis subsp.natto

Phân loại
Giống
Trình tự

Cấu
trúc
Pr

Trạng thái trình tự
Quá trình hình thành
trình tự
Sự tồn tại Pr

86092
Bacteria> Fimicutes> Bacillales>
Bacillaceae> Bacillus
275 AA
Hoàn thành
Các trình tự hiển thị là một quá trình hình
thành từ tự nhiên
Bằng chứng cấp độ Pr

Chú thích chung
Chức năng

Subtilisin là một protease ngoại bào, nó xúc
tác cho quá trình thủy phân protein và
peptide amid, Subtilisin NAT cũng có hoạt
tính tiêu sợi huyết

Hoạt động xúc tác

Thủy phân protein với nồng độ đặc hiệu
rộng với peptide và một lượng dư trong thủy

phân peptide amid

Đơn vị cấu trúc

Monomer

Vị trí dưới tế bào

Huyết khối

Trình tự tương đồng

Thuộc nhóm S8 peptidase

Tình chất vật lý

K=0,48mM cho chuỗi Suc-Ala-Pro-PhepNA

6


Kết quả nghiên cứu động học của nattokinase cho thấy hoạt động làm giảm
fibrin mạnh gấp 6 lần plasmin phân giải liên kết fibrin. Nattokinase làm giảm
fibrin gián tiếp ảnh hưởng đến hoạt động hoạt hóa của plasminogen [23].
1.1.2 Cơ chế hoạt động của nattokinase
Huyết khối là hiện tượng máu đông tại thành động mạch hay các tĩnh
mạch nằm bên trong cơ thể gây ra các hiện tượng như: nhồi máu cơ tim, tắc
nghẽn mạch máu não, đột quỵ…và nguy hiểm hơn là dẫn đến tử vong đột
ngột. Sự hình thành huyết khối liên quan đến tổn thương lớn lớp tế bào nội
mô, là sự kết dính – gần tiểu cầu và hoạt hóa thrombin. Ngoài ra thành phần

của tụ huyết khối còn phụ thuộc vào một số yếu tố khác như mức độ tổn
thương mạch máu, áp lực bao sức, hiện diện của các thuốc kháng huyết khối
[24]

.

Hình 1.3 Huyết khối được hình thành thông qua các nút tiểu cầu.
Huyết khối phát triển và được duy trì thông qua sự tích tụ dần dần của
nhiều sợi fibrin hoặc lớp niêm mạc của các mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu
sẽ tập trung vào các vùng bị thương đó để tạo thành nút tiểu cầu (hình 1.3).
Các yếu tố đông máu trong cơ thể được kích hoạt, mạng lưới fibrin được hình
thành và tạo nên cục máu đông. Nhờ tác dụng phân giải sợi fibrin, nattokinase
đã ngăn chặn sự ngưng kết của các tiểu cầu giúp làm tan các cục máu đông.
Vì vậy vai trò của nattokinase là làm tan sợi huyết fibrin. Khi fibrin bị phân
hủy thì sự đông máu trở nên khó khăn.

7


Trong quá trình làm tan huyết khối, prokinase được chuyển đổi thành
urokinase, một quá trình được tăng cường bởi nattokinase. Phá vỡ fibrin thành
các sản phẩm phân hủy cũng được nâng cao, khi lượng fibrin thấp tác dụng
chuyển hóa plasminogen thành plasmin thấp. Nattokinase tăng plasminogen tế
bào và chất hoạt hóa, tăng cường phân hủy fibrin và giảm thời gian đông máu.
Qua giảm sự hình thành huyết khối, nattokinase làm chậm lại tiến triển của
hình thành các mảng bám và ít gây tổn thương động mạch.

