Tải bản đầy đủ (.pdf) (85 trang)

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (970.35 KB, 85 trang )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI
VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: PHẠM NGỌC HÀ

Niên khóa

: 2006 – 20010

Tháng 7/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ THU NHẬN SINH KHỐI VI SINH


VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT

PHẠM NGỌC HÀ

KS. BIỆN THỊ LAN THANH

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Em xin gởi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Bộ môn
Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ
Chí Minh đã chỉ dạy, truyền đạt và trang bị cho em những kiến thức bổ ích trong suốt
quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Em xin gởi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Như Nhứt và cô Biện Thị Lan Thanh
đã tạo điều kiện thuận lợi cho em có cơ hội làm việc, học tập và thực hiện tốt đề tài tốt
nghiệp.
Em chân thành cảm ơn kỹ sư Đỗ Hoành Quân đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em
trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Anh như một người thầy, người bạn đã sẵn sàng giúp
đỡ và chia sẻ với em những khó khăn, bế tắc khi thực hiện đề tài này.
Xin gởi lời cảm ơn đến:
Những người bạn của lớp DH06SH đã cùng tôi san sẻ những buồn vui, cùng
nhau học tập và trao đổi kiến thức trong suốt thời sinh viên.
Toàn thể nhân viên Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường đã chỉ dạy, hỗ trợ cho

tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Đặc biệt cho con gởi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến gia đình nhất là Mẹ
đã luôn bên cạnh, tin tưởng, ủng hộ con và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con để con
có thể vững bước đến ngày hôm nay.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010

Phạm Ngọc Hà

i


TÓM TẮT
Trong khí quyển, nitơ là một trong những nguyên tố dồi dào nhất, nó chiếm tới 80
% thể tích khí quyển, tuy nhiên thực vật lại không thể sử dụng trực tiếp được. Một vấn đề
cần đặt ra là làm sao để sử dụng nguồn đạm phong phú này một cách hiệu quả và hữu ích
cho cây trồng. Xuất phát từ ý tưởng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển
chọn và thu nhận sinh khối vi sinh vật cố định đạm tự do”; với mục đích là thu nhận được
chủng Azotobacter và Azospirillum có khả năng cố định đạm tốt để biến nitơ trong khí
quyển thành dạng nitơ hữu ích cho cây trồng.
Để thực hiện mục đích trên, chúng tôi đã sử dụng một số phương pháp chính sau:
phương pháp lấy mẫu, phương pháp phân lập và làm thuần, xác định mật độ tế bào bằng
phương pháp đo độ đục, xác định nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl.
Với những phương pháp trên, chúng tôi thu nhận được một số kết quả sau: phân
lập được 20 chủng trên môi trường đặc trưng cho Azotobacter và 30 chủng trên môi
trường đặc trưng cho Azospirillum. Trong đó, đã chọn ra được hai chủng có những đặc
trưng giống với Azotobacter có kí hiệu là Az 2.2 và Az 5.1 phát triển và cố định đạm tốt
trên môi trường Fedorow với nguồn carbon là 2 - 2,5 % mannitol, pH tối ưu 7 - 8, thời
gian nuôi cấy thích hợp là 120 giờ. Hai chủng được chọn lọc khác có những đặc điểm
tương tự với giống Azospirillum có kí hiệu là As 2.5 và As 4.1; chúng phát triển và cố

định đạm tốt trên môi trường NFb với nguồn carbon là 1 % sucrose, pH tối ưu 7 - 7,5,
thời gian nuôi cấy thích hợp là 120 giờ.

ii


SUMMARY
In the atmosphere, nitrogen is one of the abundant elements, occupy 80% of the
atmosphere volumn. However, plants are not able to absorb directly. The problem is
offered is how to use the rich source of nitrogen efficiently and to be useful for plants.
Therefore, we carried out the thesis “ Isolation, selection and collection biomass free
nitrogen-fixing organism” to collect Azotobacter and Azospirillum strains and to produce
bioproduct being able to fix nitrogen well to transfer from molecular nitrogen in the
atmosphere to useful nitrogen for plant.
For the above purpose, some main methods were used. There included collecting
sample, isolating and homogenizing, determining cellular density by the optical density
method, determining total nitrogen the Kjeldahl method.
By the mentioned methods, we collected results such as: isolated 20 strains by
Azotobacter’s selective medium and 30 strains by Azospirillum’s selective medium. There
were 2 strains having specific characteristics similar to Azotobacter. They were named Az
2.2 and Az 5.1 developing and fixing nitrogen well in Ferodow medium with 2 - 2,5 %
mannitol, optimal pH 7 - 8, and a 120-hour incubation period was. Two different selected
strains named As 2.5 and As 4.1 had specific characteristics similar to Azospirillum; they
developed and fixed nitrogen fairly well in NFb medium with 1% sucrose, optimal pH 7 7,5, a 120-hour incubation period.
Key words: Azotobacter, Azospirillum, free nitrogen-fixing organism

