BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHU THỊ HẠNH
MÃ SINH VIÊN: 1201166

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG ĐẾN KÍCH THƯỚC
TIỂU PHÂN HỖN DỊCH PHỨC HỢP
LIPID – AMPHOTERICIN B

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHU THỊ HẠNH
MÃ SINH VIÊN: 1201166

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG ĐẾN KÍCH THƯỚC
TIỂU PHÂN HỖN DỊCH PHỨC HỢP
LIPID – AMPHOTERICIN B
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Thị Hải Yến
2. ThS. Nguyễn Văn Khanh
Nơi thực hiện:

1. Bộ môn bào chế
2. Khoa Y Dược – ĐHQGHN

HÀ NỘI – 2017


LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc đến:
TS. Trần Thị Hải Yến
Là người thầy đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu, thực
hiện đề tài, dẫn dắt em từng bước để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Sau đó, em xin gửi lời cám ơn đến anh Nguyễn Văn Khanh và chị Phạm Thị
Lê Na, là người trực tiếp chỉ bảo em từng thao tác thực nghiệm, hướng dẫn em cách
sử dụng thiết bị, là cơ sở để em có thể tự mình thực hiện nghiên cứu.
Em cũng xin cám ơn toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ
môn Bào chế - Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời
gian nghiên cứu thực nghiệm.
Nhân đây, em cũng xin gửi lời cám ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các
phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tạo
điều kiện giúp em tiếp thu tri thức trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn quan
tâm, động viên, giúp em đi đến bước cuối cùng của công việc nghiên cứu và hoàn
thành khóa luận.
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Chu Thị Hạnh


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................2
1.1. Amphotericin B ....................................................................................................2

1.2.

1.3.

1.1.1.

Công thức hóa học ..................................................................................2

1.1.2.

Đặc tính lý hóa .......................................................................................2

1.1.3.

Tác dụng dược lý ....................................................................................2

Phức hợp phospholipid chứa AMB .................................................................3
1.2.1.

Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid AMB .............................3

1.2.2.

Tá dược tạo phức ....................................................................................4

1.2.3.


Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB ..........................................5

Sự ổn định KTTP của hỗn dịch .......................................................................7
1.3.1.

DLVO lý thuyết về sự ổn định hệ keo ...................................................8

1.3.2.

Sự ổn định tĩnh điện – cơ chế ổn định electrostatic .............................10

1.3.3.

Sự ổn định bởi lực đẩy giữa các bề mặt hydrat hóa – cơ chế ổn định

steric

..............................................................................................................12

1.3.4.

Sự ổn định bởi phân tử polyme tự do – cơ chế ổn định depletion .......13

1.3.5.

Ảnh hưởng của nồng độ tiểu phân đến độ ổn định ..............................14

1.3.6.


Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ổn định ................................................15

1.3.7.

Ảnh hưởng của KTTP tới độ ổn định ...................................................15

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................16
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu..............................16
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................17
2.2.1. Phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB .............................................17


2.2.2. Phương pháp làm giảm KTTP ..................................................................19
2.2.3. Phương pháp tinh chế hỗn dịch ................................................................19
2.2.4. Phương pháp đánh giá hỗn dịch phức hợp lipid AMB ............................20
Chương 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..................................................................23
3.1. Khảo sát phương pháp làm giảm KTTP ............................................................23
3.1.1. Phương pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao ...............................................23
3.1.2. Phương pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao kết hợp đùn qua màng ..........25
3.2. Khảo sát môi trường pha loãng trong phương pháp đo KTTP ..........................26
3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của MTPT đến độ ổn định của hỗn dịch phức hợp lipid –
AMB ..........................................................................................................................28
3.3.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của MTPT lên một số đặc tính của hỗn dịch phức
hợp lipid – AMB ................................................................................................28
3.3.2. Theo dõi độ ổn định của các mẫu tạo bởi MTPT khác nhau ...................31
3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ tiểu phân đến độ ổn định của hỗn dịch phức
hợp lipid – AMB .......................................................................................................34
3.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến độ ổn định của chế phẩm .37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................

PHỤ LỤC ......................................................................................................................


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AMB

Amphotericin B

DSPG

Distearoylphosphatidylcholin

HSPC

Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa
(Hydrogenated soy phosphatidylcholine)

DMPC

Dimyristoylphosphatidylcholin

DMPG

Dimyristoylphosphatidylglycerol

DPPC

Dipalmitoylphosphatidylcholin

KTTP


Kích thước tiểu phân

LTT

Lọc tiếp tuyến

TFR

Tổng tốc độ dòng (Total flow rate)

DMSO

Dimethyl sufoxid

TKHH

Tinh khiết hóa học

PDI

Chỉ số đa phân tán
(Polydispersity index)

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

NSX


Nhà sản xuất

BP

Dược điển Anh

USP

Dược điển Mĩ

DMHC

Dung môi hữu cơ

MTPT

Môi trường phân tán


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Nguyên liệu ...............................................................................................16
Bảng 3.1. KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau các chu kì đồng nhất khác nhau ..23
Bảng 3.2. KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau khi làm giảm KTTP bằng phương
pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao kết hợp đùn qua màng .........................................25
Bảng 3.3. KTTP và phân bố KTTP của các mẫu trong môi trường đo KTTP khác
nhau ...........................................................................................................................27
Bảng 3.4. Một số đặc tính hỗn dịch phức hợp lipid – AMB với các MTPT khác nhau
...................................................................................................................................29
Bảng 3.5. KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất tạo phức hợp của các mẫu CT1, CT3,
CT4 tại các thời điểm khác nhau ...............................................................................32

