Nghiên cứu đặc tính của Chitinase tự nhiên và biểu hiện Chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium Lecanii (Luận văn thạc sĩ)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (33.43 MB, 135 trang )
N
VÀ
LECANICILLIUM LECANII
T
i Trung tâm H
, 2015
-
/>
N
VÀ
LECANICILLIUM LECANII
Chuyên ngành:
62 42 01 16
:
T
i Trung tâm H
, 2015
-
/>
i
,
,
-
.
,m
M
.
i Trung tâm H
-
/>
ii
,
.TS. Ng
.
Tôi xin chân thành
s
E
cho tôi trong quá trình
.
Lecanicillium
thôn do
-2013.
.
, Khoa Sinh
-K
q
G
-
i Trung tâm H
-
/>
iii
Trang
........................................................................................
i
..............................................................................................
ii
...................................................................................................
iii
..........................................................
vii
HÌNH.....................................................................................
ix
xii
....................................................................................... .............
1
....................................................................................... ........
1
................................................................................
2
................................................................................ 2
............................................................
3
....................................
3
.............................................. ......... 5
Lecanicillium lecanii .................................................................. 5
1.2. Chitinase .............................................................................................. 5
6
1.
7
9
.................................... 12
14
16
i Trung tâm H
-
/>
iv
L. lecanii và chitinase......................................... 19
1.3
............................ 19
1.3.2. Trong
..........................................................................
1.3
công
.................................................... 24
1.4
1.4.1.
1.4.2.
23
óa chitinase.........
25
.......................................................................................
25
......................................................................................... 29
..........................................
33
............................................................................. 33
2.1.2.
.......................................................................................
33
...............................................................................................
33
.............................................................................................
33
..............................................................................
34
2.1.4. Du
........................................................................... 34
33
................................................................... 33
........................................................................ 33
35
2.2.3
....................................................
2.2.4. Các p
2.2.7.
3.1. S
42
............................................................. 47
lý
.......................................................................................
49
.....................
50
,
i Trung tâm H
-
/>
v
L. lecanii.........................................................................................
50
3.1.1.
L. lecanii
............... 50
3.1.2.
L. lecanii
...
50
........................................ 53
L. Lecanii 43H..................................................................................... 61
............................................................................. 61
L. lecanii
3.2.2.
43H...............................................................................................................
3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitina
64
L. lecanii 43H...... 67
P. pastoris X33............................................................................ 71
n gen Chit
.............
71
P. pastoris.................
72
................................................................................... 77
P. pastoris X33....... 79
tính
L. lecanii.............................................................................
85
.............................................................................................................
85
........................
87
3.
........... 88
89
L. lecanii 43H..............................
i Trung tâm H
-
90
/>
vi
...................................................................
93
..............................................................................................
93
.............................................................................................
93
...
94
.........................................................................
95
............................................................................. 114
i Trung tâm H
-
/>
vii
Ti ng Anh
Ti ng Vi t
BLAST
Basic local alignment search tool Ph n m m so sánh trình t
bp
Base pair
C
cDNA
Complement DNA
DNA b sung
Chit
Gene encoding chitinase
Gen mã hóa chitinase
CMC
Cacboxyl methyl cellulose
Cacboxyl methyl cellulose
DEPC
Diethylpyrocarbonate
Diethylpyrocarbonate
DNA
Deoxyribonucleic acid
Axit deoxyribonucleic
DNase
Deoxyribonuclease
Enzyme th y phân DNA
dNTPs
2 -Deoxynucleoside 5 -
Các nucleotide
triphosphate
Control
IPTG
i ch ng
Isopropyl-beta-D-
Isopropyl-beta-D-
thiogalactopyranoside
thiogalactopyranoside
EDTA
Ethylenediamine tetraacetic acid
Axit ethylenediamine tetraacetic
EtBr
Ethidium bromide
Ethidium bromide
kb
Kilo base
Kilo base
kDa
Kilo Dalton
Kilo Dalton
M
Marker
Thang chu n
OD
Optical density
M
PCR
Polymerase chain reaction
Ph n ng khu
RNA
Ribonucleic acid
Axit ribonucleic
i Trung tâm H
-
quang
i gen
/>
viii
RNase
Ribonuclease
Enzyme th y phân RNA
RT-PCR
Reverse transcription polymerase
Ph n ng khu
i gen
chain reaction
rChit
Recombinante chitinase
SDS-
Sodium dodecyl sulfate
PAGE
Polyacrylamide gel
Chitinase tái t h p
n di bi n tính protein trên gel
polyacrylamide
electrophoresis
Taq
Thermus aquaticus
Thermus aquaticus
TBE
Tris boric acid EDTA
Tris boric acid EDTA
TE
Tris EDTA
Tris EDTA
TEMED
N,N,N ,N -
N,N,N ,N -
Tetramethylethylenediamine
Tetramethylethylenediamine
v/v
Volume/volume
Th tích/th tích
w/v
Weight/volume
Kh
i Trung tâm H
-
ng/th tích
/>
ix
HÌNH
Trang
Hình 1.1.
