BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THU
MÃ SINH VIÊN: 1201588

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM
LƯỢNG PHENOL TRONG THỦY SẢN
BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THU
MÃ SINH VIÊN: 1201588

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM
LƯỢNG PHENOL TRONG THỦY SẢN
BẰNG SẮC KHÍ KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Nguyên Hà
2. TS. Trần Cao Sơn
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ
sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI – 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Nguyên
Hà và TS. Trần Cao Sơn là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm
nghiên cứu khoa học và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Khoa Độc học và dị nguyên
và Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ và tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian vừa qua.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, Bộ môn Hóa phân tích và độc
chất, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những người
đã dạy bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em luôn
bên cạnh giúp đỡ, động viên để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình tốt
nhất.
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2017
Sinh viên
Lê Thị Thu

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ............................................................vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về phenol.................................................................................... 2
1.1.1. Giới thiệu chung về phenol ................................................................... 2
1.1.2. Tính chất hóa lý của phenol .................................................................. 2
1.2.

Nguồn gốc, độc tính của phenol .................................................................. 3

1.3. Độc tính của phenol đối với thủy sản .......................................................... 7
1.3.1. Ảnh hưởng của phenol đối với thủy sản ............................................... 7
1.3.2. Một số khuyến cáo về liều lượng cho phép của phenol ........................ 8
1.4. Một số phương pháp xác định hợp chất phenol ......................................... 10
1.4.1. Phương pháp xử lý mẫu ...................................................................... 10
1.4.2. Phương pháp phân tích các hợp chất phenol ...................................... 12
1.5. Giới thiệu về sắc ký khí khối phổ .............................................................. 15
1.5.1. Sắc ký khí ............................................................................................ 15
1.5.2. Detector khối phổ trong sắc ký khí ..................................................... 15
1.5.3. Một số phương pháp xác định các hợp chất phenol bằng GCMS..........................................................................................................................16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 18
ii


2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 18
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................. 18
2.2.1. Nguyên vật liệu ................................................................................... 18
2.2.2. Trang thiết bị ....................................................................................... 19
2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 20
2.3.1. Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách phenol trong thủy
sản.......................................................................................................................... 20
2.3.2. Khảo sát xây dựng điều kiện phân tích phenol bằng GCMS/MS...................................................................................................................20

2.3.3. Thẩm định phương pháp ..................................................................... 21
2.3.4. Đánh giá hàm lượng phenol trên một số mẫu thủy sản ...................... 21
2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 21
2.4.1. Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ .......................................... 21
2.4.2. Phương pháp xử lý mẫu ...................................................................... 22
2.4.3. Phương pháp sắc ký khí - khối phổ hai lần (GC-MS/MS) ................. 22
2.4.4. Thẩm định phương pháp phân tích bằng GC-MS/MS ........................ 23
2.5. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 26
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................... 27
3.1. Tối ưu hóa điều kiện tách và xác định phenol bằng GC-MS/MS.............. 27
3.1.1. Tối ưu hóa điều kiện MS..................................................................... 27
3.1.2. Tối ưu các điều kiện sắc ký khí........................................................... 28
3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu .............................................................. 29

iii


3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện cất kéo hơi nước................................................ 32
3.2.3. Điều kiện làm sạch phenol .................................................................. 33
3.3. Thẩm định phương pháp ............................................................................ 38
3.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc ....................................................................... 38
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).................. 40
3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn .................................................... 41
3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ....................................................................... 42
3.4. Kết quả xác định phenol trong một số mẫu thủy sản ................................. 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 46
Kết luận ................................................................................................................ 46
Kiến nghị ............................................................................................................. 46
TÀI LIỆU KHAM KHẢO ....................................................................................... 47
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 51


iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

AOAC

Association of Official Analytical

Hiệp hội các nhà hóa phân tích

Chemists

chính thức

BSTFA

Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide Bis(trimethylsilyl)trifluoroaceta
mid

ECD

Electron-Capture Detector


Detector cộng kết điện tử

EFSA

European Food Safety Authority

Ủy ban an toàn thực phẩm Châu
Âu

EPA

Environmental Protection Agency

Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ

FID

Flame Ionization Detector

Detector ion hóa ngọn lửa

PFB

Pentafluorobenzyl Bromide

Pentafluorobenzyl bromid

GC

Gas Chromatography


Sắc ký khí

LC

Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng

LLE

Liquid - liquid Extraction

Chiết lỏng - lỏng

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiên

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lượng

MRM

Mutiple Reaction Monitoring


Giám sát đa phản ứng

MTBFTSA N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-

N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-

methyltrifluoroacetamide

metyltrifluoroacetamid

MS

Mass Spectrometry

Khổi phổ

S/N

Signal to Noise

Tín hiệu/nhiễu đường nền

SPE

Solid Phase Extraction

Chiết pha rắn

SPME


Solid Phase Micro-Extraction

Vi chiết pha rắn

TMCS

Chlorotrimethylsilane

Chlorotrimethylsilan

UV-Vis

Ultraviolet Visible

Phổ tử ngoại – khả kiến

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các thông số vật lý của phenol ........................................................................ 3
Bảng 1.2: Một số khuyến cáo về giới hạn của phenol ..................................................... 8
Bảng 1.3: Một số phương pháp xác định các hợp chất phenol trong mẫu môi trường .. 12
Bảng 1.4: Một số phương pháp phân tích các hợp chất phenol bằng GC-MS. ............. 16
Bảng 2.1: Quan hệ giữa các kỹ thuật khối phổ và số điểm IP đạt được ........................ 23

Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ và ion con của phenol sau khi bắn phá ............................. 27
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thời gian tạo dẫn xuất của phenol với MTBFTSA ............ 30
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát nhiệt độ tạo dẫn xuất của phenol với MTBSTFA.............. 31

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát điều kiện chiết và làm sạch phenol .................................... 34
Bảng 3.5: Tỷ lệ các ion của phenol ................................................................................ 39
Bảng 3.6: Giá trị LOD và LOQ của phenol ................................................................... 40
Bảng 3.7: Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính của phenol trên
mẫu trắng thêm chuẩn .................................................................................................... 41
Bảng 3.8: Độ lặp lại và độ thu hồi của phenol tại các nồng độ 10 ng/mL, 100 ng/mL, 500
ng/mL ............................................................................................................................. 42
Bảng 3.9: Kết quả xác định hàm lượng phenol trong các mẫu thủy sản có
phenol.............................................................................................................................43

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hóa của phenol trong cơ thể người và động vật ........................ 6
Hình 1.2: Cơ chế phản ứng chung tạo dẫn xuất trimethylsilyl ...................................... 15
Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký khí - khối phổ ................................................. 16

Hình 3.1: Phổ khối của phenol sau khi bắn phá ion ....................................................... 28
Hình 3.2: Sắc ký đồ TIC và 3 ion của dung dịch phenol chuẩn 500 ng/mL .................. 29
Hình 3.3: Đồ thị thể hiện hiệu suất phản ứng tạo dẫn xuất của phenol với MTBSTFA
trong thời gian khác nhau ............................................................................................... 31
Hình 3.4: Sắc ký đồ thu được khi thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất của phenol với
MTBSTFA ở nhiệt độ 70, 80, 90ºC ............................................................................... 32
Hình 3.5: Quy trình cất kéo hơi nước mẫu..................................................................... 33
Hình 3.6: Đồ thị thể hiện diện tích pic thu được khi phân tích phenol sử dụng các phương
pháp chiết và làm sạch khác nhau so với phenol chuẩn 100 ng/mL .............................. 35
Hình 3.7: Sắc ký đồ khảo sát điều kiện chiết và làm sạch phenol bằng cột SPE C18, HLB,
chiết QuEChERS và dung dịch phenol chuẩn 100 ng/mL ............................................. 36
Hình 3.8: Quy trình xử lý mẫu xác định hàm lượng phenol trong thủy sản .................. 37

Hình 3.9: Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn 100 ng/mL .......... 38
Hình 3.10: Sắc ký đồ thể hiện tỷ lệ các ion của mẫu thêm chuẩn phenol 500 ng/mL ... 39
Hình 3.11: Sắc ký đồ của phenol ở LOD 3 ng/mL ........................................................ 40
Hình 3.12: Đường chuẩn của phenol trên nền mẫu trắng thêm chuẩn nống độ từ 10
ng/mL đến 50 ng/mL......................................................................................................41

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước Việt Nam
đang phải đối mặt với các vấn đề do ô nhiễm môi trường nước ngày càng nghiêm trọng.
Ô nhiễm môi trường nước là sự thay đổi về thành phần và chất lượng nước không đáp
ứng cho các mục đích sử dụng khác nhau, vượt quá tiêu chuẩn cho phép và có ảnh hưởng
xấu đến đời sống con người. Trong thời gian gần đây sự cố ô nhiễm môi trường biển làm
cá chết hàng loạt vùng biển ven bờ các tỉnh miền Trung được dư luận đặc biệt quan tâm
gây ảnh hưởng đến sức khỏe, kinh tế và sinh thái biển nặng nề. Từ những kết quả phân
tích và đánh giá đưa ra nhận định: “Đã có một nguồn thải lớn chứa phenol và cyanid kết
hợp phức sắt ở dạng keo xả ra môi trường biển xuất phát từ khu vực Vũng Áng, Hà Tĩnh
di chuyển theo dòng hải lưu tới Thừa Thiên Huế. Phức sắt dạng keo sẽ hấp thụ phenol,
cyanid và các chất độc khác làm giàu các độc chất này thậm chí tới hàm lượng có thể
gây độc cấp tính”. Như vậy, có thể thấy phenol là một trong các tác nhân hóa học chính
gây ra sự cố cá chết hàng loạt ở bốn tỉnh miền Trung.
Phenol là một hóa chất công nghiệp quan trọng do chúng tham gia vào nhiều
ngành công nghiệp như than cốc, lọc dầu, luyện kim, sản xuất nhựa, dược phẩm, thuốc
trừ sâu. Sự hiện diện của phenol thậm chí ở nồng độ thấp trong nước thải công nghiệp
đã ảnh hưởng xấu đến các sinh vật dưới nước cũng như cuộc sống con người. Do đó, cả
Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) và Liên minh châu Âu (EU) đã đưa phenol
và một số hợp chất phenol trong danh sách các chất gây ô nhiễm hàng đầu.
Hiện nay, Việt Nam chưa có một quy định cũng như phương pháp chuẩn để xác