Bảng 3.6. KTTP và phân bố KTTP của mẫu trước khi LTT và sau khi LTT tại các
thời điểm khác nhau ..................................................................................................35
Bảng 3.7. Một số đặc tính của mẫu bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC và nhiệt độ phòng thí
nghiệm tại các thời điểm khác nhau ..........................................................................38


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB ................................................3
Hình 1.2. Phân tử HSPC và DSPG .............................................................................4
Hình 1.3. Biểu đồ DLVO điển hình ............................................................................9
Hình 1.4. Ảnh hưởng trên biểu đồ DLVO khi: A. Thêm chất điện ly đến nồng độ thấp;
B.Thêm chất điện ly đến nồng độ trung bình; C.Thêm chất điện ly đến nồng độ cao
...................................................................................................................................10
Hình 1.5. Quá trình chuyển đổi từ dạng “hỗn loạn” sang dạng ổn định của hỗn dịch
latex theo cơ chế tĩnh điện.........................................................................................11
Hình 2.1. Mô hình thiết bị trộn vi dòng chảy tạo phức hợp lipid AMB ...................18
Hình 2.2. Quy trình bào chế phức hợp lipid – AMB theo phương pháp vi dòng chảy
...................................................................................................................................18
Hình 2.3. Cơ chế của phương pháp LTT [16] ...........................................................19
Hình 2.4. Hệ thống LTT Sartoflow Slice 200 Benchtop .........................................20
Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau các chu
kì đồng nhất khác nhau .............................................................................................24
Hình 3.2. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau khi đồng nhất hóa ở áp suất
cao kết hợp đùn qua màng.........................................................................................25
Hình 3.3. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP của các mẫu với môi trường đo KTTP
khác nhau tại thời điểm ban đầu và sau 1 tháng bảo quản ........................................27
Hình 3.4. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP hỗn dịch phức hợp lipid – AMB với các
MTPT khác nhau .......................................................................................................30
Hình 3.5. Biểu đồ hiệu suất tạo phức hợp của phức hợp lipid – AMB với các MTPT
khác nhau...................................................................................................................30

Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi KTTP và phân bố KTTP của các mẫu CT1,
CT3, CT4 theo thời gian ...........................................................................................32


Hình 3.7. Mẫu phức hợp lipid AMB với MTPT là dung dịch NaCl 0,9% trước và sau
khi LTT đến nồng độ 5 mg/ml ..................................................................................35
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi KTTP và phân bố KTTP của mẫu trước và
sau khi LTT theo thời gian ........................................................................................36
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi KTTP và phân bố KTTP của mẫu sau khi
LTT bảo quản ở hai điều kiện khác nhau ..................................................................38
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hiệu suất tạo phức hợp của mẫu sau khi LTT
bảo quản ở hai điều kiện khác nhau ..........................................................................39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Amphotericin B (AMB) là một kháng sinh polyen được chỉ định trong trường
hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng.
Do không tan trong nước nên muốn bào chế thuốc tiêm cần sử dụng biện pháp đặc
biệt, ví dụ như tạo hệ mang thuốc liposome hay phức hợp lipid. Dạng chế phẩm tiêm
ban đầu của AMB là dạng micell (chế phẩm Fungizone). Nhưng ở hệ mang dược chất
này, AMB không bền trong hệ tuần hoàn và nhanh chóng chuyển từ dạng micell sang
dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật chủ, đặc biệt là độc tính trên thận. Hai hệ
mang dược chất AMB mới là liposome và phức hợp lipid có khả năng làm giảm độc
tính trên thận so với thuốc tiêm quy ước dạng micell. So với hệ mang dược chất
liposome, phức hợp lipid có hàm lượng AMB cao hơn, quy trình bào chế đơn giản
hơn nên giá thành thấp hơn. Tuy nhiên, với cấu trúc hóa lý là hỗn dịch, các hệ mang
dược chất trên có nguy cơ kém ổn định về mặt vật lý.
Tại Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về các hệ mang dược chất khác
nhau của AMB. ThS. Dương Thị Thuấn đã nghiên cứu bào chế phức hợp lipid AMB
theo phương pháp tiêm polyol. Phương pháp bào chế này còn nhiều hạn chế như cách

tiến hành phức tạp, quy trình phối hợp hai pha kéo dài gây mất thời gian, khó nâng
cấp quy mô sản xuất. Để khắc phục những nhược điểm trên, DS. Phạm Thị Lê Na đã
nghiên cứu phương pháp bào chế tiêm vi dòng chảy và đã thu được những kết quả
tích cực. Mặc dù vậy, kích thước tiểu phân (KTTP) tạo thành theo cả hai phương
pháp trên còn lớn và độ ổn định vật lý chưa được nghiên cứu. Vì vậy, để góp phần
ứng dụng phức hợp lipid làm chất mang cho dược chất trị nấm có độc tính cao, chúng
tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân hỗn dịch phức
hợp lipid – Amphotericin B” nhằm mục tiêu:
-

Nghiên cứu phương pháp làm giảm KTTP đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm hỗn dịch.

-

Nghiên cứu một số yếu tố hạn chế sự tăng KTTP trong quá trình bảo quản.

1


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Amphotericin B
1.1.1. Công thức hóa học

Công thức phân tử: C47H73NO17.
Khối lượng phân tử: 924,08 [1].
1.1.2. Đặc tính lý hóa
 Lý tính:
-


Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [1].

