GẠO VÀNG CHUYỂN GEN
I. Mở
1.

2.

đầu
Đặt vấn đề
Trong cuộc sống công nghiệp hóa hiện đại hóa như ngày nay, mọi thứ trong
đời sống xã hội đều được nâng cao hơn. Cuộc sống đang dần phát triển và song
hành với nó luôn là sự phát triển của các nghiên cứu khoa học kĩ thuật. Trên thế
giới cũng như trong nước, nông nghiệp luôn là ngành quan trong với sự sống của
con người chính vì thế nó luôn được chú trọng và được các nhà nghiên cứu tích
cực tìm hiểu và phát triển. Và để đáp ứng được nhu cầu ngày càng lớn của con
người họ đã tìm ra được phương pháp trên các loại cây đó là tạo ra các giống
thực vật chuyển gen.
Mục đích, yêu cầu.
Thực vật chuyển gen là một bước tiến trong nền khoa học kỹ thuật ở lĩnh vực
nông nghiệp. Trước đây khi sử dụng các phương pháp lai truyền thống để tạo ra
các giống mong muốn để phù hợp với nhu cầu lợi ích của con người, các nhà
khoa học đã phải mất rất nhiều thời gian và tốn kém chi phí. Tuy nhiên khi sử
dụng phương pháp này, nó cho phép các nhà tạo giống thực vật thu được giống
mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống truyền thống.
Nội dung

II.

A.
1.

Chuyển gen ở thực vật

Khái niệm thực vật chuyển gen.
Thực vật chuyển gen là cây có DNA được sửa đổi bằng cách sử dụng kỹ
thuật di truyền. Trong hầu hết trường hợp mục đích đích là để chuyển tải đến
một đặc điểm mới cho thực vật mà trong tự nhiên không thể xảy ra như kháng
sâu bệnh ….

2.

Tình hình phát triển và thành tựu thực vật chuyển gen ở Việt Nam và thế
giới.
2.1 Để chống lại tình trạng thiếu lương thực tại nhiều quốc gia kém phát
triển trên thế giới, các nhà khoa học tại các quốc gia phát triển như Mỹ, Anh đã
nghiên cứu về loại cây chống biến đổi gen giúp mang lại năng suất, chất lượng
cao. Sau thành công này, thực vật chuyển gen được xem là bước tiến lớn của
khoa học.
Tại Việt Nam cây trồng chuyển gen đã được đưa vào thử nghiệm trong
nhiều năm qua. Tháng 8/2009 Bộ Nông Nghiệp cho phép nhập khẩu các sản


phẩm cây trồng biến đổi gen và Việt Nam đã được đưa vào trồng đại trà cây biến
đổi gen từ năm 2012.
2.2 Một số thành tựu của Việt Nam và thế giới:
- Chuyển gen tạo lúa vàng chứa vitamin a và sắt
- Chuyển gen tạo khoai tây tăng hàm lượng tinh bột
- Chuyển gen tạo dầu ăn có lợi cho sức khỏe hơn từ đậu nành và cải dầu

3.

Các phương pháp chuyển gen

Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen vào tế bào và mô
thực vật. Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vi tiêm
(microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen (phương pháp trực
tiếp).
Ngoài ra còn phương pháp phức tạp và hiệu quả hơn là chuyển gen gián tiếp
nhờ vi khuẩn Agrobacterium,... Tuỳ thuộc vào đối tượng chuyển gen mà người ta
lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp.
3.1. Vi tiêm
Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được tiêm trực tiếp
vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính
hiển vi. Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng
tế bào với hiệu quả tương đối cao.Tuy nhiên do đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực
kỳ chính xác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm và ngoài ra còn có thể làm tổn
thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây ra khi tiến hành vi tiêm.

A

Hình 3.1 - A -Thiết bị tạo kim, B- máy vi thao tác

B


C

Hình 3.1 - C - Hình ảnh vi tiêm
Hệ thống này gồm có hai bộ phận chính là kính hiển vi và máy vi thao tác. Kính
hiển vi dùng cho mục đích này là kính hiển vi soi ngược (vật kính xoay ngược
lên). Ðộ phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá một tế bào là
khoảng từ 40-60 lần.
Máy vi thao tác gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trí hai bên kính hiển vi,