định hàm lượng phenol trong thực phẩm. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Xác định hàm lượng phenol trong thủy sản bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ
(GC-MS/MS)” với các mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng phenol trong thủy sản bằng sắc ký
khí khối phổ (GC-MS/MS).
2. Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng phenol trong thủy sản.
1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về phenol

1.1.1. Giới thiệu chung về phenol
Các hợp chất phenol là những hợp chất hữu cơ trong phân tử có một hoặc nhiều
nhóm hydroxy liên kết trực tiếp với một vòng thơm. Trong đó phenol (C6H5OH) là chất
có cấu trúc đơn giản nhất. Phenol tinh khiết ở dạng rắn không màu hoặc màu trắng, ở
dạng lỏng phenol hóa hơi chậm hơi nước, có mùi đặc trưng [9], [17], [34]. Phenol được
hình thành cả trong tự nhiên và nhân tạo [8], [9], [17],[21], [34].
Hiện nay, phenol được sử dụng rông rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp như:
sản xuất các alkylphenol, cresol, cylenol, nhựa phenolic, nilon, các sợi tổng hợp, anilin,
dầu, chế tạo than, luyện kim, sản xuất thuốc diệt cỏ và là nguyên liệu ban đầu hoặc trung
gian để sản xuất một số thuốc như: acid salicylic, acid acetyl salicylic, methyl salicylat.
Vì có tính diệt khuẩn phenol còn có trong các chế phẩm dược như nước xúc miệng, thuốc
chữa đau họng, thuốc xịt khử trùng. Phenol cũng được sử dụng trực tiếp như một chất
tẩy uế, khử trùng. Tuy nhiên do tính độc và bền vững nên cả EPA và EU đã phân loại
các hợp chất phenol là chất gây ô nhiễm hàng đầu [8], [9], [14], [15], [31].
1.1.2. Tính chất hóa lý của phenol
1.1.2.1.


Tính chất vật lý của phenol

Phenol là một hợp chất hữu cơ có công thức hóa học là C6H5OH [9], [16], [34].
OH

Phenol dạng rắn là tinh thể không màu hoặc màu trắng bay hơi được, có mùi đặc
trưng hôi và ngọt cảm giác khó chịu, nóng chảy ở 40,9°C, sôi ở 181,8°C. Để lâu ngoài
không khí phenol bị nóng chảy một phần nên có màu hồng và bị chảy rửa do hấp thụ hơi
2


nước. Phenol tan trong nước, ethanol; rất tan trong ete; đồng tan trong aceton, benzen;
tan vô hạn trong nước ở 66°C. Phenol ở dạng lỏng hóa hơi chậm hơn nước [8], [9], [17],
[34].
Bảng 1.1: Các thông số vật lý của phenol
Trạng thái

Tinh thể rắn màu trắng hoặc chất lỏng

Khối lương riêng

1,07 g/cm3

Điểm nóng chảy

40,9°C

Điểm sôi


181,8°C

Độ hòa tan trong nước ở 25ºC

82,8 g/L

Độ acid (PKa) ở 25ºC

9,99

Momen lưỡng cực

1,7 D

1.1.2.2.

Tính chất hóa học của phenol

Phenol có nhóm -OH gắn trực tiếp vào vòng thơm nên có hiệu ứng liên hợp mạnh
giữa nguyên tử O của nhóm -OH với nguyên tử C của vòng thơm làm cho liên kết giữa
O và H của phenol phân cực hơn so với liên kết -OH của các alcol. Do đó, ngoài tính
chất của các alcol, phenol còn có tính acid và tính chất của vòng thơm [34].
-

Tạo phức với kim loại: các hợp chất phenol có thể tạo phức với các kim loại như
sắt, nhôm và magiê [34].

-

Phản ứng oxy hóa: các hợp chất phenol dễ bị oxy hóa tạo thành hợp chất quinon

như benzoquinon. Tác nhân oxy hóa có thể là oxy trong không khí [34].

1.2.

Nguồn gốc, độc tính của phenol

• Nguồn gốc: phenol có thể được sinh ra từ hai con đường tự nhiên và nhân tạo [7],
[8], [9], [14], [17].

3


-

Nguồn gốc tự nhiên: phenol được hình thành trong quá trình sinh tổng hợp thực
vật và `phân hủy các chất hữu cơ. Hợp chất này hình thành từ các aminoacid chứa
trong hemicellulose của cây trồng dưới ảnh hưởng của bức xạ UV (ánh sáng mặt
trời) và chuyển đổi tyrosin ở hệ thống tiêu hóa động vật có vú (bao gồm cả con
người). Hầu hết các nguồn tự nhiên chỉ giải phóng một lượng dạng vết phenol vào
môi trường nước [8], [21], [28].
Trong thực phẩm: phenol có trong mật ong, cà phê [20], nho đỏ, ca cao, cà
chua, trong thực phẩm chế biến như xúc xích nướng, thịt hun khói và thịt lợn, gà
chiên, trà đen lên men [7], [9], [17], [21], [34].

-

Nguồn gốc nhân tạo:
+ Phenol có thể được tìm thấy trong không khí, nước và đất sau khi giải phóng từ
quá trình sản xuất, sử dụng và xử lý các sản phẩm có chứa phenol. Trong đất
phenol có thể đi vào nguồn nước ngầm [8], [21].

