HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------   ------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu định danh Potyvirus hại cây hoa loa kèn

Sinh viên thực hiện : Hoàng Ngọc Anh
Mã sinh viên
: 560770
Lớp
: CNSHA - K56
Giáo viên hướng dẫn : TS. Hà Viết Cường

“ Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu
của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học”, năm học 2014-2015

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài thực tập tốt nghiệp, tôi đã nhận được rất
nhiều sự giúp đỡ và động viên từ các thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hà Viết Cường - người
đã trực tiếp hướng dẫn và đóng góp những ý kiến quan trong cho tôi trong toàn bộ
quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến tập thể các anh chị cán bộ Trung tâm
nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới, các thầy cô giáo trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học
đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp của

mình.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã giúp tôi
rất nhiều về mặt kinh tế cũng như tinh thần giúp tôi duy trì được trạng thái tốt nhất
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Hoàng Ngọc Anh

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...........................................................................................................i
MỤC LỤC................................................................................................................ ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...............................................................................v
DANH MỤC BẢNG...............................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH...............................................................................................vii
TÓM TẮT.............................................................................................................viii
PHẦN I: MỞ ĐẦU..................................................................................................9
1.1. Đặt vấn đê......................................................................................................................9
1.2. Mục đích và yêu cầu của đê tài.................................................................................10
1.2.1. Mục đích.............................................................................................................10
1.2.2. Yêu cầu...............................................................................................................10

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................11
2.1. Sơ lược vê hoa loa kèn................................................................................................11
2.2. Sơ lược vê họ Potyviridae...........................................................................................11

2.2.1. Giới thiệu............................................................................................................11
2.2.2. Cấu trúc..............................................................................................................12
2.3. Sơ lược vê chi Potyvirus.............................................................................................12
2.3.1. Giới thiệu............................................................................................................12
2.3.2. Cấu trúc phân tử.................................................................................................12
2.3.3. Genome..............................................................................................................13
2.3.4. Chức năng các protein........................................................................................13
2.3.5. Sự tái bản............................................................................................................16
2.3.6. Phương thức lan truyền......................................................................................17
2.4. Sơ lược vê bệnh virus trên họ loa kèn......................................................................17
2.4.1. Hippeastrum mosaic virus (HiMV)....................................................................17
2.4.2. Vallota speciosa virus.........................................................................................18
2.4.3. Lily mottle virus (LMoV)...................................................................................18
2.4.4. Lily symptomless virus (LSV)...........................................................................19
2.4.5. Tulip breaking virus (TBV)................................................................................19

ii


2.4.6. Lily virus X (LVX).............................................................................................20
2.4.7. Narcissus mosaic virus (NMV)..........................................................................20
2.5. Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật RT-PCR................................................................20
Các bước trong chẩn đoán bệnh cây bằng RT-PCR:...................................................20
1.Thiết kế mồi: tự thiết kế hoặc lựa chọn mồi từ các nghiên cứu đã được công bố. 20
2.Tách chiết RNA tổng số từ mô cây................................................................................20
3.Tiến hành phản ứng RT-PCR........................................................................................20
4.Kiểm tra, đánh giá kết quả bằng điện di.....................................................................20
Có 2 loại mồi được sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây:.................................................20
Mồi chung (degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có khả
năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường là các đối tượng trong 1 họ, 1

chi).

20

Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệt được
loài, thậm chí dưới loài như chủng, nòi…......................................................................20
2.6. Kỹ thuật xác định trình tự.........................................................................................21

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................21
3.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................................22
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.............................................................................22
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu..........................................................................................22
3.2.2. Thời gian nghiên cứu:.........................................................................................22
Từ 01/2015 đến 06/2015.............................................................................................22
3.3. Vật liệu nghiên cứu.....................................................................................................22
Bảng 3.2. Thành phần môi trường MS.........................................................................24
3.4. Phương pháp nghiên cứu...........................................................................................24
3.4.1. Điều tra bệnh......................................................................................................24
3.4.2. Thu mẫu và xử lý mẫu........................................................................................25
3.4.3. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu bệnh................................................................25
3.4.4. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu.....................................................................25
3.4.5. Phân lập gen bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain
Reaction)......................................................................................................................26

iii


3.4.6. Điện di sản phẩm RT-PCR trên Agarose gel 1 %...............................................27
3.4.7. Giải trình tự gen virus........................................................................................27
3.4.8. Phân tích trình tự gen virus................................................................................28

3.4.9. Xác định bệnh bằng nhiễm nhân tạo..................................................................28
3.4.10. Kỹ thuật nuôi cấy Meristem.............................................................................29
3.4.10.1. Cách pha chế.................................................................................................29
3.4.10.2. Nuôi cấy meristem.........................................................................................29

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................30
4.1. Bệnh virus trên cây hoa loa kèn................................................................................30
4.1.1. Mô tả triệu chứng...............................................................................................30
4.1.2. Điều tra tình hình bệnh virus trên cây hoa loa kèn năm 2015............................31
4.2. Xác định virus bằng RT-PCR....................................................................................33
4.2.1. Xác định virus gây bệnh khảm lá cây hoa loa kèn trắng...................................34
36
37
4.2.2. Xác định virus gây bệnh khảm lá cây hoa loa kèn đỏ........................................37
4.3. Kết quả giải trình tự gen Potyvirus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn đỏ..................39
4.4. Kết quả xác định phổ ký chủ của virus...................................................................1
4.4.1. Xác định phổ ký chủ của LMoV..........................................................................1
Cây lây............................................................................................................................1
Lần 1...............................................................................................................................1
Lần 2...............................................................................................................................1
Triệu chứng....................................................................................................................1
2 tuần..............................................................................................................................1
18 ngày...........................................................................................................................1
4.4.2. Xác định phổ ký chủ của virus mới hại cây hoa loa kèn đỏ.................................2
Cây lây............................................................................................................................3
Lần 1...............................................................................................................................3
Lần 2...............................................................................................................................3
Triệu chứng....................................................................................................................3
2 tuần..............................................................................................................................3
18 ngày...........................................................................................................................3


TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................7
Bảng 3.2. Thành phần môi trường MS.........................................................................10