một dùng để điều chỉnh kim tiêm, một dùng cho kim giữ. Tính năng của máy
này là cho phép điều chỉnh các kim theo không gian 3 chiều. Kim tiêm và kim
giữ được lắp vào máy vi thao tác và được nối với syringe qua ống bằng chất dẻo
được nạp đầy dầu parafin.
Vi tiêm được tiến hành qua các bước: nạp gen vào kim tiêm bằng phương pháp
capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10 -12 giờ) hoặc bơm
trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác,
chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển
vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ bằng lực hút của syringe, điều chỉnh kính
hiển vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào
vị trí của trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân bằng cách vặn nhẹ
syringe. Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng to và trở nên sáng hơn thì dừng lại
và kéo nhanh kim tiêm ra. Trứng tiền nhân sau khi tiêm được di chuyển xa đến
cuối đĩa petri trước khi tiêm trứng tiền nhân tiếp theo. Mỗi một nhóm trứng tiền
nhân đã hoàn thành được chuyển sang một đĩa môi trường khác để ấp và đánh
giá bằng mắt trong một vài tiếng. Sau đó tất cả các trứng tiền nhân được nhìn
thấy rõ ràng và được chuyển vào ống dẫn trứng của con cái nhận.
Ðối với thực vật thì phương pháp này được sử dụng đối với các tế bào tiền phôi
của hợp tử hoặc các tế bào tiền phôi của hạt phấn. Tuy nhiên sự xâm nhập của
gen chuyển vào DNA tế bào vật chủ là một quá trình ngẫu nhiên và xác suất để
gen chuyển xen vào vị trí DNA vật chủ mà sẽ cho phép nó biểu hiện là thấp.
Hiệu quả của vi tiêm là không cao.


3.2. Súng bắn gen
Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào
tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật.
Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics
(biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách
đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và

ballistics (sự bắn tung)). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng
nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để
gia tốc các hạt.

Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối
với hai bơm chân không. DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường
kính rất nhỏ, khoảng 1µm (các kim loại năng khác như vàng và bạc cũng được
sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt này được đặt trên
một cái đĩa ở mặt bên trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho
cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi
một viên đạn rời khỏi nòng súng. Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt
vàng hay tungsten được phóng về phía các tế bào đích. Chúng xuyên qua vách tế
bào và phóng thích các phân tử DNA.


Hình 3.2. 2 – Súng bắn gen thực vật và nguyên lý hoạt động
Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau
sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va
chạm vào đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị
phá vỡ khi va chạm mạnhvà đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và
cuối cùng các phân tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc
thể thực vật. Các tế bào từ đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã
hợp nhất thành công và biểu hiện DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh
hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối tiếp và Northern blots. Các tế bào đơn đã
chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone thực vật như auxin,
gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các tế bào mô, cơ
quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây. Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào
nảy mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền mới. Phương pháp này
có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô,
các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở

vị trí mong muốn... Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
3.3. Xung điện
Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng
để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong
phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn
giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ
thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào
bên trong tế bào.
Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết
bị gọi là máy xung gen (gene pulser). Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp
điện vào và tích một điện áp cao. Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng


qua dịch huyền phù tế bào. Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là
khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài
phần triệu giây đến một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn
phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua
màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đã được nạp điện này
đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di.

Hình 3.3 – Máy xung gen và sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện

Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và
các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu
trúc cũ. Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử
dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Phương pháp này có thể sử dụng đối với tế bào thực vật ở dạng protoplast... Với
một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì). Hiệu quả
biến nạp cao.
3.4 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium



Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một
đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật. Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với
nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách
có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn.
Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với
một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con
đường này. Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế
giới như lúa, lúa mì và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A. tumefaciens.
Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một
vector chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ các gen
gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay
thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì
các vùng bờ phải và bờ trái của T- DNA và các gen vir.
Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp
nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật. Phương pháp
chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm
tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự
di truyền của các gen chuyển đặc biệt. Tuy nhiên, một
vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạplà loại mô
được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ
khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi
trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được
sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng
và kiểu gen của thực vật.
4.

Hình 1.2.4 Chuyển gen
Agrobacterium


mục đính,ý nghĩa chuyển gen thực vật
4.1 Mục đích chủ yếu:
- duy trì mở rộng đa đang sinh học nâng cao chất lượng sản phẩm ,

nhờ


5.

- Cải thiện khả năng tích lũy dinh dưỡng
- tăng cường tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học ,
-Tạo các sản phẩm không gây hại moi trường ,
4.2 Ý nghĩa chuyển gen thực vật.
Nhìn chung những cây trồng chuyển gen có lợi ích rõ rệt như sau:
-Tăng sản lượng ,
- Giảm chi phí sản xuất ,
-Tăng lợi nhuận cong nghiệp ,
- Cải thiện moi trường
Nguy cơ tiềm ẩn
- Nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc là giảm
dinh dưỡng vào thực vật.
- Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từ
cây chuyển gen.
- Nguy cơ tác động vào sinh vật không cần diệt gay mất cân bằng sinh
thái......
B Giống lúa chuyển gen làm tang giá trị dinh dưỡng

1.


