TIỂU LUẬN
DI TRUYỀN Y HỌC


MỤC LỤC
I. PCR............................................................................................................................1
1. Khái niệm:.........................................................................................................1
2. Quy trình............................................................................................................1
3. Phản ứng RT-PCR (PCR ngược).......................................................................2
3.1 Nguyên lí.....................................................................................................2
3.2 Tiến hành phản ứng RT- PCR......................................................................3
4. Real-time PCR...................................................................................................3
4.1 Khái niệm:...................................................................................................3
4.2 Nguyên tắc:..................................................................................................3
4.3 Ưu, nhược điểm:..........................................................................................4
4.3.1 Ưu điểm:...............................................................................................4
4.3.2 Nhược điểm:.........................................................................................4
5. Lưu ý với RT-PCR: giống với PCR và cần chú ý thêm.....................................7
6. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR.........................................................7
7. Những ứng dụng của PCR.................................................................................8
7.1 Vân tay di truyền.........................................................................................9
7.2 Chẩn đoán bệnh di truyền............................................................................9
7.3 Tách dòng gen...........................................................................................10
7.4 Gây đột biến điểm.....................................................................................10
7.5 Phân tích mẫu DNA cổ..............................................................................11
7.6 Xác định kiểu gene của các đột biến.........................................................11
7.7 So sánh mức độ biểu hiện của gen.............................................................11
II. ELISA.....................................................................................................................12
1. Khái niệm:.......................................................................................................12
2. Nguyên lý:.......................................................................................................12

3. Các yếu tố ảnh hưởng:.....................................................................................14
4. Ưu, nhược điểm:..............................................................................................14
4.1 Một số ưu điểm của kỹ thuật này:.............................................................14
4.2 Tuy nhiên kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế:...........................14
5. Phân loại ELISA..............................................................................................15
5.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)................................................................15
5.2 ELISA gián tiếp.........................................................................................15
5.3 Sandwich ELISA.......................................................................................17
5.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp..................................................................18
5.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp.................................................................19
5.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh......................................................................19
5.5 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên....................................................20
5.6 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể...........................................................21
6. Ưu điểm phương pháp elisa.............................................................................22
7. Ứng dụng kỹ thuật ELISA trong y học:...........................................................23
7.1 ứng dụng phương pháp ELISA xét nghiệm HIV:......................................23
7.1.1 Cấu trúc HIV:.....................................................................................23
7.2 Nguyên lí của kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng HIV:..............23
7.3 Sinh phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV:...................25
7.4 Phát hiện kháng thể trên bệnh giun lươn bằng phản ứng ELISA..............26
III. Dịch bài báo “Isolation of RNA from Equine Peripheral Blood Cell:
Comparison of Methods”.............................................................................................26


DANH MỤC CÁC BẢNG HÌNH

Hình 1: Thiết bị nhân ADN (máy PCR)................................................................1
Hình 2: Chu trình PCR..........................................................................................2
Hình 3: Các thiết bị dùng trong kỹ thuật realtime PCR.........................................4
Hình 4: Kết quả sau khi dùng kỹ thuật PCR..........................................................5

Hình 5: Sơ đồ Realtime PCR TaqMan...................................................................6
Hình 6: Kết quả thử nghiệm quan hệ cha con........................................................9
Hình 7: Nhân bản một gen bằng plasmid............................................................10
Hình 8: Kỹ thuật ELISA......................................................................................13
Hình 9: Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh..................................................20
Hình 10: Quy trình xét nghiệm HIV....................................................................25
Hình 11: Trung bình và sai số chuẩn của giá trị trung bình.................................33
Sơ đồ 1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp.....................................15
Sơ đồ 2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp.....................................16
Sơ đồ 3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp....................................18
Sơ đồ 4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp....................19
Sơ đồ 5: Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên...............................................21
Sơ đồ 6: Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể......................................................22
Bảng 1: Kết quả cho mẫu lâm sàng……….……………………………………………31


I. PCR
1. Khái niệm:
PCR(Polymerase Chain Reaction) là môt kỹ thuật cho phép khuếch đại một
đoạn gen đặc hiệu để thu được nhiều bản sao phục vụ nghiên cứu. Bên cạnh đó,
PCR cũng cho phép dễ dàng đưa các thay đổi, đột biến vào ADN để nghiên cứu.