-

Độ tan: Thực tế không tan trong nước, hòa tan trong DMSO và trong propylen
glycol, hơi tan trong dimethylformamid, rất ít tan trong methanol, thực tế
không tan trong ethanol 96% [14].

 Hóa tính: Do AMB có hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm
carboxylic tự do nên AMB có tính chất sau:
-

Tính lưỡng thân.

-

Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các dung
dịch kiềm.

-

Dung dịch AMB 0,0005% trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và
405 nm. Tỉ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57 – 0,61, tỉ lệ độ hấp
thụ ở 381 nm so với 405 nm là 0,87 – 0,93 [1].

1.1.3. Tác dụng dược lý
Cơ chế tác dụng của AMB, cũng như của các polyen khác, dựa trên sự liên kết
giữa đuôi kỵ nước của AMB với đuôi ergosterol trên màng tế bào nấm, tạo các kênh
trên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm và tính khử cực của màng tế bào nấm, làm


2


rò rỉ các chất bên trong tế bào ra ngoài và cuối cùng làm chết tế bào nấm. AMB cũng
có thể liên kết với các cholesterol trên màng tế bào người, điều này là nguyên nhân
chính gây tác dụng phụ nghiêm trọng của AMB. Ái lực của AMB với ergosterol màng
lớn hơn với cholesterol màng nên AMB thể hiện tác dụng chống nấm chủ yếu nhưng
vẫn tiềm tàng tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tổn thương thận với các biểu
hiện: suy thận, tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển hóa, tăng kali máu,… [2].
1.2.

Phức hợp phospholipid chứa AMB

1.2.1. Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid AMB
Phân tử AMB có tính lưỡng thân, một đầu chứa nhiều nhóm hydroxyl thân
nước, một đầu là một chuỗi hydrocacbon chứa nhiều nối đôi đơn luân phiên thân dầu.
Trong môi trường nước và ở điều kiện thích hợp, khi tỉ lệ %mol AMB/phospholipid
dưới 25%, AMB sẽ liên kết giới hạn ở dạng monome với phospholipid tạo thành
liposome. Nhưng ở tỉ lệ %mol AMB/phospholipid từ 25% – 100%, AMB sẽ liên kết
với phospholipid để tạo thành cấu trúc dạng chuỗi [19].

Hình 1.1. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB [15], [19]
Bằng các phương pháp quan sát thích hợp, các nhà nghiên cứu đã suy đoán
rằng, khi tỉ lệ %mol AMB/phospholipid tăng quá 25%, AMB đủ khả năng phá vỡ
màng phospholipid kép và chen vào màng làm phá vỡ cấu trúc liposome. Mặt khác,

3


AMB cố định phospholipid bằng cách đan xen vào lớp phospholipid kiểu ngón tay

đan vào nhau. Phần polyen thân dầu của phân tử AMB liên kết với chuỗi hydrocacbon
của lipid, phần thân nước chứa các nhóm hydroxyl hướng về phía lõi, gốc phosphat
của phân tử lipid hướng về phía nhóm amin của phân tử AMB, hình thành một hình
trụ tròn. Các hình trụ tròn xếp cạnh nhau hình thành phức hợp lipid AMB có hình dải
ruy băng [19].
1.2.2. Tá dược tạo phức
Phospholipid sử dụng để chế tạo phức hợp lipid bao gồm: phosphatidylcholin,
phosphatidylglucerol,

phosphatidylethanolamin,

phosphatidylserin,

phosphatidylinositol, acid phosphatidic, sphingomyelin, có thể sử dụng đơn độc hoặc
phối hợp. Các phospholipid có thể là phospholipid tự nhiên hoặc chiết xuất từ tự nhiên
như từ trứng, đậu nành. Đại diện tốt nhất là hỗn hợp DMPC và DMPG với tỷ lệ mol
tương ứng DMPC : DMPG  7 : 3 . Các phospholipid bão hòa như là HSPC có thể sử
dụng. HSPC cũng được dùng phối hợp với DSPG và tốt nhất ở tỉ lệ mol
HSPC: DSPG  7 : 3 [19].

Hình 1.2. Phân tử HSPC và DSPG
Một số ưu điểm của HSPC: bền về hóa học hơn so với phosphatidylcholin đậu
nành chưa hydrogen hóa do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo
chưa no, giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ dược chất [18].
DSPG đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành của phức hợp lipid
AMB theo cơ chế sau: ở pH trung tính, DSPG có một nhóm phosphat bị ion hóa do
đó, phân tử tích điện âm. Khi AMB được phân tán trong dung môi được acid hóa, các
proton trong môi trường sẽ có xu hướng chuyển giao cho các nhóm amin của AMB.
Kết quả là các phân tử AMB tích điện dương. Do đó sự tích điện trái dấu, các phân