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
Bp
CTAB
cDNA
CNSH
dNTP
DNA
dNTP
HVNNVN
Kb
NCBI
LKĐ
LKT
L
PCR
RT-PCR
RNA
TTBCNĐ
TS
TAE
Taq

β- ME

Từ viết tắt
Base pair
Cetryl Ammonium Bromide
Complementary DNA
Công Nghệ Sinh học
Deoxynucleoside triphosphate
Deoxyribonucleic acid
Deoxynucleoside triphosphate
Học viên Nông nghiệp Việt Nam
Kilo base
National Center for Biotechnology Information
Loa kèn đỏ
Loa kèn trắng
Lay ơn
Polymerase Chain Reaction
Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction
Ribonucleic acid
Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới
Tiến sĩ
Tris – acetate – EDTA
Thermus aquatic
Beta- Mercaptoethanol

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu...........................................................26

Bảng 4.1. Triệu chứng chính của 2 bệnh giống bị nhiễm virus trên hai loại hoa
loa kèn..................................................................................................................30
Bảng 4.2. Tỷ lệ bệnh virus trên cây hoa loa kèn..................................................31
Chúng tôi tiến hành kiểm tra Potyvirus bằng phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi
chung cho Potyvirus là CIFor và CIRev trên 3 mẫu LKT: 2 mẫu LKT (LKT-35
và LKT-39) biểu hiện triệu chứng khảm lá điển hình và 1 mẫu LKT đối chứng
(LKT-ĐC9) không xuất hiện triệu chứng (Hình 4.7 và Bảng ). Các mẫu được
chiết bằng phương pháp CTAB/LiCl. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR cho thấy
cả 2 mẫu LKT mang triệu chứng khảm lá đều cho phản ứng dương tính với băng
sản phẩm ~ 0.7kb còn mẫu đối chứng thì cho kết quả âm tính (Bảng 4.4 và Hình
4.8). Kết quả này chứng tỏ rằng, bệnh khảm lá trên cây hoa loa kèn trắng là do
Potyvirus gây ra....................................................................................................34
..............................................................................................................................35
Hình 4.7. Các mẫu lá: LKT-35 (1), LKT-39 (2), LKT-ĐC9 (3)...........................35
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra RT-PCR trên các mẫu cây hoa loa kèn trắng............35
Để xác định virus gây bệnh khảm lá trên cây hoa loa kèn đỏ, chúng tôi đã tiến
hành thí nghiệm với 3 mẫu cây LKĐ chính là LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18
(Bảng 3.1 và Hình 4.10).......................................................................................37
..............................................................................................................................38
Hình 4.10. Các mẫu lá: LKĐ-ĐC5 (1), LKĐ-17 (2), LKĐ-18 (3).......................38
Giống như thí nghiệm với LKT, đầu tiên, chúng tôi cũng kiểm tra xem các mẫu
LKĐ có nhiễm Potyvirus hay không bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi
chung CIFor/CIRev. Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR (Hình 4.11) cho
thấy, 2 mẫu LKĐ-17 và LKĐ-18 đều xuất hiện băng sản phẩm ~ 0.7kb còn mẫu
LKĐ-ĐC5 thì không. Kết quả này cho ta thấy, triệu chứng khảm lá trên cây hoa
LKĐ cũng do Potyvirus gây ra. Trường hợp mẫu lá LKĐ-18 không có triệu
chứng khảm lá nhưng vẫn cho băng sản phẩm ~ 0.7kb chứng tỏ rằng, mẫu lá cây
LKĐ thu từ phương pháp tách vảy củ này có mang Potyvirus nhưng chưa biểu
hiện thành triệu chứng khảm................................................................................38
Sau khi khẳng định bệnh khảm lá trên cây loa kèn đỏ là do Potyvirus gây ra,

chúng tôi tiếp tục kiểm tra RT-PCR sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/LMoV-CP3R với các mẫu cho kết quả dương tính với Potyvirus: LKĐ-17 và LKĐ-18. Tuy
nhiên, cả 2 mẫu đều cho kết quả âm tính (Bảng 4.5 và Hình 4.11)......................38
Từ các kết quả trên, chúng tôi kết luận rằng, các mẫu cây loa kèn đỏ đã nhiễm
một loại Potyvirus khác mà không phải là virus LMoV như ở cây hoa loa kèn
trắng......................................................................................................................38
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra RT-PCR trên các mẫu cây hoa loa kèn đỏ................38
Bảng 4.: Kết quả lây nhiễm nhân tạo virus LMoV................................................1
Bảng 4.13: Kết quả lây nhiễm nhân tạo bệnh virus trên hoa loa kèn đỏ................3
................................................................................................................................6
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra RT-PCR rên các mẫu cây hoa Lay ơn........................6

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Mô hình cấu trúc phân tử của các potyvirus....................................13
Hình 2.2. Sơ đồ tổ chức bộ genome của potyvirus..........................................13
Hình 4.1. Bệnh khảm lá hoa loa kèn trắng (1, 2), khảm lá hoa loa kèn đỏ (3)
(nguồn Hoàng Ngọc Anh, 2015)......................................................................31
Hình 4.5. Sơ đồ bộ gen potyvirus và vị trí tương đối.......................................34
của cặp mồi CIFor và CIRev............................................................................34
Hình 4.6. Vị trí cặp mồi đặc hiệu LMoV trên bộ gen potyvirus......................34
Hình 4.8. Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện potyvirrus trên loa
kèn trắng dùng cặp mồi chung CIFor/CIRev. M: thang DNA 1 kb (hãng
Fermentas). 1,2,3: sản phẩm RT-PCR của các mẫu LKT-35, LKT-39,............36
LKT-ĐC9..........................................................................................................36
Hình 4.9. Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện LMoV trên các
mẫu loa kèn trắng bị bệnh khảm lá sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoVCP3-R. M: thang DNA 1 kb (hãng Fermentas). 1,2: sản phẩm RT-PCR.........37
của các mẫu LKT-35, LKT-39..........................................................................37
Hình 4.11. Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện Potyvirus và