C. immitis........................... 10
Hình 1.2.
Ralstonia sp. A-471 ............. 11
Hình 1.3.
S. mecescens........... 12
-
Hình 1.4.
B. circulans................................................................................................... 13
-
Hình 2.1.
Miller............................................................................................................ 37
Hình 2.2.
t
........................................................ 38
Hình 2.3.
Bradford........................................................................................................ 39
-Burk.............................................................. 40
Hình 2.4.
Chit
Hình 2.5.
P. pastoris X33............................................................................................. 47
L. lecanii........................... 50
Hình 3.1.
Hình 3.2.
L. lecanii
XhoI và XbaI...................... .......................................................................... 51
và c
Hình 3.3.
52
L. lecanii
Hình 3.4.
................................................................................ 53
Hình 3.5.
................................................................
i Trung tâm H
-
55
/>
x
Hình 3.6.
................................................................................ 56
Hình 3.7. Hình
n di SDS-PAGE c a chitinase tinh s ch t ch ng
n m L. lecanii 43H và ho t tính chitinase c
DEAE-Sephadex A-
ch có b
n qua c t
t chitin huy n phù
0,5%.............................................................................................................. 59
Hình 3.8. N
Hình 3.9.
và pH
b n nhi t
...................................... 61
b n pH c a chitinase .................................... 62
ng c a dung môi h
Hình 3.10.
và ch t t y r a lên ho t tính
chitinase ....................................................................................................... 65
Hình 3.11. Phân tích TLC các s n ph m th y phân chitin b i chitinase....... 67
dòng gen Chit
Hình 3.12.
Hình 3.13. Trình
............................. 67
gen Chit
L. lecanii 43H.....
68
Chit
Hình 3.14.
L. Lecanii 43H và
khác trong GenBank...................................... 69
Chit
Hình 3.15.
70
o sánh trình
Hình 3.16.
L. Lecanii 43H và
khác trong GenBank.................................. 71
Hình 3.17.
.....................
Hình 3.18.
P. pastoris
X33...............................................................................................................
72
71
Hình 3.19.
................................................ 74
Hình 3.20.
nhau..............................................................................................................
i Trung tâm H
-
75
/>
xi
Hình 3.21. i n di SDS-PAGE c a rChit tinh s ch t P. pastoris X33...... 78
Hình 3.22. N
........................................... 80
......................................... 81
Hình 3.23.
Hình 3.24.
rChit ............................................................................................................. 84
F. oxysporum và R. solani
Hình 3.25.
................................................................................................. 87
R. solani và F. oxysporum
Hình 3.26. S
L. lecanii 43H.............................................. 87
Hình 3.27. H
men P. pastoris X33 ................................................................................... 88
n y
Hình 3.28.
L. lecanii 43H ........................................................................... 90
và
Hình 3.29.
L. lecanii
43H .............................................................................................................. 92
i Trung tâm H
-
/>
xii
Trang
.......................................................... 32
L. lecanii
................................................................................................. 34
....................................................