4


tử hút nhau, các nhóm tích điện trái dấu của chúng tạo thành một cặp ion. Như vậy,
sự hấp dẫn phân tử giữa AMB và phân tử DSPG được tăng lên rất nhiều. Các chuỗi
hydrocacbon béo của các phospholipid bị thu hút bởi tương tác kị nước vào chuỗi dài
của liên kết đôi không có nhóm thế của polyen [23].
Sự khác biệt trong tương tác giữa AMB và DPPC với sự có mặt của K+ và Na+
có thể ảnh hưởng bởi tác động khác nhau của các ion này lên cách sắp xếp phân tử
dược chất. Những tác động này có thể liên quan tới sự khác nhau về kích thước ion.
Độ mạnh của những tương tác này yếu hơn rõ ràng đối với lớp đơn hỗn hợp phân tán
trong môi trường Na+. Sự hiện diện của ion K+ có thể là một yếu tố quan trọng trong
việc tạo điều kiện thuận lợi cho sự tương tác giữa các phân tử với các màng lipid và
tăng hiệu quả vận chuyển qua màng tế bào của các ion này mà không có sự tương tác
với các sterol. So sánh năng lượng tự do phụ thuộc hàm lượng AMB với sự có mặt
của K+ và Na+ cho thấy độ ổn định cao hơn của các lớp đơn phân tử trong môi trường
có ion K+. Theo hướng đi của bàn luận này, dường như ion K+ liên kết hiệu quả với
AMB hơn ion Na+, do ion K+ có liên kết với nhóm -COO- của AMB mạnh hơn so
với Na+ [8].
1.2.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB
Các nghiên cứu ở nước ngoài
Janoff và cộng sự (1988) đã nghiên cứu về cấu trúc của phức hợp lipid có tỉ lệ mol
DMPC : DMPG = 7 : 3 cố định nhưng thay đổi tỉ lệ mol AMB/lipid. Kết quả cho thấy
với tỉ lệ mol AMB < 5%, cấu trúc pha gel của phospholipid ở 20oC sẽ bị sang pha tinh
thể lỏng ở nhiệt độ 25oC. Nhưng với tỉ lệ mol AMB 25% và 50%, phức hợp lipid không
có nhiệt chuyển pha ở 40oC [20].
Janoff và cộng sự (2002) cũng đã tiến hành bào chế phức hợp lipid AMB bằng
phương pháp hydrat hóa film. Dung môi hòa tan dược chất được sử dụng là DMSO
hoặc methanol. Lipid sử dụng là DMPC và DMPG với tỉ lệ mol là 7 : 3. Dung dịch
hydrat hóa film là đệm phosphat, hoặc dung dịch muối hoặc dung dịch đệm glycin.

Bằng phương pháp này, tỉ lệ phần trăm mol dược chất/lipid để tạo phức hợp là từ 6 –
50%, tốt nhất là từ 30 – 50%. Máy nghiền keo đã được sử dụng trong khoảng 30 phút

5


để làm giảm kích thước tiểu phân. Để chọn lựa các tiểu phân trong khoảng tối ưu, tác
giả dùng phương pháp lọc tiếp tuyến với hai cỡ lỗ lọc khác nhau, lần đầu lọc với
màng tiếp tuyến có kích cỡ lỗ lọc 5 µm, dịch lọc lại tiếp tục lọc qua màng lọc tiếp
tuyến có kích cỡ 2 µm [21].
Larabi và cộng sự (2004) đã bào chế phức hợp lipid chứa AMB bằng phương
pháp bốc hơi dung môi pha đảo, sử dụng hai lipid DMPC và DMPG. Tỉ lệ mol các
thành phần AMB: DMPC : DMPG  5: 7 : 3 , tương tự như thành phần của Abelcet.
AMB được hòa tan trong methanol sau đó cho vào dung dịch DMHC chứa lipid đã
được hòa tan. Thêm nước tinh khiết và khuấy từ ở nhiệt độ phòng. Cô áp suất giảm
loại dung môi thu được phức hợp lipid. Soi kính hiển vi điện tử cho thấy cấu trúc hình
đĩa mỏng, khác với chế phẩm Abelcet có cấu trúc dạng chuỗi dài [22].
Các nghiên cứu trong nước
Nguyễn Thị Mỹ (2014) đã nghiên cứu bào chế phức hợp lipid AMB có tỉ lệ
mol HSPC: DSPG  7 : 3 , môi trường phân tán (MTPT) là đệm phosphat pH 7,4, tỉ lệ
mol dược chất/lipid là 25% cho hiệu suất tạo phức hợp cao (87,06%), kích thước tiểu
phân là 648,3 nm, phân bố KTTP tương đối đồng đều (PDI = 0,363). Tác giả cũng
nghiên cứu sơ bộ tính ổn định của phức hợp lipid AMB, theo dõi một số công thức
trong thời gian 3 tuần bảo quản ở điều kiện 2 – 8oC. Kết quả là các tiểu phân trong
phức hợp có xu hướng kết tụ với nhau tạo các tiểu phân lớn hơn, phân bố KTTP kém
tập trung hơn [4].
Dương Thị Thuấn (2016) đã phát triển tiếp hướng nghiên cứu của Nguyễn Thị
Mỹ, xây dựng được phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB là tiêm polyol, MTPT
là natri clorid 0,9%, dung môi hòa tan dược chất là ethanol, tỉ lệ mol dược chất/lipid
là 100%. Đồng thời tác giả cũng đã nghiên cứu một số phương pháp làm giảm KTTP

của hỗn dịch lipid AMB. Trong đó, phương pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao (5000
psi) kết hợp đùn qua màng polycarbonat 0,8 μm 100 lần cho kết quả tốt nhất về KTTP
và phân bố KTTP. Phức hợp tạo thành có kích thước < 5 μm với chỉ số phân bố tiểu
phân span < 2. Tuy nhiên phương pháp này tốn kém thời gian và không áp dụng được
trên quy mô lớn [6].