iii


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ i
TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii
SUMMARY .................................................................................................................. iii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu ..................................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên ........................................................................................ 3
2.2. Vai trò của nitơ đối với thực vật ............................................................................... 5
2.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên................................................................. 6
2.3.1. Quá trình khoáng hóa ............................................................................................ 6
2.3.2. Quá trình phản nitrat hóa ....................................................................................... 6
2.3.3. Quá trình cố định nitơ phân tử............................................................................... 6
2.4. Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ ......................................................................... 8
2.4.1. Phân loại ................................................................................................................ 8
2.4.2. Đặc điểm ................................................................................................................ 8
2.4.3. Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên................................................... 9
2.5. Đặc điểm của một số loài vi sinh vật cố định đạm ................................................... 9
2.5.1. Azotobacter ............................................................................................................ 9
a. Đặc điểm hình thái ....................................................................................................... 9
b. Đặc điểm phân loại .................................................................................................... 10
c. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ......................................................................................... 11
2.5.2. Azospirillum ......................................................................................................... 14
iv



a. Đặc điểm hình thái ..................................................................................................... 14
b. Đặc điểm phân loại .................................................................................................... 15
c. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ......................................................................................... 16
2.6. Ứng dụng của Azotobacter và Azospirillum ........................................................... 18
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 21
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 21
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 21
3.2.1. Mẫu thí nghiệm.................................................................................................... 21
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 21
3.2.3.Các môi trường dùng cho thí nghiệm ................................................................... 21
3.3. Phương pháp thí nghiệm......................................................................................... 22
3.3.1. Tăng sinh vi khuẩn .............................................................................................. 22
3.3.2. Phương pháp định lượng vi sinh vật.................................................................... 23
3.3.3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl ......................................... 23
3.3.4. Thí nghiệm 1: phân lập và làm thuần .................................................................. 24
3.3.4.1. Lấy mẫu ............................................................................................................ 24
3.3.4.2. Phân lập Azotobacter ........................................................................................ 24
3.3.4.3. Phân lập Azospirillum ....................................................................................... 24
3.3.5. Thí nghiệm 2 ....................................................................................................... 25
3.3.6. Thí nghiệm 3........................................................................................................ 25
3.3.6.1. Quan sát hình thái tế bào, xác định Gram ....................................................... 25
3.3.6.2. Khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn đã chọn lọc.. 26
a. Thử nghiệm khả năng sử dụng carbon....................................................................... 26
b. Thí nghiệm xác định quan hệ đối với oxy ................................................................. 26
c. Thử nghiệm oxydase .................................................................................................. 27
d. Thí nghiệm xác định khả năng tạo thành indol ......................................................... 28
e. Thử nghiệm tính di động trong môi trường thạch mềm ............................................ 29
3.3.7. Thí nghiệm 4........................................................................................................ 29
a. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon ...................................................................... 29


v


b. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ carbon .................................................................. 29
c. Khảo sát ảnh hưởng của pH ....................................................................................... 30
d. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .............................................................. 30
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 31
4.1.Kết quả..................................................................................................................... 31
4.1.1.Thí nghiệm 1: phân lập và làm thuần ................................................................... 31
4.1.2. Thí nghiệm 2........................................................................................................ 33
4.1.3. Thí nghiệm 3........................................................................................................ 36
4.3.5. Thí nghiệm 4........................................................................................................ 38
a. Ảnh hưởng của nguồn carbon .................................................................................... 38
b. Ảnh hưởng của nồng độ carbon ................................................................................ 42
c. Ảnh hưởng của pH ..................................................................................................... 46
d. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ............................................................................ 49
4.2. Thảo luận ................................................................................................................ 53
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 57
5.1. Kết luận................................................................................................................... 57
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 59
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
ABA


Abscisic acid

ACC deaminase

1-aminocyclopropane-1-carbonxylate deaminase

ADP

Adenosin diphosphate

ATP

Adenosin triphosphate

CRA

Congo Red Agar

GA3

Giberrellic acid

IAA

Indole-3-acetic acid

ILA

Indole lactic acid


NCBI

National Center for Biotechnology Information

OD

Optical density

TMPD

N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Hàm lượng nitơ được cố định .......................................................................... 5
Bảng 2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa............................................................................. 13
Bảng 2.3 Các loài Azospirillum..................................................................................... 16
Bảng 2.4 Những đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................................. 18
Bảng 3.1 Các môi trường dùng cho thí nghiệm ............................................................ 21
Bảng 4.1 Giá trị pH của 20 mẫu đất đã thu thập ........................................................... 31
Bảng 4.2 Danh mục các chủng vi sinh vật .................................................................... 32
Bảng 4.3 Danh mục các chủng vi sinh vật .................................................................... 33
Bảng 4.4 Hàm lượng nitơ của 20 chủng ....................................................................... 34
Bảng 4.5 Hàm lượng nitơ của 30 chủng ....................................................................... 35
Bảng 4.6 Kết quả nhuộm Gram .................................................................................... 37
Bảng 4.7 Kết quả thử nghiệm sinh lý, sinh hóa ............................................................ 38
Bảng 4.8 Hàm lượng nitơ tổng số ................................................................................. 38
Bảng 4.9 Mật độ tế bào của 2 chủng Az ....................................................................... 39

