Luận văn tốt nghiệp

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN :

2.1. Phương pháp :
Phương pháp thực hiện đề tài dựa trên phương pháp làm tiêu bản hiển vi
cố định , nhằm mục đích :
+ Nghiên cứu những chi tiết cấu tạo mà với tiêu bản sống không thể quan sát
được đặc biệt là những cấu trúc ở mức độ mô hay tế bào .
+ Với tiêu bản cố định có thể bảo quản mẫu vật trong khoảng thời gian dài
thuận lợi cho việc học tập và giảng dạy .
Để thực hiện được tiêu bản hiển vi cố định cần phải được tiến hành theo
một chuỗi kỹ thuật liên hoàn như sau :

2.1.1. Thu mẫu vật :
2.1.1.1. Giun đũa heo (A. suum ) : sống ký sinh ở ruột non của heo . Mẫu vật
được thu ở các lò mỗ gia súc bằng cách mỗ dọc phần ruột non của heo và tìm nhặt
giun đũa.

2.1.1.2 Giun đất ( Pheretima .sp ):
Ở Việt Nam giống Pheretima thường gặp ở nhiều nơi , gồm nhiều loài .
Giun
đất
sống
chui rúc
đất Thơ
ẩm nhiều
.Giun
đất là
động
có ích trong

Trung tâm Học liệu
ĐHtrong
Cần
@mùn
Tàirácliệu
học
tập
vàvậtnghiên
cứu
nông nghiệp , vì nó làm xốp đất , góp phần làm cho đất trở nên có cấu tượng và màu
mỡ .
Có thể tìm bắt Giun đất ở nơi đất thịt có nhiều mùn rác . Thường ở nơi
nào nhiều Giun đất thì đất ở đó trở nên tơi xốp hơn . Để có mẫu vật một cách chủ động
có thể tiến hành nhân nuôi chúng . Có thể xây bể gạch , trong bể cần cho nhiều chất
mùn , phân lá và tưới nước để giữ đất luôn ẩm ( không tưới quá nhiều làm đất bị ướt
sũng nước ). Giun đất có khả năng hình thành những phần cơ thể bị cắt mất . Cắt đôi
con giun rồi cho vào bể nuôi , sau khoảng thời gian 8 tháng đến 1 năm , mỗi nửa cơ thể
sẽ phát triển thành một con giun mới hoàn chỉnh . Bằng cách này cũng có thể làm gia
tăng số lượng giun dự trữ trong các bễ nhân nuôi .

2.1.2. Định hình :
Đây là giai đoạn có ý nghĩa quyết định trong quá trình làm tiêu bản cố định.

2.1.2.1. Mục đích :
Tất cả các phương pháp định hình đều nhằm mục đích chính là giết chết
nhanh tế bào và mô của cơ thể con vật nhằm cố định tất cả các cấu trúc của nó như
trong trạng thái sống và giữ cho chúng không tiếp tục bị phá hủy .Ngoài ra các phương
pháp định hình còn phải bảo đảm sao cho mẫu vật không hình thành nên những cấu
trúc mới và không gây khó khăn cho hàng loạt những quá trình chấn chỉnh trong khi
làm tiêu bản về sau (Thanh ; 1980).

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

2

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

2.1.2.2. Nguyên tắc định hình :
Mẫu vật khi định hình phải theo các nguyên tắc :
- Định hình nhanh : tức là mô , một bộ phận cơ thể hay cả cơ thể con vật sau
khi vừa được tách ra là phải cho ngay vào dung dịch định hình . Nếu vì lý do nào đó
chưa định hình được thì phải ngâm ngay mẫu vật vào dung dịch sinh lý . Đối với các
mẫu vật có kích thước lớn thì cần thiết phải tiêm thuốc định hình vào bên trong rồi mới
ngâm vào dung dịch định hình . Đối với những mẫu vật có xoang cơ thể rỗng ở trong
phải tiêm thuốc định hình vào đầy xoang trước để tránh mẫu không bị nhăn nhúm khi
ngâm vào dung dịch định hình .
- Thể tích của dung dịch định hình phải lớn hơn thể tích của mẫu vật từ 20-30
lần . Bề mặt của mẫu vật phải được tiếp xúc đồng đều với chất định hình , vì thế nếu
mẫu vật nổi thì có thể ghim vào một tấm cao su hay gỗ nhỏ rồi ngâm lật úp vào trong
dung dịch định hình . Nếu mẫu vật chìm sát dưới đáy thì cần phải lót ở đáy lọ một lớp
bông thủy tinh rồi để mẫu vật lên trên .
Sau khi định hình mẫu vật cần được rữa sạch trong nước hay trong cồn tùy theo
từng loại thuốc định hình . Nếu mẫu vật chưa làm tiêu bản được ngay thì có thể lưu trữ
lâu dài trong cồn 700 (Thanh , 1980 ).

2.1.2.3. Một số chất định hình thường dùng :
+ Nước Bouin :
Dung dịch nước bão hòa acid picric 75 ml

Formol
20 mlliệu học tập và nghiên cứu
Trung tâm Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài
Acid acetic
5 ml
( Hoè , 1976 )
+ Dung dịch Boanh ( Bouin ) là chất định hình rất tốt , được dùng phổ biến
để định hình trong thực hiện tiêu bản lát cắt của nhiều loại động vật khác nhau .
Thành phần : gồm dung dịch acid picric bão hòa : 15 phần ; formalin
nguyên chất : 5 phần ; acid acetic : 1 phần .
+ Dung dịch Carnau (Carnoy ) gồm cồn 1000 : 6 ml ; chloroform : 30 ml ;
acid acetic đặc : 10 ml . Dung dịch pha trước khi dùng .
Sau khi định hình rữa mẫu vật trong cồn 1000 . Dung dịch định hình này
xuất hiện rất nhanh trong mẫu vật nên thường dùng để định hình những mẫu vật có vỏ
cứng ít thấm như côn trùng , giun (Thanh , 1980 ).
+ Dung dịch Bouin :
Acid picric bão hòa
40% formaldehyd
Acid acetic

75 ml
25 ml
5 ml

+ Dung dịch Carnoy và Lebrun :
Cồn tuyệt đối
Acid acetic
Chloroform
HgCl2

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

33 ml
33 ml
33 ml
tới bão hòa (khoảng 25g )
3

( Gray , 1968 )
SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

2.1.2.4. Tiêu chuẩn của một chất định hình tốt :
- Ngấm nhanh vào tổ chức , giết nhanh tế bào .
- Bảo toàn hay chỉ làm thay đổi rất ít những cấu trúc cơ bản của tổ chức tế
bào , chống lại sự tiêu hủy do men nội bào , nhất là làm cho protein thành axit amin .
- Những thành phần của tế bào cần tìm không được hòa tan , không những
chịu được những khâu tác động của các khâu kỹ thuật về sau mà còn chuẩn bị tốt cho
các khâu kỹ thuật ấy .
- Không làm cho tổ chức , tế bào và những thành phần của chúng bị méo
mó , biến dạng , nhất là không sinh ra những hình giả tạo ( Gray , 1968 ).

2.1.2.5. Thời gian định hình thích hợp :
Thời gian định hình phải được lựa chọn tùy theo mục đích , đối tượng
nghiên cứu và chất định hình . Định hình quá lâu hoặc quá nhanh đều không có lợi cho
việc làm tiêu bản sau này , đặc biệt là tiêu bản lát cắt .(Thanh , 1980 ).
- Rất khó qui định cụ thể vì thời gian này phụ thuộc vào loại mẫu vật , độ dày
mẫu vật , vận tốc xuyên thấm và vận tốc cố định của dung dịch cố định , nồng độ dung

dịch cố định … Ngay đối với một dung dịch cố định đã biết kinh nghiệm của các tác
giả cũng không thống nhất về thời gian cố định .
- Thông thường những mẫu vật cố định trong dung dịch Bouin theo những
yêu cầu đã nêu trên cần được ngâm trung bình từ 1 đến 3 ngày .