LMoV trên các mẫu loa kèn đỏ. M: thang DNA 1 kb (hãng Fermentas).........39
1,2,4: sản phẩm RT-PCR của các mẫu LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng
cặp mồi CIFor/CIRev. 3, 5: sản phẩm RT-PCR của các mẫu LKĐ-17, LKĐ-18
sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R...............................................39
Hình 4. : Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện LMoV sử dụng
cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R trên các mẫu loa kèn trắng. M: thang
DNA 1 kb (hãng Fermentas). 1,2: sản phẩm RT-PCR của các mẫu LKĐ-ĐC5,
LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi CIFor/CIRev. 3, 5: sản phẩm RT-PCR của
các mẫu LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R.....5
Hình 4.6. Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện Potyvirus và
LMoV trên các mẫu cây hoa lay ỏn. M là thang DNA 1 kb (Fermentas). Các
giếng 1,2,4 tương ứng với các mẫu L1, L2, L3 sử dụng cặp mồi chung
CIFor/CIRev. Các giếng 3, 5 tương ứng với các mẫu L2, L3 sử dụng cặp mồi
LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R.............................................................................7

vii


TÓM TẮT
Vụ mùa 2009, sự xuất hiện của bệnh lùn sọc đen do SRBSDV gây ra ở nhiều
tỉnh thành miền bắc Việt Nam đã gây ra hậu quả nghiêm trọng, cây lúa bị lùn, lá
xoắn vặn và xanh thẫm, cây lúa không trỗ hoặc trỗ không thoát gây mất sản lượng
và phải tiêu hủy. Hậu quả này đã dẫn đến thiệt hại hàng nghìn tỉ đồng cho sản xuất
nông nghiệp nước ta. Nguyên nhân chính gây bệnh đã được xác định bằng sinh học
phân tử. Chúng tôi đã thiết kế một cặp mồi đặc hiệu để nhân dòng gen S10 của
SRBSDV từ đó tiến hành tạo plasmid tái tổ hợp và giải trình tự toàn bộ ORF gen
S10 trên clone. Kết quả giải trình tự và phân tích các chuỗi tương đồng tìm kiếm
trên ngân hàng gen đã cho thấy quan hệ giữa bốn chuỗi của Việt Nam với các chuỗi
cùng chi Fijivirus và cùng họ Reoviridae. Chúng tôi đã xây dựng thành công cấu
trúc biểu hiện của gen S10 trên vector biểu hiện pET-28a (+). Việc biểu hiện protein

tái tổ hợp cũng đã được tiến hành tuy nhiên vẫn chưa thu được kết quả khả quan.

viii


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đê
Trong những năm gần đây, do nền kinh tế phát triển mạnh mẽ, con người
không chỉ quan tâm về đời sống vật chất mà còn quan tâm rất nhiều đến đời sống
tinh thần. Trong đời sống tinh thần đó, người ta không thể không kể đến giá trị của
các loài hoa.
Nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm tạo nên các vùng sinh thái đa dạng
thích hợp cho việc trồng trọt nhiều chủng hoa đẹp của Việt Nam và thế giới. Hiện
tại, nước ta có khoảng 5000 ha sản xuất hoa, cây cảnh với tổng sản lượng ước tính
khoảng 4 tỷ cành hoa. Năm 2001, cả nước có hơn 8000 ha đất trồng hoa, chủ yếu
tập trung ở các tỉnh thành như Lâm Đồng (1254 ha), Hà Nội (867 ha), Hưng Yên
(867 ha)…, với doanh thu là 291 tỷ đồng, trong đó giá trị xuất khẩu đạt 7 tỷ đồng.
Về mặt kinh tế, nghề trồng hoa đem lại lợi nhuận cao hơn trồng lúa. Chính vì vậy,
nghề trồng hoa ngày càng được phát triển với quy mô, diện tích và chủng loại hoa
ngày một tăng lên.
Cùng với các loài hoa như: lan, hồng, lay ơn, cúc…, hoa loa kèn cũng là loài
hoa rất được ưa chuộng vì chúng có màu sắc đẹp, tươi lâu, chủng loại thì vô cùng đa
dạng. Hiện nay ở nước ta, hoa loa kèn đang được trồng khá phổ biến. Tuy nhiên,
trong quá trình gieo trồng, sản xuất hoa loa kèn thấy xuất hiện nhiều triệu chứng do
virus gây ra. Hầu hết là các virus gây bệnh thuộc chi Potyvirus – chi lớn nhất trong
tám chi của họ Potyviridae. Bệnh do Potyvirus gây ra những ảnh hưởng không nhỏ
đến giá trị thẩm mỹ của cây hoa. Chi virus này xuất hiện phổ biến ở các nước nhiệt
đới và cận nhiệt đới như Việt Nam. Virus có thể gây ra nhiều triệu chứng khác nhau
ở cây ký chủ như khảm, đốm, sáng gân, lùn cây, héo, còi cọc… Trong đó, ở cây hoa
loa kèn thì triệu chứng khảm lá là chủ yếu.

Tại Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về Potyvirus trên cây hoa
loa kèn. Vì vậy, để có thể góp phần cung cấp thêm thông tin về loài virus này, từ đó
đề ra các biện pháp phòng trừ hợp lý, đạt hiệu quả cao, dưới sự hướng dẫn của TS.
Hà Viết Cường, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu định danh
Potyvirus hại cây hoa loa kèn”.

9


1.2. Mục đích và yêu cầu của đê tài
1.2.1. Mục đích
• Xác định trình tự gen của Potyvirus gây bệnh khảm lá trên cây hoa loa kèn
đỏ.
• Xác định đặc điểm sinh học của Potyvirus hại cây hoa loa kèn.
1.2.2. Yêu cầu
• Điều tra bệnh virus trên cây hoa loa kèn (loa kèn trắng và loa kèn đỏ) tại Hà
Nội.
• Kiểm tra RT-PCR một số mẫu cây hoa loa kèn trắng và loa kèn đỏ bị bệnh.
• Giải trình tự gen Potyvirus hại cây loa kèn đỏ.
• Phân tích trình tự.
• Đánh giá khả năng lây nhiễm Potyvirus trên một số cây kí chủ.

