I H C THÁI NGUYÊN
TR

NG

I H C NÔNG LÂM

NGUY N TH KI U TRANG
Tên

tài:

NGHIÊN C U TH

NGHI M KIT CH N OÁN B NH GUMBORO

TRÊN ÀN GÀ NUÔI T I THÁI NGUYÊN

KHÓA LU N T T NGHI P

H

ào t o: Chính quy

Chuyên ngành: Ch n nuôi thú y
Khoa: Ch n nuôi - Thú y
Khoá: 2011 – 2015

Thái Nguyên, 2015

IH C

I H C THÁI NGUYÊN
TR

NG

I H C NÔNG LÂM

NGUY N TH KI U TRANG
Tên

tài:

NGHIÊN C U TH

NGHI M KIT CH N OÁN B NH GUMBORO

TRÊN ÀN GÀ NUÔI T I THÁI NGUYÊN

KHÓA LU N T T NGHI P

H

IH C

ào t o: Chính quy

Chuyên ngành: Ch n nuôi thú y
L p: K43 - CNTY

Khoa: Ch n nuôi - Thú y
Khoá: 2011 – 2015
Gi ng viên HD: GS TS. Nguy n Quang Tuyên
ThS.

Bích Du

Thái Nguyên, 2015


i

L IC M

N

Trong su t quá trình h c t p và rèn luy n t i tr ng i h c Nông Lâm
Thái Nguyên c ng nh th i gian th c t p t t nghi p t i phòng thí nghi m B
môn Công ngh Vi sinh - Vi n Khoa h c s s ng - i h c Thái Nguyên.
. Em luôn nh n
c s quan tâm, h ng d n và giúp
t n tình c a
các th y, cô giáo trong Ban giám hi u nhà tr ng, Ban ch nhi m Khoa cùng
toàn th các th y cô giáo trong khoa ã t n tình gi ng d y dìu d t em trong
su t th i gian qua.
L i u tiên em xin
c bày t lòng bi t n sâu s c n Ban giám hi u
nhà tr ng, Ban ch nhi m khoa và các th y, cô giáo, cán b phòng thí
nghi m B môn Công ngh Vi sinh - Vi n Khoa h c s s ng - i h c Thái
Nguyên ã t o m i i u ki n giúp em hoàn thành khóa lu n này.

c bi t, em xin chân thành c m n sâu s c t i th y giáo GS.TS.
Nguy n Quang Tuyên, Th.s.
Bích Du ã tr c ti p giúp , h ng d n
em hoàn thành khóa lu n này.
Qua ây em c ng xin bày t lòng bi t n sâu s c n gia ình, ng i
thân, b n bè và ng nghi p ã giúp , ng viên, dành nh ng tình c m vô
cùng quý báu giúp em hoàn thi n khóa lu n t t nghi p này.
Cu i cùng em xin kính chúc các th y, cô giáo trong tr ng và các th y
cô trong khoa Ch n nuôi Thú y luôn luôn m nh kh e, h nh phúc, t nhi u
thành tích trong công tác và nhi u thành công trong nghiên c u khoa h c và
gi ng d y.
Em xin chân thành c m n !
Thái Nguyên, ngày tháng n m 2015
Sinh viên

Nguy n Th Ki u Trang


ii

DANH M C CÁC B NG
Trang
B ng 4.1. Xác

nh hi u giá huy t thanh và n ng

kháng nguyên t i u cho

ph n ng ELISA (S/N) .................................................................... 45
B ng 4.2. K t qu OD450 ph n ng ELISA t i các th i i m


kháng th khác

nhau.................................................................................................. 46
B ng 4.3. K t qu OD450 ph n ng ELISA t i các th i

i m

anti-bovine

IgG:HRPO khác nhau ...................................................................... 47
B ng 4.4. Giá tr OD450

các n ng

B ng 4.5 K t qu th c hi n

kháng th khác nhau ....................... 49

a ELISA v i các th i gian r a kháng th

khác nhau ........................................................................................ 50
B ng: 4.6. K t qu th c hi n ph n ng ELISA v i th i gian

conjugate khác

nhau.................................................................................................. 52
B ng: 4.7. K t qu th c hi n

a ELISA v i các th i gian r a conjugate khác


nhau.................................................................................................. 53
B ng 4.8. K t qu ph n ng ELISA
B ng 4.9. K t qu xác
B ng 4.10. K t qu

nh m c

nh h

xác

nh

nh y và

c hi u........... 54

l p l i k t qu ph n ng ELISA ............ 55

ng c a nhi t

và th i gian

n

nh y và

c


hi u c a KIT ELISA ...................................................................... 58


iii

DANH M C HÌNH
Trang
Hình 2.1: Hình thái c a virus Gumboro............................................................ 4
Hình 2.2: C u trúc phân t virus Gumboro ...................................................... 4
Hình 2.3: H gen c a virus Gumboro ............................................................... 5
Hình 2.4: Bi u hi n

gà b nhi m virus Gumboro......................................... 11

Hình 2.5: Túi Fabicius m t các nang lympho ................................................. 14
Hình 2.6: Xu t huy t c ng c, c

