BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN XUÂN NHẬT
MÃ SINH VIÊN: 1201433

NGHIÊN CỨU TỐI ƢU CHIẾT XUẤT
CHO HÀM LƢỢNG POLYPHENOL CAO
TỪ LÁ TRÀ HOA VÀNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN XUÂN NHẬT
MÃ SINH VIÊN: 1201433

NGHIÊN CỨU TỐI ƢU CHIẾT XUẤT
CHO HÀM LƢỢNG POLYPHENOL CAO
TỪ LÁ TRÀ HOA VÀNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa
2. DS. Phạm Thị Linh Giang
Nơi thực hiện:
LỜI CẢM ƠN

Bộ môn Thực Vật

LỜI CẢM ƠN
HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn và kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Hoàng Quỳnh
Hoa và DS. Phạm Thị Linh Giang - Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội
– những người đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tôi từ những ngày đầu nghiên cứu, giúp
tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:
PGS.TS. Trần Văn Ơn, ThS. Nghiêm Đức Trọng và DS. Lê Thiên Kim – Bộ
môn Thực Vật, những người thầy luôn sẵn sàng giúp đỡ, giải đáp thắc mắc, khó khăn
mà tôi gặp phải.
Ban Giám Hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên trường
Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi nhiều kiến thức trong suốt 5 năm
học tại đây. Các bộ môn Dược Liệu, bộ môn Hóa Phân Tích, bộ môn Vật Lý- Hóa Lý...
đã tạo điều kiện cho tôi sử dụng cân phân tích độ ẩm và máy đo quang phổ UV- VIS
trong quá trình làm thực nghiệm.
Các chị kỹ thuật viên bộ môn Thực Vật đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực nghiệm. Các bạn cùng
làm khóa luận khóa 67 và các em trong nhóm nghiên cứu của bộ môn Thực Vật, tất cả
đã cùng động viên, hỗ trợ nhau rất nhiều.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè
đã luôn khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 02 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Trần Xuân Nhật



MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama .................................... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố .......................................................................... 2
1.1.2. Thành phần hóa học ..................................................................................... 4
1.1.3. Tác dụng sinh học ........................................................................................ 4
1.1.3.1. Tác dụng chống ung thư ......................................................................... 4
1.1.3.2. Tác dụng chống oxy hóa ........................................................................ 4
1.1.3.3. Một số tác dụng khác ............................................................................. 5
1.2. Nhóm chất polyphenol...................................................................................... 5
1.2.1. Định nghĩa, phân loại ................................................................................... 5
1.2.2. Các phương pháp định lượng polyphenol ..................................................... 8
1.3. Các phƣơng pháp chiết xuất polyphenol ......................................................... 8
1.3.1. Khái niệm và những yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất dược liệu ..... 8
1.3.2. Phân loại các phương pháp chiết xuất........................................................... 9
1.3.3. Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm .................................................... 9
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ................................................................................. 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 14
2.1.2. Thiết bị, hóa chất nghiên cứu ..................................................................... 14
2.1.2.1. Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm ................................................. 14
2.1.2.2. Hóa chất............................................................................................... 15
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 15
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 15
2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất cao lá Trà

hoa vàng ( Camellia chrysantha (Hu) Tuyama ) cho hàm lượng polyphenol cao
bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm. ................................................... 15


2.3.1.1. Lựa chọn các biến số (nồng độ EtOH, nhiệt độ, thời gian) và xây dựng
mô hình thí nghiệm. .......................................................................................... 15
2.3.1.2. Định lượng hàm lượng polyphenol tổng bằng phương pháp đo màu, sử
dụng thuốc thử Folin- Ciocalteu........................................................................ 18
2.3.2. Nghiên cứu xử lý số liệu thống kê bằng phương pháp đáp ứng bề mặt ...... 20
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, BÀN LUẬN ........... 23
3.1. Thực nghiệm và kết quả nghiên cứu ............................................................. 23
3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất lá
Trà hoa vàng (Camellia chrysantha (Hu) Tuyama ) cho hàm lượng Polyphenol cao
bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm. ................................................... 23
3.1.1.1. Xây dựng đường chuẩn acid gallic ....................................................... 23
3.1.1.2. Kết quả định lượng polyphenol trong các mẫu nghiên cứu ................... 24
3.1.1.3. Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chiết xuất
polyphenol ........................................................................................................ 26
3.1.2. Kết quả điều kiện chiết xuất tối ưu cho hàm lượng polyphenol cao ............ 29
3.2. Bàn luận .......................................................................................................... 30
3.2.1. Xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết
xuất đến hàm lượng polyphenol toàn phần (hình 3.6) ........................................... 30
3.2.2. Sự tối ưu hóa qua các thông số ................................................................... 31
3.2.3. Phương pháp xử lý số liệu và phương trình hồi quy đa biến ....................... 32
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 34
ĐỀ XUẤT.................................................................................................................. 35