+ Trong nước thải ngoài phenol còn chứa các chất khác như cyanid, anhydrid,
rượu, acid hữu cơ và các chất khí như ammoniac, carbon đioxid [8], [20], [25].
+ Phenol còn xâm nhập vào môi trường thông qua khí thải xe cộ, lò sưởi, khói
thuốc lá và khí từ lò đốt. Mặc dù các khí này không giải phóng phenol trực tiếp
vào nước nhưng có thể xâm nhập vào các nguồn nước do 1,3-15 µg/L phenol đã
được tìm thấy trong nước mưa [8], [21].

• Con đường phenol xâm nhập vào cơ thể
-

Qua đường hô hấp: trong không khí nơi gần với các cơ sở sử dụng chất đốt là than
và dầu mỏ hoặc lò đốt rác thải có chứa phenol. Mặc dù có thể thâm nhập qua hệ
hô hấp nhưng phenol có mùi đặc trưng nên dễ nhận biết để phòng tránh [8], [16].

-

Qua tiếp xúc trực tiếp lên da và mắt: là nhiễm độc hay gặp nhất. Một lượng đáng
kể phenol có thể xâm nhập qua da khi tiếp xúc với phenol ở dạng hơi, dạng lỏng,
hoặc chất lỏng có chứa phenol [8], [17].
4


-

Đường xâm nhập thứ ba của phenol là đường tiêu hóa thông qua thực phẩm hoặc
nước uống nhiễm phenol hoặc sử dụng chế phẩm dược như nước xúc miệng, thuốc
ngậm trị viêm họng. Nếu thường xuyên sử dụng các thực phẩm hoặc dược phẩm
có chứa phenol thì sẽ gây ra ngộ độc trường diễn [8], [17].

• Dược động học của phenol trong cơ thể: độc tính của phenol được nghiên cứu

rộng rãi ở người và động vật thí nghiệm.
-

Hấp thu, phân bố: phenol hấp thu dễ dàng bởi tất cả các đường và nhanh chóng
phân bố rộng khắp cơ thể chủ yếu ở gan, thận, não, cơ. Phenol có thể đi qua não,
nhau thai và thậm chí sữa mẹ [8], [9], [16].

-

Chuyển hóa: nếu phơi nhiễm qua đường tiêu hóa phenol chuyển hóa bước 1 qua
gan nhờ ba hệ thống enzym khác nhau. Phenol sulfototransferases (PST) xúc tác
chuyển lưu huỳnh vô cơ từ phân tử 3'-phosphoadenosin-5'-phosphosulfat hoạt hóa
đến

nhóm

hydroxyl

trên

phenol.

Uridin

diphosphat

(UDP)

-


glucuronosyltransferases (UGT) xúc tác chuyển một phân tử acid glucuronic hoạt
hóa đến nhóm hydroxyl của phenol để tạo ra một liên hợp O - glucuronid.
Cytochrom P450 2E1 xúc tác hydroxyl hóa phenol tạo thành hydroquinon và
catechol. Các chất này tiếp tục được chuyển hóa tương tự như phenol (tức là liên
hợp với acid glucuronic và sulfat) hoặc trải qua các quá trình peroxy hóa tạo
benzoquinon, trihydroxybenzen. Các nghiên cứu in vitro đã chứng minh rằng các
chất trung gian có thể liên quan đến độc tính của chất này [8].
+ Quá trình chuyển hóa của phenol phụ thuộc vào liều. Ở người và chuột nếu
uống phenol liều thấp thì sản phẩm liên hợp sulfat của phenol được cho là có ưu
thế hơn còn ngược lại ở lợn và dơi thì các sản phẩm liên hợp glucuronid chiếm
ưu thế. Khi người phơi nhiễm với phenol liều cao sản phẩm liên hợp glucoronid
và các chất trung gian được tạo ra từ quá trình peroxy hóa có nồng độ cao hơn do
đó nguy hiểm hơn [8].
5


+ Khi tiếp xúc qua da, phenol không qua chuyển hóa bước 1 ở gan nên khả năng
giải độc phenol là tương đối thấp. Điều này có thể làm tăng khả năng gây ra các
phản ứng bất lợi của phenol [8].
-

Thải trừ: dữ liệu ở người và động vật thí nghiệm cho thấy phenol và các sản phẩm
liên hợp của nó được bài tiết nhanh chủ yếu qua nước tiểu (dưới dạng phenyl
sulfat và phenyl glucuronid). Một phần nhỏ được thải trừ qua da, phân và hầu như
không tích tụ trong cơ thể [8], [9], [17].

Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hóa của phenol trong cơ thể người và động vật
• Độc tính của phenol đối với cơ thể người [7], [8], [9], [17], [21]: ảnh hưởng của
phenol đối với cơ thể người phụ thuộc rất nhiều vào khả năng dung nạp và con
đường phơi nhiễm.