Hình 1: Thiết bị nhân ADN (máy PCR)

2. Quy trình
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 2)
 (1)Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là
biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1,
DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu
DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời

gian: 1-2 phút
 (2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể
gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này
phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (4560 °C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi
không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian:
1-2 phút.
 (3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám
vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ
1


kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc
vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như
một quy tắc …, 1000bp/ 1 phút.

Hình 2: Chu trình PCR

3. Phản ứng RT-PCR (PCR ngược)
3.1 Nguyên lí
Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân một trình tự từ khuôn ARN,
gồm 2 giai đoạn: (1) Tổng hợp trình tự ADN 2 sợi từ sợi ARN làm khuôn; (2)
Trình tự ADN 2 sợi lại làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR. Phản ứng biến đổi
ARN thành ADN phải nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse-trancriptase) được
gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở nhiệt độ 50oC – 55oC trong 30
2


phút. Sau khi có sản phẩm ADN 2 sợi thì phản ứng tiếp theo là PCR thông
thường gồm 3 giai đoạn. RT-PCR được sử dụng để nhân ARN của retrovirut hoặc
mARN tách từ tế bào chất.

3.2 Tiến hành phản ứng RT- PCR
- Giai đoạn 1 (RT): 1 chu kì, thực hiện sao chép ngược từ ARN sợi đơn sang
ADN sợi kép ở nhiệt độ 50oC- 55oC, trong 30 phút.
- Giai đoạn 2 (PCR): (1). Biến tính ở nhiệt độ 94o-95oC /1phút; (2).Tiếp hợp mồi
ở 40-65oC; (3). Tổng hợp ADN ở 72oC/1 phút.

4. Real-time PCR
4.1 Khái niệm:
Trong sinh học phân tử, real-time PCR, hay còn gọi là PCR định lượng trực tiếp,
hay còn gọi là PCR động học, là một dạng biến đổi của PCR chuẩn thức để
khuếch đại và nếu kèm gam chuẩn thì đồng thời định lượng một trình tự đích đặc
hiệu khi chúng tích tụ lại ở một thời điểm nhất định sau mỗi chu kỳ phản ứng. Hệ
thống “real-time” tuân thủ thường quy chung của PCR nhưng cho một đường
cong khuếch đại tương tự đường cong phát triển vi khuẩn gồm 3 giai đoạn: kéo
dài đến khi dấu hiệu của sản phẩm PCR lớn hơn dấu hiệu nền của hệ thống; tăng
gia tốc kéo dài và tạo hình phẳng. Do vậy, một bức tranh hoàn thiện của cả quá
trình PCR được thể hiện rõ hơn chứ không phải chỉ là một sản phẩm cuối cùng
của phản ứng sau một số chu kỳ nhất định. Với real-time PCR, kết quả được
phân tích ngay trong lúc phản ứng đang chạy nên không bị nhiễm sản phẩm từ
ngoài vào, kết quả thu được nhanh hơn nhưng lại được kiểm soát tốt hơn, tự động
hoàn toàn.
4.2 Nguyên tắc:
Thực chất hệ thống Real time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy
quang phổ huỳnh quang và máy vi tính.
Real-Time PCR cho biết kết quả lượng DNA hình thành ở từng thời điểm trong
suốt tiến trình phản ứng.

3



Hình 3: Các thiết bị dùng trong kỹ thuật realtime PCR

Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản
ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo
thành.
4.3 Ưu, nhược điểm:
4.3.1 Ưu điểm:

Real-time PCR: Nhanh, cho phép theo dõi tiến trình phản ứng và biết được
lượng DNA đã tạo thành ở từng thời điểm. Không cần điện di nên tiến hành
được nhiều mẫu (gần 200 mẫu/ngày). Hạn chế tạp nhiễm. Độ nhạy cao (3pg
DNA). Lượng mẫu biến động (10-1010 copies). Độ lặp lại cao (CV < 2,0%).
4.3.2 Nhược điểm:

Vấn đề đối với Real-time PCR, không phân biệt được tác nhân gây bệnh còn sống hay
chết, đòi hỏi kỹ năng, thiết bị.