Hình 1.4 Các tác dụng sinh lý của nattokinase trên fibrin [42].
Cơ chế làm tan huyết khối của nattokinase: Thành phần chính của huyết
khối là các sợi fibrin. Plasmin là enzyme nội sinh duy nhất trong cơ thể có tác

dụng làm tan sợi fibrin. Nattokinase có khả năng hoạt động mạnh gấp 6 lần
plasmin nội sinh với cơ chế tương tự. Đồng thời, thông qua quá trình làm bất
hoạt PAI-1 làm tăng hoạt tính của tPA (chất hoạt hóa plasminogen mô) nên
gián tiếp chuyển plasminogen thành plasmin, nattokinase cũng kích thích cơ
thể sản xuất plasmin. Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin
càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông, nattokinase cũng giúp tăng
cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như
urokinase [15].

8


1.1.3 Ứng dụng của nattokinase
Nattokinase là một loại enzyme được coi là một phương thuốc hứa hẹn
cho chữa bệnh huyết khối do hoạt tính tiêu sợi huyết mạnh của nó

[11]

.

Nattokinase được sử dụng cho các bệnh liên quan đến hệ tuần hoàn máu
bao gồm bệnh tim, cao huyết áp, đột qụy, đau ngực (đau thắt ngực), huyết
khối tĩnh mạch sâu, xơ cứng động mạch (xơ vữa động mạch), bệnh trĩ, giãn
tĩnh mạch, tuần hoàn kém, bệnh động mạch ngoại biên

[18]

. Nattokinase

cũng được sử dụng để giảm đau, đau xơ cơ, hội chứng mệt mỏi mãn tính,

viêm màng dạ con, u xơ tử cung, co thắt cơ, vô sinh, ung thư và bệnh tê
phù do thiếu vitamin B1 [24].
Theo một nghiên cứu, ta có thể sử dụng enzyme này thay thế aspirin với
tác dụng xúc tác cao hơn một số enzyme khác. Enzyme này tác động lên hệ
tuần hoàn, làm quá trình lưu thông máu diễn ra dễ dàng hơn, tránh hiện tượng
tắc nghẽn mạch máu [25]. Đồng thời, enzyme này làm giảm nồng độ fibrinogen
trong huyết tương [26]. Các nhà khoa học đã nghiên cứu lâm sàng chứng minh
khả năng của nattokinase làm giảm cục máu đông sau 8 giờ uống một liều
Natto (khoảng 6000 đơn vị phân giải sợi fibrin) và euglobulin thể hiện khả
năng làm giảm cục máu đông tăng một cách đáng kể sau 12 giờ uống [1]. Một
bệnh nhân đã sử dụng kết hợp aspirin và 400 mg nattokinase trong 7 ngày liên
tục để ngăn chặn đột quỵ, xuất huyết tiểu não [28].
Song song với tác dụng làm tan huyết khối, nattokinase còn góp phần
làm giảm áp lực của máu lên thành mạch. Điều này đã được chứng minh
trong một nghiên cứu của Juan, 2010. Nattokinase có chứa ACE ức chế hoạt
động của chất làm đông máu, đồng thời làm giảm huyết áp tâm thu 11% và
tâm trương 9,7%

[29]

. Ngoài ra, nattokinase có thể ngăn chặn hiện tượng hẹp

động mạch chủ và xơ vữa động mạch do khả năng ức chế cục máu đông. Do
đó, nattokinase hứa hẹn tiềm năng chữa trị các bệnh tim mạch, đột quỵ, xơ
vữa động mạch, huyết áp cao…[23]

9


Một nghiên cứu năm 2009 cho thấy nattokinase có thể có hiệu quả

trong quá trình dị hóa các sợi amyloid độc hại liên quan đến bệnh Alzheimer ,
cũng như các sợi insulin liên quan đến tiểu đường và các sợi prion peptide
gắn liền với các bệnh do prion [26].
Nattokinase cũng có khả năng hoạt hóa nhiều loại enzyme chuyển hóa
trong cơ thể. Sau khi vào cơ thể nhờ bổ sung trực tiếp qua đường tiêu hóa,
nattokinase tách các enzyme chuyển hóa ra khỏi mình, tác động tới chúng làm
tăng khả năng chuyển hóa của chúng trong cơ thể. Có nghĩa là, nattokinase có
khả năng hỗ trợ dinh dưỡng cho cơ thể [22].
1.1.4 Nguồn gốc thu nhận nattokinase
Gần đây, các nhà khoa học tìm thấy nattokinase ở vi sinh vật (nhân sơ và
nhân thực) và giống như enzyme được sinh ra từ tụy tạng của người (tripsin
và chymotrypsin). Vi sinh vật thường sản xuất nattokinase đại diện cho nhóm
prokaryote là B.subtilis và ở nhóm eukaryote là Rhizomucor sp. Nhiều chủng
vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân lập từ các loại thực phẩm lên men truyền
thống là nguồn giống quan trọng có khả năng sản xuất các enzyme làm tan
huyết khối, như B. natto phân lập từ thực phẩm Natto, Nhật Bản[17]; Bacillus
subtilis LSSE-22 từ Bắc Kinh, Trung Quốc

