-1-

Mở đầu
Một trong những loài cây đã đ-ợc dẫn nhập vào trồng thành công ở Việt
Nam là Thông caribê (Pinus caribaea Morelet), Thông caribê gồm ba biến chủng
là Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis và Pinus caribaea
var bahamensis đều có phân bố tự nhiên ở vùng Trung Mỹ [27].
Đây là loài cây gỗ lớn, có thể cung cấp gỗ làm nguyên liệu để sản xuất bột
giấy, ván nhân tạo và đồ gia dụng. Là loài cây có sinh tr-ởng nhanh, cành nhánh
nhỏ, thân thẳng đẹp, tỷ lệ lợi dụng gỗ cao đáp ứng được nhiều mục tiêu kinh tế,
nên đến nay đã có trên 65 n-ớc nhập giống gây trồng, chủ yếu là các n-ớc thuộc
vùng nhiệt đới và á nhiệt đới [9].
Thông caribê đ-ợc nhập vào trồng thử nghiệm ở n-ớc ta năm 1963 tại Lâm
Đồng [9], qua các khảo nghiệm và rừng trồng thử nghiệm cho thấy Thông caribê
tỏ ra là loài cây có sức sinh tr-ởng nhanh, thích ứng rộng với nhiều vùng sinh thái.
Kết quả nhiều nơi cho thấy rừng sinh tr-ởng khá tốt và Thông caribê có khả năng
thích ứng lớn với môi tr-ờng. Đặc biệt Thông caribê có thể sinh tr-ởng đ-ợc trên
các vùng đất trống, đồi trọc nghèo dinh d-ỡng, một bộ phận đất đai rất lớn ở n-ớc
ta [2], [3].
Những dấu hiệu đó cho thấy Thông caribê là một trong số những loài cây
trồng rừng có triển vọng cung cấp gỗ nhỡ, gỗ lớn, gỗ nguyên liệu giấy cho nền
kinh tế quốc dân và đồng thời sớm nâng cao độ che phủ của rừng góp phần ổn định
môi tr-ờng sinh thái và đang đ-ợc nhiều cơ quan nghiên cứu, nhiều cơ sở sản xuất
hết sức quan tâm.
ở Việt Nam các loài thông đ-ợc trồng chủ yếu hiện nay là Thông ba lá
(Pinus kesiya), Thông nhựa (Pinus merkusii), Thông đuôi ngựa (Pinus masoniana)
và gần đây là Thông caribê (Pinus caribaeea) với các biến chủng khác nhau [11].
Nhìn chung trong các loài thông này, Thông caribê là loài thông có sinh tr-ởng
nhanh, thân cây thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ hơn Thông ba lá và Thông đuôi ngựa,
có tỷ lệ gỗ sử dụng cao nên đ-ợc -a thích gây trồng. Với đặc điểm sinh lý, sinh thái

-2-

và giá trị kinh tế của Thông caribê, trong ch-ơng trình trồng mới 5 triệu hecta rừng
hiện nay, Thông caribê đã đ-ợc chọn là một trong những cây trồng chính quan
trọng cần đ-ợc -u tiên phát triển.
Tuy nhiên sự ra hoa kết quả của Thông caribê ở Việt Nam từ nhiều năm
tr-ớc đây có một số vấn đề. Trên cơ sở theo dõi vật hậu các lâm phần Thông caribê
trong cả n-ớc và số liệu điều tra các nguồn giống, có thể thấy là khả năng cung ứng
giống Thông caribê ở Việt Nam ch-a đủ đáp ứng nhu cầu trồng rừng trong n-ớc.
Tình trạng thiếu giống hiện nay là do một số nguyên nhân. Nguyên nhân tạo ra
biến động về năng suất và chất l-ợng hạt giống Thông caribê ở Việt Nam là do một
số lâm phần có diện tích lớn mới bắt đầu đến tuổi thành thục và cho hạt hữu thụ
nh- ở Uông Bí (Quảng Ninh), H-ơng Sơn (Hà Tĩnh). Ngoài ra năng lực sản xuất
hạt giống của các lâm phần Thông caribê ở Việt Nam ch-a đ-ơc tận dụng hết để
đáp ứng nhu cầu giống trong n-ớc [1]. Nhiều khu rừng trồng thông không ra hoa
kết quả hoặc chỉ ra quả mà không có hạt hữu thụ hoặc số hạt hữu thụ rất ít, không
đủ hạt giống cung cấp cho trồng rừng. Trong khi khả năng cung cấp hạt của Thông
caribê ch-a đủ, giá thành hạt nhập ngoại đắt, nhân giống vô tính thông có vai trò
quan trọng trong việc phát triển cây giống để cung cấp cho trồng rừng.
Ngày nay, kỹ thuật nhân giống cây trồng đã có những b-ớc phát triển v-ợt
bậc, bằng công nghệ nhân giống vô tính có thể tạo ra một số l-ợng lớn cây giống
mang bản chất di truyền giống hệt cây mẹ trong một thời gian ngắn. Trên thế giới
công nghệ nhân giống vô tính thông bao gồm kỹ thuật nuôi cấy in vitro (nuôi cấy
mô tế bào) và kỹ thuật nhân giống hom, chiết, ghép trong đó nuôi cấy in vitro và
giâm hom ngày càng đóng vai trò chủ đạo. Lần đầu tiên năm 1976, những thực
nghiệm về nhân giống hom với một số loài thông nhiệt đới đã đ-ợc tiến hành tại
Trung tâm nghiên cứu cây có sợi (nay là Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy) ở
mức là những nghiên cứu rất sơ khai và đã đạt đ-ợc một số kết quả. Trung tâm
nghiên cứu giống cây rừng ( Viện KHLN ) cũng đã thử nghiệm giâm hom một số

loài thông và đã thành công b-ớc đầu với cây thông lai và cây Thông Caribê. Tuy
nhiên Thông caribê lại là loài khi nhân giống bằng ph-ơng pháp giâm hom trực tiếp


-3-

từ cây trội không phải luôn đạt đ-ợc kết quả. Khi giâm hom cho loài thông này từ
cây non ở v-ờn cấp hom thì dễ thành công hơn [8]. Nh- vậy giâm hom thông ở
Việt Nam kết quả ch-a cao, ch-a thể đ-a vào sản xuất quy mô lớn. Hiện nay nuôi
cấy in vitro đã đ-ợc áp dụng trong một số n-ớc có nền lâm nghiệp phát triển và đã
đ-ợc thực hiện ở quy mô công nghiệp. Nuôi cấy mô tế bào là một kỹ thuật tiên tiến
trong nhân giống cây trồng, đặc biệt đối với các cây thân gỗ nh- cây ăn quả và cây
lâm nghiệp. Nuôi cấy mô tế bào có nhiều -u việt hơn hẳn các ph-ơng pháp nhân
giống khác: cho hệ số nhân giống cao, từ một cây mẹ -u việt ban đầu có thể tạo ra
hàng triệu cây đã đ-ợc làm trẻ hoá và sạch bệnh Cây ưu việt đượctrẻ hoá qua
nuôi cấy mô là nguồn vật liệu lý t-ởng để cung cấp hom giống cho nhân giống
bằng giâm hom. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài:
Nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet)
bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
Đối t-ợng nghiên cứu là loài Thông caribê (Pinus caribaea var hondrensis),
loài thông này là một trong 3 biến chủng của Thông caribê có nhiều triển vọng ở
Việt Nam.