Gạo vàng ( gold rice).
‟Gold rice ” là loại gạo được biến đổi gen nhằm tạo ra nhiều tiền tố
vitamin A (β – caroten ) cho người dùng. Hạt gạo vàng còn gọi là ‟Hạt hy vọng”
là một khám phá lớn của ngành nghiên cứu lúa gạo thế giới đầu thế kỷ 21. Trong
năm 2000, công nghệ này đã gây tiếng vang lớn trong nghiên cứu dinh dưỡng
thế giới – một loại gạo biến đổi di truyền màu vàng có chứa tiền sinh tố vitamin
A và một số lượng lớn chất sắt được phát minh. Từ năm 2000 và đến nay các
viện nghiên cứu trên thế giới đã tạo ra GR1 và GR2.

-

2.

GR1 được tạo ra khi chuyển gen sinh tiền tố Vitamin A từ cây hoa thủy tiên và vi
khuẩn Erwinia uredovora vào giống lúa Indica.
GR2 được cải tiến từ GR1 bằng cách thay gen sinh tiền tố Vitamin A từ cây hoa
thủy tiên bằng gen từ cây bắp. GR2 sản xuất ra lượng tiền tố vitamin A cao gấp
23 lần so với GR1.
Tình hình phát triển của gạo vàng trên thế giới.
Gạo vàng bắt đầu được biết tiến hành nghiên cứu từ năm 1999, đến
năm 2000 thì GR1 ra đời.


Vào ngày 27-3-2005, một đội ngũ các nhà khoa học của công ty Hạt
Giống Syngenta ở Cambridge, Anh , đã tuyên bố khám phá được loại gạo vàng
mới GR2 chứa lượng β – carotene gấp 23 lần so với loại GR1 được khám phá
năm 2000.
Ngày 14-10-2008, Rockefeller Foundation tuyê bố sẽ tài trợ Viện
Thí Nghiệm Lúa Quốc Tế (IRRI) ở Philippines để hỗ trợ dự án ‟Hạt gạo vàng”,
nhằm tăng tốc quy trình kiểm tra chấp thuận loại lương thực GM này tại các

nước đông dân: Ấn Độ, Bangladesh, Indonesia và Philippines. Cơ quan
Rokefeller hy vọng tài trợ nêu trên sẽ giúp gạo vàng đến tay nông dân sớm hơn
để họ có thê sản xuất đại trà.
3.

Quy trình kỹ thuật chuyển gen gạo vàng
Bản thân hạt gạo có chứa geranyl geranyl diphosphat (GGPP) một tiền chất quan
trọng trong tiến trình sinh tổng hợp β-caroten. Nhưng cây lúa thường thì lại
không hề chứa β-caroten, bằng chứng là hạt gạo thường có màu trong suốt mà
không hề có màu vàng đặc trưng của β-caroten. Để GGPP chuyển hóa thành các
chất trung gian rồi chuyển hóa thành β-caroten thì cần có Enzim xúc tác tương
ứng, nhưng bản than cây lúa lại không có chứa các gen có nhiệm vụ sinh tổng
hợp ra các enzim cần thiết để xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa GGPP thành
β-caroten. Khi chuyển các đoạn gen psy, crtI, Icy vào trong cây lúa thì sẽ tạo ra
một sự thay đổi rất lớn.Khi đó, gen psy là gen mã hóa để sinh tổng hợp enzim
phytoen synthase có nhiệm vụ xúc tác để chuyển hóa GGPP (20 C) thành
phytoen (40 C).Tiếp theo đoạn crtI mã hóa để sinh tổng hợp enzim phytoen
desaturase có nhiệm vụ chuyển hóa phytoen thành β-caroten rồi chuyển hóa tiếp
thành Lycopen. Cuối cùng gen Icy mã hóa để sinh tổng hợp enzim Lycopen βCyclase có nhiệm vụ xúc tác chuyển hóa Lycopen thành β-caroten. Và kết quả là
hạt gạo chuyển gen thể hiện kiểu hình có màu vàng đặc trưng của β-caroten và
chứa một lượng tiền vitamin A rất lớn so với gạo bình thường.


4.