6


Phạm Thị Lê Na (2016) đã nghiên cứu phương pháp bào chế hỗn dịch phức
hợp lipid AMB theo phương pháp vi dòng chảy. Kết quả cho thấy phương pháp này
tiết kiệm thời gian hơn so với phương pháp tiêm polyol, phức hợp thô tạo ra có kích
thước 20,1 μm, chỉ số phân bố tiểu phân span < 1 [5].
Trong các nghiên cứu trên chưa có công trình nào nghiên cứu các biện pháp
làm giảm KTTP để đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm một cách khả thi và cũng chưa nghiên
cứu nào tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý của hỗn dịch phức hợp
lipid AMB.
1.3.

Sự ổn định KTTP của hỗn dịch
Những thuốc không tan trong nước phân tán tạo thành hệ phân tán kị dung

môi. Bởi vì năng lượng bề mặt cao nên chúng kém bền về mặt động học và có xu
hướng kết tụ. Trong hệ phân tán của các hạt mịn trong chất lỏng (hoặc của hạt mịn
trong khí) thường xuyên xảy ra tương tác do:
-

Chuyển động Brown.

-


Tạo kem hoặc đóng bánh.

-

Sự đối lưu [12].
Theo định luật Stokes, tốc độ sa lắng (hoặc tạo kem), v, của một hạt hình cầu

2ga 2 .(1  2 )
trong một lượng chất lỏng, độ nhớt η, được cho bởi [12], [13]: v 
9
Trong đó: a là bán kính hạt, ρ1: tỷ trọng của các hạt, ρ2: tỷ trọng của môi trường, g:
hằng số hấp dẫn.
Sự tạo kem của hệ nhũ tương hoặc sự sa lắng của hỗn dịch có thể giảm thiểu
bằng nhiều cách:
-

Giảm kích thước tiểu phân (giảm a).

-

Tăng độ nhớt của pha liên tục (tăng η).

-

Cân bằng tỷ trọng hai pha (lý tưởng là ρ1 = ρ2).
Khi các tiểu phân tiến đến gần nhau, sự va chạm có thể dẫn đến liên kết bền

chặt của tiểu phân rắn hoặc sự hợp nhất của các giọt chất lỏng. Từ đó hệ keo sẽ phá
hủy chính nó thông qua sự phát triển của pha phân tán và tăng cường tạo kem hoặc


7


sa lắng của những tiểu phân lớn. Những va chạm sẽ dẫn đến liên kết bền chặt hoặc
các tiểu phân tự phục hồi và duy trì trạng thái tự do phụ thuộc vào lực tương tác giữa
các tiểu phân (cả lực hút và đẩy) và bản chất bề mặt tiểu phân [13].
Cân bằng tỷ trọng hai pha hiển nhiên là phương pháp đơn giản nhất làm chậm
lại sự sa lắng, thể hiện rõ trong công thức: nếu ρ1 = ρ2, v = 0. Tuy nhiên, phương pháp
này chỉ sử dụng giới hạn trong một số trường hợp và chỉ có thể áp dụng đối với hệ
mà sự khác biệt tỷ trọng không nhiều. Ví dụ, với nhiều chất rắn hữu cơ có tỷ trọng
1,1 – 1,3 phân tán trong nước, một số hợp chất như đường hay glycerol có thể được
hòa tan trong MTPT để làm tăng tỷ trọng đến mức mong muốn [28].
1.3.1. DLVO lý thuyết về sự ổn định hệ keo
Lực tương tác giữa các hạt keo bao gồm: lực Van der Waals (lực hút), lực tĩnh
điện (lực đẩy), lực Born – chủ yếu là tầm ngắn (lực đẩy), lực steric (lực đẩy) do các
phân tử hấp phụ (đặc biệt là các đại phân tử) tại bề mặt hạt, lực solvat (lực đẩy) do
giảm hydrat hóa các phân tử khi tiến đến gần nhau.
Sự nghiên cứu lực đẩy tĩnh điện và lực hút van der Waals của Deryagin,
Landau, Verwey và Overbeek (DLVO) đã dẫn đến một lý thuyết về sự ổn định của
hệ thống treo kị nước. Thuyết DLVO nghiên cứu hai hạt hình cầu bán kính a, cách
nhau khoảng cách H.
Trong lý thuyết này:
-

Sự kết hợp của lực đẩy (VR) mang giá trị dương với lực hấp dẫn (VA) mang giá
trị âm cho tổng thế năng tương tác: Vtổng = VA + VR.

-


Lực hấp dẫn phát sinh từ lực van der Waals giữa các hạt cùng loại. Khi kích thước
các hạt này tương đối lớn so với khoảng cách giữa chúng, lực hấp dẫn được viết
như sau: VA  

-

Aa
(A là hằng số Hamaker).
12H

Lực đẩy phát sinh từ sự tích điện trên bề mặt các hạt, là do sự ion hóa bề mặt hoặc
sự hấp phụ các ion: Bề mặt tiểu phân có điện tích âm hấp phụ một lớp ion dương
lên bề mặt của nó trong lớp Stern, hình thành một lớp khuếch tán hoặc lớp điện
kép, chứa cả các ion dương và âm. Lực tĩnh điện phát sinh từ sự tương tác của các

8


lớp điện kép bao quanh các hạt lơ lửng trong hỗn dịch, gây ra lực đẩy nếu các hạt
có cùng điện tích dương hay âm bề mặt.
Phương trình gần đúng cho VR khi điện thế bề mặt nhỏ và giá trị κ nhỏ là:

VR  0 a2 exp(H) . Trong đó: ε0 là hằng số điện môi của chân không, ε là
hằng số điện môi,   là thế Stern (có giá trị xấp xỉ thế zeta), 1/κ là chiều dài
Debye – Hückel [12].