ùi ............................................................. 15

Hình 2.7 : Xu t huy t gi a d dày tuy n và d dày c ................................... 16
Hình 2.8: B nh tích trên phôi gà ..................................................................... 20
Hình 2.9: Hình nh minh h a cho ph n ng ELISA....................................... 26
Hình 3.1. S

a ph n ng ELISA xác

Hình 3.2. S

b trí thí nghi m


nh hi u giá kháng th ................ 40

xác

nh th i gian r a kháng th phù

ch n oán b nh Gumboro b ng KIT ELISA ch t o .......... 41

h p
Hình 3.3. S

b trí thí nghi m

xác

Hình 3.4. S

b trí thí nghi m xác

nh th i gian conjugate ............. 41

nh th i gian r a conjugate phù h p

ch n oán b nh Gumboro b ng KIT ELISA ch t o ...................... 42
Hình 4.1. K t qu

o OD450 ph n ng ELISA t i các th i

i m


huy t

thanh khác nhau ............................................................................. 47
Hình 4.2. K t qu

o OD450 ph n ng ELISA t i các th i

i m

anti-bovine

IgG:HRPO khác nhau ...................................................................... 48
Hình 4.3.

th kh o sát n ng

kháng th ................................................. 49


iv

DANH M C CÁC T VI T T T

Ab

: Antibody

Ag

: Antigen


CAM

: chorioallantic mem brance

Cs

: C ng s

EIA

: Enzyme Immuno Assay

ELISA

: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

Gs

: Group Specific

IB

: Infecttious Brochitis

IBDV

: Infectious bursal disease virus

Nxb


: Nhà xu t b n

ORF

: overlapping open reading frame

PCR

: polymerase Chain Reaction

RdRp

: RNA dependent RNA polymerase

RIA

: Radio Immuno Assay

Se

: Sensitivity

Sp

: Specificity

Ts

: Type-Secific


VP

: Viral Protein


v

M CL C
Trang
L I C M N .................................................................................................... i
DANH M C CÁC B NG................................................................................ ii
DANH M C HÌNH ......................................................................................... iii
DANH M C CÁC T VI T T T ................................................................... iv
U ............................................................................................ 1

Ph n 1: M
1.1.

tv n

................................................................................................... 1

1.2. M c tiêu c a

tài ..................................................................................... 2

1.3. Ý ngh a c a

tài ....................................................................................... 2


1.3.1. Ý ngh a khoa h c .................................................................................... 2
1.3.2. Ý ngh a trong th c ti n ........................................................................... 2
Ph n 2: T NG QUAN NGHIÊN C U ......................................................... 3
2.1. C s khoa h c ........................................................................................... 3
2.1.1. T ng quan v b nh Gumboro.................................................................. 3
2.1.2. T ng quan v ph

ng pháp Enzym Linked Immuno Sorbent Assay

(ELISA) ........................................................................................................... 24
2.2. Tình hình nghiên c u trong và ngoài n

c .............................................. 30

2.2.1. Tình hình nghiên c u trên th gi i ........................................................ 30
2.2.2. Tình hình nghiên c u trong n
Ph n 3:

IT

c.......................................................... 32

NG, N I DUNG VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U

......................................................................................................................... 35
3.1.


it

3.2.

a i m và th i gian ti n hành ............................................................... 35

3.2.1.

ng nghiên c u............................................................................... 35

a i m ................................................................................................ 35

3.2.2. Th i gian ............................................................................................... 35
3.3. N i dung nghiên c u ................................................................................ 35


vi

3.4. Ph

ng pháp nghiên c u và các ch tiêu theo dõi ................................... 35

3.4.1. Nguyên li u ........................................................................................... 35
3.4.2 Thi t b và hóa ch t ................................................................................ 35
3.4.3. Ph

ng pháp nghiên c u....................................................................... 36

3.4.4. Ph


ng pháp x lý s li u..................................................................... 44

Ph n 4: K T QU VÀ TH O LU N ........................................................ 45
4.1. K t qu xác

nh các i u ki n s n xu t KIT ch n oán huy t thanh h c

t kháng nguyên Gumboro.............................................................................. 45
4.1.1. Xác

nh hàm l

ng kháng nguyên và

pha loãng kháng th thích

h p cho ph n ng ELISA................................................................................ 45
4.1.2. Xác

nh s

nh h

ng c a th i gian

kháng th

n k t qu ph n ng

ELISA.............................................................................................................. 46

4.1.3. Xác

nh th i gian

a ELISA v i kháng th

c hi u c a virus

Gumboro và anti-bovine IgG: HRPO ............................................................. 47
4.1.4. Xác

nh

ch n oán b nh Gumboro

pha loãng kháng th phù h p

b ng KIT ELISA ch t o................................................................................. 48
4.1.5. Xác

ch n oán b nh Gumboro

nh th i gian r a kháng th phù h p

b ng KIT ELISA ch t o................................................................................. 50
4.1.6. Xác

nh th i gian

conjugate phù h p


ch n oán b nh Gumboro

b ng KIT ELISA ch t o................................................................................. 51
4.1.7. Xác

nh th i gian r a conjugate phù h p

ch n oán b nh Gumboro

b ng KIT ELISA ch t o................................................................................. 53
4.2. ánh giá

nh y,

4.2.1. K t qu

ánh giá

c hi u c a KIT ELISA ch t o .......................... 54
nh y,

4.2.2. Xác

nh m c

4.3.

ng c a nhi t


nh h

c hi u c a KIT ELISA ch t o .......... 54

l p l i c a k t qu ph n ng ..................................... 55
và th i gian b o qu n

n

nh y,

c hi u

c a KIT ELISA ch t o ................................................................................... 56


vii

Ph n 5: K T LU N VÀ

NGH ............................................................. 59

5.1. K t lu n .................................................................................................... 59
5.2.

ngh ..................................................................................................... 59

TÀI LI U THAM KH O
PH L C



1

Ph n 1
M

1.1.