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
GAE/g DW


Gallic Acid Equivalent/g Dry Weight - mg đương lượng acid
gallic/g chất khô

ANOVA

Analysis of Variance – Phân tích phương sai

DPPH

1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

EGCG

Epigalo catechin gallat

EtOH

Dung môi ethanol

GC

Gas Chromatography - Sắc ký khí

HPLC

High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng hiệu
năng cao

HPTLC


High Performance Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao

OD

Optical Density - Mật độ quang

RD

Standard deviation – Độ lệch chuẩn

RSD

Relative Standard Deviation - Độ lệch chuẩn tương đối

RSM

Response Surface Methodology - Phương pháp đáp ứng bề mặt

UAE

Ultrasound assisted extraction – Chiết xuất có hỗ trợ siêu âm


DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ
Bảng

Nội dung thể hiện


Trang

1.1

So sánh phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE) so với các
phương pháp chiết xuất thông thường

11

1.2

Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng phương pháp chiết có hỗ
trợ siêu âm để chiết các hợp chất nhóm polyphenol

12

2.1

Danh sách mã hóa mẫu thực nghiệm theo điều kiện chiết xuất

18

2.2

Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic

19

2.3


Đổi biến thực thành biến mã hóa theo mô hình trung tâm trong
RSM

22

3.1

Độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn

23

3.2

Mật độ quang trung bình và mg đương lượng acid gallic/g chất
khô của 27 mẫu nghiên cứu

25

Hình

Nội dung thể hiện

Trang

1.1

Đặc điểm hình thái mẫu C.chrysantha (Hu) Tuyama

3


1.2

Khung cacbon của Flavonoids

6

1.3

Các nhóm phụ trong nhóm chất chung Flavonoids

6

2.1

Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần

20

2.2

Giao diện phần mềm R

21

3.1

Đường biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào

23


3.2

Câu lệnh và kết quả các hệ số của phương trình hồi quy đa biến

27

3.3

So sánh hàm lượng polyphenol toàn phần từ thực nghiệm (Conc) và
từ mô hình (Conc1) được xây dựng

28

3.4

Xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng polyphenol

30


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trà hoa vàng (Camellia spp.) hay còn gọi là Kim hoa trà – là loại trà có hoa màu
vàng thuộc chi Camellia L. Những năm trở lại đây, Trà hoa vàng được biết đến với
nhiều tác dụng sinh học quý, mang lại lợi ích tốt cho sức khỏe. Nghiên cứu của Lixia
Song cùng cộng sự trên 6 loại Trà hoa vàng C. chrysantha, C. impressinervis,
C. euphlebia, C. microcarpa, C. nitidissima và C. tunghinensis cho thấy tác dụng
chống oxi hóa mạnh từ nhóm chất polyphenol trong trà [44]. Cùng với đó, một số
nghiên cứu khác chứng minh Trà hoa vàng có tác dụng hạ huyết áp, hạ cholesterol
máu, giảm đường huyết, chống u bướu, tăng cường hệ miễn dịch và kéo dài tuổi thọ
[17], [27].

Ở Việt Nam, cho đến nay ghi nhận sự xuất hiện của 27 loài Trà hoa vàng [12].
Trong đó, sự đa dạng tập trung chủ yếu ở các khu vực Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Ba Chẽ
(Quảng Ninh). Nghiên cứu của Ngô Thị Thảo trên các mẫu Trà ở Ba Chẽ đã khẳng
định sự có mặt của polyphenol, bước đầu định lượng được hàm lượng polyphenol tổng,
đồng thời chỉ ra tác dụng chống oxy hóa và ức chế dòng tế bào ung thư in-vitro từ dịch
chiết lá Trà hoa vàng tại đây [8]. Rõ ràng với những tác dụng sinh học quý và tiềm
năng phát triển, việc nghiên cứu phát triển các sản phẩm thuốc hay thực phẩm chức
năng từ Trà hoa vàng là nhu cầu tất yếu và quan trọng. Trong đó, bán thành phẩm dạng
cao được xem như bán thành phẩm khi đi từ dược liệu thô đến các sản phẩm hoàn thiện
khác như trà túi lọc, bột cốm, viên nang, viên nén...
Từ thực tế và nhu cầu trên, đề tài “Nghiên cứu tối ƣu chiết xuất cho hàm
lƣợng polyphenol cao từ lá Trà hoa vàng” được thực hiện với các mục tiêu sau:
-

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (dung môi, nhiệt độ, thời gian) trong quá
trình chiết siêu âm.