Ứng dụng Kỹ thuật Real time PCR chẩn đoán sớm HIV trên trẻ em Eric
Nerrienet HIV/Hepatitis Laboratory IP Cambodia, Phnom Penh. Nếu không có
sự tầm soát sớm nhiễm HIV ở trẻ, BS Nhi Khoa phải chờ đợi đến tháng thứ 15 để
có thể biết tình trạng huyết thanh học thực sự của trẻ sinh ra từ bà mẹ HIV(+)
Nếu trẻ không được phát hiện sớm và điều trị thuốc kháng virus, trẻ có nguy cơ
tử vong là 50% trong 02 năm đầu tiên của cuộc sống Kỹ thuật kinh điển trong
chẩn đóan nhiễm HIV ở trẻ - RT PCR/b-DNA: Giá thành đắt.
- Nested-DNA PCR (gen: Gag, Pol và/hoặc Env): Đắt, kỹ thuật phức tạp - Nuôi
cấy và phân lập virus: Đắt, kỹ thuật phức tạp, mất nhiều thời gian, cần labo an
4


tòan mức độ 3 - Kỹ thuật real time PCR Để chẩn đoán sớm, giá thành thấp ở trẻ

sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.

Hình 4: Kết quả sau khi dùng kỹ thuật PCR

Thông thường, real-time PCR được kết hợp với RT-PCR để định lượng một
lượng nhỏ ARN thông tin. Ký hiệu real-time PCR là rt PCR. Định lượng trực tiếp
không những có vai trò trong chẩn đoán mà còn có vai trò trong tiên lượng bệnh,
quyết định điều trị, tái điều trị, duy trì điều trị thuốc kháng virus đặc hiệu.
RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang
Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng thuốc nhuộm ADN, thường là SYBR
Green, thuốc nhuộm gắn không đặc hiệu vào tất cả các chuỗi ADN kép và phát
huỳnh quang, sau mỗi chu kỳ phản ứng, lượng ADN sản phẩm tăng làm tăng
cường độ tín hiệu huỳnh quang tương ứng. Nhược điểm của chất huỳnh quang là
có thể gắn vào các sản phẩm tự mồi gây nên hiện tượng nhiễu, làm giảm độ
5


chính xác trong phân tích định lượng kết quả trình tự đích cần khuếch đại.
Phản ứng được thực hiện trong một máy chu kỳ nhiệt như bình thường, trừ việc
thêm thuốc nhuộm chuỗi ADN kép, thuốc nhuộm chỉ phát quang khi gắn với
chuỗi ADN kép, và đầu dò sẽ đo mức huỳnh quang sau mỗi chu kỳ. Nếu kèm
gam chuẩn ngoài thì phản ứng có thể định lượng được.
RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR
TaqMan)
Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang là một phương pháp chính xác và đáng
tin cậy nhất, nhưng cũng đắt nhất. Nguyên lý của phương pháp này là các đầu dò
chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần phát
hiện (hiện tượng FRET). Đầu dò ADN hay ARN gắn đặc hiệu vào khu vực giữa
hai đoạn mồi để định lượng chỉ những ADN chứa trình tự đầu dò, do vậy làm
tăng đáng kể độ đặc hiệu, và thậm chí có thể cho phép định lượng khi có mặt cả

một số sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Khả năng này còn cho phép làm thử
nghiệm đa mồi khi sử dụng các đầu dò đặc hiệu đánh dấu các mầu khác nhau.

Hình 5: Sơ đồ Realtime PCR TaqMan

Thông thường, đầu dò mang huỳnh quang ở một đầu (Reporter – 5’) và một chất
chặn ở đầu kia (Quencher – 3’), vị trí gần nhau giữa chất mang và chất chặn làm
thuốc nhuộm huỳnh quang truyền năng lượng tới chất chặn gần đó chứ không
phát
quang. Khi taq polymerase hoạt động, do enzyme này có hoạt tính 5’ – 3’
exonuclease nên đầu dò bị đánh bật khỏi khuôn mẫu, lúc này, trạng thái gần nhau