Bảng 4.10 Hàm lượng nitơ tổng số ............................................................................... 40
Bảng 4.11 Mật độ tế bào của 2 chủng As ..................................................................... 41
Bảng 4.12 Hàm lượng nitơ tổng số ............................................................................... 42
Bảng 4.13 Mật độ tế bào của 2 chủng Az ..................................................................... 43
Bảng 4.14 Hàm lượng nitơ tổng số ............................................................................... 44
Bảng 4.15 Mật độ tế bào của 2 chủng As ..................................................................... 45
Bảng 4.16 Hàm lượng nitơ tổng số ............................................................................... 46
Bảng 4.17 Mật độ tế bào của 2 chủng Az ở các pH ...................................................... 47
Bảng 4.18 Hàm lượng nitơ tổng số của 2 chủng As ở các pH ...................................... 48
Bảng 4.19 Mật độ tế bào của 2 chủng As ở các pH khác nhau..................................... 48
Bảng 4.20 Hàm lượng nitơ tổng số ............................................................................... 49
Bảng 4.21 Mật độ tế bào ở các thời gian khác nhau của 2 chủng Az ........................... 50
Bảng 4.22 Hàm lượng nitơ tổng số ............................................................................... 51
Bảng 4.23 Mật độ tế bào ở các thời gian khác nhau của 2 chủng As ........................... 52

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Quá trình tuần hoàn đạm .................................................................................. 3
Hình 2.2 So sánh giữa cây lúa thiếu nitơ ........................................................................ 5
Hình 2.3 Chu trình nitơ trong tự nhiên ........................................................................... 7
Hình 2.4 Cấu trúc hoàn chỉnh của nitrogenase ............................................................... 8
Hình 2.5. Tế bào Azotobacte ........................................................................................... 9
Hình 2.6 Tế bào Azospirillum ....................................................................................... 15
Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm ................................................................ 22
Hình 4.1 Biểu đồ hàm lượng nitơ 20 chủng vi khuẩn .................................................. 34
Hình 4.2 Biểu đồ hàm lượng nitơ 30 chủng vi khuẩn .................................................. 35
Hình 4.3 Khuẩn lạc của các chủng chọn lọc ................................................................. 36
Hình 4.4 Nhuộm Gram các chủng chọn lọc.................................................................. 37

Hình 4.5 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau.................................... 39
Hình 4.6 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào ................................................................. 40
Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn carbon ..................................................... 41
Hình 4.8 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào ................................................................. 41
Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hưởng của các nồng độ mannitol............................................... 43
Hình 4.10 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào ............................................................... 44
Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hưởng của các nồng độ sucrose .............................................. 44
Hình 4.12 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào ............................................................... 45
Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hưởng của các giá trị pH.......................................................... 46
Hình 4.14 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào ............................................................... 47
Hình 4.15 Biểu đồ ảnh hưởng của các giá trị pH.......................................................... 48
Hình 4.16 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào ............................................................... 49
Hình 4.17 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .................................................. 50
Hình 4.18 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào ............................................................... 51
Hình 4.19 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy ........................................................ 52
Hình 4.20 Biểu đồ tương quan mật độ tế bào ............................................................... 53

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong khí quyển, nitơ chiếm gần 80% thể tích, tuy nhiên chúng tồn tại ở dạng khí
N2 với liên kết 3 rất bền vững (N≡N), ở dạng này thực vật không thể sử dụng trực tiếp
được. Để sử dụng được nguồn đạm dồi dào này cần phải phá vỡ liên kết bền vững trong
phân tử N2, tạo ra các loại đạm dễ tiêu như urê, nitrat…
Trong công nghiệp sản xuất phân bón hóa học, để phá vỡ liên kết này người ta
thực hiện các phản ứng hóa học dưới điều kiện nhiệt độ, áp suất rất cao và có sự tham gia
của nhiều chất xúc tác. Do dó, việc sản xuất phân bón bằng phương pháp này sẽ gây tốn
kém, ô nhiễm môi trường và tác động xấu đến sức khỏe của con người.

Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp, việc nghiên
cứu và tìm ra cách chuyển hóa để biến nguồn đạm dồi dào từ khí quyển vào đất mà không
gây tác động xấu đến môi trường và sức khỏe con người đã và đang được nghiên cứu.
Một trong những hướng quan trọng và hiệu quả là việc sử dụng vi sinh vật có khả năng cố
định đạm nhờ hệ enzyme nitrogenase của chúng.
Azotobacter và Azospirillum là hai giống vi sinh vật cố định đạm tự do có khả năng
làm giàu nguồn đạm trong đất - nguồn đạm cây trồng sử dụng được. Chúng có khả năng
này là nhờ quá trình cố định nitơ sinh học, quá trình khử N2 trong không khí thành NH3
dưới tác dụng của enzyme nitrogenase. Ngoài ra, chúng còn có khả năng kích thích sự hấp
thu các chất dinh dưỡng, khoáng của thực vật (NO3-, PO43-, K+, Fe2+) và sản sinh ra các
chất có khả năng điều hòa sinh trưởng ở thực vật (IAA, ILA…). Hai vi sinh vật trên phân
bố rộng rãi trong đất và nước nhưng sự phân bố trên không đồng đều và số lượng hiện
diện quá ít không đem lại hiệu quả cao. Do đó, việc phân lập và tuyển chọn chủng giống
có hoạt tính cố định đạm cao để bổ sung vào đất trồng trọt là một trong những khâu quan
trọng.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn
và thu nhận sinh khối vi sinh vật cố định đạm tự do”.