-

Chọn điều kiện chiết xuất tối ưu cho hàm lượng polyphenol cao từ lá cây Trà
hoa vàng.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama
1.1.1 .Đặc điểm thực vật, phân bố
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009, chi Trà (Camellia L)
có vị trí phân loại như sau [15]:

Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Sổ (Dilleniidae)
Bộ: Chè (Theales)
Họ: Chè (Theaceae)
Chi: Trà (Camellia L).
Trên thế giới, chi Camellia L có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở các nước
nhiệt đới và á nhiệt đới như Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Thổ Nhĩ Kì, Kenya,
Uganda, Brazil, Australia…[12]. Tại Việt Nam, chi Camellia L có tới gần 60 loài,
trong đó có 27 loài có hoa màu vàng, thường được gọi chung là Trà hoa vàng, tập trung
nhiều ở khu vực phía Bắc (Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh…) và rải rác ở phía
Nam tại một số tỉnh như Lâm Đồng, Đồng Nai…[21].
Camellia chrysantha (Hu) Tuyama là một loại Trà hoa vàng, được trồng phổ
biến ở huyện Ba Chẽ (Quảng Ninh). Đây là loài có thân gỗ nhỏ, chồi và cành non có
lông mịn thưa; cành già màu nâu, nhẵn. Lá bao chồi 5-9, thường là 6, hình elip, lớn dần
từ dưới lên; mặt ngoài màu hồng nhạt; mặt trong màu hồng nhạt hơn, nhẵn, mép
nguyên. Lá đơn, mọc so le, không có lá kèm. Cuống lá tương đối ngắn, dài khoảng 0,60,7cm, lõm ở mặt trên. Phiến lá (bánh tẻ) hình elip, cứng, dày và dai, dài 11 cm, rộng
5cm; mặt trên màu xanh thẫm, nhẵn bóng, mặt dưới màu xanh nhạt, nhẵn, thường có
nhiều điểm tuyến màu đen; gốc lá hình nêm; mép lá có khía răng cưa, khía răng nông,
2


nhỏ, phía gốc lá gần như không có khía, mật độ khía răng cưa tăng dần về phía ngọn lá,
chỗ rộng nhất khía răng cưa cách nhau 8mm; ngọn lá nhọn có mũi dài 0,4-0,5cm gân
giữa lộ rõ, lõm sâu ở mặt trên, nổi rõ ở mặt dưới, có 10-12 cặp gân bên. Hoa đều,
lưỡng tính, mọc đơn độc ở đầu cành hoặc nách lá, màu vàng, đường kính khi nở
khoảng 3cm. Cuống hoa rất ngắn, gần như không thấy. Lá bắc 6-10, có dạng hình
móng, xếp thành hai dãy, phủ lên nhau, lớn dần từ dưới lên trên, kích thước từ 0,3-1,4
cm, mặt ngoài và mặt trong có lông trắng, mịn. Cánh hoa 10-20, các cánh phía trong
dính với nhau và dính vào vòng nhị ngoài.Bộ nhị nhiều, dính với nhau ở gốc chỉ nhị.

Các chỉ nhị ở vòng ngoài của bộ nhị dài khoảng 2,4 cm, không có lông; chỉ nhị màu
vàng, mang bao phấn 2 ô. Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau tạo thành bầu trên 3 ô, có
dạng hình cầu, màu xanh nhạt, nhẵn; vòi nhụy 3, rời, màu vàng [6], [8], [11].

Hình 1.1: Đặc điểm hình thái mẫu C.chrysantha (Hu) Tuyama
1. Toàn cây; 2,3. Cành mang lá; 4. Lá; 5. Hoa; 6. Lá bắc;
7. Tràng; 8. Bộ nhị; 9. Bộ nhụy; 10. Bầu cắt ngang

3


1.1.2. Thành phần hóa học
Ở Việt Nam, cho đến nay mới có một số loài ở Tam Đảo, Quảng Ninh, Thái
Nguyên được nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học như Camellia costata Hung T.
Chang, Camellia chrysanthoides Hung T. Chang, Camellia chrysantha (Hu) Tuyama,
trong đó các nghiên cứu đa phần mới chỉ tiến hành định tính hóa học, định lượng
polyphenol tổng và EGCG trong lá các loài được nghiên cứu [6], [8], [12]. Kết quả
nghiên cứu của Hà Ly và Ngô Thị Thảo chỉ ra sự có mặt của các nhóm chất Trà hoa
vàng bao gồm: tanin, flavonoid, saponin, đường khử, sterol, chất béo và các acid amin,
trong đó các chất thuộc nhóm polyphenol có hàm lượng cao với những tác dụng sinh
học cần được quan tâm [6], [8].
1.1.3. Tác dụng sinh học
1.1.3.1. Tác dụng chống ung thư
Các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật và người đã chứng minh rằng các
polyphenol có tác dụng kìm hãm sự hình thành, phát triển và di căn của khối u, giúp
phòng ngừa bệnh ung thư và các bệnh tim mạch khi dùng hàng ngày với lượng vừa đủ.
Tác dụng này chủ yếu là do hiệu quả chống oxy hóa cao và chống tăng sinh khối u của
các hợp chất polyphenol trong trà [20], [31], [34], [36], [41], [42]. Nghiên cứu của Ngô
Thị Thảo chỉ ra tại nồng độ 100 (g/ml), mẫu nghiên cứu của các loài C. chrysantha,
C. chrysanthoides, Camellia sp1, Camellia sp2 đều có khả năng ức chế trên 50% sự