U

tv n
Ch n nuôi gà là ngh s n xu t truy n th ng lâu

i và chi m v trí quan

tr ng th hai sau ch n nuôi l n trong ngành ch n nuôi c a Vi t Nam, h ng
n m cung c p kho ng 350 - 450 nghìn t n th t và h n 2,5 - 3,5 t qu tr ng.
Tuy nhiên, ch n nuôi gà

nu c ta v n còn trong tình tr ng s n xu t nh , phân

tán, n ng su t th p, d ch b nh nhi u, s n ph m hàng hoá còn nh . Bình
quân s n l

ng th t x , tr ng ch

t 4,5 - 5,4 kg/ngu i/n m và 35 tr ng/

ngu i/ n m.
Trong vài th p k qua, m c dù công tác ch n gi ng ã c i thi n m t

cách áng k thành tích s n xu t ch n nuôi gà nh t ng tr

ng nhanh, hi u

qu s d ng th c n cao, kh n ng s n xu t th t t t, t l th t ng c cao h n
nh ng s t ng nhanh v n ng su t s n xu t ã i cùng v i vi c t ng d ch
b nh, d n

n gà b m c nhi u b nh v r i lo n chuy n hóa và m c nhi u

b nh truy n nhi m, t l ch t cao.
Trong ó có th k

n b nh Gumboro do m t l ai virus thu c h

Birnaviridae, serotype 1, chúng có kh n ng phá hu túi Fabracius, do ó làm
gi m kh n ng mi n d ch c a gà. Nhi u báo cáo khoa h c ã cho bi t gà
giai

an t 1 - 12 tu n tu i, nh t là

giai

an 3 - 6 tu n tu i

u có kh

n ng m c b nh. Gà nh h n 3 tu n tu i m c b nh không bi u hi n tri u
ch ng nh ng s làm gà suy gi m mi n d ch. T l m c b nh là 100%, t l
ch t t 10 – 50% ho c cao h n n u k t h p v i các b nh khác.

Do tính ch t gây b nh

c tr ng c a virus là lây lan r t nhanh và không

th ki m soát b ng hóa ch t hay b t k ph

ng thu c nào mà ch có th kh c

ph c b ng bi n pháp phòng tr . Vì v y thi t h i do b nh Gumboro gây ra là


2

r t áng k

i v i ch n nuôi gà c a các n

c l n trên th gi i nói chung và

c a Vi t Nam nói riêng.
Cùng v i s phát tri n v

t b c c a công ngh sinh h c, các k thu t

phân t trong ch n oán b nh ngày nay có th giúp ta ch n oán nhanh, s m
m t cách chính xác nhi u b nh do virus. Kh i phát t các v n
c s nh t trí c a Ban giám hi u nhà tr
nuôi Thú y - Tr

ng


nêu trên,

ng, Ban ch nhi m khoa Ch n

i h c Nông Lâm Thái Nguyên, em ã th c hi n

tài “Nghiên c u th nghi m KIT ch n oán b nh Gumboro trên àn gà
nuôi t i Thái Nguyên”
1.2. M c tiêu c a

tài

Nghiên c u thành công KIT ch n oán nhanh b nh Gumboro và ánh
giá k t qu thông qua th nghi m v i quy mô trong phòng thí nghi m.
1.3. Ý ngh a c a

tài

1.3.1. Ý ngh a khoa h c
K t qu c a

tài cung c p nh ng thông tin khoa h c v

s n xu t KIT và các thông s k thu t ng d ng

i u ki n

s n xu t KIT ch n


oán b nh Gumboro.
1.3.2. Ý ngh a trong th c ti n
T o

c KIT ch n oán nhanh b nh Gumboro ng d ng trong th c t

góp ph n ch n oán s m và i u tr k p th i, gi m thi t h i t i m c t i a cho
ng

i ch n nuôi.


3

Ph n 2
T NG QUAN NGHIÊN C U
2.1. C s khoa h c
2.1.1. T ng quan v b nh Gumboro
B nh Gumboro là m t b nh truy n nhi m c p tính

gà, nh ng ch y u

là gà t 3 - 6 tu n tu i và gà tây (Hitchner, S. B, 1970) [18]. B nh do m t lo i
virus tác

ng vào túi fabricius gây suy gi m mi n d ch

gà, khi n cho gà d

b m c các ch ng nh viêm da ho i t , h i ch ng thi u máu - viêm gan th

bao hàm, b nh do E. coli và kh n ng s n sinh áp ng mi n d ch kém sau khi
s d ng các lo i v c xin.
2.1.1.1. C n b nh
a. Phân lo i
Theo Dobos, P (1979) [13], virus Gumboro thu c h Birnaviridae. H
này g m có 3 gi ng: gi ng Apubirnavirus gây b nh ho i t tuy n t y cho cá,
loài giáp xác; trong ó có IBDV gây b nh cho gà; gi ng Entomobirnairus,
trong ó có virus Drosophia X gây b nh cho côn trùng (Mac Donald, R. D,
1980) [27]. Các virus thu c h này

u

c tr ng b i c u t o nhân g m 2

o n ARN s i ôi vì v y tên g i c a h virus là Birnavirus (Bottcher, B. và
cs, 1997) [10]. Tr
nghiên c u

y

c ây, do hình thái và c u trúc c a virus ch a
nên IBDV ã t ng

c

c x p vào h Picornaviridae ho c

Reoviridae.
b.