Trung tâm Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
- Hậu quả của những thiếu sót trong kỹ thuật cố định là mẫu vật bị “sống”
hoặc “ chín quá ” .
+ Mẫu “sống” thường mềm , tổ chức bị thoái hóa hoại tử dễ sinh ra
những tổn thương và hình giả tạo . Khi nhuộm bắt màu tồi . Mẫu quá dày thời gian cố
định ngắn , dung dịch cố định không đủ lượng , lại đã dùng nhiều lần v.v…sẽ làm cho
mẫu bị “ sống” .
+ Trái lại mẫu quá “ chín” quá cứng chắc , giòn khi cắt . Dù cẩn thận khi
cắt mảnh nó vẫn bị vỡ hoặc dễ nát và khi nhuộm tính bắt màu cũng giảm rõ , nhân tế
bào dễ bị nhăn nhúm . Mẫu quá “chín” do thời gian cố định quá dài (Hoè, 1976).

2.1.3. Phương pháp làm tiêu bản lát cắt :
Khi cần nghiên cứu cấu trúc cơ thể hoặc một cơ quan của loài sinh vật nào
người ta thường làm tiêu bản lát cắt . Hiện nay có nhiều phương pháp làm tiêu bản lát
cắt như phương pháp cắt lạnh , phương pháp cắt mẫu trong cenloidin , trong gelatin…
phương pháp thông dụng là cắt mẫu trong paraffin . Có thể chia quá trình cắt mẫu
trong paraffin thành 3 giai đoạn .

2.1.3.1. Chuẩn bị mẫu và đúc mẫu :
Sau khi định hình , mẫu vật cần được rữa sạch bằng cồn hoặc nước cất
và rút thật hết nước bằng cồn có nồng độ tăng dần 400_ 700 – 960 – 1000 (2 lần ). Đối
với các mẫu vật mềm nên dùng cồn với nồng độ tăng dần dần 400- 500- 600- 700- 800900-1000. Thời gian ngâm mẫu trong mỗi loại cồn thay đổi từ 20 phút đến 2 giờ ; tùy
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín


4

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

thuộc vào tính chất của mẫu vật . Sau khi rút hết nước thì chuyển mẫu vật sang một
chất trung gian như : xylen , toluen hay benzen, chloroform , v.v…
Trước khi cho mẫu vật vào chất trung gian nên chuyển qua hỗn hợp cồn chất trung gian ( tỉ lệ 1:1 ) . Thời gian ngâm mẫu trong chất trung gian thay đổi từ 20
phút đến 2 giờ tùy thuộc vào tính chất và kích thước mẫu vật . Sau đó chuyển mẫu vật
vào lọ có nắp kín chứa paraffin và chất trung gian rồi cho vào tủ ấm và giữ nhiệt độ
370C trong khoảng 2 đến 12 giờ . Bước tiếp theo là chuyển mẫu vật sang lọ chứa
paraffin nguyên chất nóng chảy giữ trong tủ sấy với nhiệt độ bằng nhiệt độ nóng chảy
của paraffin (55- 560C) từ 1 đến 2 ngày . Nên đổi paraffin 2 lần .
Để đúc mẫu trong paraffin cần có các khuôn đúc bằng kim loại , bằng dĩa
kính hay bằng giấy bóng mờ. Tốt nhất là nên gấp những khuôn đúc bằng giấy bóng mờ
có kích thước thích hợp với từng loại mẫu vật .
Paraffin nóng chảy được đổ vào các khuôn cho vừa đầy hoặc cũng có thể
pha thêm từ 5 – 10 % sáp ong , tùy thuộc vào điều kiện thời tiết . Dùng kẹp đã hơ nóng
điều chỉnh cho mẫu vật ngay ngắn .

2.1.3.2. Cắt mẫu :
Để có được lát cắt đúng tiêu chuẩn cần có máy cắt microtome.
Trước khi cắt cần chuẩn bị đầy đủ những dụng cụ cần thiết . Dung dịch dán
lát cắt như hỗn hợp albumin và glycerin . Có thể sử dụng hỗn hợp này theo 2 cách :
+ Nhỏ một giọt hỗn hợp lên trên lame rồi dùng ngón tay sạch quệt nhiều

Trung lần
tâm

Học
liệu
Cần, sau
Thơ
@một
Tàigiọt
liệu
tập
nghiên
cứu
để tạo
thành
mộtĐH
lớp mỏng
đó nhỏ
nướchọc
lên rồi
đặt và
lát cắt
vào .
+ Pha một giọt hỗn hợp với 4 ml nước cất , sau đó nhỏ một giọt dung
dịch này lên lame và đặt lát cắt lên trên .
Đặt lame vào tủ sấy với nhiệt độ 500C . Khi nước đã bay hết , sấy với
nhiệt độ 37-400C tối thiểu là 24 giờ rồi sau đó tiến hành nhuộm .

2.1.3.3. Nhuộm và gắn tiêu bản :
Tùy theo đối tượng , mục đích nghiên cứu và chất định hình đã dùng mà lựa
chọn các loại thuốc nhuộm cho thích hợp .Tuỳ theo nguồn gốc mà các loại thuốc
nhuộm được chia thành 3 nhóm là : nhóm có nguồn gốc từ thực vật , nhóm có nguồn
gốc động vật và nhóm được tổng hợp bằng phương pháp hóa học . Theo tính chất hóa

học người ta cũng chia thuốc nhuộm thành 3 loại : thuốc nhuộm axít , thuốc nhuộm
bazờ và thuốc nhuộm trung tính . Thuốc nhuộm được pha trong cồn hay nước cất .
Có hai phương pháp nhuộm là : nhuộm tiến và nhuộm lùi .
+ Phương pháp nhuộm tiến : Thuốc nhuộm được pha với nồng độ loãng
và quá trình nhuộm diễn ra tư từ trong khoảng thời gian từ một vài phút cho tới khi các
cấu trúc của m ẫu vật bắt màu rỏ là được.
+ Phương pháp nhuộm lùi : là nhuộm lát cắt trong thuốc nhuộm có nồng
độ cao nên bắt màu đậm hơn mức cần thiết . Sau đó tiến hành biệt hóa trong các chất
riêng biệt để nhận được màu thích hợp . Thực chất của vấn đề này là do một số cấu
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

5

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

trúc của mô và tế bào có khả năng bắt màu thuốc nhuộm như nhau nhưng khi nhã màu
trong các chất biệt hóa lại xảy ra với tốc độ khác nhau nên lát cắt trở nên rỏ nét hơn
trên tiêu bản . Trước khi nhuộm lát cắt cần được giải phóng khỏi paraffin bằng cách
như sau :
- Ngâm tiêu bản vào xylen ( hay trong các dung môi tương tự như : toluen ,
benzen ) 3-5 phút .
- Rút xylen ra khỏi lát cắt bằng cách ngâm tiêu bản vào cồn tuyệt đối 2-3 phút .
- Chuyển tiêu bản sang các dung dịch cồn có nồng độ giảm dần từ từ 960 - 700 400 (mỗi loại 2 phút ).
- Tráng tiêu bản bằng nước cất 1 phút .
- Nhuộm tiêu bản bằng loại thuốc nhuộm thích hợp chẳng hạn như
Hematoxylin, Eosin…
- Rút nước trong lát cắt đã được nhuộm bằng cách ngâm tiêu bản trong cồn có

nồng độ tăng dần 400 (1 phút ), 700 ( 2 phút ), 960 ( 2 phút), 1000 ( 3-5 phút ).
- Ngâm tiêu bản vào hỗn hợp dung dịch xylen – phenol để rút kiệt nước .
- Làm trong tiêu bản trong xylen 3-5 phút .
- Gắn tiêu bản bằng keo gắn Canada và sấy khô trong tủ sấy với nhiệt độ 400

50 C.

Trung tâm HọcToàn
liệubộĐH
Thơ
@ làTài
họctrong
tậpcácvàcốcnghiên
quá Cần
trình trên
tốt nhất
nên liệu
thực hiện
thủy tinh cứu
có
dạng hình trụ cao từ 11-12 cm , đường kính khoảng 4 cm và có nắp đậy kín .