phát triển của 5 dòng tế bào ung thư: MDA-BA-231(ung thư vú), Hep-G2 ( ung thư
gan), SW480 (ung thư đại tràng), SK-Mel2 (ung thư da), LU-1 (ung thư phổi) [8].
1.1.3.2. Tác dụng chống oxy hóa
Nhiều nghiên cứu đã khẳng định khả năng chống oxy hóa của trà là do hoạt tính
của các hợp chất nhóm polyphenol [16], [19], [26], [28], [29], [44]. Theo nghiên cứu
của Xiao Min cùng cộng sự [16], hàm lượng polyphenol tổng chiết xuất từ lá Trà hoa
vàng Camellia chrysantha (Hu) Tuyama cao hơn tới 36,71% so với các loại trà khác,

4


dẫn tác dụng chống oxy hóa mạnh, thể hiện qua khả năng trung hòa gốc tự do. Các chất
được xác định trong lá của loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama có tác dụng trung
hòa gốc tự do là: vitexin, quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside, kaempferol, epicatechin
(EC), epicatechin gallat (ECG), epigallocatechin gallat (EGCG)...[26], [29].
1.1.3.3. Một số tác dụng khác
Theo cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi, lá cây Trà hoa vàng
được sử dụng để chữa bệnh lỵ, các bệnh chốc lở [13]. Ngoài ra, các hoạt chất trong lá
và hoa Trà hoa vàng cũng có những tác dụng sinh học cao như: tác dụng hạ huyết áp,
hạ cholesterol máu, giảm tiểu đường, chống u bướu, tăng cường hệ miễn dịch và kéo
dài tuổi thọ [17], [27].
1.2. Nhóm chất polyphenol
1.2.1. Định nghĩa, phân loại
Hợp chất phenol là nhóm các hợp chất hóa học mà trong công thức hóa học có
chứa nhóm chức hydroxyl (-OH) gắn với vòng hydrocarbon thơm. Các hợp chất này rất
phổ biến trong giới thực vật. Tùy thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm
này mà các tính chất hóa lí và hoạt tính sinh học thay đổi [5], [14].
Thành phần polyphenol của lá Trà đa dạng, bao gồm chủ yếu là các flavonoid
và tanin [7], [8]. Các polyphenol này chiếm từ 20 - 35 % trọng lượng trà khô [7].



Flavonoid [5], [14], [25]
Flavonoid thường là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavon, flavonol,

chancol), không màu (izoflavon, catechin) hoặc có màu đỏ và màu vàng (anthocyane).
Trong cây, flavonoid thường tồn tại dưới 2 dạng là dạng tự do (aglycon) và dạng liên
kết (glycoside). Dạng aglycon tan nhiều trong các dung môi hữu cơ như ether, ethanol,
acetone,…và hầu như không tan trong nước. Dạng glycoside liên kết với đường tan
nhiều trong nước và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ.

5


Bộ khung carbon của flavonoid là C6-C3-C6 , gồm 15 nguyên tử carbon, 2 vòng
benzene A và B nối với nhau qua vòng pyren C, trong đó A kết hợp với C tạo thành
khung chroman.

2'
8
7

9

1

2

10
5


B

1'

4'

C

A
6

3'

O

3

6'

5'

4

Hình 1.2: Khung cacbon của Flavonoids
Tuỳ theo mức độ oxy hoá của mạch 3 carbon, sự có mặt hay không có mặt của
nối đôi giữa C2, C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà flavonoids có thể được chia thành nhiều
phân nhóm phụ khác nhau.

Cyanidin


Epicatechin

Quercetin

HO

OH
OH

Glucose

O - Rham nos e - glucose

OH

O

O

Saponin

Rutin

Hình 1.3: Các nhóm phụ trong nhóm chất chung Flavonoids

6


Flavonoid có thể tham gia vào nhiều phản ứng hoá học khác nhau như phản ứng
của nhóm hydroxyl (OH), phản ứng của vòng thơm (diazo hoá), phản ứng của nhóm

cacbonyl (phản ứng shinoza) và phản ứng tạo phức với kim loại. Hiện nay đã có hơn
4500 các loại flavonoid khác nhau tồn tại trong thực vật đã được nhận dạng. Trong y
học, flavonoid được sử dụng làm thuốc để chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau như:
thuốc làm bền thành mạch, thuốc chống oxy hoá, thuốc kháng viêm, chống nấm, chống
dị ứng, chống ung thư,…
 Tannin [5], [18]
Tannin là những hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử cao, có chứa các
nhóm hydroxyl và các nhóm chức khác (như cacboxyl), có khả năng tạo phức với
protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện môi trường đặc biệt.
Tannin được cấu tạo dựa trên acid tannic và acid gallic. Tannin thường là các
hợp chất vô định hình, có màu trắng, màu vàng nhạt hoặc gần như không màu, có hoạt
tính quang học, có vị chát, dễ bị oxy hoá khi đun nóng và khi để ngoài ánh sáng.
Tannin tan nhiều trong nước (tốt nhất là trong nước nóng), tan trong các dung môi hữu
cơ như ethanol, hoà tan một phần trong axetone, ethylaxetat và hầu như không tan
trong các dung môi kém phân cực như chloroform, benzene,…