c i m hình thái, c u trúc c a virus Gumboro

Virus Gumboro hay còn g i là virus gây viêm túi truy n nhi m
(Infectious bursal disease virus - IBDV). Virus Gumboro là m t l ai virus
d ng tr n, không có v b c bên ngoài, kích th

c kho ng 50 – 60 nm có hình

kh i a di n, nhi u góc c nh trông gi ng nh t ong x p

u

n c nh nhau,

g m 2 chu i RNA qu n chéo nhau, v capsid bao b c bên ngoài v này ch a
thành ph n kháng nguyên c a virus không có v b c bên ngoài nên nó
kháng v i vi c sát trùng (Delmas, B và cs, 2004) [12].


4

Theo (Ozel, M. và H. Gelderblom, 1985) [34] c u trúc virus n gi n
nh ng hoàn thi n vì th nó có kh n ng ch ng ch u l i s tác ng b t l i c a
môi tr ng. M t khác do kích th c nh bé và c u trúc linh ho t (h gen r t
n gi n), virus thích ng xâm nh p và truy n lây trong qu n th v t ch m t
cách nhanh chóng và d dàng thoát kh i mi n d ch t nhiên c a c th .

Hình 2.1: Hình thái c a virus Gumboro
Virus Gumboro có c u t o i x ng, quanh nhân là v capsid (v
protein). L p v capsid này

c h p thành b i 32 capsome ( n v hình
thái). Capsid c a virus là l p v protein n l p. Virus không có v b c ngoài
cùng mà thông th ng l p v ó là lipoproterin nên nh y c m v i formalin
không nh y c m v i ether và chloroform. M i capsome
c t o b i 5 lo i
protein c u trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP).
V m t di truy n h c cách s p x p các nucleotid trong acid ribonucleic c a
virus Gumboro cu n l i t o thành s i ôi và phân o n. ây chính là tính c
tr ng c a virus RNA, ng i ta x p nó vào h Birnaviridae là m i nh t trong
h th ng phân lo i virus trong ng v t và ng i Lukert, P. D. và Y. M. Saif
(1997) [26].

Hình 2.2: C u trúc phân t virus Gumboro


5

Dobos, P. và cs (1979) [14] virus Gumboro có h gen ch a hai s i
RNA, ó là hai phân o n phân bi t g i là phân o n A và B.
Phân o n A có
dài 3261 nucleotid ch a hai khung c m thành
ph n (overlapping open reading frame – ORF). ORF nh s mã hóa cho
protein không c u trúc VP5 không c n thi t cho quá trình sao chép virus
invitro nh ng l i quan tr ng i v i kh n ng gây b nh c a virus (Hudson, P.
J và cs, 1986) [19]. ORF l n mã hóa cho m t polyprotein 110 kDa, t xúc tác
hình thành ba lo i polypeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32kDa), và VP4 (28
kDa) (Mundt, E. và cs 1995) [31]. VP4, m t lo i enzyme protease phân c t
serine-lysine VP2 s
c tách thêm nh ng RNA d th a t i nh ng Carbon
cu i cùng

tr thành VP2 (40kDa) VP2 và VP3 là nh ng protein c u trúc.
Trong ó, VP2 ch a nh ng v trí kháng nguyên quan tr ng và h th ng mi n
d ch (Kibenge, F. S. B. và V. Dhama, 1997) [23].
Theo Boot, H. J. và S. B. Pritz-Verschuren (2004) [9] phân o n B có
dài 2827 nucleotid ch ch a duy nh t m t c u trúc gen mã hóa cho s t ng
h p m t protein duy nh t g i là VP1 (VP- viral protein), (VP1: 97kDa), ng i
ta v n cho nó là m t enzyme RNA polymerase ph thu c RNA (RNA
dependent RNA polymerase - RdRp). Polypeptide này th c hi n d i d ng
virus ngh ngoài t bào ch (virion), mang b n ch t c a m t protein t do và
c a m t protein liên k t genome (còn
c g i là VPg). VPg
cc
nh
vào uôi 5’ c a s i d ng c a hai m ch trong genome. VP1 có ho t tính sinh
h c ch u trách nhi m là enzyme RNA-polymerase (xúc tác quá trình t ng h p
RNA) c a virus.

Hình 2.3: H gen c a virus Gumboro


6

Theo Pan, J., V. N. và cs (2007) [35] virus Gumboro có hai lo i protein
mang tính kháng nguyên c bi t:
+ M t lo i protein kích thích c th sinh ra kháng th k t t a
(precipitating antibody) có tính c hi u nhóm,
c kí hi u là Gs (Group
Specific) (th c ch t là protein c u trúc VP3). Lo i này khi k t h p v i kháng
th
c hi u t o nên ph n ng k t t a, vì th có th làm ph n ng k t t a