[15]

; Bacillus sp. CK 11-4 từ

Chungkook-Jang và Bacillus sp. DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [16].
Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng lên men bán rắn chủng Bacillus
subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể. Thực tế
nattokinase được thu nhận từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm
lượng không cao và hoạt tính ít ổn định. Hiện nay đã có những nghiên cứu
bước đầu tạo nattokinase tái tổ hợp có hoạt tính bằng hệ thống vi khuẩn
(Escherichis coli, Bacillus subtilis, Lactococcus sp.). Hướng nghiên cứu
nattokinase tái tổ hợp bước đầu cho thấy hiệu quả vì enzyme tái tổ hợp được

biểu hiện có hoạt tính và tiết ngoại bào [30,31,32].

10


Nattokinase được tinh sạch từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis natto B-12
(phân lập được từ natto) có độ tinh sạch gấp 51,6 lần và hiệu suất thu hồi
43,2% so với hoạt tính ban đầu, trọng lượng phân tử 29 kDa, hoạt động ở pH
và nhiệt độ tối ưu tương ứng là 8,0 và 40°C, enzyme được hoạt hóa bởi ion
Zn2+ nhưng bị ức chế bởi ion Fe3+ và Al3+

[33]

. Trong môi trường lỏng chứa

peptone từ đậu nành 8,28 g/l, CaCl2 0,64 g/l và cao nấm men 0,74 g/l, B.natto
NLSSE sinh tổng hợp nattokinase đạt 1300 UI/ml

[34]

. B.subtilis LD-8 sinh

tổng hợp nattokinase cao trong môi trường lỏng chứa bột gạo 5%, bột đậu
nành 4%, NH4NO3 0,5% và CaCl2 0,01% (w/w), pH 7 và tỷ lệ giống 5%, sau
72 giờ nuôi cấy, hoạt nattokinase đạt được là 4220 U/ml

[35]

. B.subtilis được


nuôi cấy trên cơ chất bã bậu nành (độ ẩm 80%), ở 370C trong 20 giờ, hiệu
suất nattokinase cao nhất là 0,108 g/150 g cơ chất (dạng ướt) [26].

1.2 Tình hình nghiên cứu nattokinase trên Thế giới và tại Việt Nam
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới
Nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về sự bí ẩn của Natto là tiến
sĩ K.Yabe, một chuyên gia về vi sinh học công bố những kết quả tìm tòi của
ông về sự lên men của natto vào năm 1894, ghi lại rằng “Natto, một loại phomai thực vật” để giới thiệu với các nước phương Tây vốn rất quen thuộc với
các loại pho-mai từ sữa bò hay sữa dê. Trước Abe, chưa có một ai tìm hiểu
nguyên nhân tại sao natto có thể lên men từ rơm rạ bọc quanh. Với phương
pháp trích ly, Abe đã tìm thấy 4 loại vi khuẩn (ba loại thuộc họ Micrococci và
một loại Bacillus) đã giúp cho đậu nành lên men dễ dàng [39].
Vào năm 1905, Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã thành công trong
việc tách 2 loại vi khuẩn natto từ đậu nành nấu chín. Đến năm 1907, ông đã
phát hiện ra rằng natto có chứa enzyme protease hoạt hóa. Tiếp đó K.Oshima
báo cáo rằng protease này phân hủy fibrin và gelatin vào năm 1925. Năm
1956, S.Miyake đã xác định thành phần các acid amin của enzyme [39].

