Định lượng protein theo phương pháp bradford
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (217.74 KB, 4 trang )
Định lượng protein theo phương pháp Bradford
1. Giới thiệu
Phương pháp Bradford dựa trên sự kết hợp của
thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G250) (hình 2) với protein thành hợp chất màu xanh
dương. Thuốc nhuộm kết hợp với protein qua các axid
amin lysine và arginine. Mức độ màu phụ thuộc vào
nồng độ protein trong dung dịch.
Trong môi trường axit, các cation thuốc nhuộm
tự do mang màu đỏ và màu xanh lá cây hấp thụ ở bước
Hình 1. Công thức hóa học của
CBB G-250
sóng tương ứng 470 nm và 650 nm. Ngược lại, các
anion mang màu xanh dương (liên kết với protein) có mức độ hấp thụ cực đại ở bước
sóng 595 nm. Vì vậy người ta định lượng protein dựa trên việc đo thuốc nhuộm dạng ion
màu xanh dương ở bước sóng 595 nm. Hàm lượng protein trong mẫu được xác định dựa
theo đồ thị chuẩn của nồng độ chất chuẩn (thường là albumin huyết thanh bò, bovine
serum albumin_BSA) so với độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm.
2. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ
Thiết bị dùng chung
Máy quang phổ
Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
TT
1
2
3
4
5
TT
1
2
3
4
Vật liệu
Dung dịch BSA 0,1 mg/mL
Dung dịch mẫu X
Dung dịch mẫu Y
H2O
Thuốc thử Bradford
Dụng cụ
Micropipette P100 (20 – 200 µL) và P1000 (100 – 1000 µL)
Đầu típ cho micropipette P200 (màu vàng) và P1000 (màu xanh)
Khay 96 giếng
Cốc 250 mL để đựng rác
3. Quy trình thao tác
1
Số lượng
1 ống eppendorf
1 ống eppendorf
1 ống eppendorf
1 lọ
1 lọ
Số lượng
1 chiếc/loại
1 hộp/loại
1
1
Bước 1. Lấy 6 ống eppendorf và đánh dấu bằng bút ghi kính. Sử dụng micropipette
để pha dãy dung dịch chuẩn có thể tích 200 µL với các nồng độ: 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08
mg/mL từ dung dịch gốc BSA 0,1 mg/mL vào các ống eppendorf đó.
Bước 2. Dùng micropipette lần lượt lấy 20 µL dung dịch từ các ống eppendorf cho
vào các giếng tương ứng A1 đến A5 trong khay 96 giếng (như minh hoạ ở hình 2). Tiến
hành lặp lại ở các giếng B1 đến B6 và C1 đến C6. Sau đó, cho 200 µL dung dịch thuốc
thử Bradford vào mỗi giếng trên.
A1
Hình 2. Khay 96 giếng
Bước 3. Tiến hành tương tự như bước 2 với 2 mẫu X và Y trong 2 ống eppendorf
có sẵn, sử dụng các giếng từ D1 đến D3 đối với X và E1 đến E3 đối với Y.
Bước 4. Khi chuẩn bị xong, hãy báo cho kỹ thuật viên giúp đo độ hấp thụ quang
của các mẫu tại bước sóng 595 nm và in bảng kết quả đo trên máy vi tính.
4. Trả lời các câu hỏi
Câu hỏi 1. Hãy điền vào bảng dưới đây phần đã tính toán để pha các dung dịch BSA
chuẩn.
Nồng độ BSA (mg/mL)
Nguyên liệu
0
0,02
0,04
0,06
0,08
BSA 0,1 mg/mL (µL)
H2O (µL)
Câu hỏi 2. Từ các kết quả đo, hãy xây dựng đồ thị chuẩn trong khung giấy vẽ đồ thị dưới
đây. Đồ thị có trục tung là kết quả trung bình của độ hấp thụ của các dung dịch BSA và
trục hoành là dãy nồng độ BSA chuẩn.
2
Câu hỏi 3. Từ đồ thị chuẩn và kết quả đo độ hấp thụ của các dung dịch X, Y, hãy xác định
khoảng giá trị trung bình nồng độ của dung dịch X và Y rồi điền các kết quả vào bảng.
Dung dịch
X
Y
Độ hấp thụ
Nồng độ (mg/mL)
Câu hỏi 4. Liên kết gì đóng vai trò quan trọng trong sự gắn kết giữa thuốc nhuộm CBB
G-250 và protein?
A. Liên kết cộng hóa trị
B. Liên kết ion
C. Tương tác kỵ nước
C. Lực Van der waals
Điền dấu √ vào ô trống thích hợp ở hàng dưới
Liên kết
A
B
Trả lời
3
C
D
Câu hỏi 5. Bên cạnh phương pháp Bradford, có thể xác định nồng độ của dung dịch
protein bằng cách dùng ánh sáng tia cực tím. Đó là do:
A. Phenylalanine hấp thụ ở bước sóng 260 nm
B. Tất cả các amino acid đều hấp thụ ánh sáng tia cực tím
C. Các amino acid vòng thơm hấp thụ ở bước sóng 280 nm
D. Tryptophan và tyrosine hấp thụ ở bước sóng 280 nm
Điền dấu √ vào ô trống thích hợp ở hàng dưới
Lý do
A
B
Trả lời
4
C
D