khuy ch tán trong th ch (AGP) dùng
phát hi n c kháng nguyên và
kháng th .
+ Lo i th hai có tính kháng nguyên kích thích c th s n sinh kháng
th trung hòa (Neutralizating antibody)
c g i là kháng nguyên c hi u
typ, ký hi u Ts (Type-Secific) (th c ch t c a kháng nguyên này là v VP2).
Lo i kháng nguyên này khi k t h p v i kháng th
c hi u s t o nên ph n
ng trung hòa virus VN. Ph n ng này v a
c dùng
nh tính v a
c
dùng
nh l ng kháng th
c hi u trong ch n oán và ki m tra mi n d ch
c a b nh Gumboro.
Hai lo i protein Gs và Ts an chéo vào nhau t o nên các l p v protein
b c l y nhân virus, trong ó Ts có xu h ng n i lên trên b m t h n, các l p
protein n i nhau, các gai, móc, các receptor th th n m ngoài cùng c a b
m t virus hay các epitop liên t c h n. Còn Gs protein th ng n m sâu h n
xen k vào các protein c u trúc khác, g n ch t v i l p protein liên k t v i acid
nucleic c a nhân virus, các epitop gián o n.
Ts protein là m t ph c h p protein k t h p trong ó có protein quy t
nh tính gây b nh c a virus. Ts kháng nguyên có vai trò l n trong mi n d ch
h c và và quy t nh tính c hi u theo typ huy t thanh h c, có th giám nh,
phân bi t virus thu c các h , nhóm và typ khác nhau, th m chí trong cùng
m t phân typ huy t thanh. Gs kháng nguyên trong quá trình t o nguyên li u
th c hi n quá trình nhân lên và gây b nh, chúng
c s n xu t r t nhi u và

gi i phóng ra kh i t bào. Gs protein quy t nh tính c hi u trong cùng m t
huy t thanh h c.
Trong quá trình nhân lên c a virus, c hai kháng nguyên Gs và Ts u
c s n xu t nh nhau, khi có áp ng mi n d ch kháng th do chúng kích


7

thích s n sinh ra c ng có quan h t l thu n v i nhau. Kháng th k t t a có
s m h n kháng th trung hòa.
c. Tính ch t nuôi c y
Theo Benton, W. J và cs (1967) [8] virus có th nuôi c y trên phôi gà
(9 – 10 ngày tu i) b ng cách tiêm vào màng nhung ni u (chorioallantic mem
brance – CAM). Virus gây ch t phôi sau 3 – 5 ngày. B nh tích c tr ng:
màng nhung ni u xung huy t, s ng d y l n, phôi còi c c, xu t huy t d i da,
gan xu t huy t và ho i t , lách nh t màu và có các i m ho i t .
Landgraf, H., và cs (1967) [24] cho bi t nuôi c y trên môi tr ng t bào
phôi gà, gà tây, v t, th n th , th n kh nh ng virus không thích ng ngay trong
l n nuôi c y u tiên và ph i qua vài l n c y chuy n mù (blind passage) các
ch ng phân l p t gà: 2 – 3 l n; các ch ng phân l p t gà tây: 3 – 10 l n. N u
c y chuy n ti p i nhi u l n trên môi tr ng t bào t ch c thì c l c c a
virus gi m d n, có th s d ng làm v c xin (McFerran và cs, 1980) [30].
Nuôi c y trên ng v t s ng: gà 3 – 6 tu n tu i, b ng cách nh m t,
nh m i ho c nh vào h u môn. Sau 2 – 3 ngày gà có các tri u ch ng, b nh
tích nh ngoài t nhiên.
d. S c kháng
Theo Lukert, P. D. và Y. M. Saif (1997) [26] cho bi t virus Gumboro
có s c
kháng cao v i i u ki n t nhiên và các y u t lý hóa h c. Virus
không có v lipoprotein nên kháng hoàn toàn v i ether, chloroform, ít nh y

c m v i formalin và chloramin. Virus ch u ng t t v i s thay i c a pH
nên có s c kháng m nh trong u ki n t nhiên. Biên
dao ng c a pH
t 2 ÷ 11 virus v n ho t ng, ch khi pH = 2 ho c pH = 12 thì virus m i b
vô ho t.
V nhi t : Rodriguez - Chavez và cs (2002) [36] ã ch ng minh r ng
nhi t
56ºC virus Gumboro v n có th t n t i trong vong 5 gi , có th t n
tr
nhi t l nh -58ºC trong 18 tháng mà c l c không suy gi m. Virus ch
m t tác d ng gây b nh khi
c x lý v i phenol và thiomesal n ng
0,125% cùng v i nhi t
30ºC liên t c trong 1 gi . N u dùng nh ng ch t sát
trùng g m h n h p iod, phenol và amonium thì ít nh t trong 2 phút nhi t


8

60ºC virus Gumboro v n s ng.
23ºC m i có tác d ng di t virus. nhi t
Khi nâng nhi t
lên 70ºC virus b tiêu di t hoàn toàn trong 30 phút. N u
dùng chloramin 0,5% thì virus b tiêu di t trong vòng 10 phút.
Virus Gumboro có th t n t i r t lâu trong chu ng nuôi t 54 - 122
ngày; trong n c, ch t n chu ng, d ng c ch n nuôi và ch t th i. Virus có
th t n t i dai d ng kho ng 4 tháng trong i u ki n ch n nuôi bình th ng
Rosenberger, J. K. và S. S. Cloud (2008) [37]. i u c bi t quan tr ng trong
t nhiên là virus Gumboro có s c truy n ngang r t l n, do ó t m t d ch d
dàng tr thành vùng nguy c bùng phát d ch. Nh ng kh n ng