10


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược vê hoa loa kèn
Cây hoa loa kèn là loài thực vật có hoa hình dạng như cái kèn. Tuy nhiên, 2
loại hoa loa kèn chính là loa kèn trắng và loa kèn đỏ lại thuộc hai họ thực vật khác
nhau. Loa kèn trắng (Lilium longiflorum) là một loài thực vật một lá mầm với các lá

thẳng và gân song song, thuộc chi Lilium, họ loa kèn (Liliaceae). Còn loa kèn đỏ là
loại cây thân thảo, sống lâu năm, mọc ra từ thân hành, thường có hoa sặc sỡ, nằm
trong chi Hippeastrum, họ loa kèn đỏ (Amaryllidaceae) . Hai họ thực vật này phân
biệt với nhau nhờ bầu nhụy, với bầu nhụy hạ ở Amaryllidaceae và bầu nhụy thượng
ở Liliaceae. Dù có đặc điểm cấu tạo khác nhau nhưng chúng đều là những loài hoa
dễ chăm sóc, ít sâu bệnh và sinh trưởng mạnh. Trái ngược với hoa loa kèn đỏ
thường được trồng trong chậu để làm cảnh thì loa kèn trắng lại được trồng ngoài
đồng ruộng để lấy hoa vào khoảng tháng 4. Ở Việt Nam, hoa loa kèn trắng mới
được trồng ở một số tỉnh, thành phố có nghề trồng hoa phát triển: Đà Lạt, thành phố
Hồ Chí Minh, Hà Nội, Hải Phòng… trong đó Đà Lạt là nơi hiện đang có diện tích
trồng loa kèn trắng nhiều nhất so với các địa phương khác trên cả nước (chiếm 8%
trong tổng diện tích trồng hoa). Cây hoa loa kèn trắng là cây chịu rét khá, chịu nóng
kém, ưa khí hậu mát ẩm, nhiệt độ ban ngày là 20 -25°C, ban đêm là 12°C, ưa cường
độ ánh sáng ở mức trung bình. Loa kèn trắng thích không khí ẩm ướt, độ ẩm thích
hợp nhất là 80-85%. Việc trồng hoa loa kèn trắng đem lại lợi nhuận kinh tế cao, ước
tính, mỗi sào, trừ chi phí, hoa loa kèn trắng cho lãi từ 30 – 40 triệu đồng/năm (
2.2. Sơ lược vê họ Potyviridae
2.2.1. Giới thiệu
Potyviridae là một trong hai họ virus thực vật lớn nhất với trên 200 loài. Tất
cả các thành viên trong họ đều có bộ gen RNA sợi đơn (ssRNA), cực dương.
Các virus của họ Potyviridae, gọi tắt là các potyvirus, được phân loại thành 8
chi bao gồm: Brambyvirus, Bymovirus, Ipomovirus, Macluravirus, Poacevirus,
Potyvirus, Rymovirus và Tritimovirus.
Tên của họ “Potyviridae” có nguồn gốc từ cụm từ Potato virus Y , vốn là
virus thực vật được nghiên cứu nhiều và đầy đủ nhất và được ghi nhận đầu tiên trên

11


khoai tây từ năm 1931.

2.2.2. Cấu trúc
Phân tử (virion) của các potyvirus có dạng sợi mềm, không có vỏ bao bọc,
đường kính khoảng 11-15 nm và dài 650-950 nm đối với các virus có bộ gen đơn và
200-300 + 500-600 đối với các virus có bộ gen kép.
Các virus của 7 chi Brambyvirus, Potyvirus, Macluravirus, Poacevirus,
Ipomovirus, Rymovirus và Tritimovirus là virus có bộ gen đơn, tức là có bộ gen không
phân đoạn, chỉ gồm 1 phân tử RNA duy nhất còn các virus của chi còn lại Bymovirus
thì có bộ gen kép gồm 2 phân tử RNA-1 và RNA-2 (phân tử RNA-1 tương đương với
2/3 kích thước tính từ đầu 3’ còn phân tử RNA-2 tương đương phần còn lại của bộ gen
của các virus có bộ gen đơn).
2.3. Sơ lược vê chi Potyvirus
2.3.1. Giới thiệu
Chi Potyvirus là chi lớn nhất trong họ Potyviridae với khoảng gần 200 loài
và cùng với chi Begomovirus (họ Geminiviridae), Potyvirus là chi virus thực vật lớn
nhất, chiếm khoảng 20% tổng số virus thực vật.
Nhiều potyvirus là các tác nhân gây bệnh cho cây có ý nghĩa kinh tế, như:
• Papaya ringspot virus (PRSV) là bệnh virus số 1 hại đu đủ và bầu bí.
• Turnip mosaic virus (TuMV) hại cây rau họ thập tự và được xem là virus quan
trọng thứ 2 trên cây rau.
• Bean common mosaic virus (BCMV) trên cây họ đậu.
• Potato virus Y (PVY) trên cây khoai tây và các cây họ cà khác.
• Plum pox virus (PPV) là virus quan trọng nhất trên cây quả hạch như đào, táo,
lê, mận.
Đặc trưng của các potyvirus đó là khả năng hình thành thể vùi trong tế bào
cây. Các loại thể vùi này có thể là thể vùi tế bào chất có hình dạng đặc trưng (hình
vong, bánh xe, hình phiến…) cho potyvirus và do đó có giá trị chẩn đoán, chúng
cũng có thể là thể vùi nhân – thể vùi vô định hình, không có hình dạng xác định.
Phần lớn potyvirus có phổ ký chủ hẹp hoặc rất hẹp nhưng một số ít lại có
phổ ký chủ rất rộng, nhiễm cả trên cây 1 và 2 lá mầm.
2.3.2. Cấu trúc phân tư


12


Các potyvirus có phân tử hình sợi mềm, không có vỏ bao bọc, đường kính
11-15 nm và dài 650-950 nm. Mỗi phân tử virion được cấu tạo từ 1700-2000 tiểu
phần protein sắp xếp theo kiểu xoắn đối xứng xung quanh phân tử RNA genome
(Hình 2.1).