1. Lọ dạng hình trụ

2. Lọ dạng hình chữ nhật

Hình : Các dạng lọ nhuộm
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

6


SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

Khi nhuộm có thể dùng một loại thuốc nhuộm gọi là nhuộm đơn , có thể
dùng phối hợp 2 hay một số thuốc nhuộm gọi là nhuộm kép .Trong đó phương pháp
nhuộm kép có nhiều ưu việt hơn cho thấy rỏ nét hơn các cấu trúc của tiêu bản .
Nhuộm 2 màu Hematoxylin - Eosin:
Đây là phương pháp thông thường và phổ biến nhất được dùng để nhuộm
lát cắt .
Các tiêu bản lát cắt sau khi được giải phóng paraffin và ngâm vào cồn có
nồng độ thấp dần được đem nhuộm theo tuần tự như sau :
- Nhuộm hematoxylin từ 3 đến 45 phút tùy theo loại thuốc dùng và tính chất
của tiêu bản.
- Rữa kỹ tiêu bản trong nước chảy cho đến khi tiêu bản có màu xanh .
- Có thể biệt hóa vài giây trong cồn : axít clohydric (HCl) loãng .
- Tráng nước cất.
- Nhuộm Eosin từ 2 đến 4 phút.
- Rữa nước từ 3 dến 4 phút.
- Rút nước và làm trong rồi gắn tiêu bản trong keo gắn Canada.(Thanh ;1980)

2.2. Phương tiện :

Trung tâm
HọcDụng
liệucụ
ĐH
2.2.1.

: Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
- Becher
- Bếp
- Bộ đồ mỗ
- Kính hiển vi
- Lame
- Lammelle
- Pipet
- Ống đong
- Phễu thủy tinh
- Máy cắt vi mẫu (microtome)
- Hộp đựng tiêu bản
- Khay đựng tiêu bản
- Cân
- Tủ sấy
- Khay đựng mẫu
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

7

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

- Giấy cứng
- Giấy lọc
- Lưỡi lam Gillette
- Lọ có nút vặn
- Tủ lạnh


2.2.2. Hóa chất :
- Sodium chlorua
- Picric acid
- Formalin
- Glacical acetic acid
- Paraffin
- Paraflast
- Nước cất
- Amonium acetate
- Chloroform
- Albumin

Trung tâm -Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Glycerin
- Xylene
- Methanol
- Amonium alum
- Hematoxylin
- Sodium bicarbonate
- Chloric acid
- Eosin B
- Baume canada
- Phenol
- Sulfuric acid
- Anhydrous copper sulfate
- Bicromate kali
- Eosin Y
- Glacical alcohol

- Mecuric chloric
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

8

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

- Potassium iodide
- Iodine
- n – Butanol
- Sáp ong

2.2.3. Mẫu vật :
- Giun đũa heo ( A . suum )
- Giun đất ( Pheretima .sp )

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

9

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp


3. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI :

3.1. Chọn và thu mẫu :
3.1.1. Giun đũa heo (A . suum) :
Mẫu vật được thu tại lò giết mỗ gia súc (xưởng chế biến thực phẩm 1)
trực thuộc Công ty Thương Mại Tổng Hợp Cần Thơ Số 1 – Ngô Quyền .
Thời gian thu mẫu từ 12 giờ đêm đến 4 giờ sáng.
Sau khi thu , mẫu được rữa sạch rồi cho vào dung dịch sinh lý đã chuẩn
bị sẵn .

3.1.2.

Giun đất (Pheretima .sp ) :

Thường thu ở nơi đất xốp , nhiều mùn . Việc thu mẫu Giun đất vào mùa
mưa thường thuận lợi hơn nhiều so với thu mẫu trong mùa nắng . Vì mùa mưa đất ẩm ,
mùn ẩm dễ tìm thấy Giun đất ở lớp đất mặt không sâu và dễ đào . Mùa nắng đất khô
Giun đất chui rúc xuống lớp đất sâu bên dưới , nơi vùng trũng ẩm hoặc bề mặt phủ đầy
cỏ , mùn , rác . Một số Giun đất có ở cạnh các bờ mương nơi đất ẩm ướt .
Khi đào Giun đất ta dùng len đào thành tảng đất lớn , sau đó bẻ ra tìm
Giun đất . Mục đích là tránh làm tổn thương thuận tiện cho việc nuôi làm sạch phân .
chọnliệu
những
con tập
có kích
lớn , còn
Trung tâm HọcChọn
liệumẫu
ĐH: thông
Cầnthường

Thơ ta@nênTài
học
vàthước
nghiên
cứu
mạnh để khi làm sạch phân giun không bị chết .

3.2. Định hình :
3.2.1. Chuẩn bị mẫu trước khi định hình:
3.2.1.1. Giun đất :
Trước khi định hình ta phải làm thật sạch phân trong ruột của nó . Có 2
cách làm sạch phân trong ruột Giun đất :
* Cho giun bò trên giấy thấm có đủ độ ẩm , phải thay giấy hằng ngày cho
đến khi giun thải hết phân , đồng thời giấy thấm cũng hút sạch hết chất nhờn bên ngoài
cơ thể Giun đất . Cách này tốn công và cần có thời gian tương đối dài, nhưng có ưu
điểm là vẫn giữ được trạng thái tự nhiên của Giun đất .
* Cầm giun ở phần đầu , phần đuôi để buông thỏng , dùng hai ngón tay
cái và trỏ của tay còn lại vuốt nhẹ dọc theo cơ thể Giun đất từ đầu đến đuôi cho phân
thải ra từ từ . Tránh đừng để giun chết . Lặp lại nhiều lần đến khi thấy toàn thân con
vật hơi trong suốt , từ màu xám ngã sang màu đỏ hồng thì dừng lại . Lúc đó ruột Giun
đất đã sạch phân . Cách này có nhược điểm là dù có vuốt nhẹ tay đi nữa nhưng cũng
làm cho nội quan của con vật bị xáo trộn và dễ tổn thương do sự cọ sát giữa tay và
thân Giun đất , đồng thời cũng có sự cọ sát giữa đất và thành ruột gây nên . Cách này
làm nhanh nhưng kết quả không tốt bằng cách trên .

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

10

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi



Luận văn tốt nghiệp

* Sau khi làm sạch phân trong ruột Giun đất đến mức tối đa , ta để giun
bò trên giấy thấm vài giờ để hút sạch chất nhờn rồi đem định hình ngay . Điều tối kỵ là
tránh để giun chết .

3.2.1.2. Giun đũa :
Sau khi thu mẫu ở lò mỗ gia súc về ta rữa mẫu thật sạch bằng nước máy
và bắt đầu định hình ngay .

3.2.2. Kỹ thuật định hình :
Đối với Giun đũa và Giun đất do có xoang cơ thể nên trước khi ngâm vào
dung dịch định hình cần phải bơm dung dịch định hình vào xoang để tránh mẫu không
bị nhăn nhúm .Và riêng đối với Giun đất do cơ thể mềm dễ uốn éo , co giãn nên trước
khi định hình cần cố định trên tấm cao su bằng cách ghim kim gút ở đầu và đuôi .

3.2.3. Thời gian định hình :
Chất định hình dùng cho Giun đũa heo và Giun đất ở đây là dung dịch
Bouin, Carnoy- Lebrun ( Cách pha phần phụ lục ) .
+ Định hình bằng dung dịch Bouin :
-

Đối với Giun đũa heo định hình trong : 3 giờ
Đối với Giun đất định hình trong : 5 giờ

Định hình
dung
dịch @

Carnoy
Lebrunhọc
:
Trung tâm Học+ liệu
ĐHbằng
Cần
Thơ
Tài– liệu
tập và nghiên cứu
-

Đối với Giun đũa heo định hình trong : 2 giờ
Đối với Giun đất định hình trong : 3 gi ờ

3.2.4. Rữa chất định hình (Thao tác phụ sau khi cố định):
Việc cố định mẫu vật bằng dung dịch Bouin , Carnoy – Lebrun có thể
làm sai khác cấu trúc mẫu vật nên phải rữa sạch để loại đi chất định hình có trong mẫu
. Tuy nhiên việc rữa này thì không đơn giản trong trường hợp chất định hình chứa
mercuric chloric (HgCl2 ) hoặc picric acid .
+ Bouin :Những mô được định hình trong dung dịch này thì có màu sáng chói
của picric acid . Tất cả những màu vàng sáng chói này không thể loại đi do nó đã hình
thành nên một cấu trúc phức tạp với protein .
Phương pháp để loại màu vàng ra khỏi mẫu là ngâm mẫu vật vào dung
dịch Lenoir ( cách pha phần phụ lục ). Với dung dịch này thì hầu hết picric acid được
loại ra khỏi mẫu vật rất tốt .
Sau đó rữa mẫu vật bằng nước máy và tráng lại bằng nước cất .
+ Carnoy – Lebrun : HgCl2 hiện diện lâu dài với những tinh thể nhỏ trong mô .
Những tinh thể nhỏ này có thể được ngăn chặn bằng cách ngâm mẫu vật sau khi định
hình qua đêm vào trong dung dịch Lugol ( Cách pha phần phụ lục ) .


GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

11

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

Sau khi mẫu được ngâm trong dung dịch Lugol qua đêm sẽ được chuyển tới
cồn 700 cho đến khi mẫu không còn màu trôi ra nữa . Mẫu vật được xử lý như vậy sẽ
không bao giờ thấy những tinh thể nhỏ hiện diện khi định hình bằng dung dịch
Carnoy – Lebrun .

3.3. Đúc khuôn :
3.3.1. Mục đích :
Cố định chỉ mới giết chết tế bào và giữ cho những thành phần của nó được
bất động trong tình trạng tĩnh . Nếu mẫu vật cố định đem cắt mỏng ngay , mối liên hệ
giữa tế bào và tổ chức cũng như cơ cấu của tế bào sẽ bị thay đổi biến dạng , thậm chí
đảo lộn do tác động cơ học của lưỡi dao và mẫu vật . Do đó đúc khuôn tạo thuận lợi
cho việc cắt mẫu và đảm bảo cấu trúc của tổ chức không bị xáo trộn khi cắt thành lát .

3.3.2. Môi trường tẩm :
Để giải quyết khuyết điểm trên , cần phải có một chất làm nền cho mẫu
vật , vừa như một cái khuôn giữ vững mẫu vật , vừa thâm nhập được vào trong tế bào ,
giữ cho các thành phần của tế bào cũng như của tổ chức được yên vị khi cắt mảnh , đó
là sự tẩm . Như vậy , tẩm không chỉ là một sự bọc đơn thuần mà chính là một sự tẩm
thực sự vào trong tổ chức thuộc lĩnh vực tế bào .
Chất tẩm tốt phải có mật độ thích hợp và dễ ngấm . Mật độ có đủ chắc thì
làm khuôn mới cứng , cố định mới chặt , nhưng đồng thời cũng phải đủ mềm thì dao

mới dễ cắt . Muốn ngấm tốt thì chất tẩm phải có một thời gian được xử lý ở trạng thái
Trung lỏng
tâm. Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Như vậy là một chất tẩm phải vừa chắc vừa mềm , vừa đặc ,vừa lỏng khi
cần.
Mỗi chất tẩm đều có những ưu điểm và những hạn chế nhất định . Ở đây ,
dùng chất tẩm là paraffin và đây cũng là chất tẩm thông dụng nhất trong khi cắt mẫu .
Paraffin là một chất dễ tìm , có mật độ rất thích hợp nhưng lại không hòa
tan trong nước . Vì vậy , mẫu vật phải được xử lý nước trước khi tẩm paraffin.

3.3.3. Khử nước mẫu vật :
Mẫu vật sau khi định hình và rửa kỷ được cắt thành từng đoạn ngắn dài
khoảng 2cm trở lại . Sau đó cho vào cồn để rút kiệt nước . Tuy nhiên , nếu để ngay
vào cồn cao độ do mất nước đột ngột , nhanh chóng sẽ gây tác hại là làm sụp đỗ các
xoang cơ thể dẫn đến sự méo mó mẫu vật . Do đó ta cần cho mẫu vật lần lượt vào các
lọ cồn có nồng độ tăng dần để rút nước từ từ .
+ Mẫu vật định hình trong dung dịch Bouin :
-

Cồn 300 x 1 giờ

-

Cồn 300 x 1 giờ

-

Cồn 500 x 1 giờ

-


Cồn 500 x 1 giờ

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

12

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp
0

-

Cồn 70

x 1 giờ

-

Cồn 700 x 1 giờ

-

Cồn 960 x 1 giờ

-

Cồn 96 x 1 giờ


-

Cồn 1000 x 2giờ

-

Cồn 1000 x 2giờ

hoặc

n- Butanol x 2 giờ
n- Butanol x 2 giờ

+ Mẫu vật định hình trong dung dịch Carnoy – Lebrun :
-

Cồn 700 x 1 giờ

-

Cồn 700 x 1 giờ

-

Cồn 960 x

1 giờ

-


Cồn 960 x

1 giờ

-

Cồn 1000 x

2 giờ

-

Cồn 1000 x 2 giờ

hoặc

n- Butanol x 2 giờ
n- Butanol x 2 giờ

+ Việc rút nước có ảnh hưởng rất quan trọng đến khả năng ngấm paraffin về
sau của mẫu vật nên thể tích cồn trong từng lọ phải gấp 20 – 30 lần thể tích mẫu vật để
tránh làm loãng cồn .
+ Khi chuyển mẫu cần cho mẫu lên giấy thấm để thấm bớt nồng độ cồn cũ

Trung nhằm
tâmhạn
Học
ĐHnồng
Cần

Thơ
chế liệu
làm giảm
độ cồn
mới@
. Tài liệu học tập và nghiên cứu
+ Trên thị trường cồn tuyệt đối (9905) nên việc loại bỏ nước được thực hiện
bằng cách dùng sulfate đồng (CuSO4 ).

3.3.4. Tẩm paraffin :
Vì paraffin không tan trong nước và cồn nên trước khi tẩm paraffin , cho
mẫu vật vào lọ đựng chất dung môi trung gian vừa làm tan paraffin vừa tan trong cồn ,
chẳng hạn như : xylene , toluen , benzen , chloroform , …
Giun đũa , Giun đất là những mẫu vật tương đối nhỏ và mềm nên ở giai
đoạn này ta sử dụng dung môi trung gian là chloroform .
Khi chuyển mẫu vật sang chloroform nếu thấy hiện tượng đục thì chứng
tỏ mẫu vật chưa được rút hết nước . Khi đó cần phải xử lý rút nước thêm một lần nũa .
Cách tốt nhất là trước khi cho mẫu vật vào chloroform nên chuyển qua lọ đựng hỗn
hợp cồn tuyệt đối : chloroform (tỉ lệ 1:1) .Thời gian ngâm là 1 giờ .
Sau đó , ngâm mẫu trong chloroform , 10 giờ .
Chuyển mẫu sang lọ có nắp kín đựng hỗn hợp paraffin : chloroform (tỉ lệ
1:1) .
Cho lọ vào tủ sấy và giữ ở nhiệt độ 370C trong khoảng thời gian là 12 giờ
.
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

13

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi



Luận văn tốt nghiệp

Chuyển mẫu sang lọ đựng paraffin nóng chảy giữ trong tủ sấy nhiệt độ
khoảng 600C để paraffin nóng chảy , thời gian ngâm mẫu là 24 giờ . Các lọ đựng mẫu
này cần phải để hở nắp cho chloroform bay hơi hết .
Thay paraffin mới và tẩm mẫu trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ vẫn là
khoảng 600C.
• L ưu ý :
+ Chọn loại paraffin tốt đó là paraffin đặc , chắc , màu trắng đục và có óng
ánh dẽo dễ cắt . Lọc paraffin bằng phễu thủy tinh có lót giấy lọc để trong tủ sấy ở nhiệt
độ khỏang 650C để lấy paraffin tinh khiết . Vì paraffin hơi cứng nên khi sử dụng có thể
pha thêm 10 – 15 % sáp ong để pataffin mềm dẽo hơn , thuận lợi cho việc cắt mẫu .
+ Giữ nhiệt độ tủ sấy tương đối ổn định , tránh để nhiệt độ quá cao khi tẩm
mẫu , sẽ làm cho mẫu vật bị nóng giòn gây rất nhiều khó khăn cho việc cắt mẫu sau
này .
+ Có thể sử dụng paraflast thay thế cho paraffin , nhưng khi sử dụng dể việc
cắt mẫu được dễ dàng cần pha thêm khỏang 5% sáp ong .