-

Triệu chứng ngộ độc cấp:

6


Ngộ độc nhẹ: rối loạn tiêu hoá như buồn nôn, nôn, ỉa chảy; rối loạn thần kinh và
toàn thân như mệt mỏi, chóng mặt, nhức đầu, gầy sút nhanh. Nếu hít phải hoặc
tiếp xúc với phenol gây khó chịu cho da, mắt và màng niêm mạc ở người.
Ngộ độc nặng: bỏng, hoại tử, ăn mòn tại chỗ, rối loạn tiêu hoá, giãy giụa, co giật,
hôn mê, rối loạn tuần hoàn, hô hấp và sốc nặng dẫn đến tử vong. Nếu bệnh nhân
chưa tử vong ngay còn có thể bị viêm gan, viêm thận, đái ra huyết cầu tố.
-

Triệu chứng ngộ độc trường diễn: nếu nhiễm độc phenol lâu dài có thể gây suy
thận, kích thích dạ dày ruột, ảnh hưởng đến máu và gan cũng đã được báo cáo.
Tiếp xúc với phenol bị rát, viêm da, kích ứng hoặc hoại tử da.

-

Ảnh hưởng đến trẻ em [8]:
+ Trẻ em: nôn mửa, buồn ngủ là những triệu chứng chính được quan sát thấy ở
trẻ em sau khi tình cờ nuốt một chất khử trùng có chứa phenol.
+ Thai nhi: phenol là một chất độc với thai nhi, nhưng không gây quái thai.
+ Sữa mẹ: không có thông tin về mức độ độc tính của phenol trong sữa mẹ.

-

Ung thư: không có bằng chứng phenol gây ung thư trên con người. Cơ quan

nghiên cứu ung thư quốc tế, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ và chương trình Độc
tố Quốc gia Hoa Kỳ (NTP) đã xác định rằng phenol không được phân loại là chất
gây ung thư của con người [7], [8], [9], [17].

1.3.

Độc tính của phenol đối với thủy sản

1.3.1. Ảnh hưởng của phenol đối với thủy sản
Phenol và các dẫn chất của phenol là các chất gây ô nhiễm nguồn nước từ các
nguồn nước tự nhiên đến các nguồn nước thải của nhiều ngành công nghiệp hóa học như
luyện kim, hóa dầu, sản xuất phenol, dược phẩm và các ngành công nghiệp nhựa, nhuộm,
sơn, hóa dệt, thuộc da…. Nồng độ nhỏ phenol trong nước cũng có thể gây độc đối với
một số loài thủy sản và con người vì sự dung nạp và nhạy cảm của các cơ thể sống đối
với phenol có thể khác nhau. Điều này sẽ gây ra sự gián đoạn trong chuỗi thức ăn trong
7


hệ sinh thái biển [7]. Độc tính của phenol rất khác đối với các sinh vật được thử, hàm
lượng oxy hòa tan, nhiệt độ và thành phần các chất tan trong nước. Nước thải phenol có
chứa các hợp chất khác có độc tính cao hơn chỉ chứa mình phenol [7], [28].
Đa số các nghiên cứu về độc tính của phenol đối với thủy sản chỉ mới quan tâm
tới phơi nhiễm của cá với các mức nồng độ phenol trong nước. Cá phơi nhiễm với phenol
cấp tính có các biểu hiện: chán ăn, tăng tiết chất nhầy từ da và mang, suy hô hấp cấp,
ảnh hưởng đến thần kinh như mất thăng bằng, thay đổi giải phẫu bệnh đối với mang,
thận và gan do đó ảnh hưởng dến chuyển hóa trong cơ thể, làm giảm sinh trưởng và phát
triển của cá thậm chí còn ảnh hưởng đến máu [25], [26], [28]. Cá nước ngọt nhạy cảm
với phenol ở mức từ 5,02 mg/L (96h LC50) đối với cá hồi vân tới 85 mg/L (2,5h LC50)
đối với cá vàng. Độc tính mạn của phenol với các sinh vật nước ngọt cũng đã được báo
cáo trong một số nghiên cứu. Giai đoạn ấu trùng ở một số loài là đặc biệt nhạy cảm. LC50

từ 6,5 đến 58 ngày ở cá dao động từ 0,07 đến 2,67 mg/L. Đối với cá biển nồng độ tác
động dao động từ 5,6 mg/L (96 giờ LC50) đến 30,6 mg/L (96 giờ LC50) [16].
1.3.2. Một số khuyến cáo về liều lượng cho phép của phenol
Hiên nay, tất cả các tài liệu Codex (Việt Nam), Liên minh Châu Âu, Hoa Kì hay
Nhật Bản chưa có một cơ quan tổ chức nào quy định mức giới hạn của phenol trong hải
sản. Tuy nhiên, một số cơ quan và tổ chức có đưa ra các mức khuyến cáo để bảo vệ sức
khỏe con người như sau:
Bảng 1.2: Một số khuyến cáo về giới hạn của phenol
Cơ quan ban

Khuyến cáo

TLKK

hành
Bộ tài nguyên Giới hạn cho phép của phenol tổng trong nước biển vùng
và môi trường ven bờ là 0,03 mg/L, vùng gần bờ là 30 µg/L và vùng biển
Việt Nam

xa bờ là 30 µg/L (2007).

8

[3]


Bộ Y tế Việt Giới hạn tối đa thôi nhiễm phenol từ hợp kim chế tạo đồ

[2]


hộp là không quá 5 mg/kg (2007).