11


Năm 1986, Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác
dụng của nattokinase sau khi thử nghiệm gần 173 loại thực phẩm khác nhau
để so sánh. Sumi đã xác định nattokinase là một loại enzyme có khả năng
phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme,
nó có hoạt tính mạnh gấp 4 lần plasmin đồng thời tuyệt đối an toàn cho cơ thể
khi hấp thụ qua đường ăn uống [22].
Đến nay đã có nhiều nghiên cứu xoay quanh các đề tài về nattokinase.
Các nhà khoa học tại trường Y khoa Keck (Hoa Kỳ) đã tìm ra được
nattokinase có khả năng làm giảm sự kết dính của các tế bào máu, do đó làm

giảm độ nhầy của máu thông qua các nghiên cứu in vitro. Các nhà khoa học
này cũng đã tìm ra tác dụng làm giảm lipid máu của nattokinase khi kết hợp
với gạo nấm men đỏ đối với những người bị tăng lipid máu.
Tại hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand (30/43/5/2006), Masafumi Kitakaze đã khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ
rệt các chứng Mỡ (Triglyceride và Cholesterols) trong máu cao qua nghiên
cứu chung của 4 cơ quan y tế Nhật Bản, kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện
nếp sinh hoạt và tiêu thụ Natto thiên nhiên trước nguy cơ béo phì do “thừa”
dinh dưỡng và các chứng bệnh hiểm nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày
càng tăng khắp nơi trên thế giới.
Theo kết quả nghiên cứu của 3 cơ quan y tế: Đại học bang Oklahoma
(Mỹ), JCR Pharmaceuticals (Nhật Bản) và Trường Y khoa Miyazaki, phối
hợp thử nghiệm trên cơ thể người (in vivo) bằng cách cho ăn natto 200g/ngày
và đã kiểm chứng được những hiệu ứng kể trên, đặc biệt phát hiện lượng
plasmin nội sinh giảm sụt ở người cao tuổi không đủ để làm tan huyết khối,
gây vón cục trong động mạch, thì hiệu quả của Natto càng rõ rệt.
1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Trong nước đã có một số nghiên cứu sản xuất thuốc làm tan huyết khối
để điều trị các chứng tắc nghẽn mạch (thrombosis) như: Nhóm nghiên cứu
của Lý Thị Bích Thủy (Viện Công nghệ sinh học) đã nghiên cứu và sản xuất
12


thành công chế phẩm Lumbrokinase (sản phẩm tách từ giun đất Nhật Bản có
tên khoa học là Lumbricus rubellus và từ giun quế Việt Nam có tên khoa học
là Perionyx escavatus) có tác dụng làm tan cục máu đông làm nghẽn động
mạch tạo ra vết thương bị tụ máu [2].
Nông Văn Hải và nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học đã
nghiên cứu tạo thể hoạt hóa plasminogen dạng mô (tPA) tái tổ hợp trong vi
khuẩn E.coli. Vũ Hồng Diệp và cộng sự (2008) cũng đã nghiên cứu sản xuất
streptokinase tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli BL21 [3]. Khuôn khổ đề tài KC

10.28 “Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme
tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng
trong điều trị”, Quyền Đình Thi và cộng sự (Viện Công nghệ sinh học) đã
nhân dòng và biểu hiện thành công streptokinase (enzyme có chức năng tương
tự nattokinase) trong E.coli

[4]

. Nhóm nghiên cứu của Quyền Đình Thi (Viện

Công nghệ sinh học) cũng đã nhân dòng gen mã hóa subtilisin từ hai chủng
Bacillus subtilis có độ tương đồng 99% với trình tự amino acid của một
enzyme khác cũng đã được sử dụng làm thuốc chống tắc nghẽn mạch máu
nattokinase [4].
Nhóm tác giả Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được
hai chủng Bacillus sp. 7.2 và Bacillus sp. NP3 có khả năng sinh tổng hợp 470
FU/g nattokinase trên môi trường đậu nành hạt hấp chín ở điều kiện nuôi cấy
trên đĩa petri và trên khay. Lượng nattokinase này chiếm khoảng 85% so với
protease toàn phần