3.3.5.

Đúc mẫu :
+ Xếp khuôn đúc :
Để đúc được mẫu ta cần phải có các khuôn đúc .
Dùng giấy bìa cứng (không màu ) xếp thành các khuôn có kích thước ( 3

Trung tâm
Học
ĐH
Cần

cm x 1,5
cm xliệu
1,5 cm
) như
hìnhThơ
vẽ : @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Mẫu giấy khuôn xếp

Cách xếp
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

14

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

Khuôn xếp
+ Tiến hành đúc mẫu :
Đặt khuôn lên bề mặt cục nước đá để làm lạnh khuôn . Đổ paraffin đã
chuẩn bị sẵn trong tủ sấy vào các khuôn đúc cho vừa đầy . Chờ cho 1/3 paraffin từ đáy
khuôn trở lên đặc lại . Dùng kẹp đã được hơ nóng trên ngọn đèn cồn gắp mẫu vật
ngâm trong paraffin nóng chảy đặt nhanh vào ngay giữa khuôn đúc . Không nên để
mẫu lâu ngoài không khí sẽ làm cho lớp paraffin mỏng bao quanh mẫu đông lại ngăn
cách mẫu với khối paraffin trong khuôn đúc . Nếu mẫu không ngay ngắn ta dùng kim
mũi nhọn đã hơ nóng điều chỉnh mẫu vật lại . Khối paraffin sẽ từ từ đông lại trong thời
gian này không được đụng chạm , xoay chuyển khuôn đúc để tránh sai lệch mẫu trong
khối paraffin .

Khi đúc mẫu xong , khối mẫu được dự trữ trong tủ lạnh . Sau 24 giờ tiến hành
cắt mẫu .

Trung tâm
liệu :ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.4. Học
Cắt mẫu
3.4.1. Mục đích :
Muốn quan sát cấu tạo lát cắt ngang cơ thể mẫu vật dưới kính hiển vi , ta phải
cắt chúng thành những lát rất mỏng gọi là vi mẫu . Bề dày của lát cắt chỉ nên gồm vài
lớp tế bào và phải trong suốt để ánh sáng có thể xuyên qua .

3.4.2. Thao tác :
~ Chuẩn bị :
Trước khi cắt chuẩn bị sẵn phương tiện và khối mẫu sẵn sàng .
+ Phương tiện :
Máy cắt : được tra lưỡi lam vào dao cố định .
Vài miếng gỗ nhỏ , kẹp, ống nhỏ giọt , bút lông , nước đá , nước ấm
(500C ) , đèn cồn , dao , v.v…
+ Khối mẫu :
Lấy khối paraffin có chứa mẫu ra khỏi khuôn.
Dùng dao gọt khối mẫu thành hình khối chữ nhật chứa mẫu ở giữa lớp
paraffin cách đều mẫu khoảng 3cm . Sau đó gắn khối mẫu vào miếng gỗ . Có 2 cách
gắn :

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

15

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi



Luận văn tốt nghiệp

- Gọt khối mẫu hình khối chữ nhật thành khối mẫu hình thang cân rồi gắn lên
khối gỗ .
- Gắn khối mẫu hình khối chữ nhật lên miếng gỗ rồi mới tiến hành gọt thành
hình thang cân .
Khi thực hiện thì cách thứ hai có lợi hơn vì paraffin dễ bị mềm khi nhiệt
độ cao . Nếu gọt trước thành khối có hình thang thì sẽ bị biến dạng khi hơ nóng và gắn
nó lên miếng gỗ . Do đó ta gắn khối paraffin lên miếng gỗ trước chờ cho paraffin cứng
lại mới gọt thành khối hình thang cân .
Để khối mẫu gắn chặt vào miếng gỗ ( bàn giữ khối mẫu ) ta hơ nóng mặt
đáy của khối mẫu và miếng gỗ đến khi paraffin bắt đầu chảy ra thì ép chặt mặt đáy
khối mẫu vào miếng gỗ ở tư thế vuông góc .
Dùng dao gọt khối mẫu thành hình thang cân , hai mặt đáy phải thật song
song nhau và lớp paraffin chỉ còn cách mẫu khỏang 2mm . Gắn miếng gỗ mang khối
mẫu vào .

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Hình : Chuẩn bị cắt mẫu

Hình : mẫu được cắt thành băng
~ Điều chỉnh máy cắt và tiến hành cắt mẫu :
+ Điều chỉnh độ nghiêng của dao theo 1 góc khoảng 15 - 200 .
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

16

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi



Luận văn tốt nghiệp

+ Đưa mẫu vật vào sát lưỡi dao , điều chỉnh sao cho mặt cắt của khối mẫu và
lưỡi dao song song nhau .
+ Điều chỉnh độ dày lát cắt từ 15 – 20 μm , quay đều tay , các lát cắt nằm ở
trên mặt dao sẽ tạo thành dải băng dài . Sau đó , điều chỉnh độ dày của lát cắt xuống 8
– 10 μm . Và bắt đầu hứng lấy các lát cắt về sau :

3.4.3. Tải mẫu lên lame :
~ Chuẩn bị :
+ Đối với lame mới chưa dùng thì chỉ cần rữa bằng nước máy , tráng qua một
lượt cồn rồi lau khô .
+ Nếu lame mới có nhiều vết bẩn thì cho vào dung dịch NaOH 1% đun sôi
một lúc . Sau đó rữa bằng nước máy có pha thêm một ít HCl loãng , cuối cùng rữa
bằng nước thường cho sạch hết acid rồi lau khô .
+ Cũng có thể chỉ ngâm vào dung dịch HCl 2% trong một giờ rồi rữa sạch
acid bằng nước máy , tráng lại bằng nước cất .
+ Đối với lame đã sử dụng rồi thì cần ngâm vào dung dịch Bicromate Kali
(cách pha phần phụ lục ) . Sau đó rữa bằng nước máy , tráng nước cất rồi lau khô .
+ Khi dã có lame sạch , khô , ta nhỏ một giọt dung dịch dán Albumin :
Glycerin (cách pha phần phụ lục ) lên lame và dùng một lame khác ép sát vào giọt keo
dán kéo dài theo chiều dọc của lame để dung dịch dán tráng đều trên mặt lame một lớp
Trung mỏng
tâm .Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
+ Cho lame vào tủ sấy , sấy khoảng một giờ ở nhiệt độ 500C để dung dịch dán
bám vào lame .
*Lưu ý : không nên tráng một lớp dày Albumin : Glycerin vì khi nhuộm dung dịch
này sẽ bắt màu và dơ mẫu vật .

~ Tiến hành :
Trên dải băng cắt ta chọn những mẫu tròn , nguyên vẹn , mỏng . Dùng lưỡi lam
cắt rời mẫu ra khỏi băng , dùng kẹp gắp mẫu đặt lên lame đã nhỏ sẵn một giọt nước ấm
khỏang 500C . Khi đó , lát cắt sẽ dãn ra , rồi để nghiêng lame cho nước chảy ra bớt .
Đặt lame lên khay cho vào tủ sấy , sấy một ngày ở nhiệt độ 500C để cho
nước bốc hơi đoạn băng sẽ dãn ra và dính vào lame . Không nên để nhiệt độ cao hơn vì
paraffin nóng chảy sẽ làm hỏng lát cắt .
Hạ nhiệt độ tủ sấy xuống 370C trong 24 giờ rồi tiến hành nhuộm mẫu.