kháng
c avirus Gumboro ã làm cho tình hình b nh Gumboro tr nên nan gi i, i u
này lý gi i t i sao nh ng n i gà b b nh m c dù áp d ng bi n pháp v sinh
tiêu c, sát trùng chu ng tr i
c th c hi n nghiêm ng t nh ng àn gà nuôi
ti p theo c ng v n b b nh. Nh v y mu n tiêu di t
c virus Gumboro ph i
dùng các lo i hóa ch t m nh, thích h p, li u cao và s d ng m t cách tri t .
Nh ng n i ã có b nh l u hành ho c có virus ti m tàng thì ph i h t s c chú ý
khâu v sinh phòng b nh.
2.1.1.2. D ch t h c
a. Loài v t m c b nh
Theo Lucio, B. và S. B. Hitchner (1980) [25] loài gà
c coi là loài
m c b nh duy nh t trong t nhiên; tuy nhiên, g n ây m t s tác gi cho r ng,
v t c ng b nhi m virus Gumboro.
Gà t 3 – 9 tu n tu i ( c bi t t 3 – 6 tu n tu i) c m nhi m m nh nh t;
tuy nhiên c ng có tr ng h p m c b nh s m h n (9 ngày tu i), ho c mu n
h n (sau 9 ngày tu i). Gà d i 3 tu n tu i m c b nh không bi u hi n tri u
ch ng lâm sàng nh ng h u qu lâm sàng là suy gi m mi n d ch.
Tr = [d/(b + d)] × 100


44

nh

b. Xác
n


n

nh c a KIT ELISA ch t o

nh c a KIT

c xác

nh trên 10 m u huy t thanh

cl y

c hi u v i virus Gumboro trong các m u huy t thanh

ng u nhiên, kháng th
này

c xác

nh b ng KIT ch t o v i cùng các i u ki n th c hi n. L p l i

ph n ng 5 l n. Ch m i m ng ng k t c a t t c các l n ph n ng, xác
h s bi n

nh

ng (Coefficient of variation - Cv).

3.4.3.11. Ph ng pháp xác nh i u ki n b o qu n KIT ch n oán b nh
Gumboro

xác nh i u ki n b o qu n KIT thích h p, không làm nh h ng
n ch t l
nhi t

ng c a KIT, chúng tôi ti n hành b o qu n KIT

: nhi t

nh y,
tu n.

phòng và
c hi u,

n

4ºC r i hàng tu n th c hi n thí nghi m xác
nh c a KIT, thí nghi m

i u ki n b o qu n KIT

nh y và
t o ra.

n

hai i u ki n

c xác


nh c a KIT không thay

nh

c th c hi n trong 12

nh b i các y u t và khi ó,
i so v i th i i m KIT m i

ánh giá kh n ng phát hi n b nh c a KIT ch t o

c

c, chúng tôi

ti n hành th KIT ch t o b ng 123 m u huy t thanh trong ó có 70 m u âm
ng tính (+) v i b nh Gumboro. T t c các m u trên ã

tính (-) và 53 m u d

c ti n hành ch n oán b ng ph
tr ng. T

ó, so sánh và ánh giá

ng pháp: Ch n oán virus h c trên phôi
chính xác c a KIT ch t o trong hai i u

ki n b o qu n.
3.4.4. Ph


ng pháp x lý s li u

S li u thu

c,

ph n m m Excel 2010.

c x lý b ng ph

ng pháp toán h c thông d ng và


45

Ph n 4
K T QU VÀ TH O LU N

4.1. K t qu xác

nh các i u ki n s n xu t KIT ch n oán huy t thanh

h c t kháng nguyên Gumboro
4.1.1. Xác

nh hàm l

ng kháng nguyên và


pha loãng kháng th thích

h p cho ph n ng ELISA
Kháng nguyên Gumboro
Kháng nguyên có th

c ch t o b ng ph

c nh n bi t

c hi u b i kháng th

virus Gumboro. Kháng nguyên Gumboro
ELISA

các n ng

:

ng pháp ông tan.
c hi u c a

c pha loãng và ph lên

a

15; 20; 25; 30, 35 µg/ml.

Huy t thanh ch a kháng th


c hi u c a Gumboro

c pha loãng

trong PBS theo các t l 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600.
K t qu xác

nh hàm l

ng kháng nguyên và

pha loãng kháng th

thích h p cho ph n ng ELISA trong b ng 1 cho th y: giá tr S/N
là 3,64; t

ng ng v i n ng

kháng nguyên Gumboro là 25 µg/ml,

loãng huy t thanh là 1:200. ây là các n ng
ph n ng ELISA phát hi n kháng th
B ng 4.1. Xác

t cao nh t
pha

c coi là thích h p nh t cho

c hi u c a virus Gumboro.


nh hi u giá huy t thanh và n ng

kháng nguyên t i u

cho ph n ng ELISA (S/N)
N ng

kháng nguyên

pha loãng huy t thanh d

ng chu n

Gumboro (µg/ml)

1:100

1:200

1:400

1:800

1:1600

15

3,30


3,46

3,08

2,67

2,85

20

3,30

3,43

2,19

2,62

2,57

25

3,21

3,64

3,33

2,78


2,72

30

3,33

3,31

3,35

2,81

3,36

35

2,27

3,43

2,44

2,85

2,58


46

4.1.2. Xác


nh s

nh h

ng c a th i gian

kháng th

n k t qu ph n

ng ELISA
V i n ng

kháng nguyên Gumboro là 25 µg/ml,

pha loãng huy t thanh ch a kháng th

a qua êm

4oC.

c hi u là 1:200, ph n ng kháng

nguyên - kháng th

c th c hi n

37oC trong 45, 60, 90, 120 phút. Giá tr


OD450 c a ph n ng

c o3l n

c trình bày

b ng 4.2.