Thuyết minh 10 bước tạo gạo vàng chuyển gen
* Gồm 10 bước:
- Bước 1: Giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) được
trồng trong nhà kính với các điều kiện môi trường tối ưu, được sinh
trưởng phát triển tốt, đảm bảo sạch bệnh. Người ta chọn những cây

lúa có đặc điểm tốt, chọn hạt chắc mẩy, bóc vỏ để chọn phôi tốt rồi
tiến hành bảo quản trong môi trường vô trùng.
- Bước 2: Tiến hành nuôi cấy mô từ phôi đã chọn để chuẩn bị nguyên
liệu cho giai đoạn chuyển gen. Quá trình nuôi cấy sử dụng môi trường
MS có thành phần như sau:
- Bước 3: Tách chiết ADN từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora, sau đó
tiến hành cắt bằng enzim EcoRI và Kpnl để thu nhận đoạn gen ctrI. Quá
trình tách chiết gen ctrI được tiến hành như sau:
Lấy 1 ml nước cho vào một ít giống vi sinh vật (vi khuẩn Erwinia
uredovora) trên ống thạch nghiêng cho vào ống eppendorf rồi đem cân.
Lấy thêm một ống eppendorf khác, thêm nước vào sao cho có khối
lượng bằng với khối lượng của ống thí nghiệm và đem hai ống đi ly tâm.


Đưa hai ống vào máy ly tâm, đặt sao cho 2 ống ở vị trí đối xứng tâm với nhau
qua trục quay của máy ly tâm. Đóng cửa của máy và đặt chế độ ly tâm cho máy
như sau:
+ Tốc độ quay: 10000 vòng/phút
+ Thời gian ly tâm : 1 phút
+ Nhiệt độ ly tâm: 100C
Sau khi ly tâm, lấy ống thí nghiệm ra, thấy hỗn hợp phân thành 2 lớp. Ta
loại bỏ lớp nước nổi ở phía trên đi, chỉ giữ lại phần lắng (Phần sinh khối vi
sinh vật). Tiếp tục ta thêm vào ống thí nghiệm vừa loại bỏ phần nổi 200
microlit InstaGene (InstaGene là hỗn hợp các chất – là bộ kid để test
nhanh), rồi đem ủ ở 560C trong máy ổn nhiệt trong 30 phút để hoạt hóa
enzim. Bấm đồng hồ để canh thời gian.
Sau 30 phút lấy ống thí nghiệm ra khỏi máy ổn nhiệt và đem ống đi lắc mạnh
trong 10 giây bằng máy vortex. Sau đó tiếp tục đưa ống vào đặt trong bể ổn
nhiệt ở 950C hoặc nước sôi trong 8 phút. Bấm đồng hồ để canh thời gian.


Sau 8 phút, lại lấy ống ra đem lắc mạnh bằng vortex trong 10 giây. Rồi đem ly
tâm với chế độ ly tâm được cài đặt là:
+ Tốc độ: 11000 vòng/phút
+ Thời gian ly tâm: 2-3 phút
+ Nhiệt độ ly tâm: 100C
Sau khi ly tâm, lấy ống nghiệm ra quan sát thấy hỗn hợp phân thành 3 lớp.
Lớp trên cùng chính là ADN có khối lượng nhỏ nhất nên nổi lên trên sau khi
ly tâm. Phần AND sau khi tách ra được tiến hành cắt đoạn gen cần (đoạn gen
ctrI) bằng enzyme EcoRI. Ta thu nhận được đoạn gen ctrI để sử dụng trong
chuyển gen ở các bước sau.
- Bước 4: Hoa thủy tiên (hoặc ngô) được trồng trong nhà kính với các điều
kiện môi trường tối ưu, đảm bảo sạch bệnh, được chọn lọc với điều kiện cây
sinh trưởng phát triển tốt, cho hoa có màu vàng tươi. Người ta chọn những
bông hoa (quả ngô) đang trong thời gian phát triển mạnh để chiết xuất gen.
Gen psy và gen lyc của các bông hoa (quả) này được tiến hành theo các giai
đoạn như sau:
+ Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g hoa thủy tiên (hoặc hạt
ngô), xay cho đến khi thành bột mịn.