Nam
Cục

quản

lý Nồng độ phenol trong nước uống đóng chai không nên

[8]

thực phẩm và vượt quá 0,001 mg/L (2005).
thuốc Hoa Kỳ
Liều lượng tham khảo (reference dose-RfD) của phenol là

EPA

[8]

0,6 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (2002).
Liều lượng tham khảo (reference dose - RfD) của phenol

EFSA

[17]

là 0,3 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (2005).
Ngưỡng phenol tối đa được phép hấp thụ hàng ngày mà

[17]


không gây hại (Tolerable daily intake-TDI) là 0,5 mg/kg
trọng lượng cơ thể/ ngày (2008).
LC50 của dung dịch phenol trên chuột trong khoảng từ 340

[17]

đến 530 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày (2006).
Cơ quan quản Mức Rủi ro Tối thiểu (MRL) cho việc tiêu thụ thực phẩm [8], [9]
lý các chất độc có chứa phenol trong ngắn hạn (dưới 14 ngày) là 1 mg/kg
hại

và

bệnh trọng lượng cơ thể/ngày (2006).

dịch
Cục quản lý an Giới hạn phơi nhiễm của phenol trong không khí nơi làm
toàn

và

khỏe

[8]

sức việc một ngày 8 giờ là 5 ppm (2005).
nghề

nghiệp Hoa Kì

 Như vậy, có thể thấy phenol là một chất khá độc đối với con người. Tuy nhiên
cũng giống như các loại hóa chất khác đặc tính độc hay có hại cho sức khỏe con
người của phenol vẫn phụ thuộc vào hàm lượng (chứa trong thực phẩm) và liều
lượng (mức độ hấp thu).

9


1.4.

Một số phương pháp xác định hợp chất phenol

1.4.1. Phương pháp xử lý mẫu
Xử lý mẫu là một trong những bước quan trọng để có thể xác định phenol dạng
vết trong các nền mẫu khác nhau. Phương pháp xử lý mẫu thích hợp giúp loại bỏ, làm
giảm các yếu tố gây cản trở, làm giàu và xác định cũng như định lượng đúng được lượng
chất phân tích có trong mẫu. Tuy nhiên, phenol là một chất phân cực và dễ bay hơi do
đó xác định các hợp chất này trong cá cũng như các nền mẫu khác ở mức 1 ng/mL rất
khó khăn [15], [20], [24].
1.4.1.1.

Phương pháp tách phenol khỏi nền mẫu thủy sản

Phenol trong nền mẫu thủy sản thường ở dạng kết hợp và có lẫn các chất khác
gây ảnh hưởng cho việc xác định chất này. Vì vậy cần phải loại bỏ các yếu tố gây cản
trở và tách phenol ra khỏi nền mẫu. Cũng tương tự như nền mẫu nước, phenol trong thủy
sản sẽ được tách bằng cất kéo hơi nước với sự có mặt của dung dịch đồng (II) sulfat
trong môi trường acid. Việc dùng đồng (II) sulfat khi cất mẫu đã được acid hóa nhằm
tạo đồng (II) sulfua mà không tạo ra hydrosulfua, acid hóa mẫu để tránh tạo tủa đồng (II)
hydroxid là chất có khả năng acid hóa các hợp chất phenol. Như vậy toàn bộ phenol và

dẫn xuất của phenol có trong mẫu cùng bị cất kéo theo hơi nước. Vì tốc độ bay hơi của
các hợp chất phenol chậm nên thể tích dịch cất thu được phải đủ lớn cỡ thể tích mẫu đem
cất [5], [11].
1.4.1.2.

Phương pháp làm sạch phenol

Mục đích của quá trình làm sạch là đưa được tối đa lượng chất cần phân tích vào
dung môi thích hợp để thực hiện các bước tiếp theo. Hiệu quả của quá trình làm sạch
được thể hiện bằng độ thu hồi. Phương pháp chính thức của Hoa Kỳ để chiết phenol
trong chất lỏng là chiết lỏng-lỏng bằng cách acid hóa mẫu đến pH=2 sau đó chiết
diclorometan hoặc cloroform (phương pháp US EPA 604, 625). Phương pháp này có
10


nhược điểm như hình thành nhũ tương, sử dụng nhiều dung môi nên thường đắt tiền, độc
hại, tốn nhiều thời gian phân tích do đó đã được thay thế bằng các phương pháp khác
nhạy cảm, chọn lọc, nhanh chóng và thân thiện với môi trường hơn [15], [20].
Chiết pha rắn (SPE) được phát triển vào những năm 1980 và được đánh giá là
một kỹ thuật tốt để tách chiết và làm sạch các chất do hiểu quả, chọn lọc, giảm mất chất
phân tích và sử dụng dung môi. Chất phân tích sẽ được hấp phụ vào chất hấp phụ và rửa
giải bằng dung môi như etyl acetat, methanol, acetonitril hoặc aceton. Loại dung môi
được lựa chọn phụ thuộc vào loại chất hấp phụ và độ phân cực của từng chất phân tích.
Các chất hấp phụ pha đảo không phân cực chứa silica được sử dụng đầu tiên trong phân
tích các hợp chất phenol trong nước trong đó cột C18 được sử dụng rộng rãi nhất, nhưng
hiệu suất chiết vẫn còn thấp nhất là đối với phenol. Theo một cuộc khảo sát, sử dụng các
chất hấp phụ polymer hữu cơ sẽ ổn định hơn như cột Oasis HLB, ENV+, Lichrolut EN
cho độ hấp phụ với các hợp chất phenol cao hơn. Tuy nhiên, các cột chiết pha rắn thường
phù hợp với một lượng mẫu nhỏ, chỉ sử dụng được 1 lần do đó rất tốn kém và quá trình
chiết vẫn sử dụng dung môi hữu cơ [15], [20], [24].