Acid gallic

Procyanidin

7


Tannin tạo phức màu đặc trưng với các kim loại nặng, tạo phức với protein,
tinh bột, cellulose và muối khoáng. Trong y học, tannin được sử dụng làm thuốc cầm
máu, thuốc chữa đi ngoài, chữa ngộ độc kim loại nặng, , điều trị cao huyết áp và chứng
đột quỵ,…
1.2.2 . Các phương pháp định lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol toàn phần có thể xác định bằng nhiều kỹ thuật khác
nhau: quang phổ hồng ngoại, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký lỏng kết

hợp với khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [19]. Các kỹ thuật này
cho độ chính xác và đặc hiệu cao nhưng lại yêu cầu về máy móc trang thiết bị đắt tiền,
tốn kém.
Năm 2013, Bộ khoa học và công nghệ Việt Nam đã đưa ra tiêu chuẩn quốc gia
TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005), quy định phương pháp xác định hàm lượng
polyphenol toàn phần trong Trà xanh và Trà đen. Đó là phương pháp đo màu sử dụng
thuốc thử Folin-Ciocalteu [1]. Mặt khác, luận văn của Ngô Thị Thảo [8] cũng như khóa
luận của Hà Ly [6] đã sử dụng phương pháp này để định lượng polyphenol toàn phần
trên lá cây Trà hoa vàng. Phương pháp đã được thẩm định lại, cho độ đặc hiệu, tuyến
tính và lặp lại cao, đáp ứng yêu cầu phân tích định lượng polyphenol trong các mẫu Trà
hoa vàng. Chính vì vậy, đề tài quyết định sử dụng phương pháp đo màu với thuốc thử
Folin-Ciocalteu để tiến hành định lượng hàm lượng polyphenol trong mẫu nghiên cứu.
1.3. Các phƣơng pháp chiết xuất polyphenol
1.3.1. Khái niệm và những yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất dược liệu
Chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất tan có trong
dược liệu, chủ yếu là các hoạt chất có tác dụng điều trị, sau đó tách chúng ra khỏi phần
không tan trong dược liệu [3]. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung
dịch của các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết [9]. 3 nhóm yếu tố ảnh
hưởng bao gồm [3], [9]:

8


 Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo dược liệu: Màng tế bào dược liệu,
chất nguyên sinh, một số tạp chất trong dược liệu như pectin, gôm, chất nhày,
tinh bột, chất béo, dầu mỡ, sáp, nhựa, enzyme,…
 Những yếu tố thuộc về dung môi: Độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt của
dung môi.
 Những yếu tố thuộc về kĩ thuật: Nhiệt độ, thời gian chiết xuất, mức độ chia nhỏ
(hay độ mịn) dược liệu, khuấy trộn, pH môi trường,…

1.3.2. Phân loại các phương pháp chiết xuất
Các phương pháp chiết xuất được phân loại dựa vào nhiều yếu tố [2], [3]:
 Dựa vào nhiệt độ có phương pháp chiết nóng (như chiết hồi lưu), chiết nguội.
 Dựa vào chế độ làm việc có phương pháp chiết gián đoạn (ngâm và ngấm kiệt);
bán liên tục và liên tục.
 Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương pháp: ngược
dòng, xuôi dòng, chéo dòng.
 Dựa vào áp suất làm việc có các phương pháp: áp suất thường, áp suất giảm (áp
suất chân không), áp suất cao (chiết có áp lực).
 Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt, có các phương pháp: phương pháp
chiết có hỗ trợ sóng siêu âm, phương pháp chiết hỗ trợ sóng viba, phương pháp
tạo dòng xoáy,...
1.3.3. Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm
Các chiết xuất thông thường như chiết ngấm kiệt, ngâm lạnh, ngâm nóng, chiết
soxhlet đã được sử dụng để chiết xuất các hợp chất polyphenol. Tuy nhiên, những
phương pháp chiết xuất này đòi hỏi một lượng lớn dung môi; thời gian kéo dài, ảnh
hưởng đến một số hợp chất polyphenol và hạn chế khi ứng dụng trong công nghiệp
[20], [35]. Gần đây, nhiều kỹ thuật chiết xuất mới đã được phát triển để chiết xuất các
hợp chất polyphenol từ thực vật, bao gồm chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (Ultrasound