39
a 1/[S] và 1/V........................................................... 40
...................................................................
44
.......................................................................... 45
6.
B ng 3.1. K t qu tinh s ch chitinase t ch ng n m L .lecanii 43H........... 59
... 63
P. pastoris X33/pPChi
...............................................................
73
................ 74
P. pastoris X33.................. 77
... 82
i Trung tâm H
-
/>
1
1.
tâm ngh
. Cùng
-
hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease
-acetyl
-1,4-glucosid
1
và C4
-
trong chitin.
i Trung tâm H
-
/>
2
:
Lecanicillium lecanii
L. lecanii
Pichia pastoris
chitinase
X33
.
L. lecanii
cao.
;
L. lecanii
;
L. lecanii
Pichia pastoris X33;
.
L. lecanii sinh chitinase cao
(1)
.
(2)
.
i Trung tâm H
-
/>
3
4.1.
,
Fusarium oxysporum và Rhizoctonia
solani
L. lecanii 43H
xo
L. lecanii.
: (i) Gen
Chit
L. lecanii 43H
;
Chit
Chit mã hóa endochitinase
JX665045. (ii) B
P. pastoris
Tinh
.
(iii) C
.
L. lecanii.
L. lecanii
L. lecanii.
i Trung tâm H
-
/>
4
uá trình
L. lecanii.
i Trung tâm H
-
/>
5
1
1.1.
Lecanicillium lecanii
Lecanicillium
Lecanicillium
Lecanicillium lecanii, L. attenuatum,
L. longisporum, L. muscarium
L. nodulosum.
L. lecanii
Verticillium lecanii. Ngày nay, L. lecanii
Cordyceps confragosa [124].
Lecanicillium
[22],
Lecanicillium
[47], [49], [60], [93].
[95].
L. lecanii
chính là:
L. lecanii
L. lecanii sinh ra
Lecanicillium
C
L. lecanii
i Trung tâm H
-
/>
6
L. lecanii
1.2. Chitinase
Chit
-1,4-
1
và C4
-
chitobiosidase (EC 3.2.1.29) và N-
-acetyl glucosamine.
-acetyl glucosamine thôn
1,4,
và -
-
-
i Trung tâm H
-
/>
7
-
[57].
[27].
1.2.1.
Trichoderma
[32], [37]; Glicocladium; Metharhizium [61], [128]; Beauveria, Lecanicillium
[23], [42], [91]; Aspergillus [145]; Penicillium [80]
Serratia [148], Aeromonas [139], Arthrobacter [100],
Micrococcus [19], Clostridium, Bacillus [24], [137]
Streptomycetes [72], [144].
i Trung tâm H
-
/>
8
m gia vào
Helix aspersa
[89], [90].
1.2.2.
chitinase
tác
- và S-glycoside) (International Union of Biochemistry
and Molecular Biology, 1992; />Chitinase
các nhóm khác nhau.
i Trung tâm H
-
/>
9
th
-acetyl glucosaminidase (EC.3.2.1.30).
-acetylglucosaminidase phân
-acetyl glucosamine [106].
hydrolase 18, 19 và 20 [52].
chitobiase và N[73]
Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma
harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens
Streptomyces griceus
Haemophillus influenzae
d
allosamidin [73]
-N-acetyl-D-Glucosamine
Streptomyces
h 5 nhóm: là
i Trung tâm H
-
/>
10
-
chitin (vùng g
[106].
1.2.3.
1.2.3.1.
B. cereus
[53],
[72],
Streptomyces sp. M-
Streptomyces griserus
[132].
Trichoderma atroviride
mã hó
[88].
Clonostachys rosea
amino acid [135].
acid [43]. Chitinase
Coccidioides immitis
L. psalliotae
i Trung tâm H
-
/>
11
[42]. Zhu và
L. lecanii
các
,
L. lecanii
[151].
ino
acid [150].
C. immitis
(
(
-
-
(S3-S6) và
(H31 và 2 nên không có kí
[135].
C. immitis [135]
Hình 1.1.
1.2.3.2.
gian
i Trung tâm H
-
/>