6


giữa chất mang và chất chặn bị phá vỡ nên hiện tượng FRET không xảy ra nữa,
chất huỳnh quang không còn bị chặn, ở trạng thái tự do nên phát quang và tín
hiệu phát quang này sẽ được máy đo lại Ề Sản phẩm đích tăng lên sau mỗi chu kỳ
phản ứng thì lượng chất huỳnh quang tự do được giải phóng ra cũng tích tụ lại
ngày càng nhiều.
PCR được tiến hành bình thường, trừ việc thêm đầu dò có đánh dấu huỳnh
quang; Khi phản ứng bắt đầu, ở giai đoạn gắn mồi của PCR, cả mồi và đầu dò
đều gắn đặc hiệu vào ADN đích; Quá trình tổng hợp chuỗi được thực hiện từ vị
trí các mồi, và khi taq polymerase chạm vào đầu dò thì hoạt tính 5’ – 3’
exonuclease của enzyme này phá hủy đầu dò, tách chất mang huỳnh quang khỏi
chất chặn và do đó làm tăng lượng chất huỳnh quang ở dạng tự do. Chất huỳnh
quang được đo bằng máy real-time PCR, lượng tăng trung bình nhân chất huỳnh
quang tương ứng với lượng tăng cấp số mũ của sản phẩm và được sử dụng để xác
định chu kỳ ngưỡng (Ct) của mỗi phản ứng.


5. Lưu ý với RT-PCR: giống với PCR và cần chú ý thêm


Loại enzyme phiên mã ngược

Enzyme phiên mã ngược là ADN polymerase phụ thuộc ARN, xúc tác quá trình
tổng họp từ ARN thành sợi đơn ADN bổ trợ đầu tiên và sau đó là tổng hợp chuỗi
ADN đầu tiên.
Trên thị trường thường lưu hành 3 loại enzyme có hoạt tính phiên mã ngược là
AMV, M-MuLV, và Tth. Các loại enzyme này có hoạt tính tối ưu ở các độ pH,
nồng độ muối, và nhiệt độ ủ khác nhau nên cần tối ưu hóa các điều kiện phản
ứng cho từng loại. AMV và M-MuLV có khả năng tổng hợp ADN bổ trợ dài tới
lOkb, còn khả năng tổng hợp của Tth là 1 – 2 kb.

6. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Các mồi oligonucleotide: Tỷ lệ GC ở các mồi thường chiếm khoảng
40-75%. Khoảng cách giữa hai mồi thường không dài quá 3 kb. Các mồi không
được tạo cấu trúc bậc hai do liên kết giữa các nucleotide ngay trong một mồi.
Độ dài của mồi (số nucleotide) từ 15 đến không quá 30. Những mồi dài hoặc
ngắn hơn ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp chính xác với ADN khuôn hoặc nhân
bản không đặc hiệu. ADN được tổng hợp khi đầu 3' của mồi đã liên kết với
khuôn mặc dù đầu 5' có thể tự do. Do đó đầu 5' của mồi có thể được gắn thêm
linker hoặc đoạn nucleotide điều khiển (promoter). Nồng độ mồi khoảng
0,1μM đến 1μM. Nồng độ thường được xác định dựa vào giá trị OD đo ở 260
nm.
7


Liên kết giữa mồi và ADN khuôn: Mồi gắn vào sợi khuôn ADN nhờ
liên kết tạo cặp bổ sung giữa chúng. Liên kết này phụ thuộc thời gian, nhiệt độ,