Vi chiết pha rắn (SPME) được phát triển để giải quyết một số hạn chế trong kỹ
thuật SPE. Dụng cụ SPME bao gồm một sợi silica nung chảy được bao phủ các polymer
khác nhau đặt trong kim tiêm của một ống tiêm. SPME dựa trên sự cân bằng giữa nồng
độ chất phân tích trên mẫu và trong lớp sợi silica. Xử lý mẫu bằng SPME sẽ tiết kiệm
thời gian phân tích cũng như dung môi nhưng SPME có một nhược điểm là các sợi SPME
rất đắt, tuổi thọ ngắn, dễ đứt nhất là trong một hệ thống hoàn toàn tự động [15], [18],
[20].
Gần đây, một sự kết hợp độc đáo giữa các quy trình (chiết và làm sạch), dung
môi, muối và chất hấp thụ cho thấy rất hiệu quả là phương pháp xử lý mẫu bằng chiết
QuEChERS. Hiện tại, đây là quy trình xử lý mẫu chuẩn cho phân tích dư lượng thuốc
trừ sâu trong trái cây, rau quả và có thể mở rộng cho các chất phân tích khác. Chiết
11


QuEChERS nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, bền vững, an toàn và chủ yếu được kết hợp với GCMS, GC-MS/MS hoặc LC-MS [23].
Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng, tuy nhiên qua các nghiên cứu
và điều kiện phòng thí nghiệm hiện có chúng tôi tiến hành làm sạch mẫu thủy sản sau
khi cất kéo hơi nước bằng ba phương pháp sau đây:
-

Chiết pha rắn bằng cột C18.

-

Chiết pha rắn bằng cột HLB.

-

Chiết QuEChERS.


1.4.2. Phương pháp phân tích các hợp chất phenol
Các phương pháp phân tích thường được sử dụng để xác định các hợp chất phenol
là phương pháp quang phổ và phương pháp sắc ký với các detector khác nhau.
Bảng 1.3: Một số phương pháp xác định các hợp chất phenol trong mẫu môi trường
Nền

Phương

Phương pháp

Giới hạn

mẫu

pháp xử lý

phân tích

phát hiện

Nhận xét

TLKK

mẫu
Nước

Chiết trong UV-Vis ở bước 0,01 mg/L Nhanh, chính xác, rẻ,

[5],


uống,

cloroform

sóng 510 nm cho 500 ml quá trình xử lý mẫu

[11]

nước

hoặc không. hoặc 460 nm mẫu.

thải

đơn giản. Tuy nhiên,

dựa vào phản

bất

ứng

phenol nào đều hấp

với

4-

dẫn


chất

thụ bức xạ UV-Vis

aminoantipyri/
K3Fe(CN)6

kỳ

ở

nên thường được sử
dụng để xác định

pH = 10.

hàm lượng tất cả dẫn

12


chất phenol có trong
mẫu.
Nước,

LLE

bằng LC-UV ở bước 0,05 - 0,50 Độ nhạy, độ đặc


nước

dietylete

thải

sau khi đã

có thể phân tích được

được

các chất phân cực và

sóng 232 nm.

hiệu, độ lặp lại cao,

µg/L

tạo

dẫn xuất
Mẫu

không bền với nhiệt

SPE

LC-ED


môi

mà không cần tạo

0,0090,045 µg/L

trường
Thuốc

LLE

với LC-MS

LLE

với GC-FID

0,14 μg/L

đúng, độ chính xác

clorid.

cao, có thể tự động
GC-MS

0,026 μg/L

nước


hóa trong phân tích.
Đối với các chất có

[32]

[31]

nhiệt độ hóa hơi cao
SMPE

GC-FID

SPE

GC-MS tạo dẫn 15

thải
Mẫu

Độ chọn lọc, độ

metylen

SPE

[10]

đắt tiền.


uống
Nước

[27]

quá trình xử lý mẫu

0,07 - 0,28 các yếu tố nhiễu từ
µg/mL
môi trường, thiết bị

etanol

Nước

dẫn xuất. Tuy nhiên,
phức tạp, dễ bị lẫn

đông y dung môi là

Nước

[6]

xuất

0,47 - 9,01 hoặc kém bền với
µg/L
nhiệt có thể tạo dẫn


[18]

75 xuất phù hợp. Tuy
nhiên quá trình xử lý

[30]

với ng/L

-

mẫu phức tạp.

