Các enzyme dùng trong dna tái tổ hợp
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.74 MB, 76 trang )
GVHD:
NGUYỄN HOÀNG LỘC
SVTH:
Trịnh Thị Mỹ Uyên
Lê Bình Phương
Phan Thanh Bảo Phước
Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử
I. Các enzyme hạn chê
Type I
+ Vị trí cắt cách vị trí nhận biết lớn
Type II
+ Cắt ngay trình tự nhận biết
( khoảng 100 Base)
Type III
+ Vị trí cắt cách vị trí nhận biết lớn
( khoảng 20-30 Base)
+ Cắt ngoài trình tự nhận biết.
+ Cắt trong trình tự nhận biết
+ Cần và ATP
+ Chỉ cần
+ Cần và ATP
Không đặc Hiệu
Đặc Hiệu
Không đặc Hiệu
Cách gọi tên.
Chữ thứ nhất của tên chi viết tắt in nghiêng
+
hai chữ đầu của tên loài viết tắt in nghiêng
+
Viết tắt chủng vi khuẩn
+
tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các yếu tố
ngoài nhiễm sắc thể.
2. Gắn các đầu tận cùng được cắt bởi enzyme hạn chế
+ terminal transferase.
Enzyme này sẽ tạo ở đầu 3’ của DNA sợi đôi một homopolymer
3. Isochizomer
Isochizomer
Nhận biết trình tự 4 nucleotide nằm trong trình tự 6
- MboI
và Sau3AI cùng nhận biết trình tự:
- Trong
khi đó BamHI nhận biết trình tự:
+ SalI cắt trình tự
(G TCGAC)
+ XhoI cắt trình tự (C TCGAG)
4. Methyl hóa
+ dam (DNA adenine methylase)
+ dcm (DNA cystosine methylase)
5. Cắt DNA bằng enzyme hạn chế
5.1. Các loại đệm dùng trong phản ứng cắt DNA
Riêng SmaI sử dụng loại đệm riêng.
5.2. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme hạn chế
A, Thành phần cho tổng thể tích 20 :
+ DW : 16
+ Buffer 10x : 2
+ DNA ( 0,2- 1) : 1 .(Thường phải pha loãng mẫu DNA bằng nước tới dung tích 17.
+ RE : 1 .
Spin
ủ mẫu ở nhiệt độ thích hợp .
• Để Dừng phản ứng cắt:
Ta bổ sung 0,5M EDTA ( pH 7,5) để đạt tới nồng độ cuối cùng là 10mM.
+ Kiểm tra phản ứng cắt bằng phương pháp chạy điện di
+ Tinh sạch DNA sau khi cắt bằng phenol, Phenol : chloroform, chloroform và kết tủa DNA lại bằng 2 lần thể tích ethanol hoặc 1 lần thể tích của
isopropanol.
hạn chế
hạn chế
hạn chế
hạn chế
II. Các enzyme trùng hợp
1. DNA polymerase (DNA-dependent DNA polymerase)
1.1. DNA polymerase I của E. coli
1.2. Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli
1.3. DNA polymerase của bacteriophage T4
1.4. Taq DNA polymerase
1.1. DNA polymerase I của E. coli
Hoạt tính polymerase 5’-3’
Hoạt tính exonuclease 3’-5’
Hoạt tính exonuclease 5’-3’