nồng độ mồi cũng như nồng độ sợi khuôn. Khi nồng độ mồi rất lớn so với nồng
độ khuôn, thời gian ủ mồi với sợi khuôn không cần thiết quá lâu. Nhiệt độ ở
giai đoạn này phụ thuộc chiều dài của mồi và hàm lượng GC. Khi oligo mồi
gồm 12 đến 15 base, nhiệt độ ủ khoảng 40-45 oC. Nhiệt độ 72oC thích hợp cho
phản ứng tổng hợp ADN bằng Taq polymerase (là AND polymerase có hoạt
tính ở nhiệt độ cao). Lúc này cần lưu ý các mồi ngắn thường bị biến tính 87-88
tách ra khỏi sợi khuôn. Ngoài ra, trong trường hợp mồi được tổng hợp xuất phát
từ trình tự acid amin thì liên kết giữa mồi với ADN khuôn không hoàn toàn bổ
sung do tính chất thoái hoá của mã di truyền. Do đó, mồi loại này dễ dàng tách
ra khỏi sợi khuôn ở nhiệt độ tổng hợp ADN 27oC. Vì vậy trong trường hợp này,
thời gian gắn mồi có thể kéo dài hơn so với mồi có trình tự chính lấy từ đoạn
cần nhân bản vì Taq polymerase có thể tổng hợp ADN ở nhiệt độ gắn mồi. Sau
đó mới tăng nhiệt độ lên 72oC. Rõ ràng nhiệt độ và thời gian ở giai đoạn gắn
mồi đặc biệt quan trọng; nhiệt độ quá cao gây biến tính, nhiệt độ quá thấp tạo ra
các liên kết không đặc hiệu (mồi có thể bám vào vị trí bất kỳ có độ tương đồng
chứ không đảm bảo chính xác). Ngoài ra khi ADN khuôn chiếm tỷ lệ rất nhỏ (ví
dụ một đoạn ADN trong genome), thời gian cần thiết để mồi tìm đúng vị trí liên
kết đặc hiệu và tạo cặp với khuôn thường khoảng 2 phút trong một số chu kỳ
đầu tiên. Điều đáng lưu ý khi chỉ vài nucleotide ở đầu 3' của mồi đã liên kết với
khuôn thì Taq polymerase sẽ kéo dài sợi mồi thành sợi ADN mới bất chấp mồi
chưa liên kết hoàn toàn với khuôn ở đầu 5'.
Nồng độ một số ion cũng như bốn loại nucleotide dNTPs trong môi
trưòng đều ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Ví dụ, ion Mg +2 kích thích phản ứng
tổng hợp ADN trong khi muốn nhân được đoạn ADN dài cần loại bỏ hoàn toàn
KCl khỏi môi trường. ADN khuôn có thể là ADN genome tách ra từ tế bào,
ADN từ các ngân hàng genome hoặc ADNc, các AND bất kỳ; ARN tổng số
hoặc ARNm. Nồng độ ADN khuôn thường < ng với ADNc, hoặc <μg với ADN
genome.

7. Những ứng dụng của PCR

7.1 Vân tay di truyền
Vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định một người bằng
cách so sánh DNA của người đó với mẫu đã có, ví dụ như, mẫu máu thu được từ
8


hiện trường vụ án có thể được so sánh di truyền với mẫu máu của người tình
nghi. Có thể chỉ cần một lượng nhỏ DNA thu từ máu, tinh dịch, nước bọt, tóc...
Về lý thuyết thì chỉ cần một mạch DNA đơn là đủ.
Mặc dù các kết quả "dấu vân tay" là duy nhất (trừ cặp song sinh giống hệt nhau),
mối quan hệ di truyền, ví dụ, cha mẹ và con hoặc anh chị em ruột, có thể được
xác định từ hai hoặc nhiều dấu vân tay di truyền, có thể được sử dụng để thử
nghiệm quan hệ cha con. Một biến thể của kỹ thuật này cũng có thể được sử
dụng để xác định các mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật.

Hình 6: Kết quả thử nghiệm quan hệ cha con

7.2 Chẩn đoán bệnh di truyền
Phát hiện các bệnh di truyền trong một gen nhất định là một quá trình lâu dài và
khó khăn, có thể được rút ngắn đáng kể bằng cách sử dụng phương pháp PCR.
Mỗi gen trong câu hỏi có thể dễ dàng được khuếch đại qua PCR bằng cách sử
dụng các loại sơn lót thích hợp và sau đó trình tự để phát hiện đột biến.
Bệnh virus, cũng có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR thông qua
khuếch đại của DNA của virus. Phân tích này là có thể ngay sau khi nhiễm trùng,
có thể từ vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu chứng thực tế xảy ra. Chẩn
9


đoán sớm như vậy cho các bác sĩ dẫn quan trọng trong điều trị.
7.3 Tách dòng gen

Nhân bản một gen không nên nhầm lẫn với nhân bản toàn bộ một sinh vật mô tả
quá trình cô lập một gen từ một sinh vật và sau đó chèn nó vào sinh vật khác.
PCR thường được sử dụng để khuếch đại gen, mà sau đó có thể được chèn vào
một vector (vector là một phương tiện chèn một gen vào cơ thể) như một plasmid
(một phân tử DNA vòng) (Hình 7). DNA sau đó có thể được chuyển thành một
sinh vật khác nhau, nơi gen và sản phẩm của nó có thể được nghiên cứu chặt chẽ
hơn. Thể hiện một gen nhân bản (thể hiện một gen có nghĩa là để sản xuất các
protein mà nó xác định sản xuất) cũng có thể là một cách để sản xuất hàng loạt
hữu ích ví dụ protein-cho, thuốc men.