3.5. Nhuộm mẫu :
3.5.1. Mục đích :
Để phân biệt rõ các cấu trúc của mẫu vật cần quan sát , vì các cơ quan bộ
phận trong cơ thể ở đây là các cấu trúc trên tiết diện cắt ngang ăn màu thuốc nhuộm
khác nhau.
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

17

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

3.5.2. Phương pháp nhuộm :
~ Các giai đoạn trong quá trình nhuộm mẫu :
+ Chuẩn bị :
- 3 lọ xylen
- 3 lọ cồn 960
- 3 lọ cồn 700
- 3 lọ cồn 500

- 3 lọ cồn 300
- 4 lọ nước cất
- 1 lọ hematoxylin
- 1 lọ HCl 0,1% trong cồn 700
- 1 lọ NaHCO3 1% trong nước máy
- 1 lọ Eosin B
- 1 lọ Eosin Y
- 1 lọ phenol : xylen
- 1 lọ Baume canada

Trung tâm- 1Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
đèn cồn
- Giấy thấm hoặc giấy vệ sinh
- Đồng hồ
- Kính hiển vi
- Lame đã tải mẫu
- Lammelle
- Một lọ cồn tuyệt đối
- Kẹp
- Khay đựng lame
- Khăn
- Băng keo
+ Các giai đoạn thực hiện :
Vì mẫu được tẩm và bao bọc trong paraffin nên trước khi nhuộm phải làm tan
paraffin loại chúng ra khỏi lát cắt
. Loại paraffin

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín


18

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

Lấy tiêu bản đã được sấy trong tủ sấy ra hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho paraffin
hơi chảy ra rối ngâm vào xylen (I) để paraffin loại ra khỏi lát cắt . Giai đoạn này thực
hiện trong 15 phút .
* Lưu ý : Để thuận tiện cho việc nhuộm liên tục ta cần đánh số vào tiêu bản .
-

Chuyển qua lọ xylen (II) ngâm trong 10 phút để làm trong và sạch tiêu bản .
. Rút xylen:

-

Ngâm tiêu bản vào cồn tuyệt đối trong 5 phút
. Nhuộm kép Hematoxylin – Eosin :
§ Nhuộm Hematoxylin :

Vì thuốc nhuộm hematoxylin ( cách pha phần phụ lục ) được pha trong
nước cất nên phải làm cho lát cắt ngấm nước trước khi nhuộm bằng cách :
- Chuyển tiêu bản từ cồn tuyệt đối sang các nồng độ cồn giảm dần : 960 – 700 –
50 – 300 , mỗi lọ 2 phút .
0

- Ngâm nước cất 1 phút .
- Nhuộm hematoxylin 1 phút , tiêu bản có màu tím đỏ .

- Rửa tiêu bản trong nước máy .

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
- Dùng khăn lau bớt hematoxylin bám xung quanh mẫu , tránh chạm mẫu làm bễ

mẫu .
- Ngâm tiêu bản trong nước cất 1 phút.
- Biệt hóa tiêu bản trong cồn 700 - HCl loãng (0,1%) , 5 giây (tùy theo độ mỏng
dày của lát cắt mà có thể tăng hoặc giảm thời gian biệt hóa ). Tiêu bản ngã sang màu
hồng đỏ
.
- Rữa tiêu bản trong nước máy chứa 1% Sodium bicarbonate , tiêu bản chuyển
từ màu hồng đỏ sang màu tím xanh và rữa cho đến khi không còn màu trôi ra nữa .
§ Nhuộm Eosin :
Vì thuốc nhuộm Eosin (cách pha phần phụ lục ) là thuốc nhuộm tương phản
dùng với thuốc nhuộm hematoxylin để làm nổi rỏ thuốc nhuộm chính, từ đó làm cấu
trúc mẫu vật rỏ nét hơn .
Thuốc nhuộm Eosin được pha trong cồn nên trước khi nhuộm phải ngâm tiêu
bản vào loạt cồn có nồng độ tăng dần .
Sau khi rữa tiêu bản trong nước máy chứa 1% sodium bicarbonate , ngâm
vào nước cất 1 phút .
Ngâm tiêu bản vào trong loạt cồn có nồng độ tăng dần : 300 –500 – 700 – 96 0,
mỗi lọ 2 phút .
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

19

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi



Luận văn tốt nghiệp

Nhuộm Eosin B 10 phút / Eosin Y 5 phút .
Rữa tiêu bản trong nước máy đến khi không còn màu trôi ra nữa .
Tráng tiêu bản bằng nước cất 1 phút .

*Lưu ý :
+ Quá trình nhuộm được thực hiện trong các lọ thủy tinh có chiều cao bằng
hoặc hơn chiều dài của tấm lame và có nắp đậy kín . Mỗi lọ có ghi nhãn rõ ràng để
tránh nhằm lẫn .
+ Khi chuyển ta dùng kẹp gắp các tiêu bản từ lọ này đem đặt trên tờ giấy thấm
để hút bớt các chất còn bám trên lame , xong ngâm vào lọ khác .Nhằm tránh gây bẩn
tới mức tối đa ở các lọ mới . Nhưng một điều có tính chất nguyên tắc là không được để
tiêu bản khô ngoài không khí .
+ Sau khi dùng , đậy kín các lọ này lại để các lần sau có thể sử dụng lại . Sau
một thời gian khi các chất trong lọ bị bẩn thì phải thay các chất khác .

3.6. Khử nước , làm trong và dán mẫu :
3.6.1. Khử nước :
Sau khi nhuộm xong tiêu bản phải qua giai đoạn khử nước để rút kiệt
nước trong lát cắt vì phần lớn môi trường dán không thích hợp với nước . Đồng thời để
tiêuHọc
bản cốliệu
định ĐH
lâu dàiCần
khôngThơ
bị nổ tiêu
cố định.
Trung giữ
tâm

@ bản
Tàidán
liệu
học tập và nghiên cứu
Để tránh tiêu bản mất nước đột ngột ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào , cho
tiêu bản vào một lọat cồn có nồng độ tăng dần :300 – 500 – 700 – 960 , mỗi lọ 2 phút .
Ngâm tiêu bản vào hỗn hợp xylen : phênol (cách pha phần phụ lục ) để
rút kiệt nước . Dung dịch này hút nước rất mạnh . Có thể chuyển trực tiếp từ cồn 960
sang dung dịch này , thời gian ngâm 5 phút .

3.6.2. Làm trong :
Chất làm trong phải có tác dụng loại thải cồn , làm tan paraffin thích hợp
với dung dịch dán ( hòa tan dung dịch dán Baume canada ).
Do đó sau khi loại nước ra khỏi mẫu vật , ngâm tiêu bản trong xylen 10
phút . Đây là chất có tác dụng làm trong tiêu bản rất hữu hiệu và luôn được sử dụng
trong kỹ thuật làm tiêu bản cố định . Do xylen có chiết suất cao nên mẫu vật sau khi
làm trong thì trở nên tương phản và trong sáng hơn , giúp ta quan sát rỏ ràng các cấu
trúc của mẫu vật.
* Lưu ý:
Việc khử nước và làm trong là những khâu rất quan trọng trong việc thực hiện
những tiêu bản hiển vi cố định . Do đó phải lưu ý làm thật kỹ các khâu này nhằm hạn
chế gây thất bại về sau .

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

20

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi



Luận văn tốt nghiệp

3.6.3. Dán mẫu :
Sau khi đã thực hiện qua đầy đủ tất cả các giai đoạn trên ta tiến hành dán
mẫu , nhằm bảo vệ mẫu vật và tiện cho việc quan sát dưới kính hiển vi .
Mẫu được dán trong Baume canada . Đây là một loại chất nhựa được tiết
ra từ cây nhựa thơm Abies balsamea hoặc Abies fraseri … Baume canada là một chất
lỏng sánh , trong , màu hơi vàng . Để tiện cho việc dán được dễ dàng ta pha loãng
trong xylen ( cách pha phần phụ lục ).
Có hai phương pháp dán mẫu :
+ Nhỏ một giọt Baume canada lên tiêu bản có lát cắt , dùng ngón tay cái và ngón
trỏ cầm lammelle và đặt xuống lame , hợp với lame một góc 450 , hạ lammelle từ từ
xuống đến khi lammelle tiếp xúc với Baume canada thì buông tay ra ấn nhẹ cho
Baume canada tràn đều khắp các cạnh của lammelle và tràn ra ngòai khỏang 1mm .
Phương pháp này rất dễ bị bọt khí .
+ Nhỏ một giọt Baume canada lên lame có mẫu vật và một giọt lên lamelle . Sau
đó áp hai giọt này lại với nhau . Phương pháp này tránh được bọt khí .
Để khắc phục cách thứ nhất ta thực hiện các bước sau :
- Nhỏ hai giọt Baume canada lên lame cạnh mẫu vật.
- Đặt lammelle xuống chạm giọt Baume canada , sau đó chờ cho Baume
Canada tràn đều ra cạnh lamelle tiếp xúc với lame .