9


assisted extraction - UAE), có hỗ trợ vi sóng (MAE), chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn
(SFE), trích xuất pha rắn (SPE), chiết xuất chất lỏng áp suất (PLE) [20], [22], [30],
[32], [35], [37], [45]. Trong số các phương pháp này, phương pháp chiết xuất có hỗ trợ
siêu âm là một lựa chọn thay thế ít tốn kém và phổ biến.
Trong nghiên cứu của Khan cùng cộng sự [41], lượng polyphenol toàn phần thu
được bằng chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE) cao hơn đáng kể so với chiết bằng phương
pháp thông thường không có hỗ trợ siêu âm. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua

bảng 1.1.

10


Bảng 1.1: So sánh phƣơng pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE) so với các phƣơng
pháp chiết xuất thông thƣờng
Đối tƣợng

Nhóm chất

Kết quả so sánh

Citrus unshiu

Phenolic Acid

Thời gian chiết UAE =10-40 phút, [38]

TLTK

lượng Phenolic Acid thu được tương
đương với 8h ngấm kiệt.
Citrus unshiu

Phenolic
và

Acid So với phương pháp ngấm kiệt, UAE [39]


Flavanone tăng lượng polyphenol toàn phần thu

glycosides

được và cả về hoạt tính chống oxy hóa
của dịch chiết.

C .reticulata

Hesperidin

So với chiết Soxhlet, lượng hesperidin [40]
thu được gần nhau nhưng hesperidin thu
được ít bị biến tính hơn khi chiết UAE.

Folium

Flavonoids

eucommiae

UAE hiệu quả hơn chiết nhiệt, vi sóng, [24]
và chiết xuất với sự hỗ trợ của enzyme.

Triticum

Nhóm Phenolic Giảm thời gian chiết từ 60 phút (phương [23]

aestivum


giàu

pháp thông thường) xuống còn 5 phút

heteroxylans

(UAE).

Euonymus

Flavonoids rutin Khi Scan bằng kính hiển vi điện tử, UAE [46]

alatus

và Quercetin

cho thấy sự phá màng tế bào nhanh hơn
nhiều so với chiết ngấm kiệt.

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã sử dụng phương pháp chiết
có hỗ trợ siêu âm để chiết các hợp chất nhóm polyphenol từ các loại dược liệu khác

11


nhau. Các nghiên cứu này đều đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết
như nhiệt độ, nồng độ dung môi, thời gian, công suất bể siêu âm, pH… và sử dụng
phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) để xử lý số liệu thống kê (bảng 1.2).
Bảng 1.2: Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc sử dụng phƣơng pháp chiết có
hỗ trợ siêu âm để chiết các hợp chất nhóm polyphenol

Tên dƣợc liệu

Điều kiện tối ƣu

chiết xuất

Hàm lƣợng

Nồng độ

Nhiệt

Thời

Thông số

EtOH

độ

gian

khác

(%)

(oC)

(phút)


TLTK

Polyphenol
toàn phần
(mg GAE/g
DW)

Citrus sinensis L

80,00

40,00

X

P=150W

2,758

[30]

Cimicifugae

58,37

70,00

X

P= 377,5W


8,764

[35]

Vitis vinifera

53,15

56,03

29,03

X

5,44

[22]

Wheat bran

64,00

60,00

25,00

X

3,12


[45]

Rhodomyrtus

65,00

45,00

30,00

X

76,42

[47]

Camellia sinensis

46,00

60,00

33,00

X

47,50

[32]


Phlomidoschema

X

41,50

49,30

pH=6,5

15,40

[41]

60,00

X

5,00

pH= 6,2,

59,68

[43]

rhizome

tomentosa


ơparviflorum
Cassia auriculata

P=50W
“X” : thông số không được khảo sát trong nghiên cứu.

12


Nhận thấy, phạm vi ứng dụng của phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm khá
rộng, được nhiều nghiên cứu sử dụng để tối ưu hóa quá trình chiết xuất đối với hợp
chất nhóm polyphenol. Sóng siêu âm mang đến hiệu quả cơ học, cho phép phá hủy cấu
trúc tế bào, tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa pha rắn và pha lỏng, tăng thẩm thấu từ
dung môi vào nguyên liệu chiết và kết quả là chất tan nhanh chóng khuếch tán từ pha
rắn tới dung môi [20], [35], [48]. Ngoài ra, thiết bị siêu âm không quá đắt tiền, dễ vận
hành, bảo quản đơn giản. Thời gian chiết xuất được rút ngắn, ít ảnh hưởng đến hoạt
chất chiết và tiết kiệm năng lượng đầu vào [20], [30], [35], [48]. Từ những ưu điểm
trên, đề tài lựa chọn phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (UAE) làm phương pháp
chiết và hướng đến khảo sát ảnh hưởng của các thông số: nồng độ dung môi EtOH,
nhiệt độ, thời gian tới quá trình chiết xuất. Từ đó, đưa ra được quy trình chiết xuất lá
Trà hoa vàng tối ưu nhất cho hàm lượng polyphenol cao.