MTBFTSA

13


Tóm tại, sắc ký là phương pháp phân tích thường được sử dụng để xác định các
hợp chất phenol dạng vết trong các mẫu nước nói riêng và mẫu môi trường nói chung.
Nhưng, sắc ký khí thường được sử dụng rộng rãi hơn do có độ phân giải, độ chọn lọc
cao, dễ dàng kết hợp với các detector khác nhau cho độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Sắc ký
khí kết hợp ECD, FID hoặc MS là phương pháp phân tích được sử dụng trong một số
phương pháp chuẩn như US EPA 604, 625 và 8041a [28], [29], [30], Phenol có khả
năng thích ứng với GC mà không cần tạo dẫn xuất, tuy nhiên ở nồng độ thấp xảy ra kéo
đuôi pic đặc biệt khi phân tích mẫu môi trường ngay cả khi sử dụng cột mao quản mới.
Để khắc phục hiện tượng này, phenol được tạo dẫn xuất với một tác nhân thích hợp như
tác nhân silyl- hóa, acyl- hóa và alkyl- hóa để tạo ra một chất mới ít phân cực và bền với
nhiệt hơn. Tuy nhiên, tác nhân acyl- hóa đòi hỏi pH kiềm từ 9 đến 11. Diazomethan là
chất dễ nổ và gây ung thư do đó nếu quá trình tạo dẫn xuất tại chỗ sẽ gây độc [13].

Pentafluorobenzyl bromid (PFB) được sử dụng rộng rãi để tạo dẫn xuất với các hợp chất
phenol bao gồm các nitrophenol nhưng hiệu suất của phản ứng này với các nitrophenol
được báo cáo là tương đối thấp. Các ete PFB được phát hiện nhạy cảm nhất bằng detector
cộng kết điện tử (ECD) nhưng một nhược điểm lớn của quy trình ete PFB là một lượng
lớn các chất gây cản trở từ nền mẫu môi trường cũng được chiết và được phân tích với
GC-ECD. Ete PFB được phát hiện chọn lọc hơn bằng GC - MS nhưng không phải là một
giải pháp tối ưu, bởi vì phổ khối electron ion hóa (EI) của chúng bị ảnh hưởng bởi ion
pentafluorobenzylium m/z 181 được tìm thấy không chọn lọc do nó cũng có trong phổ
khối của các hợp chất nền mẫu được dẫn xuất hóa. Vì vậy, phương pháp tạo dẫn xuất
với tác nhân silyl- hóa cùng với phân tích bằng GC-MS được coi là phương pháp tối ưu
nhất để xác định các hợp chất phenol trong nền mẫu môi trường. Tác nhân silyl- hóa có
ưu điểm nổi bật như: có nhiều tác nhân silyl- hóa, khả năng tạo dẫn xuất với nhiều hợp
chất, quá trình xử lý mẫu đơn giản, trong đó tác nhân N-(t-butyldimethylsilyl)-Nmethyltrifluoracetamid ngoài những ưu điểm trên còn có độ ổn định cao, dẫn xuất của

14


nó với phenol có thể bảo quản trong 7 ngày mà không thay đổi ngay cả khi có độ ẩm cao
[30].
Cơ chế phản ứng chung cho sự hình thành dẫn xuất trimethylsilyl như sau [19]:

Hình 1.2: Cơ chế phản ứng chung tạo dẫn xuất trimethylsilyl
1.5.

Giới thiệu về sắc ký khí khối phổ

1.5.1. Sắc ký khí
Sắc ký khí là kỹ thuật tách các chất dựa vào sự phân bố của các chất giữa hai pha,
pha động là chất khí và pha tĩnh có thể là chất rắn (sắc ký khí rắn) hoặc chất lỏng (sắc
ký khí lỏng). Khác với các dạng sắc ký khác, trong GC pha động không tương tác với

chất phân tích mà chỉ làm chức năng vận chuyển chất phân tích qua cột [1].
Sắc ký khí có thể áp dụng để phân tích các chất ở thể khí và bền với nhiệt. Đối
với những chất không có tính chất phù hợp thông thường cần tạo dẫn xuất có khả năng
bay hơi tốt và có thể phân tích được bằng sắc ký khí [1].
1.5.2. Detector khối phổ trong sắc ký khí
1.5.2.1.

Khái niệm:

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các
hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử hay các ion mảnh của phân tử theo
tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z) [1].
Về bản chất có thể coi khối phổ là một loại detector nhưng nó là một detector đặc
biệt vì ngoài vai trò phát hiện phối phổ còn có khả năng tách các chất đồng rửa giải dựa
trên sự khác nhau về khối lượng của chúng [1].

15


1.5.2.2.

Nguyên tắc hoạt động:

Mẫu từ máy sắc ký khí đưa vào máy khối phổ sẽ được ion hóa trong buồng ion
để tạo các phần tử mang điện, sau đó được mang đến bộ phận lọc và phân tích khối để
tách các ion khác nhau theo tỷ số m/z. Các ion được bộ phận phát hiện thu nhận, tín hiệu
thu được chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ [1].

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký khí - khối phổ
1.5.3. Một số phương pháp xác định các hợp chất phenol bằng GC-MS

Bảng 1.4: Một số phương pháp phân tích các hợp chất phenol bằng GC-MS
STT

1

Phương

Mẫu phân

pháp

tích

GC-MS

Lá Carica
Papaya L

Điều kiện xử lý mẫu

LOD

Chiết bằng dụng cụ Soxhlet với 0,03-0,33

TLKK

[12]

methanol sau đó chiết LLE; tạo mg/g
dẫn xuất với BSTFA+TMCS 1%


2

GC-MS

Mẫu nước Mẫu được chiết pha rắn với cột Nhỏ hơn
ngầm

ENV+,

tạo

nhiễm bẩn

MTBFTSA

16

dẫn

xuất

với 0,1 µg/L

[22]