Hình 2.1. Mô hình cấu trúc phân tử của các potyvirus
( />2.3.3. Genome
Tất cả các potyvirus đều có bộ gen là một phân tử RNA sợi đơn, cực dương,
kích thước ~ 10 kb. Tổ chức bộ gen của các potyvirus tính từ trái sang phải là:
Một vùng 5’ không dịch mã (5’UTR).
Một ORF đơn, lớn gọi là ORF chính (major ORF). ORF chính mã hóa 1
polyprotein, sau khi dịch mã sẽ được xử lý thành khoảng 10 protein chức năng:
protein P1, protein bổ trợ (Helper component protein, HC-Pro), protein P3, protein
6K1, protein thể vùi tế bào chất (CI), protein 6K2, protein VPg (viral protein
genome-linked, Hari, 1981; Siaw et al., 1985; Riechmann et al., 1989; Murphy et
al., 1990), protein NIa-pro (major protease of small nuclear inclusion protein - NIa),
protein NIb (large nuclear inclusion protein) và protein vỏ (coat protein, CP)
(Shukla et al., 1998). Protein VPg gắn vào đầu 5’ của RNA genome.
Một đầu 3’ không dịch mã (3’UTR), kết thúc bằng 1 đuôi poly-A.

Hình 2.2. Sơ đồ tổ chức bộ genome của potyvirus
( />2.3.4. Chức năng các protein

13



P1
 P1 là 1 proteinase. P1 là vùng biến động nhất của bộ gen. P1 có hoạt tính
proteinase và sẽ tự cắt liên kết P1/HC-Pro sau dịch mã để giải phóng P1.
 P1 tương tác với RNA. P1 có khả năng liên kết với RNA của virus, do vậy
nó có vai trò trong quá trình vận chuyển virus.
 P1 tham gia ức chế phản ứng phòng thủ của tế bào ký chủ (thông qua cơ
chế câm gen).
HC-Pro
 HC-Pro cần thiết cho sự lan truyền qua vector. Vai trò này của protein
HC-Pro được thể hiện qua cơ chế bắc cầu. HC-Pro đóng vai trò là một phân tử cầu
nối, trong đó phần đầu N của nó (thông qua motif bảo thủ cao KITC) sẽ liên kết với
receptor ở bề mặt phía trong của vòi aphid, còn phần trung tâm của nó (thông qua
motif PTK) sẽ liên kết với protein vỏ của virion. Nhờ cầu nối này mà phân tử virus
được giữ lại ở phần vector.
 HC-Pro cần cho virus di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các tế bào.
HC-Pro là một protein vận chuyển (MP) của potyvirus. HC-Pro làm tăng kích thước
giới hạn (size exclusion limit, SEL) của sợi liên bào và do đó cho phép RNA của
virus có thể di chuyển giữa các tế bào.
 HC-Pro có hoạt tính proteinase. Đầu C của HC-Pro có hoạt tính
proteinase, cho phép nó tự cắt khỏi liên kết giữa HC-Pro và P3.
 HC-Pro cần cho sự tái bản (thông qua motif IGN).
 HC-Pro có thể ức chế bộ máy câm gen của tế bào. Đây là một chức năng
quan trọng của potyvirus chống lại phản ứng phòng thủ của cây.
P3
P3 cũng là vùng biến động và ít được nghiên cứu chức năng. P3 được biết là
quy định tính gây bệnh của virus thông qua tương tác với các protein khác của
virus.
CI
 CI là thành phần chính của phức hợp tái bản virus. CI có hoạt tính
helicase, hoạt tính liên kết RNA, hoạt tính thủy phân ATP. Tất cả các hoạt tính này

đều cần thiết cho CI tháo xoắn cấu trúc trung gian sợi kép của RNA virus trong quá

14


trình tái bản.
 CI cần cho sự di chuyển của virus giữa các tế bào. Quá trình di chuyển
giữa các tế bào yêu cầu năng lượng. Do CI có hoạt tính ATPase nên nó đảm nhận
vai trò cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển virus qua các tế bào. Ngoài
ra, CI tương tác trực tiếp với plasmodesmata và phức hợp ribonucleoprotein của
virus để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển.
6K1 và 6K2
 6K1 tương tác với P3 để quy định tính gây bệnh của virus.
 6K2 là một protein mỏ neo giúp liên kết bộ máy tái bản của virus vào
mạng lưới nội chất – nơi thực hiện quá trình tái bản.
VPg
 VPg chính là phần đầu N của NIa. VPg cũng là một protein cấu trúc vì
ngoài protein CP, nó có mặt trong phân tử virus. VPg liên kết vào đầu 5’ của RNA
virus và bảo vệ phân tử RNA khỏi bị phân hủy.
 VPg cần cho quá trình tái bản bộ gen virus, di chuyển hệ thống của virus
trong cây.
 VPg tương tác với yếu tố khởi đầu dịch mã của tế bào như eIF4E và
eIF(iso)4E, do đó cho phép ribosome có thể tiếp cận RNA virus ngay sau khi tháo
vỏ để thực hiện quá trình dịch mã. Cần chú ý là potyvirus có bộ gen RNA sợi đơn
cực (+), phân tử RNA genome của virus không được mũ hóa nên quá trình dịch mã
ORF trên bộ gen virus là một quá trình dịch mã độc lập mũ CAP.
 VPg là một protein Avr cho potyvirus. Nhiều gen kháng của thực vật đối
với potyvirus đã đực chứng minh là các gen lặn, ví dụ như pvr1 (ớt), mo1 (rau diếp),
sbm1 (đậu) và rym4/5 (lúa miến). Các gen này thực chất mã hóa yếu tố khởi đầu
dịch mã eIF4E. Khi các gen này (ở trạng thái đồng hợp tử), mang các đột biến phá

vỡ tươnng tác VPg - eIF4E đã dẫn tới kiểu hình kháng.
NIa-Pro
NIa-Pro là phần đầu C của protein NIa. Nó là một protease chính của virus.
Đầu C của NIa-Pro có hoạt tính protease cho phép nó cắt các liên kết P3/6K1,
6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg, VPg/NIa-Pro, NIa-Pro/NIb và NIb/CP để giải phóng ra