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
- Hạ lammelle từ từ xuống , đồng thời Baume canada tràn từ từ theo lamelle.
* Lưu ý :
-

Các thao tác trong khi dán mẫu phải nhẹ nhàng.

-


Hạn chế tối đa bọt khí trong mẫu .

- Sau khi làm trong phải dán tiêu bản ngay tránh để lâu ngoài không khí làm
mẫu bị khô .
- Sau khi dán sấy tiêu bản một tuần ở nhiệt độ 45 – 500C . Khi tiêu bản khô
hẳn thì lấy ra , dùng dao cạo bỏ lớp Baume canada dư trên tiêu bản . Sau đó , dùng tấm
vải tẩm xylen chùi lại cho thật sạch .

3.6.4. Bảo quản tiêu bản :
+ Dán nhãn vào tiêu ở góc trái ( ghi rỏ tên mẫu vật , dung dịch nhuộm , ).
+ Để tiêu bản trong hộp kín dùng cho việc đựng tiêu bản . Hộp đựng tiêu bản bảo
quản nơi sạch sẽ , tránh ánh sáng , ẩm ướt , nhiệt độ cao .
+ Tiêu bản cố định có thể bảo quản được trong thời gian khá dài nếu thực hiện
tốt các thao tác trên.

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

21

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

TÓM TẮT QUI TRÌNH THỰC HIỆN TIÊU BẢN LÁT CẮT CỦA
GIUN ĐŨA ( Acaris suum ) VÀ GIUN ĐẤT ( Pheretima.sp )
STT GIAI ĐOẠN
1


Định hình :

2

Đúc mẫu :

HÓA CHẤT / DỤNG CỤ

NHIỆT ĐỘ/THỜI GIAN

-3 giờ (Giun đũa heo )
-5 giờ ( Giun đất )
- Dung dịch Carnoy và Lebrun -2 giờ (Giun đũa heo )
-3 giờ (Giun đất )
- Rữa nước máy (đối với dung -Đến khi không còn màu
trôi ra
dịch Bouin).
0
- Ngâm cồn 70 (đối với dung -2 giờ
dịch Carnoy và Lebrun ).
- Dung dịch Lugol (đối với -1 đêm
mẫu định hình trong dung dịch
Carnoy và Lebrun ) .
- Dung dịch Lenoir (đối với -24 giờ
mẫu định hình trong dung dịch
Bouin).
-30 phút
- Nước máy
- Dung dịch Bouin.


- Cắt mẫu một đoạn ngắn

Trung tâm Học liệu ĐHkhoảng
Cần2Thơ
cm. @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
- Nước cất
- Cồn 30 0
- Cồn 50 0
- Cồn 70 0
- Cồn 96 0
- Cồn 100 0 (hay n – Butanol )
- Cồn 100 0 : Chloroform hay n
– Butanol : Chloroform (tỉ lệ 1 :
1)
- Chloroform
- Paraffin : Chloroffom (tỉ lệ
1:1) .
- Paraffin I / Tủ sấy.
- Paraffin II / Tủ sấy.
- Paraffin / Khuôn đúc.
- Trữ trong tủ lạnh.
3

-10 giờ
-12 giờ / 370C
-24 giờ / 600C
-24 giờ / 600C
-24 giờ

Cắt mẫu :

- Máy cắt vi mẫu (microtome) .
- Albumin : glycerin dán mẫu .
- Tải mẫu lên lame.
- Sấy lame / Tủ sấy.
- Sấy lame / Tủ sấy.

4

-1 phút
-2 giờ
-2 giờ
-2 giờ
-2 giờ
-4 giờ
-1 giờ

-1 giờ / 500C
-1ngày / 500C
-24 giờ / 270C

Nhuộm mẫu:

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

22

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp


- Hơ trên đèn cồn
- Xylen I
- Xylen II
- Cồn tuyệt đối
- Cồn 96 0
- Cồn 70 0
- Cồn 50 0
- Cồn 30 0
- Nước cất
- Hematoxylin
- Nước máy
- Nước cất
- HCl 0,1% trong cồn 70 0
- NaHCO3
- Nước cất
- Cồn 30 0
- Cồn 50 0
- Cồn 70 0
- Cồn 96 0
- Eosin B hay Eosin Y
- Nước máy

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu
5

Khử nước , - Nước cất
làm trong và - Cồn 30 0
dán mẫu :
- Cồn 50 0

- Cồn 70 0
- Cồn 96 0
- Cồn 99 05
- Xylen : Phênol
- Xylen
- Baume canada
- Tủ sấy

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

-20 phút
-10 phút
-5 phút
-2 phút
-2 phút
-2 phút
-2 phút
-1 phút
-1 phút
- Đến khi không còn màu
trôi ra.
-1 phút
-5 giây
-Đến khi không còn màu
trôi ra.
-1 phút
-2 phút
-2 phút
-2 phút
-2 phút

-10 phút (EosinB ) ; 5 phút
(Eosin Y) .
-Đến khi không còn màu
học
tập và nghiên cứu
trôi ra.
-1 phút
-2 phút
-2 phút
-2 phút
-2 phút
-2 phút
-5 phút
-10 phút
-50 0C / 1 tuần

23

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

NỘI DUNG
1. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU:

1.1. Giun đũa heo (Ascaris suum) :
1.1.1. Phân loại :
Ngành : Nemathelminthes = Aschelminthes
Lớp : Nematoda

Bộ : Spirudida
Phân bộ : Ascaridida
Họ : Ascarididae
Giống : Ascaris
Loài : Ascaris suum

1.1.2. Đặc điểm cấu tạo :
1.1.2.1. Hình dạng ngoài :

Trung tâm Học
liệu
Cần Thơ
liệu
tậpthuôn
và nhỏ
nghiên
cứu
Giun
đũaĐH
heo (Ascaris
suum )@
có Tài
hình trụ
dài học
, hai đầu
, phía đầu
thuôn nhỏ hơn phía đuôi . Con đực thường có kích thước nhỏ và ngắn hơn con cái (con
cái có cơ thể dài tới 30 cm ) . Con đực có đuôi cong tròn về phía bụng và có mang hai
gai giao cấu .
Ở phần thước cơ thể có chỏm đầu được phân biệt với đầu còn lại của cơ thể

bằng chỗ thắt nhỏ . Tận cùng trước của chỏm đầu có lỗ miệng nằm ở giữa ba thùy môi
. Quan sát lát cắt mặt trước của chỏm đầu thấy rỏ cấu tạo của ba thùy môi : một thùy
môi và hai thùy bên - bụng . Thùy lưng có kích thước lớn hơn thùy bên – bụngvà phủ
ở phía trên lỗ miệng . Hai thùy bên – bụng có kích bằng nhau và phủ ở hai bên và phía
bụng . Lỗ miệng khi đó nằm ở giữa ba thùy môi và có dạng khe ba nhánh . Mặt ngòai
của các thùy môi có các núm cảm giác . Đó là phần lồi của lớp cuticun , bên trong có
tận cùng của đấu dây thần kinh thực hiện chức năng cảm giác . Thùy lưng có hai núm
kép nằm lệch về phía bụng của mép môi. Ngòai núm kép ra , ở mỗi thùy môi còn có
hai núm đơn kề nhau , nằm lệch về phía lưng và hơi lùi về phía trong so với mép của
thùy môi.
Tại vị trí 1/3 cơ thể về phía trước của con cái , các vòng cuticun thắt lại và
kết với nhau tạo thành một cấu trúc được gọi là đai sinh dục . Đây chính là chỗ tựa cho
con đực khi giao phối . Ở đó có lỗ sinh dục cái , là một khe rất nhỏ nằm ở mặt lưng .
Hậu môn cũng là một khe nhỏ nằm ở gần cuối cơ thể . Đuôi của cơ thể nằm ở phía sau
hậu môn .