Hình 1.3. Biểu đồ DLVO điển hình
Hình dạng của đường cong V – H được minh họa hình trên, chỉ ra ba điểm
quan trọng: một cực đại sơ cấp, một cực tiểu sơ cấp và một cực tiểu thứ cấp.
Tại khoảng cách H nhỏ, độ sâu của cực tiểu sơ cấp tăng khi giá trị tuyệt đối

của VA tăng nhiều hơn VR. Khi khoảng cách giữa các tiểu phân đạt đến phạm vi này,
chúng sẽ kết tụ và không thể tách rời nhau.
Tại khoảng cách H trung bình, giá trị tuyệt đối của VR lớn hơn nhiều VA, kết
quả là hình thành đại Vmax. Độ lớn của Vmax phụ thuộc vào thế zeta, nồng độ chất điện
ly và bán kính hạt. Nếu cực đại sơ cấp quá nhỏ, tương tác giữa hai tiểu phân có thể
đạt được cực tiểu sơ cấp, kết quả là các tiểu phân trong hỗn dịch kết tụ nhanh chóng

9


và không phân tán đều trở lại được. Ngược lại, nếu cực đại sơ cấp cao đáng kể (cao
gấp hàng chục lần năng lượng chuyển động nhiệt kT, k là hằng số Boltzmann, T là
nhiệt độ), hai tiểu phân không thể tiếp xúc gần lại. Khi đó hỗn dịch bền về mặt động
học.
Tại khoảng cách H xa, VR là một hàm mũ, giảm nhanh hơn so với sự giảm VA,
dẫn đến hình thành một cực tiểu thứ cấp. Độ sâu của cực tiểu thứ cấp tăng theo sự
tăng bán kính tiểu phân và hệ số Hamaker của hỗn hợp. Độ sâu của cực thiểu thứ cấp
có vai trò quan trọng, quyết định sự ổn định của hệ thống. Nếu cực tiểu thứ cấp nhỏ
hơn năng lượng chuyển động nhiệt kT, các hạt tiểu phân sẽ luôn đẩy nhau [12],
[13],[27]. Ngược lại, hỗn dịch có thể kết bông [28].
1.3.2. Sự ổn định tĩnh điện – cơ chế ổn định electrostatic

Hình 1.4. Ảnh hưởng trên biểu đồ DLVO khi:
A. Thêm chất điện ly đến nồng độ thấp
B. Thêm chất điện ly đến nồng độ trung bình
C. Thêm chất điện ly đến nồng độ cao
Hình 1.4 cho thấy tác động của chất điện ly đến một biểu đồ DLVO điển hình.
Những thay đổi trong biểu đồ phát sinh do sự nén lại của lớp điện tích kép bởi nồng
độ chất điện ly tăng, dẫn đến tăng κ, vì vậy giảm 1/ κ.
Đường cong A: Ở nồng độ chất điện ly thấp, vùng điện kép lớn và VR mở rộng

đến khoảng cách xa hơn giữa hai tiểu phân. Tổng của VR và VA hình thành đường
cong năng lượng tổng cộng có một cực đại sơ cấp cao nhưng không có cực tiểu thứ
cấp.
10


Đường cong B: Sự gia tăng lớp điện kép khi có nhiều chất điện ly thêm vào
dẫn đến sự suy yếu của VR và kết quả là một cực đại sơ cấp nhỏ, nhưng quan trọng
hơn là một cực tiểu sơ cấp. Nồng độ này của chất điện ly sẽ hình thành một hỗn dịch
ổn định do xảy ra sự kết bông tại cực tiểu thứ cấp [13] và nếu cực đại sơ cấp lớn hơn
nhiều năng lượng chuyển động nhiệt, các tiểu phân sẽ không kết tụ tại cực tiểu sơ cấp
[7].
Đường cong C: Ở nồng độ chất điện ly cao, vùng giá trị VR sẽ bé đến mức lực
hút Van der Waals chi phối hình dạng của đường cong năng lượng. Đường cong sẽ
không có cực đại sơ cấp hay cực tiểu thứ cấp [13].

Hình 1.5. Quá trình chuyển đổi từ dạng “hỗn loạn” sang dạng ổn định của hỗn dịch
latex theo cơ chế tĩnh điện
Nồng độ và loại chất điện ly quyết định sự mở rộng của lớp điện kép và ảnh
hưởng đến độ ổn định của hỗn dịch. Trong ví dụ ở hình 1.5, hỗn dịch latex đã sulphat
hóa, sau khi thẩm tách hoặc trao đổi ion để loại đi hầu hết các ion, chuyển thành dạng
sắp xếp ổn định do có lực đẩy tĩnh điện tầm xa giữa các tiểu phân. Điều này chỉ ra
rằng các hạt latex tích điện có thể tương tác mạnh từ khoảng cách xa gấp nhiều lần