13


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là lá loài Trà hoa vàng, thu hái vào tháng 12 năm 2016 tại

vườn trồng nhà anh Nịnh Văn Trắng, xã Đạp Thanh- huyện Ba Chẽ- tỉnh Quảng Ninh.
Loài nghiên cứu đã được giám định tên khoa học là Camellia chrysantha (Hu)
Tuyama, thuộc chi Camellia L. Tiêu bản được lưu tại Phòng tiêu bản- Bộ môn Thực
Vật- Trường Đại học Dược Hà Nội với mã số tiêu bản : HNIP/18507/17
Xử lý nguyên liệu sau thu hái: Lá cây sau khi thu hái được làm sạch, hong khô
và sấy ở nhiệt độ 450C đến hàm ẩm <10%, sau đó, dược liệu được nghiền đến kích
thước bột thô và bảo quản trong túi ni lông kín, tránh ánh sáng trực tiếp.
2.1.2. Thiết bị, hóa chất nghiên cứu
2.1.2.1. Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm
 Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: máy chấm sắc ký
Linomat 5, buồng phát hiện TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCATS và
VideoScan.
 Máy đo quang Hitachu U-1900
 Tủ sấy WiseVen (R) WOF.
 Cân phân tích hàm ẩm MR25
 Bể siêu âm WISD.
 Cân kỹ thuật Sartorius (TE3102S).
 Cân phân tích Executive Pro Semi-Micro (ES 225 SM-DR)
 Bể đun cách thủy
 Cồn kế, nhiệt kế
 Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ, bình nón nút mài bình định mức, ống
nghiệm, pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, bình gạn.
14


2.1.2.2. Hóa chất
 Chất chuẩn acid gallic 97%, được cung cấp bởi Viện Dược Liệu.
 Dung môi: methanol, ethanol 96%, nước cất.
 Thuốc thử Folin- Ciocalteu (hãng Merck, Germany)
 Natri cacbonat (Na2CO3) (tiêu chuẩn DĐVN IV)

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất lá Trà hoa
vàng (Camellia chrysantha (Hu) Tuyama ) cho hàm lượng Polyphenol cao bằng
phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm.
-

Lựa chọn các biến số (nhiệt độ, nồng độ EtOH, thời gian) và giá trị của từng

biến số, thiết kế mô hình thí nghiệm, tiến hành chiết xuất theo mô hình đã xây dựng.
-

Định lượng hàm lượng polyphenol tổng (TPC) trong cao thu được bằng phương

pháp đo màu dùng thuốc thử Folin- Ciocalteu.
-

Kết quả được xử lý thống kê bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM -

Response surface methodology) với phần mềm R, để xác định ảnh hưởng của các biến
số tới quá trình chiết xuất.
2.2.2. Xác định điều kiện chiết xuất tối ưu cho hàm lượng polyphenol cao
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình chiết xuất cao lá Trà
hoa vàng ( Camellia chrysantha (Hu) Tuyama ) cho hàm lượng polyphenol cao
bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm.
2.3.1.1. Lựa chọn các biến số (nồng độ EtOH, nhiệt độ, thời gian) và xây dựng mô hình
thí nghiệm.
 Yếu tố ảnh hƣởng

15



Qua các nghiên cứu ở bảng 1.2, kết hợp với điều kiện thiết bị siêu âm trong
phòng thí nghiệm bộ môn, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn 3 yếu tố để khảo sát ảnh
hưởng đến quá trình chiết siêu âm bao gồm: dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết xuất.
1) Dung môi chiết xuất
Các nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng aceton, ethylacetate, ethanol, methanol
và hỗn hợp methanol để tách chiết polyphenol. Do có độ nhớt thấp nhất nên ethanol
cho hiệu suất chiết polyphenol thấp hơn các dung môi còn lại [10]. Tuy nhiên, để ứng
dụng trong bảo quản và chế biến thực phẩm, ethanol thường được sử dụng vì đây là
loại dung môi an toàn [30], [47]. Tất cả những nghiên cứu trong bảng 1.2 đều sử dụng
dung môi ethanol - nước làm dung môi chiết xuất. Dung môi ethanol - nước được lựa
chọn do có khả năng hòa tan tốt các chất trong nhóm polyphenol, là dung môi xanh,
được sử dụng phổ biến và an toàn trong chiết xuất công nghiệp [30]. Do đó, với mục
đích khảo sát ảnh hưởng dung môi đến quá trình chiết xuất, nhóm nghiên cứu tiến hành
khảo sát ba mức độ dung môi là: nước cất, ethanol 50% (EtOH 50) và ethanol 90%
(EtOH 90) (tính theo thể tích).
2) Nhiệt độ chiết xuất
Theo các nghiên cứu đã được công bố trong và ngoài nước, hàm lượng
polyphenol thu được tương đối cao ở khoảng nhiệt độ 700C – 800C [10]. Mặt khác khi
chiết ở nhiệt độ rất cao trên 800C làm tăng chi phí sản xuất và giảm chất lượng sản
phẩm do sự hình thành những hợp chất không mong muốn, làm chuyển dạng cấu trúc
polyphenol hoặc phá hủy một số dạng polyphenol có tác dụng chống oxy hóa [9], [47],
đồng thời có thể gây nguy hiểm khi chiết xuất bằng ethanol nếu thiết bị không đảm bảo
độ an toàn. Vì vậy, đề tài giới hạn cận trên của yếu tố nhiệt độ là 800C, đồng thời khảo
sát thí nghiệm tại các giá trị nhiệt độ 350C, 500C và 700C.