-4-

Ch-ơng 1
Tổng quan tàI liệu
1.1. Một số kết quả ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro thực vật trong sản

xuất nông lâm nghiệp
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào hay vi nhân giống là tên gọi chung cho
các ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ đ-ợc tách khỏi cây
(George, 1993) đang đ-ợc dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây
lâm nghiệp. Các bộ phận đ-ợc dùng để nuôi cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi
bất định, bao phấn, phấn hoa, phôi và các bộ phận khác nh- vỏ cây, lá non, thân
mầm [18], [19].
Nhờ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô vào nhân giống, ng-ời ta đã tạo ra hàng
loạt cây con đồng nhất về kiểu gen với số l-ợng lớn mà các ph-ơng pháp nhân
giống vô tính thông th-ờng khác không thể có đ-ợc. Nuôi cấy mô có -u thế hơn
các ph-ơng pháp nhân giống vô tính khác là có tỷ lệ nhân giống cao, tới hàng triệu
cây mỗi năm. Ngoài ra có thể áp dụng nhiều biện pháp xử lý lên nuôi cấy in vitro
hơn là các ph-ơng pháp khác. Cây giống tạo ra bằng ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro
vừa khoẻ, trẻ sinh lý và có thể sạch virus ngay cả khi mẫu lấy từ đỉnh sinh tr-ởng
của những cây đã nhiễm virus.
Năm 1960, Morell đã nhận thấy mô phân sinh của địa lan và phong lan có rất
ít hoặc không có virus, từ đó ông phát hiện ra khả năng nhân nhanh cây sạch bệnh
của các giống này. Chỉ sau một năm, ông thu đ-ợc 4 triệu cây đồng nhất về mặt di
truyền từ một chồi lan ban đầu [22]. Sau đó Morell và cộng sự đã phục tráng giống
khoai tây bằng cách dùng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh và đã tạo ra đ-ợc những
cây khoai tây không chứa virus (1968) [22].
Theo Murashige (1974) có khoảng 300 loài cây có thể nhân giống bằng
ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro) [33]. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã đ-ợc hơn 600 công
ty trên thế giới áp dụng để nhân hàng triệu cây giống hàng năm, trong đó chủ yếu


-5-

là nhân giống cây hoa, cây cảnh, cây ăn quả, cây công nghiệp và một số cây rau
(Vasin, 1994) [21]. Nhu cầu cây giống in vitro ngày càng nhiều, mấy năm gần đây

hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây các loại, -ớc tính phải đạt 250
triệu cây/năm mới đáp ứng đ-ợc yêu cầu thực tiễn [19].
Dự kiến thị tr-ờng cây giống đ-ợc nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy mô vào
khoảng 15 tỷ USD/năm và tốc độ tăng tr-ởng hàng năm của thị tr-ờng là khoảng
15% (Govil và Gupta, 1997) [21]. Thái Lan mỗi năm xuất khẩu hoa thu khoảng 20
triệu USD, trong đó phần lớn là hoa đ-ợc nhân giống bằng nuôi cấy in vitro.
Việc chọn vật liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, không những
quyết định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo. Các công trình
của DAmato (1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh tr-ởng của chồi mới đảm bảo về sự
ổn định di truyền. Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích th-ớc nhỏ, kết hợp với xử
lý nhiệt để làm sạch bệnh là vật liệu tốt để nhân. Các chồi nhân ban đầu th-ờng
đ-ợc lấy từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên môi tr-ờng thạch chứa các muối
khoáng, đ-ờng, vitamin và các chất điều hoà sinh tr-ởng. Vi nhân giống đ-ợc bắt
đầu bầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân, sau đó khử
trùng và đ-a vào nuôi cấy ở môi tr-ờng phù hợp. Các chồi đ-ợc hình thành và đ-ợc
tách ra cấy chuyển sang môi tr-ờng mới, quy trình cứ thế đ-ợc lặp lại. Đây là
ph-ơng pháp cho hệ số nhân thấp hơn ph-ơng pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo
hoặc phôi, nh-ng các chồi đ-ợc hình thành giữ đ-ợc đặc điểm của cây mẹ, ít hoặc
không bị thay đổi về mặt di truyền. Trong một số tr-ờng hợp, vi nhân giống có thể
thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh cây trực tiếp từ mô sẹo. Ph-ơng
pháp này cho hệ số nhân cao hơn nh-ng th-ờng kéo theo sự biến dị soma [19].
Ưu điểm của nuôi cấy in vitro là: cho hệ số nhân cao sẽ rút ngắn thời gian
đ-a giống vào sản xuất; nhân đ-ợc một số l-ợng cây lớn trong một diện tích nhỏ;
thuận tiện và làm hạ giá thành vận chuyển, việc bảo quản cây giống thuận lợi. Cây
nuôi cấy mô th-ờng đ-ợc trẻ hoá cao độ và có rễ giống nh- cây mọc từ hạt, thậm
chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại


-6-


th-ờng không có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất nh- cây mọc từ hạt và
th-ờng có hiện t-ợng bảo l-u cục bộ. Ví dụ, cây mô Keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng
tuổi (cũng nh- các loài cây bố mẹ là Keo tai t-ợng và Keo lá tràm) có đủ các loại lá
kép một lần, kép hai lần và lá giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc nh- những cây mọc từ
hạt điển hình, thì cây hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây tr-ởng
thành và không có rễ cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế , còn tính bảo l-u cục bộ
thì biểu hiện rõ rệt). Vì thế nuôi cấy mô còn là một biện pháp trẻ hoá giống trong
sản xuất lâm nghiệp [13].
Khác với cây nông nghiệp ngắn ngày, cây rừng có đời sống dài ngày và phải
mất nhiều năm mới ra hoa kết quả. Sau khi chọn đ-ợc cây trội, muốn có giống tốt
để đ-a vào sản xuất, phải xây dựng v-ờn giống và rừng giống và phải đợi thêm một
số năm mới có thể thu đ-ợc một l-ợng hạt đủ lớn phục vụ trồng rừng, tuy nhiên cây
giống từ những hạt này sẽ bị phân hoá dẫn đến năng suất rừng biến động. Nhân
giống bằng ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro là một trong những biện pháp hữu hiệu
để duy trì những đặc tính tốt nhất của cây mẹ cho các thế hệ cây sinh d-ỡng tiếp
theo. Do vậy nuôi cấy in vitro đã đ-ợc áp dụng rộng rãi cho một số loài cây rừng
nh- bạch đàn [14].
Hiện nay nuôi cấy in vitro đã và đang đ-ợc ứng dụng rộng rãi trong sản xuất
th-ơng mại ở nhiều n-ớc trên thế giới, hàng trăm loài cây lá rộng và hàng chục loài
cây lá kim đã đ-ợc nuôi cấy mô thành công. Cho tới năm 1991, Thái Lan đã nhân
giống thành công bằng nuôi cấy mô cho 55 loài trong tổng số 67 loài tre trúc thử
nghiệm. Công nghệ này cho phép nhân nhanh loài Dendrocalamus asper với công
suất 1 triệu cây mỗi năm. Với loài Dendrocalamus asper, trong năm 1980 họ chỉ
có trong tay vài trăm hạt giống và đã nhanh chóng có trên 100 000 cây con đ-ợc
đ-a ra huấn luyện tại v-ờn -ơm, đến năm 1992 mục tiêu của họ là sản xuất vài
triệu cây con phục vụ trồng rừng [14].
Số các loài bạch đàn đã đ-ợc nhân giống bằng ph-ơng pháp in vitro ngày
một tăng, tới năm 1987 đã có trên 20 loài bạch đàn khác nhau tạo đ-ợc cây con in