+ Chuyển bột này vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi
cho vào cốc 50 ml nitơ lỏng. Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng.
+ Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu bột đã được xử lí
trên rồi tiến hành lắc nhẹ.
+ Ngâm trong bể ổn nhiệt ở 56 độ trong vòng 20 phút.
+ Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở
nhiệt độ phòng. Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng
để quay li tâm và tiến hành quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm,
20 phút)
+ Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2

ml dung dịch CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 700. Sau đó trộn đều.
+ Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở
nhiệt độ phòng. Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20
phút).
+ Cho 30 ml đệm kết tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một
màng AND màu trắng đục nổi lên.
+ Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút). Loại bỏ phần
dịch lỏng thu phần kết tủa.
+ Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56oC NaCl
1M và cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy
RNA .
+ Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa ADN.
+ Quay li tâm, lấy phần tủa.
-Bước 5: Các nhóm gen sau khi được chiết xuất, tinh sạch sẽ được cắt
thành các đoạn nhỏ được chuyển vào 2 plasmid là pCaCar và pFun3. Trong
đó hai gen psy, crt1 được chuyển vào plasmid pCaCar, gen còn lại là lcy
được chuyển vào một plasmid pFun3.
Plasmid chuyển gen


5.

-Bước 6: Các plasmid được chuyển vào hai đĩa petri khác nhau có nuôi
vi khuẩn Agrobacterium tumefacien dòng mannopine type Ti plasmid.
Plasmid tự động chuyển vào bên trong tế bào vi khuẩn, nhờ sự tăng sinh của
vi khuẩn chúng được nhân bản với số lượng lớn và được sử dùng trong giai
đoạn tiếp theo.
-Bước 7, 8: Nuôi cấy A. tumefactien trên môi trường có chứa mầm tái sinh
cây lúa đã được chuẩn bị ở bước 2. Các đoạn gen ngoại lai từ A. tumefactien
sẽ được chuyển vào mầm tái sinh từ phôi. Môi trường MSReg3 là môi trường

tối ưu nhất cho quá trình chuyển gen bằng A. tumefactien. Trong giai đoạn tiếp
theo vi khuẩn mang gen chuyển được đưa vào nuôi cấy trong môi trường
có chứa phôi của hạt lúa Indica đã được chuẩn bị. Vi khuẩn chuyển đoạn gen
cần chuyển vào phôi. Các phôi sau chuyển gen được đưa đi nuôi cấy trong
phòng thí nghiệm để chuẩn bị cho giai đoạn chuyển ra môi trường tự nhiên.
-Bước 9: Nuôi cấy mô tái sinh tạo cây con từ mầm tái sinh đã chuyển gen.
-Bước 10: Cây lúa chuyển gen sau tái sinh được nuôi tăng sinh, rồi
chuyển ra môi trường đất và được cho tập thích nghi dần với các điều kiện
môi trường ngoài phòng thí nghiệm sau đó cho lai với giống lúa địa phương
để tăng khả năng thích nghi với điều kiện tự nhiên tại vùng sản xuất và được
trồng với số lượng lớn ngoài tự nhiên để thu sản phẩm. Các hạt lúa thu được
sẽ được đưa đi kiểm tra kết quả chuyển gen và kiểm tra tính an toàn trước
khi trở thành sản phẩm cho con người sử dụng.
So sánh gạo chuyển gen và gạo thường
-Kiểm tra bằng cảm quan: quan sát nội nhũ ta
+ hạt gạo thường có màu trắng trong
+ hạt gạo chuyển gen β-caroten có màu vàng ngà
-Kiểm tra bằng phân tích thấy hàm lượng vitamin A trong gạo chuyển gen cao
hơn nhiều lần so vs gạo thường. Trong đó lượng caroten trong gạo nhận gen


chuyển từ cây ngô cao hơn gạo nhận gen chuyển từ hoa thủy tiên

6.

Ý nghĩa của việc tạo ra gạo vàng
Người ta dự tính khoảng 100 đến 140 triệu trẻ em trên thế giới đang bị thiếu
vitamin A, gây ra mù mắt, bệnh sởi và tử vong. Việc nghiên cứu và tạo thành
công giống gạo vàng có thể cứu hàng trăm nghìn trẻ em bị mù hằng năm do
thiếu vitamin A.


III.

KẾT LUẬN
Trong một thời gian khá dài, công nghệ biến đổi gen đã có ảnh hưởng khá lớn
đến nền nông nghiệp thế giới. Chúng vẫn được đưa vào sử dụng tuy nhiên chưa
ai khẳng định được liệu thực vật chuyển gen có thực sự tốt cho sức khỏe và cuộc
sống của con người hay không và cũng chưa một nhận định nào cho rằng liệu
thực vật chuyển gen có hại đối với con người. Đó là một điều mà các nhà tạo
giống cây trồng đang tích cực nghiên cứu để tìm ra ưu điểm hay nhược điểm
thực sự của nó. Đây vẫn còn là một dấu hỏi lớn cho sự phát triển của nền khoa
học kỹ thuật trong nông nghiệp.