11


kích thước của chúng theo cơ chế ổn định tĩnh điện. Như vậy, sự loại bỏ hoặc thêm
chất điện ly có thể ứng dụng để kiểm soát độ ổn định của một hỗn dịch [27].
Ngoài ra, nồng độ điện tích còn ảnh hưởng đến KTTP. Theo một nghiên cứu

của Amro M. El Badawy và các cộng sự, sự tăng lực ion làm tăng KTTP của H 2AgNPs. Theo thuyết về lớp điện kép, sự giảm độ dày của lớp điện kép kèm theo sự
tăng lực ion. Điều này làm tăng tương tác giữa các tiểu phân, dẫn đến tăng mức độ
tập hợp và tiểu phân sa lắng. Đối với các mẫu hỗn dịch khác, sự tăng nồng độ NaNO3
từ 10 mM đến 100 mM đều làm tăng KTTP, trừ tại một số điểm pH xác định, giá trị
KTTP không khác biệt nhau nhiều [9]. Trong một nghiên cứu khác của J. Sabin và
các cộng sự (2006) đã chỉ ra rằng nồng độ ion Na+ và K+ tác động lên KTTP của
liposome phosphatidylcholin trong lòng đỏ trứng gà. Tại nồng độ thấp của các ion
này, các tác giả quan sát thấy sự giảm đường kính liposome. Điều này có thể giải
thích do chênh lệch gradient nồng độ ở hai bên màng sinh ra áp lực thẩm thấu và bởi
vì màng không thấm một vài ion, liposome tương tác loại bớt các phân tử nước, làm
giảm kích thước [24].
Có khi định luật DLVO không thể áp dụng để giải thích sự ổn định của
liposome. Nếu liposome bền vững ngay cả khi không có lực đẩy electrostatic, điều
đó có nghĩa là một lực khác có vai trò giữ các tiểu phân đủ xa để tránh được lực hút
van der Waals. Lực này có thể là lực hydrat hóa [24].
1.3.3. Sự ổn định bởi lực đẩy giữa các bề mặt hydrat hóa – cơ chế ổn định steric

Hình 1.6. Cơ chế ổn định steric [25]

12


Ngoài lực đẩy tĩnh điện, chất keo cũng có thể ổn định bởi lực đẩy hình thành
từ sự hấp thu phân tử lớn và chất diện hoạt lên bề mặt của chúng. Trong các dung
dịch nước các phân tử hấp phụ sẽ được ngậm nước.
Sự ổn định hình thành do 3 tác động:
 Ảnh hưởng entropy: Sự tiếp cận của hai tiểu phân được hấp phụ chuỗi chất ổn định
dẫn đến tương tác steric khi các chuỗi tương tác với nhau. Hiệu ứng steric không xuất
hiện cho đến khi H = 2  , vì vậy tương tác tăng đột biến cùng với sự giảm khoảng
cách. Sự cố định cấu trúc dẫn đến sự thay đổi entropy âm ( S ). Mỗi chuỗi bị cố

định cấu trúc một phần, góp phần làm tăng năng lượng tự do của hệ, dẫn đến lực đẩy.
Hiệu ứng steric phụ thuộc vào: (1) chiều dài của chuỗi phân tử hấp thụ. (2) tương tác
của dung môi với chuỗi; và (3) số lượng chuỗi trên một đơn vị diện tích bề mặt tương
tác.
 Thẩm thấu: Hiệu ứng thẩm thấu xuất hiện khi chuỗi đại phân tử trên tiểu phân kế
bên lấn vào không gian của nhau làm tăng nồng độ của chuỗi trong các khu vực đan
xen. Lực đẩy xuất hiện do áp lực thẩm thấu của dung môi có xu hướng pha loãng nơi
có nồng độ cao: điều này chỉ có thể đạt được khi tiểu phân di chuyển ra ngoài.
 Ổn định enthalpy: Trong sự tiếp cận gần của các tiểu phân, phân tử nước hydrat
hóa hấp phụ trên bề mặt phân tử được tách ra, gây ra sự tăng enthalpy dẫn đến hình
thành lực đẩy [13].
1.3.4. Sự ổn định bởi phân tử polyme tự do – cơ chế ổn định depletion

Hình 1.7. Cơ chế ổn định depletion
13


Sự ổn định depletion của tiểu phân keo được tạo bởi đại phân tử tự do trong
dung dịch [25]. Hầu hết các thuyết về sự tạo tủa bông depletion đều dựa vào mô hình
của Asakura và Oosawa. Theo mô hình này, khi hai tiểu phân tiến đến gần nhau với
một khoảng cách nhỏ hơn đường kính của polyme tự do, sự loại bỏ các phân tử
polyme khỏi khe hở giữa các tiểu phân dẫn đến sự hình thành vùng không có polyme.
Từ đó hình thành lực hấp dẫn liên quan đến việc giảm áp suất thẩm thấu trong vùng
giữa các tiểu phân. Tại tỷ lệ polyme tự do thích hợp, hỗn dịch xảy ra hiện tượng tủa
bông [26].
1.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ tiểu phân đến độ ổn định
Một hỗn dịch có thể được coi là loãng nếu chuyển động nhiệt của các hạt chiếm
ưu thế hơn so với ảnh hưởng của lực tương tác giữa các tiểu phân. Chuyển động
chuyển dịch của tiểu phân (thường được xem là chuyển động Brown) rộng và trong
các hỗn dịch như vậy chỉ xảy ra va chạm không thường xuyên giữa các tiểu phân, có