-7-

vitro (Gupta và Mascarenhas, 1987). Các nhà khoa học ấn Độ đã tạo thành công
cây mô từ các cây trôi bạch đàn Eucalyptus camandulensis, Eucalyptus globulus,
Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus torelliana và cả từ các cây trội có hàm l-ợng
tinh dầu cao của bạch đàn chanh Eucalyptus citriodora. Cây mô có nguồn gốc từ
cây -u việt sinh tr-ởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của
cùng cây mẹ. Tại úc, nhân giống bằng nuôi cấy in vitro đã đ-ợc áp dụng để nhân
nhanh các cây đ-ợc chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang đ-ợc đ-a vào sản
xuất lớn cho loài E. camaldulensis. Vào năm 1987, khoảng 20 000 cây mô của các
dòng vô tính chịu mặn đã đ-ợc tạo ra để trồng lại rừng ở các mỏ bauxite gần Perth,
Tây úc [14].
Trung Quốc đã tạo cây in vitro thành công cho 100 loài cây thân gỗ nhdương, bạch đàn, bao đồng, tếch Là n-ớc ứng dụng sớm và thành công nuôi cấy
mô vào trồng rừng diện rộng, cây đ-ợc nhân giống thành công chính là E.
urophylla. Đến năm 1991 ở vùng Nam Trung Quốc, ng-ời ta đã tạo ra trên 1 triệu
cây mô của các cây và dòng lai đ-ợc chọn lọc. Những cây mô này đ-ợc dùng nhlà các cây đầu dòng để tạo cây hom tại các v-ờn -ơm địa ph-ơng và dùng thẳng
vào trồng rừng [15].
Nhiều loài cây lá rộng châu Âu đã đ-ợc thử nghiệm nhân giống thành công
bằng các biện pháp nuôi cấy mô, đó là các loài nh-: Acer, Beluta, Carpinus, Fagus,
Quercus, Ulmus, Fraxinus, Prunus, Juglans, Castanea, Tilia, Sorbus Các cây
mô đã đ-ợc trồng ra thực địa để so sánh và đã cho thấy chúng có phenotip giống
nhau, tỷ lệ sống ở rừng trồng sau khi cây đ-ợc huấn luyện là khá cao, đạt 90 -100%
cho các loài Beluta, Quercus, Sorbus và Salix [15].
Hiện nay nuôi cấy in vitro cũng là một biện pháp nhân giống đ-ợc áp dụng
nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các ch-ơng trình trồng rừng dòng vô
tính. Đối với các loài thông P. nigra, P. pinaster, P. sylvestris giâm hom từ cây già
là rất khó cho nên ng-ời ta đang áp dụng các biện pháp nuôi cấy mô nh- nuôi cấy
phôi, nuôi cấy tạo mô sẹo và các biện pháp này có nhiều triển vọng, nhất là đối



-8-

với thông P. pinaster. Nhân chồi in vitro từ cây non loài Vân sam (Picea
sitchensis) cho hệ số nhân biến động rất lớn tuỳ theo cây mẹ, cụ thể là 17 5000
chồi mỗi năm. Có tới 30 loài trong số các loài cây lá kim đ-ợc nghiên cứu nuôi cấy
mô và đã đạt đ-ợc những thành công b-ớc đầu, trong đó phải kể đến các loài nhAbies balsamea (tạo đ-ợc chồi ở cây 15 20 tuổi), các loài Bách tán Araucaria,
Liễu sam Cryptomeria japonica, Larix sp., Picea glauca, Thiết sam Pseudotsuga
menziesii, Cù tùng Sequoia sempervirens, Sequoiadendron gigenteum, Thuja sp.,
Tsuga heterophylla [15].
Nuôi cấy mô có thể là biện pháp tốt để trẻ hoá và tăng hệ số nhân, nhất là
biện pháp tạo phôi vô tính. Ng-ời ta đã nghiên cứu tạo nuôi cấy phôi vô tính cho
cây Thiết sam (Pseudotsuga menziesii), mặc dù ch-a tạo ra đ-ợc cây hoàn chỉnh từ
các phôi vô tính của cây này nh-ng chồi bất định đã đ-ợc tạo ra từ đỉnh thân cây
mẹ 64 tuổi. Bằng ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro, các loài Bách tán cho hệ số nhân
thấp, chỉ tạo đ-ợc 20 60 chồi mới từ một cây con trong vòng 4 tháng đối với loài
A. cunninghamii và mới chỉ có các chồi của loài cây này ra rễ in vitro [15]
Trong số 30 loài cây lá kim đã đ-ợc nuôi cấy mô, có bốn loài đ-ợc đ-a vào
sản xuất diện rộng, đó là Cù tùng Sequoia sempevirens ở AFOCEL (Pháp); thông
P. radiate ở Viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilân; P. taeda và Pseudotsuga
menziesii ở Mỹ .
Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đã đ-ợc áp dụng cho cây Tếch, Gupta và
các cộng sự (1979) đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ
mầm cây 100 tuổi. Từ đó họ có thể tạo đ-ợc 500 cây in vitro từ một chồi ở cây
tr-ởng thành và 3000 cây từ một cây non trong một năm. Kaosa-ard (1990) cho
biết Thái Lan cũng đã phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô (nuôi cấy đỉnh
thân và phôi) vào năm 1986 cho cây Tếch và cho phép tạo 500 000 chồi từ một chồi
trong một năm. Perhutani (1991) cũng cho biết Indonexia đã thử nghiệm nuôi cấy
mô thành công và một vài cây mô đã đ-ợc đem trồng thử [15].



-9-

Ng-ời ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng các biện pháp nuôi
cấy mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang đ-ợc
dùng để tạo cây mô Phi lao sinh tr-ởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho
trồng rừng [15].

1.2. Thông caribê, vị trí trong sản xuất lâm nghiệp và triển vọng trồng rừng ở
Việt Nam
Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) đ-ợc gây trồng ở n-ớc ta từ những
năm 1963, những thông báo đầu tiên cho thấy Thông caribê là loài sinh truỏng
nhanh thân thẳng đẹp, cành nhánh nhỏ hơn Thông ba lá và Thông đuôi ngựa nên
đ-ợc nhiều địa ph-ơng -a thích gây trồng. Tuy nhiên ch-a đ-ợc đánh giá đầy đủ, vì
vậy có nhiều ý kiến khác nhau trong việc sử dụng loài thông này [9], [12].
Thông caribê gồm 3 biến chủng là: Pinus caribaea var caribaea, Pinus
caribaea var hondurensis và Pinus caribaea var bahamensis đều có phân bố tự
nhiên ở vùng Trung Mỹ. Trong đó biến chủng caribaea có phân bố từ 16o 20o độ
vĩ Bắc, phân bố tự nhiên ở Cuba và đảo Juventus thuộc vùng biển Caribê, chủ yếu
tập trung ở những vùng thấp, đồi bát úp, th-ờng ở độ cao 330 m so với mặt n-ớc
biển. Ngoài ra biến chủng caribaea còn xuất hiện ở độ cao xấp xỉ 760 m, ít có
tr-ờng hợp phân bố ở độ cao trên 1200 m (Poyton, 1997) [4].
Biến chủng bahamensis phân bố tự nhiên từ 22o 27o độ vĩ Bắc, thuộc vùng
đảo Bahamas và Caicos, ngoài ra còn tìm thấy ở bán đảo Yucutan thuộc vùng Đông
Bắc Mỹ. Biến chủng hondurensis phân bố tự nhiên từ 12o 16o độ vĩ Bắc, tập trung
chủ yếu ở đảo Belize, Guatelama, Poptun, Guanaja, Nicazagua. Sinh tr-ởng chủ yếu
trên các khu vực đồng cỏ, đồng bằng ven biển có độ cao so với mặt n-ớc biển là
460 760 m, nh-ng phân bố tập trung nhiều nhất ở độ cao 460 m (Perry JP Jr,
1991) [4].
Gỗ Thông caribê có thớ thẳng mịn, độ bóng vừa phải, th-ờng đ-ợc sử dụng
làm ván ép, thân Thông caribê thẳng, dễ c-a xẻ nh-ng phụ thuộc nhiều vào độ tuổi