Hình 7: Nhân bản một gen bằng plasmid

7.4 Gây đột biến điểm
Đột biến là một cách để làm thay đổi trình tự của các nucleotide trong DNA. Có
những tình huống trong đó một là quan tâm đến biến đổi (thay đổi) bản sao của
một chuỗi ADN nhất định, ví dụ, khi đánh giá các chức năng của một gen hoặc
trong ống nghiệm tiến hóa protein. Đột biến có thể được đưa vào trình tự DNA
sao chép theo hai cách cơ bản khác nhau trong quá trình PCR. Đột biến trang
web hướng cho phép người thử nghiệm để giới thiệu một đột biến tại một địa
điểm cụ thể trên sợi DNA. Thông thường, đột biến mong muốn được kết hợp
trong các mồi sử dụng cho các chương trình PCR. Đột biến ngẫu nhiên, mặt
khác, dựa trên việc sử dụng các polymerase dễ bị lỗi trong quá trình PCR. Trong
trường hợp đột biến ngẫu nhiên, vị trí và tính chất của đột biến không thể kiểm
soát. Một ứng dụng của đột biến ngẫu nhiên là để phân tích các mối quan hệ cấu
trúc chức năng của protein. Bằng cách thay đổi một cách ngẫu nhiên một chuỗi
10


DNA, người ta có thể so sánh các protein kết quả với ban đầu và xác định chức
năng của từng phần của protein.

7.5 Phân tích mẫu DNA cổ
Sử dụng PCR, nó sẽ trở thành có thể phân tích ADN đó là hàng ngàn năm tuổi.
Kỹ thuật PCR đã được sử dụng thành công trên động vật, chẳng hạn như một voi
ma mút bốn mươi ngàn năm tuổi, và cũng trên DNA của con người, trong các
ứng dụng khác nhau, từ việc phân tích các xác ướp Ai Cập đến việc xác định một
Sa hoàng Nga.
7.6 Xác định kiểu gene của các đột biến
Thông qua việc sử dụng kỹ thuật PCR, người ta có thể dễ dàng xác định alen của
một đột biến hoặc đa hình một cá nhân. Ở đây, một trong hai đoạn mồi là phổ
biến và sẽ bám một khoảng cách ngắn từ đột biến, trong khi người anneals khác
phải làm biến thể của đầu 3' của mồi cụ thể được sửa đổi, chỉ ủ nếu nó phù hợp
với một trong các alen. Nếu đột biến của lãi suất là một T hoặc C đơn đa hình
(T / C SNP), người ta sẽ sử dụng hai phản ứng, một trong có chứa một mồi kết
thúc bằng T và kết thúc khác trong C. Lớp sơn lót phổ biến là như nhau. Sau
PCR, hai bộ phản ứng sẽ được chạy trên gel agarose và các mô hình ban nhạc sẽ
cho bạn biết nếu cá nhân là đồng hợp tử T, đồng hợp tử C, hoặc heterzygous T /
C. Phương pháp này có nhiều ứng dụng, chẳng hạn như khuếch đại haplotype
nhất định (khi alen nhất định ở mức 2 hoặc nhiều SNPs xuất hiện cùng nhau trên
cùng nhiễm một sắc thể (Linkage mất cân bằng) hoặc phát hiện các nhiễm sắc thể
tái tổ hợp và nghiên cứu về tái tổ hợp phân bào giảm nhiễm.
7.7 So sánh mức độ biểu hiện của gen
Các nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật PCR truyền thống như là một cách để
ước tính thay đổi trong số lượng biểu hiện của gen. Axit ribonucleic (RNA) được
phiên mã từ DNA trước khi tổng hợp protein và những sợi RNA giữ các hướng
dẫn trình tự protein được gọi là RNA thông tin (mRNA). Một khi RNA được cô
lập nó có thể được đảo ngược chép lại vào DNA (DNA bổ sung để được chính
xác, được gọi là cDNA), lúc đó truyền thống PCR có thể được áp dụng để
khuếch đại gen, phương pháp này được gọi là RT-PCR. Trong hầu hết các trường
hợp nếu có nhiều nguyên liệu ban đầu (mRNA) của một gen sau đó trong PCR
nhiều bản sao của gen được tạo ra. Khi sản phẩm của phản ứng PCR được chạy

trên gel agarose, tương ứng với một gen, sẽ xuất hiện lớn hơn trên gel. Bằng cách
chạy mẫu khuếch đại cDNA từ sinh vật xử lý khác nhau có thể có được một ý
11


tưởng chung trong đó mẫu thể hiện nhiều hơn của gen quan tâm.