B ng 4.2. K t qu OD450 ph n ng ELISA t i các th i i m

kháng th

khác nhau
S l n o

Th i gian th c hi n ph n ng kháng nguyên - kháng th (phút)

OD450

45

60

90

120

L n1

3,62


3,73

3,76

3,78

L n2

3,66

3,70

3,79

3,78

L n3

3,68

3,74

3,80

3,79

Trung bình

3,65


3,72

3,78

3,78

C n c vào b ng 4.2 K t qu

o OD450 ph n ng ELISA t i các th i

i m huy t thanh khác nhau cho th y:
Giá tr OD450 c a ph n ng ELISA
45, 60, 90, 120 phút
d n t phút th 45

c o 3 l n t i m i th i i m

u n m trong kho ng 3,6 - 3,8. Giá tr

o OD450 t ng

t giá tr cao nh t t i th i i m 90 sau ó duy trì giá tr

t i th i i m 120 phút. C th

ây giá tr OD450 trung bình o

phút th 45 là 3,65 t ng lên 3,72 t i th i i m 60 phút và


ó

c là

t giá tr cao nh t

là 3,78 t i th i i m 90 phút. Vì giá tr OD450 t i th i i m 90 phút là cao
nh t trong kho ng t (45 - 120 phút) do ó ây chính là th i gian thích
h p

huy t thanh.


47

Giá tr OD
3,79

3,8

3,8
3,78 3,78

3,79

3,76
3,74

3,73


3,75

3,7
3,68

3,7
3,66

3,65

L n1

3,62

L n2
L n3

3,6

3,55

3,5
45

60

90

120
Th i gian


Hình 4.1. K t qu
t i các th i
4.1.3. Xác

nh th i gian

i m

o OD450 ph n ng ELISA
huy t thanh khác nhau

a ELISA v i kháng th

c hi u c a virus

Gumboro và anti-bovine IgG: HRPO
Thí nghi m xác nh nh h ng c a i u ki n ph c h p ph n ng
kháng nguyên - kháng th và anti-bovine IgG: HRPO
c th c hi n trong
30, 45, 60, 90 phút nhi t
phòng, giá tr OD450 c ng
c xác nh 3 l n
l n
c trình bày b ng 4.3.
B ng 4.3. K t qu OD450 ph n ng ELISA t i các th i i m anti-bovine
IgG:HRPO khác nhau
S l n o
Th i gian th c hi n ph n ng kháng nguyên - kháng th (phút)
OD450

30
45
60
L n1
3,61
3,78
3,81
L n2
3,66
3,82
3,79
L n3
3,68
3,84
3,83
Trung bình
3,65
3,81
3,81


48

C n c vào b ng 4.3 K t qu OD450 ph n ng ELISA t i các th i i m
anti-bovine IgG:HRPO khác nhau:
Giá tr OD450 c a ph n ng ELISA
c o 3 l n t i m i th i i m 30,
45, 60 u n m trong kho ng 3,6 - 3,84. Giá tr o OD450 t ng d n t phút th
30 t giá tr cao nh t t i th i i m 45 sau ó duy trì giá tr ó t i th i i m
60 phút. C th

ây giá tr OD450 trung bình o
c là phút th 30 là 3,65
t giá tr cao nh t là 3,81 t i th i i m 45 phút sau ó gi nguyên t i th i
i m 60 phút. Vì giá tr OD450 t i th i i m 45 phút là cao nh t trong kho ng
t (30 - 60 phút) và không t ng thêm t i th i i m 60 phút do ó ây chính là
th i gian thích h p
huy t thanh.

Hình 4.2. K t qu

o OD450 ph n ng ELISA t i các th i i m

anti-

bovine IgG:HRPO khác nhau
4.1.4. Xác nh
pha loãng kháng th phù h p
ch n oán b nh
Gumboro b ng KIT ELISA ch t o
Các gi ng trong a ELISA 96 gi ng ã g n kháng nguyên có n ng
25 g/ml.
xác nh hàm l ng kháng th ph
a, chúng tôi s d ng huy t
thanh c a gà gây nhi m virus Gumboro ngày th 35.
N ng
kháng th ph gi ng
c pha loãng theo t l 1/25, 1/50,
1/100, 1/150, 1/200, 1/300, 1/400 trong kho ng 0,1 – 0,391 µg/ml ( ây là
các n ng
pha loãng b c hai theo hàng d c theo ph ng pháp

checkerboard),
tìm n ng
kháng th bão hòa, t c là m t n ng
t i
thi u kháng th
k t h p v i kháng nguyên cho giá tr OD450 cao nh t.


49

Ph n ng kháng nguyên - kháng th

c th c hi n

37oC, th i gian

c thí nghi m 30 phút, 60 phút, 90 phút
Thí nghi m

c l p l i 3 l n và k t qu

B ng 4.4. Giá tr OD450

kháng th khác nhau

các n ng

(ODTB - ODBLANK) ± STD
Th i gian
a (phút)


pha
loãng kháng
1:25
1:50
1:100
1:150
1:200
1:300
1:400
Các giá tr

c trình bày trong b ng 4.4.