- 10 -

(Bredenkamp và Van Vuuren, 1987) [25]. Ngoài ra Thông caribê còn có nhiều
công dụng khác nh-: gỗ xây dựng, gỗ trụ mỏ, ván dăm, ván ép, bột giấy, gỗ đóng
tàu thuyền, ván ốp t-ờng, gỗ đóng congtenơ, ván ốp trần, gỗ đóng đồ hộp, gỗ cột
điện, gỗ cột nhà, gỗ nội thất, than củi
Với tốc độ sinh tr-ởng nhanh và khả năng thích ứng rộng với các vùng sinh
thái khác nhau trên thế giới, đáp ứng đ-ợc nhiều mục tiêu kinh tế nên Thông caribê
đã đ-ợc dẫn nhập gây trồng ở 65 n-ớc trên thế giới, chủ yếu là các n-ớc thuộc
vùng Nhiệt đới và á nhiệt đới. Giới hạn vĩ độ trồng mở rộng nhiều so với nơi
nguyên sản, từ vĩ độ 55o Nam ở Argentina tới 33o vĩ độ Bắc ở ấn Độ D-ơng, giới
hạn kinh độ cũng đ-ợc mở rộng từ 180o kinh đông ở Fiji tới 158o kinh độ tây ở
Hawaii. Độ cao vùng trồng biến động từ mặt n-ớc biển tới 1200 m ở Zaire, 1220 m
ở Nigeria, trên 1820 m ở Uganda và 2400 m ở Kenya (Anoruo và Berlyn, 1993) [5]
Nh- vậy, Thông caribê đã đ-ợc gây trồng ở tất cả các dạng khí hậu của các
n-ớc nhiệt đới và cận nhiệt đới. Vùng phân bố rừng trồng của loài đ-ợc mở rộng cả
về vĩ độ và kinh độ, cả vùng có khí hậu miền núi tới khí hậu cận nhiệt đới và vùng
ven biển (Anoruo và Berlyn, 1993) [5]. Nhìn chung thông Caribê có thể sinh tr-ởng
tốt trên nhiều loại đất khác nhau khi đ-ợc trồng ngoài phạm vi phân bố tự nhiên
của chúng.
Việt Nam là một n-ớc nằm trong khu vực nhiệt đới của Châu á, có các điều
kiện địa lý khá t-ơng đồng với sự phân bố tự nhiên của Thông caribê, nên đã đ-ợc
đ-a vào trồng ở n-ớc ta từ nhiều năm nay. Ngày nay Thông caribê đã đ-ợc xác
định là một trong các loài cây trồng rừng trong ch-ơng trình 5 triệu hecta rừng. Các
kết quả khảo nghiệm b-ớc đầu ở Việt Nam cho thấy thông là loài cây có nhiều
triển vọng, đặc biệt là biến chủng Pinus caribaea var hondurensis.
Kết quả khảo nghiệm Thông caribê tại Đà Lạt năm 1963 b-ớc đầu cho thấy
biến chủng hondurensis của Thông caribê có sinh tr-ởng nhanh, hình dáng thân

đẹp, cao, thon đều, tán lá nhỏ, cành mọc ngang, có tốc độ sinh tr-ởng nhanh hơn
Thông ba lá. ở tuổi 12, cây cao bình quân 14.3 m và đ-ờng kính ngang ngực bình


- 11 -

quân đạt 16.3 cm, tăng tr-ởng bình quân về chiều cao là 1.19 m/năm và đ-ờng kính
là 1.35 cm/năm. ở tuổi 16, cây cao trung bình 19.9 m, đ-ờng kính ngang ngực
trung bình là 26.4 cm, tăng tr-ởng chiều cao bình quân là 1.24 m/năm và đ-ờng
kính là 1.65 cm/năm [12].
Khảo nghiệm tại Mang Linh cho thấy biến chủng hondurensis trồng trên đất
feralit vàng đỏ phát triển trên đá mẹ granit có tầng đất sâu, ẩm và lớp mùn khá dày
có sinh tr-ởng nhanh hơn Thông ba lá Đà Lạt. Sau 16 năm trồng, cây có chiều cao
bình quân là 17 m và đ-ờng kính là 26.6 cm, tăng tr-ởng bình quân hàng năm về
chiều cao là 1.21 1.22 m/năm và đ-ờng kính là 1.76 1.80 cm/năm [12].
Giai đoạn 1978 1982, một khảo nghiệm xuất xứ khá đầy đủ theo dự án
SIDA tại Phú Thọ (P. Stahl, 1984) [40]. Vật liệu nghiên cứu gồm bốn loài Thông:
Thông nhựa (P. merkusii) với 5 xuất xứ, Thông ba lá (P. kesiya) với 6 xuất xứ,
Thông oocarpa (P. oocarpa) với 1 xuất xứ, Thông caribê (P. caribaea) gồm 3 biến
chủng, trong đó biến chủng caribaea (1 xuất xứ), biến chủng bahamensis (1 xuất
xứ) và biến chủng hondurensis (4 xuất xứ). Khảo nghiệm đ-ợc xây dựng trên 4 địa
điểm là Thái Long, Sơn Nam (Tuyên Quang), Đền Hùng và Yên Kiện (Vĩnh Phú
cũ). Trong 4 loài thông đ-a vào khảo nghiệm (ở giai đoạn 6 8 tuổi) thì Thông
caribê là loài có sinh tr-ởng nhanh nhất, trong các biến chủng Thông caribê đ-ợc
khảo nghiệm thì biến chủng hondurensis có sinh tr-ởng nhanh nhất, tiếp đến là
biến chủng bahamensis và cuối cùng là biến chủng caribaea [16], [30], [41].
Kết quả khảo nghiệm ở tuổi 8 cho thấy những xuất xứ có sinh tr-ởng tốt của
2 biến chủng hondurensis và bahamensis là xuất xứ Potun (Guatemala), Guanaja
(Honduras), Cardwell (Queensland, Australia), Almicamba (Nicaragua) và Andros
(Bahamas). Tác giả đã đi đến kết luận: ở khu vực này nếu trồng rừng quy mô lớn

chỉ tập trung vào các xuất xứ tốt của hai biến chủng hondurensis và bahamensis
[41].
Kết quả nghiên cứu và đánh giá các khảo nghiệm loài và xuất xứ Thông
caribê sau 9 năm trồng khảo nghiệm ở Đại Lải (Vĩnh Phúc), Đông Hà (Quảng Trị),


- 12 -

Sông Mây (Đồng Nai), cho thấy Thông caribê là loài cây có triển vọng về sinh
tr-ởng nhanh, trong đó biến chủng P. caribaea var hondurensis đ-ợc đánh giá là
biến chủng có sinh tr-ởng nhanh hơn hai biến chủng còn lại, trong biến chủng
hondurensis có xuất xứ Poptun, Alamicamba, Guanaja và Cardwell là những xuất
xứ có triển vọng nhất và phù hợp với một số vùng trồng ở n-ớc ta [3].
Đánh giá những kết quả khảo nghiệm đ-ợc xây dựng gần đây Lê Đình Khả
cũng cho thấy P. caribaea var hondurensis là một trong những biến chủng triển
vọng hơn hai biến chủng còn lại [9], [10], [29]. Đánh giá mới nhất của Phan Thanh
H-ơng (2000) khi nghiên cứu đặc điểm sinh tr-ởng của một số xuất xứ Thông
caribê đ-ợc khảo nghiệm trên một số trên một số vùng sinh thái ở Việt Nam cho
thấy trong ba biến chủng Thông caribê đ-ợc đ-a vào khảo nghiệm, biến chủng
hondurensis có sinh tr-ởng tốt nhất tại 5 địa điểm: Đại Lải (Vĩnh Phúc), Đông Hà
(Quảng Trị), Pleiku (Gia Lai), Lang Hanh (Lâm Đồng) và Sông Mây (Đồng Nai);
biến chủng Bahamensis sinh tr-ởng tốt nhất ở Xuân Khanh, Cẩm Quỳ (Hà Tây);
biến chủng caribeaea sinh tr-ởng kém nhất trên tất cả các lập địa [4].
1.3. Những nghiên cứu về nhân giống thông bằng ph-ơng pháp nuôi cấy in
vitro trên thế giới
1.3.1. Các nghiên cứu về vật liệu nuôi cấy in vitro và khả năng hình thành chồi
từ mẫu nuôi cấy
Những nghiên cứu nuôi cấy mô cho loài thông đã đ-ợc tiến hành bằng việc
sử dụng mấu nuôi cấy ban đầu từ cây con, vì loaị vật liệu này thuận lợi cho việc
khử trùng mẫu cấy. Theo B. Macdonald khi lấy mẫu cấy đối với cây thân gỗ nên

lấy vào sáng sớm và kích th-ớc mẫu cấy nên dài từ 2 3 cm [17]. Murashige nhận
thấy đối với các cây thân gỗ, mẫu cấy lấy từ cây non tái sinh tốt hơn mẫu lấy từ cây
mẹ tr-ởng thành [34].
Sự hình thành các chồi bất định từ phôi tr-ởng thành đã đ-ợc tiến hành cho
loài Thông P. radiate, P. loblolly vì khả năng cho hệ số nhân cao, các thử nghiệm