1


1.2. Yêu cầu
™ Phân lập các chủng Azotobacter và Azospirillum có khả năng cố định đạm.
™ Tuyển chọn và thu nhận sinh khối một số chủng vi khuẩn Azotobacter và
Azospirillum có hoạt tính cố định đạm cao để ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh.
1.3. Nội dung thực hiện
™ Phân lập, làm thuần các chủng vi sinh vật từ các mẫu đất thu thập tại các vùng
khác nhau trên môi trường chuyên biệt.
™ Chọn lọc các chủng Azospirillum và Azotobacter có khả năng cố định đạm cao.
™ Quan sát hình thái tế bào, xác định Gram và một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa

chính của các chủng vi khuẩn chọn lọc.
™ Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên sự tăng trưởng và khả năng cố định đạm
(nguồn carbon, nồng độ carbon, pH, thời gian nuôi cấy) của các chủng chọn lọc.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên
Trong nước, nitơ chủ yếu ở dạng hợp chất của NH4+, NO2-, NO3-. Trong đất có 2 dạng
nitơ tồn tại đó là nitơ vô cơ trong các muối khoáng và nitơ hữu cơ trong xác, chất bài tiết
từ sinh vật. Các hợp chất chứa nitơ trong xác và chất bài tiết của động vật và thực vật bị
một số loại nấm và vi khuẩn phân giải.
Trong đất thông khí tốt, amon hầu như chuyển hóa toàn bộ thành hợp chất nitrat. Phần
lớn hợp chất nitrat được thực vật hấp thụ, phần còn lại bị mất đi do mưa rửa trôi và tác
dụng của phản nitrat hóa. Khi nước trong đất ở trạng thái bão hòa do mưa hoặc ngập
nước, do thiếu oxy mà sinh ra phản nitrat hóa.

Hình 2.1 Quá trình tuần hoàn đạm chủ yếu trong tự nhiên.
Hình 2.1 là quá trình tuần hoàn đạm chủ yếu trong tự nhiên. Hợp chất đạm mà thực
vật hút từ đất, một phần như gốc rễ được trả lại đất, phần còn lại được động vật và thực
vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất bài tiết và xác trả lại đất. Những chất hữu cơ
này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh vật, nấm bị khử thành đạm ở dạng hữu hiệu.

3


Trên thực tế trong tuần hoàn này đạm bị mất đi khá nhiều. Phần lớn phân người và gia
súc theo nước chảy ra biển do tưới, do mưa mà số lượng lớn đạm trong đất bị rửa trôi,
cuối cùng chảy vào biển. Số đạm này, một phần được trả lại bằng phân bón có nguồn gốc

từ sản phẩm của biển, nhưng phần rất lớn là ở dạng mà thực vật lục địa hầu như không thể
sử dụng được nữa, nghĩa là bị loại ra khỏi hệ thống tuần hoàn.
Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N2) chiếm khoảng 80 %, ở
dạng nguyên tử kép (N2) được khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị bền
vững (N≡N). Mặc dù rất cần nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ được nitơ ở
dạng NO3- và NH4+. Để sử dụng được nguồn nitơ lớn từ không khí có 2 con đường chính
là hóa học và sinh học.
™ Hóa học: Kể từ năm 1920, biện pháp công nghiệp Haber - Bosch đã giúp con
người phá vỡ liên kết ba này. Biện pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt độ rất cao (450
- 500oC), áp suất là 125 atm và Fe3+ là chất xúc tác. Các hợp chất nitơ được tổng hợp hóa
học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ lớn và ổn định. Tuy nhiên, bên cạnh việc
sử dụng phân đạm được tổng hợp hóa học cho nông nghiệp có thể làm tăng năng suất cây
trồng thì cũng đem lại những tác hại vô cùng to lớn, vì trung bình chỉ có 40 - 50 % lượng
đạm bón được cây hấp thu, phần còn lại gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí…
từ đó gây hại thậm chí là tiêu diệt các sinh vật. Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa
học gây hại rất lớn đối với cá, động vật thân mềm và con người. Một ví dụ cụ thể ở những
người sống ở nông thôn và sử dụng giếng nước chứa nitrat cao thì thường có hiện tượng
oxy kết hợp với hemoglobin (gọi là hiện tượng Methemoglobinemia) điều này gây hại
đến tế bào máu. Ngoài ra, việc lạm dụng phân đạm tổng hợp hóa học còn gây tác hại cho
đất (như đất bị bạc màu, chua, chai…) hay ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm (như việc
tồn dư các hợp chất chứa đạm).
™ Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase để thực hiện
được một quá trình sinh học đặc biệt - quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả
năng thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ. Việc sử dụng phân
bón vi sinh chứa các vi sinh vật trên vẫn đảm bảo cho năng suất cây trồng khi hạn chế sử
dụng phân bón hóa học lại cho sản phẩm rất an toàn, lượng nitrat giảm đáng kể, đất không