15


các protein chức năng đơn lẻ.
Nib
NIb là một RNA dependent RNA polymerase (RdRp). Đây là một chức năng
quan trọng cho phép bộ gen virus được tái bản từ sợi (+) sang sợi (-) và ngược lại.
CP
 CP của potyvirus đã được nghiên cứu rất kỹ. Protein CP có thể được chia
làm 3 phần (đầu N, trung tâm và đầu C). Đầu N là phần nhô lên bề mặt phân tử, khá
biến động về trình tự và chứa các epitope đặc hiệu cho virus ở mức loài và mức
chủng. Phần trung tâm và đầu C bảo thủ hơn và mức biến động của 2 phần này tương
đương mức biến động chung trên toàn bộ bộ gen. Chính vì vậy, CP, đặc biệt phần đầu
C và trung tâm hay được sử dụng trong đánh giá đa dạng virus.
 CP có vai trò quan trọng trong lan truyền qua vector. Đầu N của CP chứa
1 motif bảo thủ cao (DAG). Thông qua motif này, phân tử virus sẽ liên kết với HCPro theo lý thuyết bắc cầu để lan truyền qua vector rệp muội.
 CP có vai trò quan trọng trong di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các
tế bào. CP cùng với HC-Pro là 2 protein vận chuyển (MP) của potyvirus. Cả 2
protein này đều làm tăng kích thước giới hạn (SEL) của lỗ liên bào và do đó cho
phép virus di chuyển giữa các tế bào.
 CP là một protein cấu trúc tạo virion.
 CP điều khiển quá trình tái bản RNA virus.
2.3.5. Sự tái bản
• Virus xâm nhập vào trong tế bào chất. Sau đó, tiến hành tháo vỏ, giải phóng

bộ gen virus (ssRNA sợi +).
• Bộ máy dịch mã của tế bào sẽ dịch mã tạo polyprotein ngay trên khuôn RNA
genome của virus (ssRNA sợi +). Tiếp theo, polyprotein này được xử lý hậu
dịch mã nhờ chính các vùng có hoạt tính protease của polyprotein để tạo
thành các protein chức năng.
• Các protein của virus và của tế bào ký chủ thực hiện quá trình tái bản (cần 2
protein chủ chốt của virus là RdRp (NIb) và helicase (CI). Các protein tham
gia tái bản cùng với RNA sợi (+) lắp ráp thành “phức hợp tái sinh virus”

16


(VRC – viral replication complex) gắn trên màng lưới nội chất. Tại VRC,
sợi RNA (-) sẽ được tổng hợp trên sợi RNA (+).
• Sợi (-) mới được tổng hợp ra lại được dùng làm khuôn để tổng hợp nhiều sợi
(+) mới.
• Lắp ráp thành virion mới từ protein CP và sợi (+) được tổng hợp mới.
2.3.6. Phương thức lan truyền
• Lan truyền ngoài tự nhiên bằng rệp muội theo kiểu không bền vững.
• Nhiều virus truyền qua vật liệu giống như củ giống (PVY - khoai tây;
OYDV, LYSV, SYSV - hành tỏi), hạt (BCMV - đậu đỗ), qua phấn hoa
(BCMV - đậu đỗ).
• Có thể truyền qua tiếp xúc cơ học.
2.4. Sơ lược vê bệnh virus trên họ loa kèn
2.4.1. Hippeastrum mosaic virus (HiMV)
Hippeastrum là một chi trong họ Amaryllidaceae, có khoảng 90 loài với hơn
600 giống cây trồng và cây lai (Stevens, 2001), có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và
cận nhiệt đới của châu Mỹ từ phía Bắc Argentina tới Mexico và vùng Caribbean.
Chi này gồm các loài cây thân thảo sống lâu năm, mọc ra từ thân hành, thường có
hoa sặc sỡ và nhiều loài được trồng làm cảnh.

HiMV là một potyvirus. Bệnh do HiMV gây ra được mô tả lần đầu tiên bởi
Kunkel vào năm 1922 trên cây Hippeastrum hybridum (Kunkel, 1922). Dọc theo
phiến lá và cuống hoa của cây bệnh xuất hiện những vết khảm sọc, đứt quãng
(Brunt et al., 1973). Phân tử HiMV có hình sợi mềm, kích thước 782 x 12 nm. Mỗi
phân tử virion được cấu tạo từ các tiểu phần protein sắp xếp theo kiểu xoắn đối
xứng xung quanh 1 phân tử RNA genome (Brunt, 1973; Jayasinghe & Dijkstra,
1979).
HiMV không truyền qua hạt giống, không truyền qua phấn hoa. Virus được
truyền bằng tiếp xúc cơ học nhưng đây không phải là con đường lan truyền ngoài tự
nhiên của virus. Ngoài tự nhiên, virus lan truyền qua rệp như Myzus persicae, Aphis
fabae, A. gossypii theo kiểu không bền vững.
Virus có thể được xác định bằng phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi
chung cho Potyvirus. Ngoài ra, có thể xác định virus bằng cách quan sát thể vùi

17


trong tế bào cây bệnh với hình dạng đặc trưng cho potyvirus như hình trụ, hình
vòng bánh xe, hình phiến. Hầu hết các tế bào bệnh đều có chứa 1 thể vùi, nằm gần
hoặc áp sát vào nhân tế bào và lục lạp của những tế bào này thường nhỏ hơn so với
các tế bào bình thường.
Ký chủ tự nhiên của HiMV mới chỉ tìm thấy trên các cây họ thuộc
Amaryllidaceae, nhưng thông qua phương pháp nhiễm bệnh bằng tiếp xúc cơ học
thì virus có thể gây bệnh trên một số cây thuộc các họ Amaranthaceae,
Chenopodiaceae và Solanaceae.
2.4.2. Vallota speciosa virus
Cây Vallota speciosa (Scarborough Lily) thuộc chi Cyrtanthus, họ
Amaryllidaceae, là cây thân thảo sống lâu năm, mọc ra từ thân hành, có nguồn gốc
từ Nam Phi, hoa thường nở vào cuối mùa hè đầu mùa thu (Stevens, 2001). Hoa hình
phễu, có nhiều màu sắc khác nhau như đỏ tươi, cam, vàng, hồng trắng.