II. ELISA
1. Khái niệm:
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết
với enzym) Hay còn gọi là phương pháp ELISA hay EIA là một kỹ thuật sinh hóa
để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay
ELISA được sử dụng rộng rãi trong y học.

2. Nguyên lý:
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể,
trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp
(thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất
thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu
giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng
độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Hay nói cách khác ELISA giúp
xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu
nghiên cứu.
Trong phương pháp này:
1. Tấm kính được phủ một lớp kháng thể.
2. Sau đó mẫu được thêm vào và kháng nguyên liên kết để nắm bắt kháng
thể.
3. Sau đó các kháng thể phát hiện được thêm và gắn vào một khu vực khác
nhau (epitope) của kháng nguyên.
4. Enzyme liên kết kháng thể thứ cấp được thêm vào và liên kết với các

kháng thể phát hiện.
5. Sau đó các chất nền được thêm vào và phản ứng giữa chất nền và các
enzyme tạo ra một sự thay đổi màu sắc. Mật độ quang học (OD) các giá trị
có thể được đo spectrophotometrically.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên,
kháng thể (cần có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết) và
chất tạo màu; quy trình được thực hiện qua hai bước:
 Bước 1: phản ứng miễn dịch học- là sự kết hợp giữa kháng nguyên và
12


kháng thể
 Bước 2: phản ứng hóa học- thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm
giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do
đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
Enzyme thường được sử dụng là:
Peroxidase
Beta-galactoxidase
Alkaline phosphatase

Hình 8: Kỹ thuật ELISA

Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm
(polystyrene microtiter plate).
Phương thức cố đinh không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề
mặt của đĩa;
Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn
với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra
Khi tiến hành cần chú ý những yếu tố sau đây sẽ ảnh hưởng đến độ nhạy của
phản ứng ELISA:

Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng
Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên
Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên

13


3. Các yếu tố ảnh hưởng:
Ngoài ra, kết quả cửa ELISA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố:
 Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ
chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng
bị nhiễm.
 Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thì
phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện
bảo quản
 Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra
thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo
màu.
 Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương
thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo
quản.
 Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên
thay đổi một yếu tố thí nghiệm.
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc
kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch
phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà
vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau. ELISA được dùng để xác định nhiều tác
nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.

4. Ưu, nhược điểm:

4.1 Một số ưu điểm của kỹ thuật này:
Dễ thực hiện
Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu
Có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG, IgA và IgE
4.2 Tuy nhiên kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế:
Đòi hỏi thời gian ( có kết quả sau 5 giờ)
Thiết bị mắc tiền

14


5. Phân loại ELISA
5.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)
Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA. Trong đó,
kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được
phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme).

Sơ đồ 1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp

- Ưu điểm: Đơn giản nhất
- Nhược điểm:
+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope
(trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào
một epitope.
+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng.
5.2 ELISA gián tiếp
Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng
nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng
thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme).


15


Sơ đồ 2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp

 Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là các
đĩa).Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu
kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ
của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
 Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng
nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống
các mẫu KNchuẩn.
 Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như
albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các
mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết
thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt
của đĩa. Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả
các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố
định mà không kết hợp với protein của huyết thanh.
 Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết
hợp với bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu
kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme).
 Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
 Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu
huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố
khuyếch đại).

16



*Ưu và nhược điểm:
Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều
loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa.
Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều
này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử
nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng
được.
5.3 Sandwich ELISA
Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho
phản ứng mạnh và nhạy. Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được
đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture
antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ thuật này cũng
được phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double
antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody
sandwich).
DAS ELISA gồm sự dính thụ động của kháng thể vào pha rắn (đáy giếng).
Những kháng thể này sau đó kết hợp với các kháng nguyên được thêm vào.
Những kháng nguyên được pha loãng trong blocking buffer nhằm ngăn sự dính
không chuyên biệt của chúng vào pha rắn. Ở đây, những phần của blocking
buffer không nên chứa bất kỳ kháng nguyên nào mà có thể kết hợp với kháng thể
bắt. Sau khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha
rắn.
Kháng thể bắt sau đó được thêm vào. Do vậy, đây là sự kết hợp trực tiếp với
kháng nguyên đích và kháng thể bắt. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng
thể một hoặc khác về nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể. Sau
khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào và đọc trên máy đo quang phổ. Vì sử dụng một
kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn về tính chuyên biệt và
những thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt. Điều này giới hạn sự linh
hoạt của phương pháp, ví dụ như mỗi kháng thể được sử dụng phải được đánh
dấu riêng (cho những kháng nguyên khác nhau). Theo cách này, direct ELISA bị