- 13 -

trồng rừng từ những cây mô (plantlet) đã đ-ợc thiết lập (Smith, 1985; Amerson và
cộng sự, 1985) [38].
Dùng các mẫu cấy khác nhau thì sự hình thành chồi sẽ khó dễ khác nhau.
Phần lớn các công trình trong nhân giống cây lá kim đã xuất bản đều mô tả vật liệu
nuôi cấy ban đầu là những cơ quan của cây non vô trùng với ph-ơng thức tái sinh
tạo chồi và cây con. Chồi có thể đ-ợc kích thích và hình thành trực tiếp trên phôi
hữu tính của cây lá kim và trên những cơ quan của cây non đặc biệt là lá mầm và
chồi đỉnh, trong đó lá mầm của cây non từ là vật liệu đ-ợc sử dụng rộng rãi nhất
[26]. Những loại mẫu cấy này thuận tiện cho việc khử trùng mẫu (lấy từ hạt) và
cũng thuận lợi cho phôi vô tính và lá mầm phân hoá tạo chồi bất định.
Trong hầu hết các nghiên cứu, lá mầm cây non đ-ợc tách ra để nuôi cấy cho
số chồi bất định nhiều hơn phôi nguyên vẹn, trụ d-ới lá mầm hoặc các mô khác của
cây non và trở thành mẫu cấy đ-ợc sử dụng rộng rãi. Khả năng tái sinh chồi của lá
mầm phụ thuộc độc lập với tuổi của chúng, lá mầm từ cây mầm P. radiate 1 ngày
tuổi ở trạng thái sinh lý tốt nhất cho sự tạo chồi (Aitken Christie và các cộng sự,
1982), trong khi chồi in vitro của cây Linh sam ( Douglas) đ-ợc tái sinh từ lá mầm
có tuổi tối -u từ 2 4 tuần (Wochok và Abo El-Nil, 1977) [26]. Một nghiên cứu
khác đ-ợc thực hiện bởi Cheng (1977) không tìm thấy sự ảnh h-ởng của tuổi (2
tuần hoặc 2 tháng tuổi) đến số chồi đ-ợc tạo ra từ lá mầm cây Linh sam (Douglas)
non. Số chồi đ-ợc hình thành từ phôi hoặc mẫu cấy từ cây non có thể bị ảnh h-ởng
lớn bởi các thủ tục xử lý tr-ớc khi tạo chồi. Sự tái sinh chồi in vitro sẽ thuận lợi nếu

hạt thông đ-ợc xử lý lạnh (Smeltzer và cộng sự, 1977; Relly và Washer, 1977) [26]
hoặc đ-ợc xử lý bằng H2O2 để phá vỡ trạng thái ngủ tr-ớc khi phôi đ-ợc tách ra và
nuôi cấy (Mehra-Palta và cộng sự, 1977) [31]; (Mott và Amerson, 1981) [32]. So
sánh các kết quả từ hạt đ-ợc xử lý và không xử lý, một tỷ lệ lớn lá mầm của P.
taeda và P. monticola đã hình thành chồi và có một số lớn chồi trên một cây so với
hạt không đ-ợc xử lý [26].


- 14 -

Tuy nhiên những mẫu cấy trên chỉ nên giới hạn trong việc nghiên cứu quá
trình phát sinh hình thái vì khó đảm bảo rằng các đặc tính di truyền của chúng có
đ-ợc bảo vệ hay không và có phù hợp mục tiêu không, nên không thể dùng cho sản
xuất. Nếu mục đích là nghiên cứu, mẫu cấy đều có thể lấy từ phôi của hạt non, hạt
già. Nuôi cấy mô, cơ quan của cây tr-ởng thành sẽ khó khăn hơn vì khó tạo đ-ợc
mẫu cấy, có thể không cho ra đ-ợc chồi bất định hay chồi nách, đôi khi khó ra rễ
và th-ờng tạo ra những cây có tính h-ớng nghiêng.
1.3.2. Các nghiên cứu về môi tr-ờng nuôi cấy trong nhân giống thông in vitro
Trên thế giới nhân giống các loài cây lá kim bằng ph-ơng pháp nuôi cấy mô
đã đ-ợc thực hiện và công bố bởi nhiều tác giả (Aitken Christie và Thorpe, 1984;
Berlyn và các cộng sự, 1986) [38].
Trong nuôi cấy in vitro, chồi có thể đ-ợc tái sinh trực tiếp từ callus trên mẫu
cấy còn non của cây lá kim nh-ng nh- vậy th-ờng hay có những rủi ro về biến
động kiểu gen, đặc biệt là nuôi cấy những callus không có tổ chức (Aitken
Christie và các cộng sự, 1988) [38].
Nếu nh- sự hình thành chồi từ callus bị loại trừ, kỹ thuật nhân giống in vitro
thích hợp cho cây lá kim là: tạo chồi trực tiếp; tạo chồi từ chồi nách; nuôi cấy phôi
vô tính. Mẫu cấy sử dụng cho những kỹ thuật này là phôi hạt non, cây mầm, chồi
nách ... Mẫu cấy từ những cây tr-ởng thành khó đ-ợc hình thành, có thể không cho
ra đ-ợc chồi bất định hay chồi nách, đôi khi khó tạo rễ và kết quả th-ờng tạo ra

những cây h-ớng nghiêng (Aitken Christie và cộng sự, 1988) [38].
Môi tr-ờng nuôi cấy đã đ-ợc dùng cho nuôi cấy tạo chồi in vitro cây lá kim
có thể kể tới là:

SH (1972); WPM (1981); GD (1972); MCM (1983); SH

(1972)các môi trường SH; GD; WPM; LPm cải tiến và thấy phần lớn các môi
tr-ờng tạo chồi tốt hơn so với môi tr-ờng MS (1962), chồi xuất hiện với tần số lớn
hơn nhiều [26]. Các môi tr-ờng nuôi cấy nói trên đều chứa đủ các nguyên tố đa
l-ợng và vi l-ợng nh-ng sai khác về hàm l-ợng khá lớn.


- 15 -

Thorpe và Harry (1991) đã nghiên cứu nuôi cấy thông Pinus canariensis với
nguồn vật liệu sử dụng chủ yếu từ lá mầm của cây con mới nảy mầm vô trùng, tác
giả sử dụng hai loại môi tr-ờng nuôi cấy chính là môi tr-ờng SH (1972); môi
tr-ờng MCM (1983) có bổ sung 5-10 M BAP. Nghiên cứu đã xác định đ-ợc môi
tr-ờng MCM với nồng độ BAP tối -u trong giai đoạn tái sinh chồi là 10 M, xác
định đ-ợc tổ hợp phytohormon là BAP/2 iP (tỷ lệ 1:1) là 5/5 M cho kết quả tái
sinh chồi tốt hơn môi tr-ờng chỉ có BAP; xác định đ-ợc giá thể ra rễ là hỗn hợp vô
trùng than bùn/vermiculate (tỷ lệ 1:1) chứa 1/4 khoáng MCM, xử lý chồi ra rễ bằng
IBA 1 M trong 4 giờ. Kết quả đã đ-a cây in vitro vào giá thể trong bầu PVC ở
điều kiện nhà kính [42].
Shakya, Joshee và Agrawal (1989) đã thành công trong nghiên cứu nhân
giống thông P. wallichiana bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi có định h-ớng. Vật liệu
nuôi cấy là phôi đ-ợc tách ra từ hạt thông P. wallichiana (còn gọi thông xanh hay
thông Bhutan). Phôi tách ra đ-ợc nuôi cấy trên môi tr-ờng Aiken - Christie (LP1984) bổ sung BAP ở các nồng độ từ 0 - 88 M trong 10; 14; 21 ngày. Kết quả đạt
ít nhất 40 chồi/phôi trong 1 chu kỳ cấy chuyển 4 tháng [40].
Năm 1995, Okamura M. và Kondo T. công bố Hướng dẫn nuôi cấy mô cây

thông giới thiệu tạo cây con thông Pinus thunbergi trong ống nghiệm từ nuôi cấy
phôi và lá mầm. Trong h-ớng dẫn này dùng môi tr-ờng GD (1972) và môi tr-ờng
AE để nuôi cấy giai đoạn nhân chồi. Giai đoạn nuôi cấy ban đầu bổ sung 5 - 10
M BAP và 3 % đ-ờng. Giai đoạn ra rễ dùng môi tr-ờng Risser and White có bổ
sung 10 M IBA và đã tạo thành công cây con trong ống nghiệm nh-ng không thấy
công bố số l-ợng và các kết quả thí nghiệm [37].
Nuôi cấy mô cây lá kim có nhiều khó khăn, đặc biệt là đối với các loại cây
nh- thông. Các thông tin về mẫu nuôi cấy, môi tr-ờng dinh d-ỡng khoáng và sử
dụng chất điều hoà sinh tr-ởng cho các loài cây lá kim nói chung và loài thông nói
riêng đ-ợc kê trong biểu 1.1 [26]:
Biểu 1.1: Thông tin về nuôi cấy in vitro các loài cây lá kim