4



bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo đất do các hệ sinh vật
có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn, cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn. Ngoài
ra, còn có các con đường tạo nitơ khác như do sấm chớp hay cháy.
Bảng 2.1 Hàm lượng nitơ được cố định bởi các con đường khác nhau
Hàm lượng nitơ cố định

Cách cố định nitơ

(1012 g/năm)

Không phải con đường sinh học

80

(Non-biologital)
Công nghiệp (Industrial)

50

Sự cháy (Combustion)

20

Chớp hay sét (Lightning)

10

Con đường sinh học

175


(Biologital)
Đất nông nghiệp

90

Đất rừng và không phải nông nghiệp

50

Biển

35

2.2. Vai trò của nitơ đối với thực vật
Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp
lục, ATP… Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao động từ 1 - 3
%. Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng trong
đời sống sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của cây trồng. Thiếu nitơ, cây
sinh trưởng kém, chlorophylle không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân
cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên năng suất giảm. Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh
hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất của cây trồng.
Cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ đổ, giảm năng suất nghiêm
trọng và đôi khi không có thu hoạch.

Hình 2.2 So sánh giữa cây lúa thiếu nitơ (trái) và được cung cấp đầy đủ nitơ (phải).
5


2.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên

2.3.1. Quá trình khoáng hóa
Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của quần thể
vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy thuộc vào điều
kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau. Giai đoạn này có sự tham gia của các
chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia
vào quá trình oxy hóa những hợp chất chứa nitơ thành nitrat (NO3-), một dạng thích hợp
để cho cây trồng hấp thu.
Vi khuẩn amon hóa
NH4+

Hợp chất hữu cơ
Vi khuẩn nitrat hóa
+

NH4

NO2Nitrosomonas
Nitrobacter

NO2-

NO3-

2.3.2. Quá trình phản nitrat hóa
Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí dưới tác
dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ.
Vi khuẩn phản nitrat hóa
NO3-

N2


2.3.3. Quá trình cố định nitơ phân tử
Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống
cộng sinh ở rễ cây họ Đậu hay Azotobacter sống tự do... sẽ biến đổi N2 trong không khí
thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và
đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất. Để quá trình này xảy ra thì phải có lực khử mạnh,
ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong điều kiện này enzyme nitrogenase mới
hoạt động).
6


Nitrogenase

H2O

N2 + H2

NH3

NH4+

Vi khuẩn cố định đạm

Hình 2.3 Chu trình nitơ trong tự nhiên.
™ Cơ chế cố định đạm của vi sinh vật
Phản ứng cố định nitơ được xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau:
N2 + 8 H+ + 8 e- +16 ATP → 2 NH3 + H2 +16 ADP +16 Pi
Như phương trình trên, nitrogenase xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3 trong sự
hiện diện của ATP và chất khử như dithionite trong phòng thí nghiệm hay ferredoxin
trong cơ thể sống. Nitrogenase là một phức hệ enzyme được cấu tạo bởi 2 thành phần, đó

là protein có phân tử nhỏ. Một thành phần gọi là protein sắt - molypden (Mo - Fe protein)
còn gọi là thành phần I, thành phần kia gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là
nitrogenase khử hay thành phần II. Thành phần I và thành phần II của nitrogenase đều rất
mẫn cảm với oxy, vì vậy nên hoạt động cố định nitơ của vi sinh vật diễn ra trong điều
kiện kỵ khí.

7


Hình 2.4 Cấu trúc hoàn chỉnh của nitrogenase.
2.4. Đại cương về vi khuẩn cố định nitơ
2.4.1. Phân loại
Vi khuẩn cố định nitơ được phân thành 2 nhóm nhỏ: vi khuẩn sống cộng sinh và vi
khuẩn sống tự do.
2.4.2. Đặc điểm
™ Vi khuẩn sống cộng sinh là những vi khuẩn sống tương tác với thực vật theo kiểu
hai bên cùng có lợi. Khi đó, vi khuẩn sống cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi chất dinh
dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định cư, điển hình
là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ Đậu. Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn
và thực vật được xem như là sự tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó vi
khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh. Hầu hết những vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn
Gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu; hay xạ khuẩn - vi khuẩn Gram
dương có khả năng hình thành nốt sần trên cây thân gỗ, cây 2 lá mầm và cây bụi. Ban
đầu, những vi khuẩn cộng sinh ở cây họ Đậu được phân loại thành chi Rhizobium, do đó,
những vi khuẩn này thường được nói đến như là những vi khuẩn nốt rễ (rhizobia). Ngày
nay, những vi sinh vật cộng sinh ở cây họ Đậu được phân loại thành nhiều chi, trong đó,