16



3) Thời gian chiết xuất
Chọn các khoảng thời gian 15 phút, 30 phút và 45 phút để tiến hành chiết xuất.
 Cách tiến hành
Pha các nồng độ ethanol: Sử dụng cồn kế và các dụng cụ do thể tích thích hợp
để pha các dung dịch nồng độ ethanol 50%, 90% từ nước cất và ethanol thực phẩm có
nồng độ 96%.
Xác định hàm ẩm của bột dược liệu thô lá Trà hoa vàng bằng phương pháp mất
khối lượng do làm khô ở nhiệt độ 1050C, trong 5 phút [4].
Cân chính xác khoảng 10g dược liệu, cho vào bình nón nút mài dung tích 500
ml, thêm khoảng 25 ml dung môi, dùng đũa thủy tinh trộn đều cho dược liệu thấm đều
dung môi trong thời gian 15 phút. Tiếp tục bổ sung 75 ml dung môi, đậy nắp và chiết
siêu âm với thời gian và nhiệt độ tùy theo điều kiện các thí nghiệm đã thiết kế. Lọc lấy
dịch chiết. Bổ sung 100 ml dung môi ( tỉ lệ dược liệu : dung môi = 1:10) và chiết lần 2
với cùng điều kiện. Gạn, lọc và gộp dịch chiết của 2 lần chiết, thu được dịch chiết tổng.
Cô cách thủy dịch chiết tổng ở nhiệt độ 800C trong bể cách thủy đến cắn. Toàn bộ cắn
được sấy trong cốc có mỏ ở nhiệt độ 45oC đến khối lượng không đổi. Cân khối lượng
cắn thu được.
 Mô hình khảo sát
Tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố đã lựa chọn tới quá trình
chiết xuất polyphenol từ lá Trà hoa vàng (C. chrysantha (Hu) Tuyama) với các thí
nghiệm được mã hóa tại bảng 2.1. Mỗi mẫu được tiến hành chiết lặp lại 3 lần (27 mẫu,
81 thí nghiệm).

17


Bảng 2.1: Danh sách mã hóa mẫu thí nghiệm theo điều kiện chiết xuất
Nƣớc cất

Dung môi

Nhiệt độ

EtOH 90

EtOH 50

35

50

70

35

50

70

35

50

70

15p

Aa1

Ab1


Ac1

Ba1

Bb1

Bc1

Ca1

Cb1

Cc1

30p

Aa2

Ab2

Ac2

Ba2

Bb2

Bc2

Ca2


Cb2

Cc2

(phút) 45p

Aa3

Ab3

Ac3

Ba3

Bb3

Bc3

Ca3

Cb3

Cc3

(oC)
Thời
gian

2.3.1.2. Định lượng hàm lượng polyphenol tổng bằng phương pháp đo màu, sử dụng
thuốc thử Folin- Ciocalteu.

 Nguyên tắc
Các polyphenol trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp đo màu, dùng
thuốc thử Folin-Ciocalteu. Thuốc thử này chứa chất oxy hóa là axit phosphovonframic. Trong quá trình khử, các nhóm hydroxyl phenol dễ bị oxi hóa, chất oxy hóa
sinh ra có màu xanh với độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm.. Xây dựng đường
chuẩn với chất chuẩn acid gallic.
 Cách tiến hành
1) Chuẩn bị dung môi và thuốc thử
- Thuốc thử: pha loãng dung dịch thuốc thử Folin- Ciocalteu 10 lần bằng nước
cất ngay trước khi tiến hành phản ứng.
- Dung dịch Na2CO3 7,5%: Cân 37,50 gam natri carbonat (Na2CO3) cho vào
bình định mức 500ml. Thêm nước ấm đến nửa bình, lắc để hòa tan, để nguội đến nhiệt
độ phòng và pha loãng bằng nước cho đủ thể tích.
2) Chuẩn bị mẫu chuẩn

18