Vallota speciosa virus là một potyvirus mới được công bố gần đây vào năm
2006 tại New Zealand (Wei et al., 2006). Ký chủ tự nhiên của virus này mới chỉ
được phát hiện trên cây hoa thủy tiên (chi Narcissus) (Wei et al., 2006; Nixon
et al., 2008; Wylie et al., 2010).
2.4.3. Lily mottle virus (LMoV)
LMoV là một potyvirus. LMoV được xem là virus phổ biến và nguy hiểm
nhất trên cây hoa trồng bằng củ. Virus còn được gọi dưới một số tên như Lily streak
mottle virus (Brierley & Smith, 1944) và cho đến năm 1990 vẫn được gọi là Tulip
breaking virus (TBV) (Dekker et al., 1993; Derks et al., 1994, dẫn theo Asjes,
2000).
Triệu chứng của LMoV trên lily biến đổi theo tính mẫn cảm của cây. Triệu
chứng có thể biến đổi từ sáng gân, đốm lá, khảm lá, vệt vàng hoặc xanh nhạt, xoăn
và co rút lá, những vết đốm chết hoại màu hơi đỏ nâu cho đến các dạng nhẹ hơn của
triệu chứng lá hay thậm chí là sự nhiễm không biểu hiện triệu chứng ở một số giai
đoạn phát triển trên đồng ruộng. Một số cây có thể biểu hiện vệt trên màu sắc hoa
và hoa bị dị hình, không đối xứng, trong khi những cây khác có thể biểu hiện các
đốm hình nhẫn chết hoại màu nâu trên các vảy của củ. Cây thường thấp hơn và chết

18


sớm, hoa cắt nhanh tàn.
Việc phát hiện virus ở những cây bị nhiễm bệnh phụ thuộc vào virus, độ mẫn
cảm của cây trồng và ảnh hưởng của điều kiện trồng . Mức độ đa dạng về triệu
chứng của LMoV khiến cho việc loại bỏ các cây bị bệnh trên đồng ruộng không dễ
dàng.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật RT-PCR và ELISA đã được sử dụng để
nhận biết những chủng virus trên các cây trồng. LMoV được phát hiện bằng kỹ
thuật RT-PCR với mồi đặc hiệu. Gen quy định protein vỏ đã được giải trình tự sau
khi phân lập dòng cDNA phần đầu 3’ của bộ gen virus (Brierley & Smith, 1944 dẫn

theo Derks et al., 1994). So sánh phương pháp ELISA và RT-PCR, Yoshiji (2002)
chỉ ra rằng RT-PCR nhạy hơn là ELISA trong việc xác định sự có mặt của virus
trong các cây lily. Độ tin cậy của các thử nghiệm thay đổi rất ít khi tiến hành vào
giữa tháng 11 và tháng 3. Sự khác nhau về mức độ tập trung của virus được xác
định ở các vảy đơn riêng rẽ của các củ (van Schadewijk, 1986).
LMoV truyền theo kiểu không bền vững bởi rệp muội Myzus persicae ,
Aphis gossypii, Macrosiphum euphorbiae. Virus được truyền qua dịch cây và không
qua hạt giống của lily (Brierley và Smith, 1944 dẫn theo Derks, 1997).
2.4.4. Lily symptomless virus (LSV)
LSV là một virus thuộc chi Carlavirus, họ Flexiviridae. LSV gây hại chủ yếu
trên 3 loài thực vật thuộc 2 họ khác nhau là cây Alstroemeria (họ
Alstroemeriaceae), hoa ly (Lilium spp.) và cây hoa tulip (Tulipa) (họ Liliaceae).
LSV lan truyền theo kiểu không bền vững nhờ các loài rệp như Myzus
persicae (Mowat & Stefanac, 1974), Macrosiphum euphorbiae (Derks & Abeele,
1980), Aphis gossypii, A. fabae và Aulocorthum solani (Mowat & Stefanac, 1974;
Derks & Asjes, 1975). Bên cạnh đó LSV có thể lan truyền bằng con đường tiếp
xúc cơ học.
2.4.5. Tulip breaking virus (TBV)
TBV là một potyvirus. TBV nhiễm tự nhiên trên cây các cây Tulipa spp,
Lilium spp. Virus này gây hại nghiêm trọng trên cây hoa Tulip. Truyền bệnh nhờ
véc tơ truyền bệnh là côn trùng: Myzus persicae, Aphis gosypii, Aphis fabae,

19


Macrosiphum euphorbiae, Dysaphis tulipae, Aphididae.Virus truyền không theo
một cách thức cụ thể. Virus truyền bệnh qua việc ghép cành, kỹ thuật cơ học gây xát
thương, không truyền bệnh bằng tiếp xúc giữa các cây với nhau, không truyền qua
hạt giống, không truyền qua phấn hoa.
Phạm vi phân bố: Có thể Phân bố trên toàn thế giới (Brierley & Smith 1944).

2.4.6. Lily virus X (LVX)
LVX là virus thuộc chi Potexvirus. Theo CABI, 2007, LVX chỉ gây hại trên
cây hoa ly (Lilium spp.). Tuy nhiên theo Takashi et al. (2000), LVX có thể xâm
nhiễm trên 11 trong số 43 loài thuộc 10 họ khi lây nhiễm nhân tạo bằng tiếp xúc cơ
học.
2.4.7. Narcissus mosaic virus (NMV)
NMV thuộc chi Potexvirus. Theo CABI, 2005, NMV chỉ gây hại trên 2 loài
hoa trồng là Lilium speciosum và Narcissus (cây thuỷ tiên vàng). Tuy nhiên theo
Brunt (1966), NMV có thể lây nhiễm trên một số loài cỏ nằm trong 10 họ của cây 2
lá mầm.
NMV không truyền qua vector côn trùng và hạt giống mà truyền qua tiếp xúc
cơ học và qua củ giống (Mowat, 1971).
2.5. Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật RT-PCR
Các bước trong chẩn đoán bệnh cây bằng RT-PCR:
1. Thiết kế mồi: tự thiết kế hoặc lựa chọn mồi từ các nghiên cứu đã được công
bố.
2. Tách chiết RNA tổng số từ mô cây.
3. Tiến hành phản ứng RT-PCR.
4. Kiểm tra, đánh giá kết quả bằng điện di.
Có 2 loại mồi được sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây:
Mồi chung (degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có
khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường là các đối tượng trong 1
họ, 1 chi).
Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệt
được loài, thậm chí dưới loài như chủng, nòi…