8



hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium, Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium và
Bradyrhizobium.
™ Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do (không cộng sinh) là những vi khuẩn cố định
đạm không xâm nhập vào thực vật theo hướng cộng sinh chuyên biệt. Trong số này quan
trọng nhất là loài thuộc chi Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas và Clostridium.
2.4.3. Vai trò của vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên
Vai trò quan trọng nhất của những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ
cung cấp đạm cho cây trồng. Tuy nhiên, bên cạnh đó, các vi khuẩn cố định nitơ còn được
biết đến với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như: kích thích sinh trưởng ở thực vật
bằng cách tạo ra các enzyme như ACC deaminase, hay tạo ra các hormon thực vật như
IAA, cytokinin và GA3; Giảm tác động có hại của mầm bệnh bằng cách cạnh tranh về
dinh dưỡng, cạnh tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, các enzyme thủy
phân chống lại bệnh sự xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng vệ của cây ký
chủ.
2.5. Đặc điểm của một số loài vi sinh vật cố định đạm
2.5.1. Azotobacter
Azotobacter được phân lập và nuôi cấy thuần
khiết từ năm 1901 do nhà vi sinh vật Hà Lan Beijerinck.
Đó là loài Azotobacter chroococcum. Về sau người ta
tìm thấy nhiều loài khác trong giống Azotobacter.
a. Đặc điểm hình thái
Azotobacter là loại vi khuẩn Gram âm, không
sinh bào tử. Tế bào sinh sôi nảy nở theo lối phân cắt giản
đơn.
Hình 2.5. Tế bào Azotobacter
trên kính hiển vi (×1000).
Chúng không tạo bào tử nhưng tạo thành bào xác (kyste, cyste), có thành mỏng,
có tính đa hình. Vi khuẩn này thuộc loại hiếu khí nhưng có thể phát triển được trong điều

9



kiện vi hiếu khí. Tế bào vi khuẩn có dạng từ hình cầu đến hình que. Khi còn non tế bào có
dạng hình que đầu tròn.
Hầu hết các loài Azotobacter đều có lông roi (flagella) nhưng chỉ có A. agile và A.
vinelandii là có sự di động rõ ràng. Sự sắp xếp của lông roi có rất nhiều tranh cãi nhưng
theo quan sát của Hofer, Krasilnikov và cộng sự bằng kính hiển vi thì hầu hết Azotobacter
có lông roi nằm ở bên; ngoại trừ A. insique có lông roi nằm ở 1 cực và A. nigricans có
lông roi dạng hình nhẫn đặc biệt (peculiar ring-shaped configuration). Kích thước trung
bình khoảng 2,0 - 7,0 µm và 1,0 - 2,5 µm, đôi khi có chiều dài đạt đến 10 - 12 µm. Khi
già, tế bào Azotobacter mất khả năng di động, kích thước thu nhỏ lại biến thành dạng hình
cầu. Sinh chất xuất hiện nhiều hạt, đó là các hạt volutin, granulose, các giọt mỡ… Quan
sát dưới kính hiển vi, cho thấy khi già tế bào Azotobacter được bao bọc bởi một lớp vỏ
nhầy khá dày, vỏ nhầy đó chứa khoảng 75 % là chất hydrid của uronic acid và chỉ chứa
khoảng 0,023 % nitơ.
Ngoài ra, trong các bình nuôi cấy có thể thấy xuất hiện những dạng khổng lồ của tế
bào Azotobacter; cũng có khi xuất hiện những dạng nhỏ bé đến 0,2 µm, thậm chí đôi khi
xuất hiện cả những dạng qua lọc hết sức nhỏ bé. Khi gặp điều kiện thuận lợi, các dạng
này có thể nhanh chóng phát triển thành các tế bào bình thường. Tóm lại, hình dạng tế bào
Azotobacter và chu kì biến đổi của chúng phụ thuộc vào tuổi của ống giống và điều kiện
phát triển.
Trên các môi trường không chứa nitơ, khuẩn lạc của Azotobacter có dạng tròn, lồi,
đôi khi nhăn nheo và xuất hiện màng bao nhầy nhớt. Khi nuôi cấy lâu trên môi trường
đặc, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng hoặc màu nâu đen (tùy loài Azotobacter).
b. Đặc điểm phân loại
Theo Becking (1974), Azotobacter có 4 loài: A. chroococcum, A. beijerinckii, A.
vinelandii, A. agilis.
9 Azotobacter chrococcum: có kích thước tế bào 2,0 × 3,1 μm, tạo nang xác, có khả
năng di động được, có tiên mao. Khuẩn lạc khi già có màu nâu đen, sắc tố không
khuếch tán vào môi trường. Có khả năng đồng hóa mannitol, tinh bột, glucose…