[1]

. Tuy nhiên đây cũng chỉ là những nghiên cứu ban đầu,

quy mô phòng thí nghiệm, chưa có khả năng triển khai ứng dụng vào thực tế
sản xuất.
Trong năm 2013-2014, Huỳnh Văn Minh và cộng sự (Đại học Y Dược
Huế) đã có những nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về Natto đối với huyết áp
cao. Bằng việc nghiên cứu trên 71 người được phát hiện có HATT từ 130 đến
159 mmHg và/hoặc HATTr từ 85 đến 99 mmHg (tiền THA hoặc THA độ I)

với liều 2010 FU/ngày trong 8 tuần liên tục, kết quả cho thấy giảm đồng thời
13


HATT và HATTr có ý nghĩa thống kê so với placebo ở người tiền THA và
THA độ 1, giảm cứng động mạch thông qua hiệu quả làm giảm PWV và PP
nhiều hơn có ý nghĩa thống kê so với placebo, có hiệu quả tốt lên một số
thành phần lipid máu như làm giảm cholesterol toàn phần và LDLCholesterol.
Trên thị trường Việt Nam đã có một số sản phẩm nattokinase dưới dạng
thực phẩm chức năng được sản xuất trong nước kế thừa các thành tựu khoa
học trong và ngoài nước nhưng chưa phổ biến và giá thành khá cao. Do đó,
việc nghiên cứu sâu về enzyme này là cần thiết và cần được chú trọng hơn.

1.3 Giới thiệu về Bacillus Subtilis natto 5
1.3.1 Hệ thống phân loại và sự phân bố trong tự nhiên
Theo nghiên cứu, B.subtilis natto 5 nằm trong hệ thống phân loại như
sau:
Giới: Prokaryota

Ngành: Protophyta

Lớp: Schyzomycetales

Bộ: Eubacteriales

Họ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis subsp. Natto [12]


Hình 1.5 Mô phỏng hệ thống phân loại của Bacillus subtilis natto 5.

14


Khi mới được phát hiện, B.subtilis natto 5 được coi như là một loài
vi sinh vật mới. Từ kết quả phân tích DNA-nhiễm sắc thể B.nato và B.subtilis
của Seki năm 1975 và kết quả phân tích gen 16S rRNA của Tamang năm
2002, các khóa phân loại đã xếp B.subtilis natto là một dòng thuộc loài
B.subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác là có khả năng lên men tạo sản
phẩm Natto.
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí.
Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất
và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất
trồng trọt có khoảng 106 – 107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa
mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm [40].
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon
trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các
hợp chất hữu cơ là vitamin và A.A cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như
Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp,
chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường
như: nutrient agar (NA), nutrient broth (NB) [3].
Bacillus subtilis còn phân bố trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm
được chế biến từ các loại hạt đó. Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống
như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua)… cũng có mặt của chúng và
có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh học [5].
1.3.2 Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+),
kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn (hình

1.6). Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các lớp giác mạc, lớp bề mặt có tính chất
protein, một vài lớp lót peptidoglycan và các protein trên mặt ngoài của màng
tế bào. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông. Khuẩn lạc khô hoặc
nhớt, không màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành màng
mịn lan trên bề mặt thạch. Như hầu hết các vi khuẩn Gram dương khác, cấu
15


trúc bề mặt của Bacillus khá phức tạp và có các đặc tính kết dính và chống
chịu điều kiện khắc nghiệt cao.

Hình 1.6 Hình thái của Bacillus subtilis [16].
Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 –
0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần
lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH
thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là
đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis [6].
Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid,
có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia
phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục
năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus
subtilis trong 200 – 300 năm [40].
1.3.3 Đặc điểm sinh hóa
Bacillus subtilis lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose,
maltose, saccharose, xylose và arabinose.
Thử nghiệm indol là âm tính (-), các phản ứng nitrate, amylase, MR là
dương tính (+), có khả năng di động và hiếu khí (bảng 1.2).

16