- 16 -

Môi
nuôi Môi
tr-ờng tr-ờng
kích
thích hình
nhân chồi
thành
chồi

Loài cây

Mẫu
cấy

Piece abies


Phôi hạt già

Môi
tr-ờng
kéo
dài Nguồn tham khảo
chồi

1/2SH-1972 + 1/2SH-1972
1.1 mg/lBAP

Von Arnold và Eriksson
(1987)
Von
Arnold
(1987)

Piece glauca

Trụ d-ới lá LPm-1981 + 2.2 LPm-1981
mầm
mg/lBAP

Ellis và các cộng sự
(1991)

Piece glauca

Trụ d-ới lá CD-1975 +2.25 CD-1975

mầm
mg/lBAP

Campbell
(1975)

Piece
ormorika

Chồi và lá LPm-1981 + 1.0 LPm-1981
mầm
cây mg/lBAP

Budimir
(1992)

và
và

Durzan
Vujieie

con
Pinus briata

Phôi hạt và SH mod.- 1981 SH mod.- 1981
lá mầm
+ 3.0 mg/lBAP

Abdullah và các cộng sự

(1981)

Pinus
canariensis

Phôi
mới
mầm

Martinez Pulido và các
cộng sự (1991-1992)

Pinus caribeae Phôi hạt

hạt MCM-1983 + 1/2David
nảy 2.2 mg/lBAP
1982a

Cheng-

1/2David
+
0.05%AC

Cheng-1977;1978

1977;1978 + 2
mg/lBAP

Halos và Go (1993); Go

và các cộng sự (1993)

Pinus contorta

lá mầm và 1/2LPm-1981 + 1/2LPmtrụ d-ới lá 2.25 mg/lBAP
1981
mầm
cây
non

1/4LPm1981;
1/8LPm1981

Patel và Thorpe (1984)

Pinus elliotii

lá mầm từ GD-1975 + 10 GD-1975
phôi
mg/lBAP + 0.01

1/2GD1975

Lesney và các cộng sự
(1988)

mg/lNAA
Pinus
virginiana


lá mầm từ GD mod.-1981 SH-1972
SH- 1972
hạt đã nảy + 10 mg/lBAP
+
4
mầm
mg/lBAP

Lopez Petalta và các cộng
sự (1991)


- 17 -

Sơ đồ nuôi cấy in vitro cây lá kim từ các mẫu cấy có thể tóm tắt [26]:

S phỏt sinh
phụi

Tạo chồi
trực tiếp

Phụi

Cây mầm

Callus phụi
hoỏ

Phụi vụ

tớnh

Lá mầm

Chồi bất
định

Trụ d-ới lá
mầm

Tạo chồi
trực tiếp

- Chồi nách
- Bó lá kim

Chồi sinh
tr-ởng và
v-ơn dài

Cõy con
in vitro

Cõy con
in vitro

Chồi nách

Trên cơ sở có môi tr-ờng dinh d-ỡng khoáng với thành phần và hàm l-ợng
t-ơng đối thích hợp thì điều quan trọng nhất còn lại là vấn đề sử dụng chất điều hoà

sinh tr-ởng (còn gọi là phytohormone hay hormon). Biểu 1.1 cho thấy trong nuôi
cấy in vitro cây thông, để kích thích hình thành chồi th-ờng đòi hỏi hàm l-ợng chất
điều hoà sinh tr-ởng t-ơng đối thấp. Phần lớn các môi tr-ờng hình thành và v-ơn
chồi không cần sử dụng phytohormon. Tuy nhiên nhiều tác giả cho rằng cho thêm
một số chất điều hoà sinh tr-ởng với liều l-ợng thích hợp là cần thiết. Có nghiên
cứu đã dùng BAP đến nồng độ 2 10 mg/l. Qua quá trình nghiên cứu thành công
với hơn 30 loài cây lá kim của các tác giả trên thế giới, nhận thấy rằng BAP 2 mg/l
2.25 mg/l là rất thích hợp cho sự phân hoá tạo chồi, kích thích phân hoá tạo chồi
từ phôi vô tính bằng BAP sẽ t-ơng đối có hiệu quả.
Nhân giống bằng ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro với thông, mặc dù các loài
có đòi hỏi gần giống nhau đối với môi tr-ờng nuôi cấy nh-ng do mỗi đặc điểm


- 18 -

riêng của mỗi loài mà vẫn có thể yêu cầu những xử lý, điều chỉnh cá biệt khác
nhau.
Tác dụng dẫn dắt phân hoá tạo chồi của các cytokinin khác nhau không
giống nhau hoặc cũng có thể giống nhau, trong biểu có thể thấy tác dụng của BAP
rõ hơn Kinetin. Trong sự phối hợp giữa cytokinin và auxin, th-ờng thấy sử dụng
BAP phối hợp với NAA hơn là với IAA và IBA.
Trong việc dẫn dắt hình thành rễ, các nghiên cứu có nhận xét khá thống nhất
với nhau và phần lớn đều chọn dùng IBA, tuy nhiên về chọn chất auxin nào và về
liều l-ợng thì còn cần phải thử nghiệm cho phù hợp với mỗi loài.
Trong các môi tr-ờng nuôi cấy bổ sung thêm cytokinin (th-ờng sử dụng
BAP), đôi khi kết hợp với một auxin ở một nồng độ nhất định. Chồi thông sau đó
đ-ợc ra rễ trên môi tr-ờng chứa IBA [26].
Môi tr-ờng nuôi cấy các loài thông th-ờng đ-ợc bổ sung thêm vitamin và
các acid aminCác chất này đều có ảnh hưởng tốt đối với sự phân hoá tạo chồi và
hình thành phôi vô tính. Những chất này có thể có tác dụng nâng cao tỷ lệ hình

thành chồi, đẩy nhanh tốc độ phát triển của chồi.
Trong nuôi cấy in vitro thực vật nói chung và thông nói riêng môi tr-ờng
nuôi cấy có hàm l-ợng đ-ờng khác nhau sẽ có hiệu quả khác nhau. Nồng dộ thấp
ảnh h-ởng đến nguồn cung cấp Hidratcarbon sẽ không có lợi cho sinh tr-ởng của
chồi. Nồng độ quá cao làm ảnh h-ởng đến áp suất thẩm thấu và sẽ không có lợi cho
quá trình hấp thụ và vận chuyển các chất. Các nghiên cứu nuôi cấy tạo chồi cây
thông th-ờng chọn dùng nồng độ 2-3 %, phần lớn dùng đ-ờng sacaroza.
1.4. Những nghiên cứu về nhân giống cây thân gỗ và cây thông bằng ph-ơng
pháp nuôi cấy in vitro ở Việt Nam
Sau khi một số giống Bạch đàn có năng suất cao đ-ợc nhập, các dòng vô tính
Bạch đàn và Keo lai có năng suất cao ra đời, nuôi cấy mô và giâm hom đã trở thành
một phong trào nhân giống đ-ợc áp dụng rông rãi trong sản xuất lâm nghiệp.