10


9 Azotobacter beijerinskii: có kích thước tế bào 2,4 × 5,0 μm, có khả năng tạo nang
xác, không có lông roi, không di động được. Khi già có màu vàng hoặc màu nâu, sắc
tố không khuếch tán vào môi trường. Có khả năng đồng hóa mannitol không đồng
hóa tinh bột nhưng đồng hóa được benzoat natri.
9 Azotobacter vinelandii: tế bào có kích thước 1,5 × 3,4 μ m , có khả năng tạo nang xác,
có tiên mao, có khả năng di động. Loài này sinh sắc tố màu vàng lục huỳnh quang,
sắc tố này khuếch tán vào môi trường, có khả năng đồng hóa mannitol và benzoat
natri.
9 Azotobacter agllis: tế bào có kích thước 2,8 × 3,3 μm. Không tạo nang xác, có lông
roi, có khả năng di động được. Khi già khuẩn lạc có màu vàng lục huỳnh quang, sắc
tố khuếch tán vào môi trường. Không có khả năng đồng hóa benzoat natri, mannitol.
c. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Azotobacter có khả năng cố định nitơ, sự cố định nitơ của chúng có liên quan tới
sự tăng nhanh số lượng tế bào, thông thường có thể cố định được 15 - 20 mg nitơ trên mỗi
gram glucose, sucrose hay mannitol dưới điều kiện tối ưu. Thí nghiệm của Fischer với 48
dòng A. chroococcum trong 7 ngày đã thu được lượng nitơ nằm trong khoảng 13 - 19,5
mg (trung bình là 17,8 mg) trên gram mannitol. Đối với các nguồn carbon khác như acetic
acid, lactic acid và gluconic acid trong môi trường có bổ sung đầy đủ molypden thì
Azotobacter có thể cố định được 10 - 13 mg trên mỗi gram carbon. Khi sống trong môi
trường có nguồn nitơ hữu cơ hoặc vô cơ thì tác dụng cố định nitơ sẽ rất thấp hoặc không
có. Trên các môi trường không chứa nitơ, khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đôi
khi nhăn nheo. Một số chủng Azotobacter có khả năng sử dụng nitrit, nitrat. Hai loại
amino acid thích hợp nhất đối với nhu cầu dinh dưỡng của Azotobacter là glutamic acid
và asparaginic acid.
Vi khuẩn Azotobacter có khả năng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau:
alcohol (ethanol, propanol, butanol, 2,3 - butylene glycol, glycerol, sorbitol, mannitol,

inositol), dạng muối Na hay Ca của acid hữu cơ (acetic acid, propionic acid, butyric acid,
valeric acid, caproic acid, lactic acid, glyceric acid, pyruvic acid, malic acid, malonic
acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, oxalacetic acid, citric acid, tricarballylic

11


acid, gluconic acid và saccharic acid), các mono-, di- và trisaccharide (glucose, fructose,
galactose, sorbose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, trehalose, melizitose, raffinose)
và các loại polysaccharide (dextrin, tinh bột, glycogen). Thêm vào đó, Azotobacter còn có
khả năng sử dụng benzoic acid, salicylic acid thậm chí là phenol. Chúng không có khả
năng sử dụng methanol, formic acid, oxalic acid, erythritol, xylose, arabinose (rhamnose
và mannose). Do đó, Azotobacter phát triển mạnh ở môi trường giàu chất hữu cơ dễ đồng
hóa. Đất có bón phân xanh, phân chuồng, rơm rạ có khả năng thúc đẩy sự phát triển của
Azotobacter. Trong đất, Azotorbacter đồng hóa rất tốt các sản phẩm phân giải của
cenlulose.
Sự phát triển của Azotobacter cũng rất cần những yếu tố khoáng sau: P, S, K, Ca,
Mg, Fe và Mo. Azotobacter mẫn cảm cao đối với P, Ca. Chúng có thể sử dụng P ở dạng
phosphate, glycerolphosphate và 1,6 - hexosediphosphate. Quá trình cố định nitơ của
Azotobacter chỉ bắt đầu xảy ra khi nồng độ PO43- đạt đến 4 mg trong 100 ml môi trường.
Ngược lại, khi nồng độ PO43- đạt tới 800 mg trong 100 ml quá trình cố định N sẽ bắt đầu
ngừng lại. Những điều tra ở Việt Nam cho thấy trong đất có lượng chứa CaO cao hơn 0,4
% luôn có mặt một số lượng lớn các tế bào Azotobacter, chúng hầu như không phát triển
trong đất có có chứa lượng CaO dưới 0,25 % (Nguyễn Lân Dũng, 1965). Ca cần thiết
thường được bổ sung dưới 2 dạng calcium carbonat và calcium diphosphate (CaCO3,
CaHPO4) và chỉ có thể thay thế bởi strontium (Burk và Lineweaver). Riêng đối với A.
chroococcum, nồng độ CaCl2 thích hợp nhất là 0,01 %, nếu cao hơn sẽ ảnh hưởng không
tốt đối với hoạt động cố định N của chúng, có tác giả đã dùng A. chroococum như là loài
vi khuẩn chỉ thị để xác định nhu cầu về vôi của đất. Theo Greaves và Anderson, S chỉ
được sử dụng ở dạng sulphate; Greene tìm thấy hiệu quả khi bổ sung 0,05 mg S trên gram

mannitol. Theo Bortels, Krzemieniewski, Kovats và Rippel thì hàm lượng Fe cần thiết
cho điều kiện tối ưu là 20 - 40 ppm ở dạng iron (III) sulfate hay iron (III) chloride
hexahydrate. Nguyên tố Mg được Azotobacter đòi hỏi với số lượng cao hơn sắt khoảng 10
lần. Mg có thể được thay thế bởi Mn. Horner và Burk đã có báo cáo cho rằng khi sử dụng
cả Mg và Mn cho A. chroococcum thì loài này sẽ tăng trưởng tốt hơn. Hàm lượng Mo cần
thiết vẫn đang còn có nhiều giả thiết và yếu tố này có thể được thay thế bởi vanadium...