giới hạn về sự chuẩn bị kháng thể. Hệ thống cũng bị giới hạn ở chỗ kháng
nguyên phải có ít nhất hai epitope vì cả hai kháng thể bắt và phát hiện đều kết
hợp trực tiếp với kháng nguyên.
Kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope
khác nhau trên phức hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác
17


biệt nhỏ giữa những kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể
bắt khác nhau. Việc sử dụng cùng một kháng thể bắt và phát hiện có thể dẫn đến
vấn đề khi có giới hạn về vị trí gắn kết sẵn có cho sự phát hiện. Kích thước và
mối quan hệ không gian của các epitope trên kháng nguyên đích là rất quan trọng
và có thể ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm.
Sandwich ELISA có thể được chia làm hai hệ thống:
5.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp

Sơ đồ 3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp

- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng
kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.
Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn
đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về
kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử
nghiệm.

18


5.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp


Sơ đồ 4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp

Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được gắn
enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên.
5.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh
Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa là hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt
cặp với chất thứ ba. Phản ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh phải
được đưa vào đồng thời.
Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh. Cả hai phản ứng đều có sự tham gia của
hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên. Nếu một kháng thể được ủ trước phản
ứng đó được gọi là ức chế (blocking/ inhibition assays). Phản ứng cạnh tranh
mang nghĩa cả hai kháng thể được thêm vào đồng thời với nhau (hình 9).

19


Hình 9: Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh

5.5 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên
Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên được mô tả ở sơ đồ 5
Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên trên bề mặt đĩa và lượng kháng thể
gắn enzyme đã được chuẩn độ để tối ưu. Kháng nguyên và kháng thể gắn
enzyme được thêm vào đĩa cùng một lúc để tạo ưu thế cạnh tranh.
Nếu kháng nguyên tương tự hoặc cùng như kháng nguyên đã được gắn trên đĩa
thì kháng thể gắn enzyme sẽ gắn lên kháng nguyên này. Khi nồng độ của kháng
nguyên cạnh tranh cao sẽ ngăn cản bất kỳ sự kết hợp của kháng thể gắn enzyme
với kháng nguyên trên bề mặt đĩa (cạnh tranh 100%). Nếu nồng độ kháng nguyên
cạnh tranh giảm (ví dụ : pha loãng) sự cạnh tranh sẽ giảm. Như vậy nồng độ
kháng nguyên cạnh tranh càng cao thì độ hấp thu màu càng giảm.
Kháng nguyên cạnh tranh có thể được thêm trực tiếp vào đĩa nếu nó được pha

loãng trong blocking buffer trước khi thêm kháng thể gắn enzyme.
Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan của nồng độ
phân tử cần kiểm tra và kháng nguyên trên bề mặt đĩa (và mức độ tương đồng
của kháng nguyên).
Sau khi ủ và rửa, lượng kháng thể được đánh dấu được định lượng sau khi thêm
cơ chất. khi không có kháng nguyên trong mẫu kiểm tra hay không có sự tương
đồng của kháng nguyên thì không có sự gắn kết với kháng nguyên được đánh
dấu và không có sự cạnh tranh với kháng nguyên này. Kết quả là mẫu có chứa
kháng nguyên thì sự cạnh tranh làm giảm cường độ màu còn đối chứng âm thì
20


không.

Sơ đồ 5: Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên

5.6 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể
Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể được mô tả chi tiết ở sơ đồ 6.
Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể tương tự với Direct C-ELISA kiểm tra kháng
thể. Sự cạnh tranh ở đây là giữa kháng thể trong mẫu và kháng thể được đánh
dẫu với các vị trí trên kháng nguyên trên đĩa. Mẫu và kháng thể đánh dấu được
trộn với nhau trước khi thêm vào đĩa.

21