90

60

30

2,541 ± 0,122
2,515 ± 0,102
2,572 ± 0,255
2,362 ± 0,078
2,106 ± 0,114
1,694 ± 0,121
1,251 ± 0,124

1,414 ± 0,065
1,408 ± 0,036

1,468 ± 0,081
1,311 ± 0,145
1,217 ± 0,064
1,011 ± 0,095
0,738 ± 0,088

0,766 ± 0,021
0,800 ± 0,032
0,770 ± 0,071
0,735 ± 0,040
0,678 ± 0,029
0,560 ± 0,029
0,41 ± 0,020

b ng trên

Hình 4.3.

c bi u di n trong

th kh o sát n ng

th

kháng th

V i các k t qu th hi n trong b ng và hình 4.3
và th i gian kháng th thích h p t

hình 4.3


pha loãng kháng th

ng ng là 1:200 và 90 phút.


50

ch n oán b nh
4.1.5. Xác nh th i gian r a kháng th phù h p
Gumboro b ng KIT ELISA ch t o
Các gi ng trong a ELISA 96 gi ng ã g n kháng nguyên có n ng
25 g/ml,
pha loãng kháng th là 1:200, th i gian kháng th là 90 phút.
xác nh th i gian phù h p lo i b kháng th d , chúng tôi ti n hành thí
nghi m v i các i u ki n:
- S l n r a a: 3
- Th i gian r a a: 1 phút, 2 phút, 3 phút.
C n c vào giá tr OD c a các gi ng ph n ng xác nh th i gian r a
a chúng tôi thu
c các k t qu trong b ng 4.5 nh sau: các gi ng các
hàng III và IV
c r a 3 l n, m i l n 2 phút có hi n t ng hình thành các liên
k t không c hi u, các gi ng có cùng i u ki n ph n ng g n k t kháng th
và kháng nguyên nh ng giá tr OD có s sai khác áng k . K t qu này cho
th y, th i gian r a kéo dài d n t i hi n t ng th t thoát ph c h p kháng
nguyên - kháng th .
Trong khi th i gian r a kháng th 3 l n, m i l n 1 phút, các gi ng ph n
ng không hình thành hi n t ng spotness, các gi ng
c r a 3 l n, m i

l n 1 phút thì các giá tr OD cao h n so v i các gi ng
c r a 3 l n, m i l n
2 phút và 3 phút. K t qu này cho th y, th i gian r a kéo dài d n t i hi n
t ng th t thoát ph c h p kháng nguyên- kháng th .
B ng 4.5 K t qu th c hi n

a ELISA v i các th i gian r a kháng

th khác nhau
I

2,11 2,13 2,12 2,12 2,08 2,00 2,08 2,13 2,14 2,13

II

2,09 2,14 2,13 2,14 2,08 2,02 2,12 2,14 2,13 2,15

III

2,01 2,05 2,19 2,11 2,03 2,23 2,07 2,04 2,26 2,07

IV

2,11 3,02 2,21 2,07 2,27 2,06 2,24 2,20 2,03 2,17

V

1,97 1,95 1,95 1,97 1,95 1,97 1,94 1,95 1,96 1,97

VI


1,95 1,98 1,95 1,96 1,97 1,97 1,96 1,95 1,95 1,97


51

K t qu trong b ng 4.5 cho phép k t lu n, th i gian r a

a ELISA là

3 l n, m i l n 1 phút.
Chú thích:
- Hàng I, II: là các gi ng

kháng th pha loãng 1:200, th i gian r a

a

là 1 phút
- Hàng III, IV: là các gi ng

kháng th pha loãng 1:200, th i gian r a

a là 2 phút
- Hàng V, VI: là các gi ng

kháng th pha loãng 1:200, th i gian r a

a là 3 phút
4.1.6. Xác


nh th i gian

conjugate phù h p

ch n oán b nh Gumboro

b ng KIT ELISA ch t o
Các gi ng trong
25 g/ml,

a ELISA 96 gi ng ã g n kháng nguyên có n ng

pha loãng kháng th là 1:200, th i gian

37oC, th i gian r a

a là 1 phút, s l n r a

kháng th là 90 phút

a là 3.

Trong thí nghi m này, chúng tôi b trí các gi ng
màu (SC) nh m m c ích ki m tra tính n

i ch ng c ch t sinh

nh c a c ch t, các gi ng này ch


có s t n t i c a ph c h p kháng nguyên - kháng th và c ch t sinh màu. Do
thi u enzyme, vì v y theo logic úng thì các gi ng này có tín hi u quang h c
r t th p, ch
trong

t kho ng 0,09 – 0,15 Trong tr

ng h p, tín hi u quang h c

a cao h n thì có th do hai tình hu ng: 1)

a r a không s ch ho c 2)

c ch t sinh màu b h ng.
ng th i, các m u huy t thanh âm tính chu n c ng
ánh giá vi c có hay không hình thành liên k t không
vào ph c h p kháng nguyên - kháng th do nh h
logic úng, các gi ng này có tín hi u quang h c t
ch ng SC. Trong tr

c s s ng

c hi u c a conjugate

ng c a th i gian . Theo
ng

ng v i các gi ng

i


ng h p tín hi u quang h c cao h n, i u ó có ngh a là

có hình thành các liên k t không

c hi u c a conjugate.