20


2.6. Kỹ thuật xác định trình tự

Những phương pháp xác định trình tự axit nucleic đang được sử dụng ngày
nay đều dựa trên phương pháp của Frederick Sanger (1977) , có cải tiến. Phương
pháp này còn được gọi là phương pháp enzyme học hay phương pháp dideoxy.
Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá
trình kéo dài DNA khi tổng hợp. Nhân tố kết thúc là các 2,3 dideoxynucleoside
triphosphat (ddNTP). Các ddNTP có thể kết hợp vào chuỗi DNA đang tổng hợp qua
nhóm 5 triphosphat nhưng lại không thể tiếp tục kết hợp được với phân tử
desoxynucleoside triphosphat tiếp theo. Do đó khi trộn lẫn lượng nhỏ
dideoxynucleoside triphosphat với 4 loại desoxynucleosid triphosphat rồi tiến hành
tổng hợp DNA nhờ DNA polymerase thì sẽ thu được một loạt các đoạn DNA được
kết thúc đặc hiệu bởi gốc dideoxy nucleotit. Tiến hành 4 thí nghiệm tách rời, mỗi
phản ứng bổ sung 1 loại dideoxy nucleotit khác nhau sẽ thu được các đoạn DNA có
kết thúc bằng các dideoxy nucleotit khác nhau và hơn kém nhau 1 nucleotit. Chạy
điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng, ta có thể xác định trình tự của chuỗi DNA
quan tâm.

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

21


3.1. Đối tượng nghiên cứu
Potyvirus hại cây hoa họ loa kèn.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Trung tâm bệnh cây nhiệt đới – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu:
Từ 01/2015 đến 06/2015
3.3. Vật liệu nghiên cứu
3.3.1. Mẫu cây thí nghiệm

Các mẫu cây sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các mẫu cây sử dụng trong nghiên cứu
STT

Ký hiệu mẫu

Cây ký chủ
Loa kèn

1

LKT-36

2

LKT-39

3

LKT-ĐC9

4

LKT-56

5

LKT-58

6


LKĐ-ĐC5

Loa kèn đỏ

7

LKĐ-17

Loa kèn đỏ

8

LKĐ-18

Loa kèn đỏ

Triệu chứng

Địa điểm thu mẫu

Khảm lá

Tây Tựu-Từ Liêm

Khảm lá

Tiền Phong-Mê Linh

Không triệu


Bộ môn Sinh học- khoa

chứng

CNSH
Cây nuôi cấy meristem

trắng
Loa kèn
trắng
Loa kèn
trắng
Loa kèn

Khảm lá

trắng
Loa kèn

Khảm lá

trắng

Không triệu
chứng
Khảm lá
Không triệu
chứng


(cây nguồn: LKT1)
Cây nuôi cấy meristem
(cây nguồn: LKT2)
Vườn Thực Vật – Khoa
Nông Học
Vườn Thực Vật – Khoa
Nông Học
Mẫu cây tách vảy
Bộ môn Thực Vật –

9

LKĐ-21

Loa kèn đỏ

Không triệu

Khoa CNSH

chứng

(Nhân nhanh từ vảy củ
- Giống: Red Peacock)

22


Bộ môn Thực Vật –
10


LKĐ-22

Loa kèn đỏ

Không triệu

Khoa CNSH

chứng

(Nhân nhanh từ vảy củ
- Giống: Red Peacock)

11

L-ĐC

Lay ơn

12
13

L-3
L-11

Lay ơn
Lay ơn

Không triệu

chứng
Khảm lá
Khảm lá

Tiền Phong – Mê Linh
Tiền Phong – Mê Linh
Tiền Phong – Mê Linh

3.3.2. Cây chỉ thị
Potyvirus trên hoa loa kèn trắng: thuốc lá (Nicotiana tabacum var. Xanthi),
phong huệ đỏ (Zephyranthes rosea), ly (thu từ phương pháp tách vảy củ; nguồn:
Viện nghiên cứu Rau quả), cỏ lan chi (Chlorophytum bichetii), lô hội
Potyvirus trên hoa loa kèn đỏ: thuốc lá (Nicotiana tabacum var. Xanthi), hoa
loa kèn đỏ (Hippeastrum sp.)(bộ môn Thực vật – khoa CNSH), phong huệ đỏ
(Zephyranthes rosea), ly (thu từ phương pháp tách vảy củ; nguồn: Viện nghiên cứu
Rau quả), cỏ lan chi (Chlorophytum bichetii).
3.3.3. Các đệm, dung dịch, kít, hóa chất và môi trường chính
• 2xGoTaq (hãng Fermentas)
• MMLUV Reverse transcriptase (hãng Fermentas)
• Đệm 0.5× TAE dùng điện di: 5mM Tris-acetate và 0.25mM EDTA (pH 7.8).
• Agar
• Đệm photphat 0.01M, pH 7.4: lây nhiễm bệnh nhân tạo.
• CTAB
• β mercaptoethanol
• Chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1): loại bỏ lipid and protein trong tinh chiết
RNA.
• LiCl
• Đệm TE: 10mM Tris-Cl và 1mM EDTA (pH 8.0).
• DEPC
• Môi trường MS : nuôi cấy Meristem với thành phần môi trường được trình bày ở


23


phần phụ lục.
Bảng 3.2. Thành phần môi trường MS
Ký hiệu DD mẹ Thành phần

Số mg/ 1 lít
MT nuôi cấy

Đa lượng
MS1

MS2

MS3

NH4NO3

1650

KNO3

1900

MgSO4.7H2O

370


KH2PO4

170

CaCl2.2H2O

440

Vi lượng
MnSO4.4H2O

23,3

ZnSO4.7H2O

8,6

H3BO3

6,2

KI

0,83

Na2MoO2.2H2O

0,25

CuSO4.5H2O


0,025

CoCl2.6H2O

0,025

Na2EDTA

37,3

FeSO4. 7H2O

27,8

Vitamin và axit amin
MS4

Thiamine HCl

0,1

Nicotinic axit

0,5

Pyridoxine HCl

0,5


Glycine

2

Myo-inositol

100

Sucrose (g/l)
3.4. Phương pháp nghiên cứu

30

3.4.1. Điều tra bệnh
Điều tra tỷ lệ bệnh trên ruộng trong thời điểm thu mẫu. Tính tỷ lệ bệnh theo
công thức:

24