Đề tài: Quy trình định lượng S.Aureus bằng phương pháp đếm đĩa
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.34 MB, 21 trang )
BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA THỦY SẢN
MÔN:MÔN:
MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM ĐĨA
GVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH
NHÓM THỰC HIỆN: 7
1. Tổng quan về vi khuẩn staphylococcus aureus:
Đặc điểm:
- Hiếu khí hay kị khí tùy ý
- Cầu khuẩn, Gram (+), chùm nho
- Có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNA, phosphatese
- Khả năng lên men đường manitol, trehalose, sucrose
- Phản ứng đặc trưng: phản ứng đông tụ huyết tương
Phân bố:
- Thịt, cá, rau quả,sữa, trứng,…qua con đường tiếp xúc với
người thao tác trong quá trình chế biến. Ngoài ra còn có trên
lông, mụn nhọt, vết thương,…
- Có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl.
- Hầu hết các vòng tan máu đều tạo sắc tố vàng sau 1 – 2 ngày
nuôi cấy ở nhiệt độ phòng.
- Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt.
staphylococcus aureus
Quy trình định
lượng S.aureus
2.1 Phạm vi áp dụng:
- Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4830 – 1: 2005
( ISO 6888-1 : 1999)
- *TCVN 4830-1:2005 : tiêu chuẩn này quy định phương pháp
định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với
coagulase trên đĩa thạch có mặt trong các sản phẩm dùng cho
con người hoặc thức ăn chăn nuôi, bằng cách đếm số khuẩn lạc
thu được trên môi trường đặc ( môi trường Baird-Packer) ở
350C – 370C.
2.2 Nguyên tắc:
- Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc, một lượng
mẫu qui định (sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù).
- Ủ các đĩa ở điều kiện hiếu khí ở 37oC và kiểm tra 24h
hoặc 48h.
- Tính số lượng Staphylococcus aureus trong một ml
hoặc một gram mẫu từ những khuẩn lạc điển hình và
không điển hình trên các đĩa ở độ pha loãng khác nhau
và khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính.
2.3 Môi trường và hóa chất:
Môi trường
Công dụng
Dung dịch Saline Peptone Water
(SPW)
Dung dịch đẳng trương để pha loãng
mẫu
Môi trường chọn lọc để nuôi cấy
S.aureus
Môi trường Baird – Parker
Môi trường Trypticase Soy Agar
(TSA)
Brain heart broth (BHI)
Huyết tương thỏ
HCl 10%
NaOH 10%
Bảo quản và phục hồi vsv trong quá
trình nuôi cấy
Dùng để khẳng định S.aureus
Chỉnh pH môi trường
2.5 Qui trình phân tích:
Chương 3: Thuyết minh qui trình
Bước 1: chuẩn bị mẫu thử và
huyền phù ban đầu
Lấy 10g ( mẫu rắn) hoặc
hút 10ml ( mẫu lỏng)
90ml dung dịch pha
loãng SPW
( hoặc túi nhựa vô
trùng )
Cho vào máy dập mẫu (mẫu rắn) hoặc lắc đều (mẫu lỏng)
Đồng nhất mẫu
Bước 2: Pha loãng mẫu
DD 10 -2
Hút 1ml dd 10 -1
9ml SPW
Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10 4, 10 -5,… cho đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp.
Bước 3: Phân lập trên môi trường chọn lọc
Hút 0.1ml dd mẫu
BPA
Bước 4: quan sát, đếm số khuẩn lạc
Sau 24h
Sau 24h tiếp theo
Đánh dấu
khuẩn lạc
điển hình
Khuẩn lạc S.aureus dương
tính,đánh dấu khuẩn lạc
không điển hình
Bước 5+6: Phục hồi và khẳng định
Cấy 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc
không điển hình từ BPA sang các ống
nghiệm tương ứng chứa 5ml môi trường BHI
Ủ 37 ± 1oC trong 24 ± 3h
Hút 0,1 ml dịch nuôi cấy BHI vào ống nghiệm có
kích thước 10mm × 75mm đã chứa 0,3 ml huyết
tương thỏ ( hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất)
Kiểm tra sự động tụ của huyết tương sau 4, 6, 8,
24h
Xác định tỷ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc
đặc trưng và không đặc trưng.
Báo cáo kết quả
- Âm tính: không có khối đông, hỗn hợp dung dịch vẫn
đồng nhất như ống không cấy.
- Dương tính: có khối động tụ huyết tương chiếm ¾.
Âm tính
Dương tính
Bước 7: báo cáo kết quả
Ví dụ
Nồng độ
pha
loãng
Nt
Na
30
Số khuẩn lạc
thử nghiệm
phản ứng
coagulase
Số phản ứng
coagulase (+)
Ht
5
5
5/5
5
2
5
5
5
1
Ha
10-2
47
5
2/5
5/5
10-3
8
1/5
Kết quả