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

24

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi


Luận văn tốt nghiệp

Qua lớp cuticun trong suốt , có thể thấy nổi rỏ bốn gờ hạ bì chạy dọc suốt
cơ thể : gờ hạ bì lưng và bụng lớn có màu trắng , hai gờ hạ bì bên nhỏ và có màu thẫm
hơn .

1.1.2.2. Cấu tạo lát cắt ngang :

+ Thành cơ thể :
Thành cơ thể có cấu tạo theo kiểu bao biểu mô cơ , bao gồm lớp cuticun ,
hạ bì và lớp cơ .
- Lớp cuticun : là lớp ngoài cùng , có chiều dày khỏang 30- 40 μm , nhìn chung
trong suốt , nhưng thực ra bao gồm 10 lớp có độ dày và độ khúc xạ ánh sáng khác
nhau . tầng này bảo vệ cơ thể khỏi tác động cơ học và hóa học của môi trường . Chúng
kết bằng một hệ thống các sợi không co duỗi được , nhưng do chúng xếp chéo nên cơ
thể có thể biến dạng tạm thời theo kiểu uốn cong . Tầng cuticun của giun cho nước và
khí thấm qua . Hoạt động hô hấp qua đó tiến hành trên tòan bộ bề mặt cơ thể .Tầng
cuticun còn là màng thấm chọn lọc cho một số hợp chất hữu cơ và ion , điều hòa trao
đổi của các chất này giữa môi trường trong và ngoài cơ thể .
- Lớp hạ bì : nằm ngay dưới lớp cuticun có cấu trúc hợp bào . Chiều dài hạ bì
thay đổi trong khoảng 26- 32 μm . Trong dãy nguyên sinh chất liên tục có nhân tế bào
và các không bào nằm rải rác theo từng nhóm . Tại bốn vị trí gần như cách đều nhau :
giữa lưng , giữa bụng và hai bên cơ thể lớp hạ bì dày lên rỏ rệt theo chiều dọc tạo
thành bốn gờ hạ bì : gờ lưng , gờ bụng và hai gờ bên . Gờ bên có kích thước lớn hơn ,
bên trong có chứa tiết diện cắt ngang của ống bài tiết . Các gờ lưng và gờ bụng khác
Trung gờ
tâm
ĐHcủaCần
@như
Tài
vàngọn
nghiên
cứu
lưngHọc
ở chỗ liệu
phần gốc
chúngThơ
teo nhỏ

cáiliệu
cuốnghọc
nâng tập
lấy phần
, đưa sâu
vào xoang cơ thể . Trong gờ lưng và gờ bụng có tiết diện cắt ngang của dây thần kinh
lưng và dây thần kinh bụng .
-Lớp cơ : là lớp trong cùng của thành cơ thể . Do bị các gờ hạ bì phân cách , lớp
cơ phân thành bốn dãy kéo dài suốt chiều dọc cơ thể : hai dãy bên – lưng và hai dãy
bên – bụng . Hệ cơ cấu tạo theo kiểu đa tế bào . Mỗi tế bào bao bọc trong màng riêng
và gồm có sợi co rút của mỗi tế bào xép theo chiều dọc và áp sát vào hạ bì . Trên tiêu
bản cắt ngang , phần này bắt màu đậm nhất . Các túi nguyên sinh chất hướng vào bên
trong xoang cơ thể . Các chồi nguyên sinh chất liên kết với nhau và hướng về các gờ
hạ bì lưng và bụng . Nhân tế bào tương đối lớn , song trên tiêu bản khó nhìn thấy .
+ Xoang cơ thể :
- Xoang cơ thể của Giun đũa heo ( A . suum ) là xoang nguyên sinh . Đó là một
xoang kín chạy suốt từ đầu tới phía đuôi con vật tiếp xúc trực tiếp với thành cơ thể ở
phía ngoài và với thành ruột ở phía trong không có màng ngăn cách . Đặc tính này để
phân biệt với xoang thứ sinh ở Giun đất .
- Tiết diện cắt ngang ruột của A . suum là một vòng các tế bào hình trụ nằm hơi
lệch về phía lưng . Căn cứ vào đặc điểm này để định hướng mặt lưng và mặt bụng của
lát cắt ngang con vật .
- Giữa thành cơ thể và ruột là xoang nguyên sinh chứa các phần khác nhau của
hệ sinh dục .

GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

25

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi



Luận văn tốt nghiệp

~ Ở con cái : các tiết diện cắt ngang có kích thước nhỏ nhất và trông giống như
bánh xe có nan hoa đó là tuyến trứng . Ống dẫn trứng là những tiết diện có kích lớn
hơn , bên trong chứa nhiều trứng có dạng những chấm tròn . Hai tử cung có tiết diện
lớn nhất nằm cạnh nhau và lệch về phía bụng , chứa đầy trứng đã chín . Thành tử cung
có cấu trúc khá rõ.
~ Ở con đực : tuyến tinh có cấu trúc cắt ngang giống như tuyến trứng . Các
phần tiếp theo cũng có cấu tạo tương tự như hệ thống ống dẫn của con cái . Ống phóng
tinh có kích thước lớn nhất và có thành khá dày , tinh trùng Giun đũa có dạng hình
tháp nhỏ không có đuôi .

1.2. Giun đất = trùn đất ( Pheretima . sp )
1.2.1. Phân loại :
Ngành : Annelida
Lớp

: Olygochaeta

Bộ

: Lumbricimorpha

Họ

: Perichaetidae

Giống : Pheretima

Loài

: Pheretima . sp

1.2.2.
điểm
cấu tạo
: @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Trung tâm
HọcĐặc
liệu
ĐH– Cần
Thơ
1.2.2.1.

Hình dạng ngòai :

Giun đất trưởng thành dài khoảng 20 – 30 cm với trên dưới 100 đốt tương
đối giống nhau .Các đốt phân biệt rỏ ở mặt ngoài cơ thể nhờ các ngấn ngăn đốt . Màu
sắc cơ thể Giun đất rất khác nhau , thường là màu xám đỏ có ánh kim , mặt bụng sáng
màu hơn mặt lưng .
Mặt ngòai cơ thể khá nhẳn nhụi , luôn luôn nhờn ẩm , rất thích ứng với
đời sống chui luồn trong đất . Chất nhờn là do các tuyến trong lớp biểu bì tiết ra bao
phủ mặt ngoài thích nghi với đời sống ở cạn của Giun đất .
Dùng tay sờ kỹ hoặc quan sát dưới kính lúp mới nhận thấy ở giữa mỗi đốt
có một vòng tơ , gồm những tơ ngắn và phân bố đều đặn .
Ở giữa mặt lưng tại ranh giới giữa các đốt bắt đầu từ đốt thứ XI – XII trở
về sau đều có lỗ lưng xếp thành hàng . Có khi giết giun bằng nước nóng qua các lỗ này
dịch cơ thể phun mạnh ra ngoài thành tia .
Đai sinh dục được hình thành từ 3 đốt : đốt thứ XIV , XV và XV. Ở mặt

ngoài không còn ranh giới giữa các đốt và ở mỗi đốt không có vòng tơ . Đai sinh dục
bao quanh cơ thể . Ở giữa đốt XV về phía bụng có lỗ sinh dục cái .
Lùi về phía sau đai sinh dục một đốt có hai lỗ sinh dục nằm trên hai nhú
lồi của đốt XVIII . Quanh lỗ sinh dục đực thường có các nhú nhỏ . Số nhú thay đổi từ
5 đến 10 ở mỗi bên , nằm ở trước và sau lỗ sinh dục đực . Xa về phía trước của đai
GVHD: Nguyễn Mỹ Tín

26

SVTH: Phan Thị Ngọc Thi