nghĩa là các tiểu phân không “nhìn thấy nhau” cho đến khi một va chạm xảy ra. Nói
theo cách khác, trong một hỗn dịch loãng, khoảng cách trung bình giữa các tiểu phân
lớn hơn nhiều so với phạm vi của lực tương tác. Trong trường hợp này, tương tác
giữa các tiểu phân có thể được đại diện bởi va chạm giữa hai tiểu phân. Giả định rằng
lực hấp dẫn có thể bỏ qua, có nghĩa là các tiểu phân không sa lắng, đặc tính của hệ
pha loãng phần lớn không phụ thuộc vào thời gian [27].
Khi nồng độ của tiểu phân trong hỗn dịch tăng, khả năng tương tác giữa các
tiểu phân tăng và lực tương tác giữa chúng đóng một vai trò quan trọng trong việc
quyết định đặc tính của hệ. Cùng với việc tăng nhiều hơn nữa nồng độ tiểu phân, lực
đẩy tạo ra sự sắp xếp trật tự các tiểu phân, đến mức đạt được một cấu trúc được tổ
chức cao. Trong trường hợp này, bất cứ tiểu phân nào trong hệ cũng có tương tác với
những tiểu phân xung quanh và biên độ dao động nhỏ so với kích thước của nó. Như
trong trường hợp của hỗn dịch loãng, đặc tính của những hỗn dịch đặc này không phụ
thuộc nhiều vào thời gian [27]. Ngoài ra, hỗn dịch đặc kết bông có độ nhớt cao ở
trạng thái tĩnh, do có lực hấp dẫn cao [7].

14


Khi xảy ra quá trình kết bông, các tiểu phân có cấu trúc lỏng lẻo trong toàn hệ
thống. Tình huống như vậy có tầm quan trọng thực tiễn và xảy ra với nhiều hỗn dịch
đặc. Bằng cách lắc bình chứa, cấu trúc kết bông này dễ dàng bị phá vỡ và hình thành
hệ hỗn dịch đồng nhất. Hiểu theo cách khác, dạng kết bông ngăn cản sự sa lắng. Bởi
vì sự kết bông phụ thuộc vào nồng độ tiểu phân trong hệ, sự hình thành cấu trúc này
xảy ra dễ dàng tại nồng độ chất rắn cao hơn. Thêm vào đó, hỗn dịch loãng thường
xảy ra sự “chống kết bông” tự phát, do cả nồng độ chất điện ly và nồng độ tiểu phân
giảm đến mức mà không thể xảy ra sự kết bông [28].
1.3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ ổn định
Sự ổn định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số PDI, sự tích
điện bề mặt. Trong quá trình bảo quản, có thể xảy ra kết tụ các tiểu phân phức hợp

lipid [3]. Độ nhớt cao ngăn cản sự kết hợp của các lớp màng sau khi các tiểu phân va
chạm. Độ nhớt là một yếu tố phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng lên, độ nhớt
giảm, dẫn đến sự mất ổn định của các tiểu phân [10].
Tính thấm của phức hợp lipid cũng giống như liposome phụ thuộc vào nhiều
yếu tố: loại phospholipid, hàm lượng và tính chất của dược chất cũng như điều kiện
bảo quản. Trong đó, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sắp xếp của các tá dược trên
màng. Sự tăng nhiệt độ có thể khiến màng lipid có cấu trúc lỏng lẻo hơn, dẫn đến sự
rò rỉ dược chất, kết tập các hạt và tăng KTTP [10]. Như vậy, bảo quản ở nhiệt độ thấp
làm cho phospholipid ổn định hơn và kéo dài được tuổi thọ của chế phẩm [3].
1.3.7. Ảnh hưởng của KTTP tới độ ổn định
Kiểm soát KTTP có vai trò rất quan trọng đối với độ ổn định của hỗn dịch.
Làm giảm KTTP là cần thiết để ngăn cản sự sa lắng. Ngoài ra, KTTP cũng có những
tác động khác đến độ ổn định. Đối với hỗn dịch đặc, tương tác tiểu phân – tiểu phân
lớn đáng kể, điều này có thể làm tăng độ nhớt của hỗn dịch. Các tiểu phân nhỏ có tác
động lớn hơn đối với sự tăng độ nhớt của hệ bởi vì chúng có tổng diện tích bề mặt
lớn hơn các tiểu phân lớn. Sự phân bố KTTP cũng đóng một vai trò quan trọng trong
việc quyết định độ nhớt của hỗn dịch. Hỗn dịch có phân bố KTTP rộng cho độ nhớt
thấp hơn với hỗn dịch có phân bố KTTP hẹp [7].

15


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
-

Đối tượng nghiên cứu: phức hợp lipid AMB

-


Nguyên liệu:
Bảng 2.1. Nguyên liệu

-

STT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1

AMB

Trung Quốc

USP 32

2

Acid hydrochlorid đặc

Trung Quốc

BP 2013

3


Chloroform

Trung Quốc

DĐVN IV

4

Ethanol

Trung Quốc

DĐVN IV

5

HSPC

Lipoid – Đức

NSX

6

DSPG

Lipoid – Đức

NSX


7

Methanol

Trung Quốc

DĐVN IV

8

Natri chlorid 0,9%

Việt Nam

DĐVN IV

9

Glucose

Việt Nam

DĐVN IV

10

Kali chlorid

Trung Quốc


TKHH

11

Kali dihydrophosphat

Trung Quốc

TKHH

12

Natri hydroxyd

Trung Quốc

TKHH

13

DMSO

Jansen – Đức

BP 2013

14

Nước tinh khiết


Việt Nam

DĐVN IV

Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu:
+ Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi, Đức), bình cầu NS 29/32, dung
tích 1000 ml (Buchi, Đức).
+ Hệ thống phân tích kích thước Mastersizer 3000E (Malvern, Anh).
+ Máy đồng nhất áp suất cao EmulsiFlex – C5 (Avestin, Canada).
+ Hệ thống lọc tiếp tuyến (LTT) Sartoflow Slice 200 Benchtop, màng
polysulfon 30 kD (Sartorius, Đức).
+ Máy đồng nhất kết hợp đùn qua màng LiposoFast LF 50 (Avestin, Canada).
16