- 19 -

Những cơ sở hiện đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong lâm
nghiệp n-ớc ta là Viện nghiên cứu cây nguyên liêụ giấy Phù Ninh, Trung Tâm
khoa học sản xuất lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống thành phố Hồ Chí
Minh, Tr-ờng Đại học Lâm nghiệp.
Trong khi năng suất rừng tự nhiên cửa ta chỉ đạt 2 - 6 m3/ha/năm, năng suất
rừng trồng quảng canh đ-ợc trồng bằng cây hạt cũng chỉ đạt 5 - 7 m3/ha/năm, thì
năng suất rừng trồng của một số giống Bạch đàn mới chọn tạo hoặc mới nhập đ-ợc
trồng bằng cây mô và cây hom có thể đạt 15 m3/ha/năm, còn năng suất giống Keo
lai đ-ợc trồng bằng cây mô và cây hom ở một số nơi cũng có thể đạt 20 -30
m3/ha/năm [13]. Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu
giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô cho Keo lai, Bạch
đàn và một số giống cây rừng khác [13].
Nghiên cứu nuôi cấy mô cho giống lai giữa Bach đàn liễu và Bạch đàn trắng
đã đ-ợc Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1977) thực hiện thành công từ năm 1993 và

thấy rằng khi dùng BAP bổ sung vào môi tr-ờng cơ bản MS có thể tạo đ-ợc 20 -30
chồi/cụm. Môi tr-ờng MS bổ sung IBA có thể đạt tỷ lệ ra rễ 80% [11]. Nghiên cứu
nuôi cấy mô cho giống Bạch đàn lai U29C3 do Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000) tiến
hành và đã thu đ-ợc cây mô từ tổ hợp lai này để khảo nghiệm. Kết quả cho thấy
thời kỳ mẫu bị nhiễm ít nhất và có tỷ lệ bật chồi cao nhất là từ tháng Năm đến
tháng Tám. Môi tr-ờng MS bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số chồi trung bình trong mỗi
cụm cao nhất (16.6 chồi/cụm). Môi tr-ờng ra rễ thích hợp là môi tr-ờng MS bổ
sung 1,0 mg/l IBA, cho tỷ lệ ra rễ tới 83,8% [11].
D-ơng Mộng Hùng (1993) nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô cho hai
loài bạch đàn Eucalyptus camaldulensis và Eucalyptus urophylla từ cây trội của 2
loài. Kết quả đã tạo đ-ợc một số cây mô bạch đàn, tuy nhiên tỷ lệ mẫu nhiễm nấm
bệnh khi đ-a mẫu vào môi tr-ờng vô trùng còn cao, hệ số nhân chồi thấp (1 2
lần) [7].


- 20 -

Nuôi cấy mô cho Lát hoa (Chukrasia tabularis) đã đ-ợc thực hiện cho chồi
lấy từ cây 2 tuổi. Giai đoạn nhân chồi dùng môi tr-ờng MS có 1,0 1,5 mg/l BAP
đạt 10 chồi/cụm. Giai đoạn ra rễ dùng môi tr-ờng MS bổ sung 0,1 mg/l IBA hoặc
0,1 mg/l IBA phối hợp với 0,1 mg/l NAA cho tỷ lệ ra rễ đến 87,5% [10].
Nuôi cấy mô, tế bào cây thân gỗ có nhiều khó khăn, đặc biệt là với các loài
cây lá kim nh- cây thông. ở n-ớc ta, kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào cho cây thân gỗ
mới ở thời kỳ của những b-ớc đi ban đầu và ứng dụng vào sản xuất quy mô lớn chủ
yếu cho loài bạch đàn và đến nay các công trình đã đ-ợc công bố ch-a nhiều. Năm
2003, Trần Trung Hiếu, Nguyễn Xuân Th-ơng và các cộng sự công bố kết quả
b-ớc đầu nhân nhanh giống thông caribê (Pinus caribaea) bằng ph-ơng pháp nuôi
cấy in vitro. Kết quả đã tìm ra môi tr-ờng nhân chồi, ra rễ và tạo đ-ợc cây con có
khả năng phát triển ngoài v-ờn -ơm [6]. Các tác giả sử dụng mẫu cấy là đoạn chồi
non đầu cành của cây 3-5 tuổi do Trung tâm sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ

Thống Nhất - Đồng Nai (Viện Khoa học Lâm nghiệp) cung cấp. Môi tr-ờng nuôi
cấy cơ bản là môi tr-ờng SH (1973), Litvay (1981) và các môi tr-ờng khoáng đa
l-ợng giảm đi một nửa là SH-1/2 và LV-1/2. Để tạo cụm chồi, tăng tr-ởng chồi và
ra rễ, các tác giả đã dùng chất điều hoà sinh tr-ởng là BAP, NAA, IBA. Kết quả
sau 6 tuần nuôi cấy, số chồi thu đ-ợc cao nhất trên môi tr-ờng SH7 (có bổ sung 3
mg/l BAP; 0.5 mg/l IBA) là 6,17 1,13 chồi/mẫu; trên môi tr-ờng SH16 (có 0,1
mg/l BAP; 0,1 mg/l IBA) cho chiều cao chồi cao nhất là 3,41 0,51 cm; sau 9 tuần
nuôi cấy trên môi tr-ờng tạo rễ SH -1/2, chồi tạo 3 rễ/chồi và rễ dài nhất là 3 cm,
sau 12 tuần nuôi cấy cây con có thể phát triển ngoài v-ờn -ơm. Công bố trên không
cho biết tỷ lệ tạo rễ của chồi in vitro và tỷ lệ cây sống sau khi đ-a ra điều kiện
ngoài.
Cuối năm 2002 những nghiên cứu b-ớc đầu về nuôi cấy mô cây Thông
caribê và Thông lai đã đ-ợc tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu
giấy. Kết quả đã xác định đ-ợc ph-ơng pháp khử trùng mẫu cho tỷ lệ mẫu sống và
sạch là 10,1% (khử trùng bằng H2O2 5% trong 20 phút), đã thử nghiệm và xác định


- 21 -

đ-ợc điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ) thích hợp cho nhân chồi thông. Đã
tiến hành thử nghiệm một số môi tr-ờng nuôi cấy (MS; MCM; GD) và đã thu đ-ợc
những cụm chồi in vitro. Tuy nhiên các nghiên cứu mang tính chất thăm dò và có
những tồn tại nh- hệ số nhân rất thấp (1,7 lần)
Tóm lại, nhiều công trình nghiên cứu đã đi sâu vào giải quyết các nội dung
cơ bản về nuôi cấy in vitro và sử dụng cây mô trong sản xuất. Các tác giả đã chỉ ra
một số môi trường nuôi cấy, tạo rễ Những kết quả nghiên cứu này làm cơ sở cho
những nghiên cứu tiếp theo và đ-ợc ứng dụng cho từng loài. Đó cũng là những dẫn
liệu và định h-ớng quan trọng cho đề tài này. Kết quả nghiên cứu chủ yếu tập trung
vào nuôi cấy phôi vô tính và tạo chồi trực tiếp từ các cơ quan của cây mầm. Tuy
các công trình nghiên cứu ở các n-ớc trên thế giới đã giải quyết nhiều các vấn đề

liên quan tới việc nuôi cấy in vitro thông, nh-ng ít có tác giả nào kể cả trong n-ớc
và n-ớc ngoài đề cập tới vấn đề nhân giống Thông caribê bằng ph-ơng pháp tái
sinh tạo chồi trực tiếp từ chồi non một cách t-ơng đối đầy đủ về nghiên cứu thời
gian lấy mẫu trong năm, loại vật liệu nuôi cấy, tuổi vật liệu nhân giống, môi tr-ờng
nuôi cấy, chất điều hoà sinh tr-ởng, giá thể -ơm cây in vitro. Đề tài này cố gắng đi
sâu giải quyết một số vấn đề nói trên.


- 22 -

Ch-ơng 2
mục tiêu, nội dung và ph-ơng pháp nghiên cứu
2.1. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu nhân giống, xác định đ-ợc môi tr-ờng nuôi cấy thích hợp để
nhân giống thông và tạo đ-ợc cây con Thông caribê hoàn chỉnh bằng ph-ơng pháp
nuôi cấy in vitro.

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu ảnh h-ởng của thời điểm lấy mẫu , nguồn mẫu, tuổi mẫu nuôi
cấy đến khả năng tái sinh chồi in vitro.
2.2.2. Nghiên cứu ảnh h-ởng của môi tr-ờng nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi in
vitro.
2.2.3. Nghiên cứu ảnh h-ởng của môi tr-ờng nuôi cấy lên quá trình sinh tr-ởng,
khả năng nhân nhanh cụm chồi.
2.2.4. Nghiên cứu ảnh h-ởng của các yếu tố đến khả năng ra rễ của chồi in vitro:
tuổi chồi, môi tr-ờng nuôi cấy, chất kích thích ra rễ.
2.2.5. Xác định giá thể cấy cây con in vitro ra bầu.