12


Azotobacter là vi khuẩn hiếu khí có khuynh hướng phát triển trên bề mặt của môi
trường nuôi cấy. Meyerhof và Burk nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ oxy với sự phát
triển của A. chroococum và đã kết luận rằng chúng phát triển tối ưu ở trong không khí với
20 % O2 nhưng vẫn có thể phát triển ở 0,12 % O2. Williams và Wilson tìm ra rằng ở áp
suất O2 là 0,5 atm thì A. vinelandii phát triển tốt nhất.

agllis

A.

vinelandii

A.

beijerinckii

Đặc điểm

A.


A.

Tên loài

chroococcum

Bảng 2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các loài Azotobacter nói chung

Sắc tố
Tan trong nước huỳnh quang

_

_

Đen

Nâu

Tinh bột

+

Mannitol
Ramnose

Không tan trong nước

Lục


Trắng

_

_

_

+

_

+

_

_

_

+

_

+

_

+


+

+

+

Đồng hóa

Di động
Flagella

(Tiêm mao)

Petitrichous

(Chu mao)

+

Lophotrichous (Chùm mao)
Monotrichous

(Đơn mao)

Sinh bào xác

+

+


+

_

Sinh vỏ nhày

+

+

+

+

Thường gặp trong đất

+

+

+

_
+

Sống ở nước ngọt
Tỷ lệ %GC trong DNA

65-66


66

66

53-54

Azotobacter phát triển ở nhiệt độ 10 - 45oC, nhiệt độ tối ưu thông thường là 30oC.
Tuy nhiên, nhiệt độ phát triển tối ưu thay đổi theo loài và một vài dòng A. chrooccum có
thể phát triển ở 5 - 7oC.
Azotobacter rất mẫn cảm với pH. Chúng có thể phát triển được ở pH 4,5 - 9,0, nhưng
pH thích hợp nhất đối với Azotobacter là pH 7,2 - 8,2. pH tối ưu của A. chroococcum và
A. vinelandii là gần 7,5; với A. beijerinckii (Yamagata và Itano) là gần 6,8.
Azotobacter đòi hỏi độ ẩm rất cao của đất. Ẩm độ thích hợp nhất là 75 - 80 %.

13


Ngoài khả năng cố định đạm, Azotobacter còn có khả năng tiết ra hormon thực vật
(IAA), các vitamin (B1, B6, nicotinic acid, pentotenic acid, biotin…). Bên cạnh đó,
Azotobacter còn có khả năng tiết ra các loại kháng sinh thuộc nhóm Anixomixin để chống
nấm. Một số chủng A.chroococum có khả năng sinh ra một số chất chống nấm có phổ tác
dụng khá rộng (ức chế Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria …).
2.5.2. Azospirillum

Vào năm 1922, Beijerinck - nhà vi sinh vật học và thực vật học người Hà Lan đã
phát hiện một chủng vi khuẩn giống với Spirillum trong môi trường thiếu khoáng nitơ có
nguồn carbon là lactate hay malate từ đất vườn. Ông nhận thấy rằng khi dùng môi trường
trên để nuôi cấy chủng vi khuẩn mới này thì có sự gia tăng hàm lượng nitơ, trong khi đó,
trong môi trường không có sự hiện diện của chủng này thì không có biểu hiện như vậy.
Do chủng này dễ nuôi cấy trên môi trường muối khoáng với acid hữu cơ và cũng có hình

dạng giống với Spirillum trong những điều kiện nhất định, Beijerinck đã xem chủng này
là một thành viên của chi Spirillum và là sinh vật trung gian kết nối giữa chi Spirillum và
Azotobacter. Ban đầu ông đặt tên chủng mới này là “Azotobacter spirillum”, nhưng sau
đó lại đổi tên thành “Spirillum lipoferum”. Năm 1932, Schroder đã tiến hành nghiên cứu
lại về S. lipoferum nhưng hầu hết thất bại khi chứng minh sự cố định nitơ bởi những
chủng vi khuẩn thuần. Vì thế chủng này đi vào quên lãng trong nhiều năm. Vào năm
1963, Becking đã phân lập được một số vi khuẩn tương tự với S. lipoferum có khả năng
cố định nitơ rõ rệt. Mười năm sau đó, Favilli đã tiến hành định danh vi khuẩn cố định nitơ
phân lập được từ mẫu đất tại Italy là Spirillum lipoferum và chứng minh được khả năng
cố định nitơ của chủng này trong canh trường lỏng có bổ sung một lượng nhỏ cao nấm
men. Vào năm 1978, Tarrand và cộng sự đã công bố trong tài liệu nghiên cứu khóa phân
loại di truyền một loài vi khuẩn tên là “Azospirillum lipoferum”, bởi vì loài này có độ
tương đồng di truyền cũng như có nhiều đặc điểm tương ứng với mô tả của Beijerinck về
S. lipoferum, đặc biệt, chúng hình thành những tế bào có hình dạng giống với Spirillum
trong điều kiện nhất định. Cũng trong năm 1978, Tarrand và cộng sự cũng đã phát hiện
thêm loài Azospirillum brasilense.
a. Đặc điểm hình thái

14


×