2.3. Vật liệu nghiên cứu
* Chồi non của cây thông biến chủng Pinus caribaea var hondurensis (gieo -ơm từ

nguồn hạt nhập nội) đ-ợc 2 năm tuổi.
* Chồi đỉnh của cây mầm thông vô trùng nảy mầm trong ống nghiệm từ hạt (biến
chủng Pinus caribaea var hondurensis) nhập nội.
* Chồi của cây hom thông 4 năm tuổi của Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu
giấy Phù Ninh đ-ợc dẫn về từ cây trội thông Pinus caribaea var. hondurensis xuất
xứ Poptun (Guatemala).


- 23 -

2.4. Ph-ơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm đ-ợc duy trì trong điều kiện nhân tạo với:
+ Số giờ chiếu sáng: 10 h/ ngày.
+ C-ờng độ ánh sáng: 1500 - 3000 lux.
+ Nhiệt độ: 25 - 29 oC.
2.4.2. Ph-ơng pháp nuôi cấy
Tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy là đoạn chồi non của cây hom; cây hạt và
cây mầm vô trùng. Nuôi cấy đoạn chồi non là một ph-ơng pháp đ-ợc ứng dụng
rộng rãi trong sản xuất nông lâm nghiệp. Qúa trình nuôi cấy cơ quan qua các b-ớc
sau:
- Cấy khởi động: là giai đoạn khử trùng, đ-a mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn
này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái
sinh tốt. Khử trùng mẫu bằng chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn, đ-ợc tiến
hành qua các b-ớc:
* Rửa sạch mẫu trong n-ớc xà phòng loãng tr-ớc khi sử dụng hợp chất tiệt
trùng.
* Rửa lại mẫu d-ới vòi n-ớc chảy trong vòng 10 - 15 phút.
* Nhúng mẫu trong dung dịch cồn 75o trong 20 giây.
* Ngâm mẫu trong dung dịch khử trùng với khoảng thời gian từ 5 - 30 phút.

* Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại mẫu bằng n-ớc cất đã vô trùng.
- Tạo và nhân nhanh chồi: là giai đoạn kích thích mô cấy phát sinh hình thành
nhiều chồi. Vấn đề là phải xác định đ-ợc môi tr-ờng và điều kiện nuôi cấy thích
hợp để có thể có hiệu quả cao nhất.
+ Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy: Tiến hành nuôi cấy trên các môi
tr-ờngdinh d-ỡng cơ bản có bổ sung 4,5 g/l agar; 20 g/l đ-ờng và độ pH của các
môi tr-ờng đ-ợc điều chỉnh đến 5,8. Khi xác định đ-ợc công thức có hàm l-ợng
dinh d-ỡng thích hợp thì tiếp tục thử nghiệm ảnh h-ởng của việc bổ sung thêm các


- 24 -

chất cytokinin (Kinetin và BAP) ởcác nồng độ từ 0,1 2,5 mg/l, mục đích tìm ra
chất và nồng độ cytokinin thích hợp.
+ Nhân chồi: Trên cơ sở của thí nghiệm tái sinh mẫu ban đầu, tiếp tục thử nghiệm
môi tr-ờng tối -u cho qúa trình nhân nhanh chồi thông. Tiến hành thử nghiệm ảnh
h-ởng của việc bổ sung phối hợp giữa cytokinin với các chất auxin (NAA, IBA,
IAA), nồng độ từ 0,1 1,0 mg/l nhằm tìm ra môi tr-ờng tối -u cho việc nuôi cấy
chồi thông.
- Tạo rễ và huấn luyện: là giai đoạn chuyển chồi từ môi tr-ờng nhân nhanh sang
môi tr-ờng tạo rễ để có đ-ợc cây con hoàn chỉnh. Chọn các chồi đủ tiêu chuẩn
(chiều cao, màu sắc, hình dạng) nuôi cấy trên các môi trường tạo rễ, mục đích
tìm ra môi tr-ờng thích hợp tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, rễ, lá. Sau đó
cây con đ-ợc huấn luyện để thích nghi với điều kiện bên ngoài.
- Đ-a cây in vitro ra điều kiện bên ngoài: Để tìm giá thể thích hợp cho cây con
có tỷ lệ sống cao khi đ-a ra ngoài điều kiện tự nhiên, tiến hành các thử nghiệm về
thành phần ruột bầu.
2.4.3. Các thí nghiệm và ph-ơng pháp bố trí thí nghiệm
+ Thí nghiệm 1: Xác định thời điểm lấy mẫu vật nghiên cứu (4 đợt/năm; 3 lần
lặp/đợt; 30 mẫu/lần lặp).

Đợt 1 (8/2005).
Đợt 2 (11/2005).
Đợt 3 (2/2006).
Đợt 4 (5/2006).
+ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh h-ởng của loại vật liệu nhân giống và tuổi vật liệu
nhân giống đến sự tái sinh chồi in vitro. Thí nghiệm tiến hành vào tháng Tám, đ-ợc
bố trí 3 lần lặp, 20 mẫu /lần lặp. Các đoạn chồi đ-ợc xử lý và khử trùng, đ-a vào
ống nghiệm, sau 5 tuần nuôi cấy những mẫu sạch và có khả năng nảy chồi đã đ-ợc
sử dụng trong thí nghiệm gồm:
Công thức A1: Chồi đỉnh của cây mầm vô trùng 45 ngày tuổi.


- 25 -

Công thức A2: Chồi đỉnh của cây mầm vô trùng 60 ngày tuổi.
Công thức A3: Chồi đỉnh của cây mầm vô trùng 75 ngày tuổi.
Công thức B1: Đoạn chồi non 45 ngày tuổi của cây hạt 2 năm tuổi.
Công thức B2: Đoạn chồi non 60 ngày tuổi của cây hạt 2 năm tuổi.
Công thức B1: Đoạn chồi non 75 ngày tuổi của cây hạt 2 năm tuổi.
Công thức C1: Đoạn chồi non 45 ngày tuổi của cây hom 4 năm tuổi.
Công thức C2: Đoạn chồi non 60 ngày tuổi của cây hom 4 năm tuổi.
Công thức C1: Đoạn chồi non 75 ngày tuổi của cây hom 4 năm tuổi.
+ Thí nghiệm 3: ảnh h-ởng của môi tr-ờng nuôi cấy (hàm l-ợng khoáng) lên khả
năng tái sinh chồi invitro từ mẫu nuôi cấy. Thí nghiệm đ-ợc bố trí 3 lần lặp, 30
mẫu/lần lặp. Vật liệu nuôi cấy là các đoạn chồi non (1,7 2,0 cm) đ-ợc tách riêng
ra khỏi cụm chồi, cấy vào các môi tr-ờng thí nghiệm có 2 % đ-ờng sacaroza, 4,5 %
agar và bổ sung BAP (0,5 mg/l).
Công thức 1 (WPM): Nuôi cấy trên môi tr-ờng WPM (1981)
Công thức 2 (SH): Nuôi cấy trên môi tr-ờng SH (1972)
Công thức 3 (LPm): Nuôi cấy trên môi tr-ờng LPm (1981)

Công thức 4 (MCM): Nuôi cấy trên môi tr-ờng MCM (1983)
Công thức 5 (AE): Nuôi cấy trên môi tr-ờng AE ()
Công thức 6 (Cheng): Nuôi cấy trên môi tr-ờng Cheng (1977,1978)
Công thức 7 (GD): Nuôi cấy trên môi tr-ờng GD (1972)
Công thức 8 (GD-mod): Nuôi cấy trên môi tr-ờng GD-mod (1981)
Công thức 9 (SH-mod): Nuôi cấy trên môi tr-ờng SH-mod (1981)
+ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh h-ởng của các chất điều hoà sinh tr-ởng lên khả
năng nhân chồi và sinh tr-ởng của chồi. Thí nghiệm thực hiện với 3 lần lặp, 5 bình
nuôi/lần lặp, 6 chồi /bình.
++ Thí nghiệm 4.1: Nghiên cứu ảnh h-ởng của các chất điều hoà sinh tr-ởng nhóm
cytokinin lên khả năng nhân chồi và sinh tr-ởng của chồi. Vật liệu nuôi cấy là các