ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA HÓA-BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
‫־־־־־־־־־־־******־־־־־־־־־‬

GIÁO TRÌNH

THÍ NGHIỆM KỸ THUẬT SINH
HỌC PHÂN TỬ

Người soạn: Ths.PHẠM THỊ KIM THẢO

Đà Nẵng, 2016


NỘI DUNG THỰC HÀNH

Bài 1: Tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn
Bài 2: Một số phương pháp định tính và định lượng DNA thô
Bài 3: Thiết lập phản ứng PCR
Bài 4: Tách chiết plasmid

Kế hoạch thí nghiệm (5 buổi)
YÊU CẦU THÍ NGHIỆM
Sinh viên xem kỹ tài liệu, phần tính toán, cách pha hóa chất cho thí nghiệm

KẾ HOẠCH THÍ NGHIỆM
Buổi 1
Kiểm tra
Làm quen với các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong sinh học phân tử, Chuẩn bị hóa
chất, môi trường, nuôi cấy vi khuẩn

Buổi 2 (Bài 1)
Kiểm tra
Tiến hành tách chiết DNA từ tế bào vi khuẩn
Buổi 3: (Bài 1 phần còn lại và Bài 2)
Nhận xét buổi làm thứ 2, và thực hành bài số 2
Buổi 4:
Làm bài 3 (thiết lập phản ứng PCR) và bài 4


YÊU CẦU CHUNG VÀ QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG
THÍ NGHIỆM SHPT
1. Quy tắc làm việc trong phóng thí nghiệm
-

Phải tôn trọng trật tự ngăn nắp và vệ sinh phòng thí nghiệm

-

Mỗi người mỗi nhóm có nơi làm việc riêng, chỉ sử dụng những dụng cự thiết bị
dành riêng cho mình. Thiếu thì phải hỏi cán bộ hướng dẫn. Tuyệt đối không lấy của
người khác.

-

Trong phòng thí nghiệm không được ăn uống hút thuốc, giữ im lặng… luôn mặc áo
Blue khi làm việc

-

Không được tự điều chỉnh hoặc sử dụng những thiết bị của phòng thí nghiệm khi

chưa được hướng dẫn.

-

Sau khi thí nghiệm xong phải làm vệ sinh, rửa dụng cự thí nghiệm và sắp xếp gọn
gàng nơi làm việc

-

Trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm phải rửa tay bằng xà phòng diệt khuẩn. Trường
hợp cần thiết phải sát trùng bằng cồn

Tiến hành ghi chép thí nghiệm:
Trong sổ phải ghi chép đầy đủ các điều có liên quan đến việc hoàn thành các thí
nghiệm. Phải ghi chép cẩn thận, rõ ràng và theo một trật tự nhất định.
Ví dụ :1/ Tên thí nghiệm, ngày bắt đầu và ngày kết thúc.
2/ Đối tượng nghiên cứu
3/ Những điều kiện tiến hành thí nghiệm
4/ Nguyên tắc cơ bản của phương pháp phân tích đã sử dụng
5/Kết quả nhận được.
Các số liệu phải ghi thành từng bảng. Nếu cần thiết phải làm đồ thị, biểu đồ, hình
vẽ, ghi chép tất cả các số liệu thực nghiệm và các tính toán vào trong sổ.


CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỪ
1. Micropipettes đơn kênh (Pipetman)
Đặc điểm cấu tạo :

Hình 1.1: Cấu tạo pipet, cách cầm pipetman (micropipet) và các tip tương ứng.
- Đặc điểm phân loại:

Dựa vào thể tích lấy mẫu người ta chia micropipet thành 6 loại:
Bảng 1.1: Các loại pipetman và thể tích tương ứng
STT
1
2
3
4
5
6

Loại pipet
P-2
P-10
P-20
P-100
P-200
P-1000

Giới hạn sử dụng (l)
0.1-2
0.5-10
2-20
10-100
50-200
100-1000

Độ chia nhỏ nhất(l)
0.002
0.02
0.2

0.2
0.2
2.0

Bảng 1.1: Ví dụ sử dụng pipetman mix theo thể tích

Chú ý:
- Cắm đúng loại tip của từng pipet (tương ứng với thể tích cần hút)
- Không dốc ngược pipetman khi đang hút hóa chất
- Không được chỉnh quá giới hạn thể tích qui định trên thân pipet
- Cuối buổi thí nghiệm phải điều chỉnh pipet về trạng thái nghỉ (giá trị lớn nhất hoặc
nhỏ nhất )


BÀI 1: TÁCH CHIẾT DNA TỪ TẾ BÀO VI KHUẨN
Nguyên tắc chung: Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu
nhận một lượng acid nucleic đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Yêu cầu
của kĩ thuật tách chiết acid nucleic là thu nhận được phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa
không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Các acid nucleic cần được tách chiết trong
điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase, Rnase).
Qui trình tách chiết acid nucleic (DNA, RNA) thường gồm 3 bước chính sau:
1. Phá bỏ màng tế bào và (màng nhân)
Có thể phá bỏ màng tế bào và (màng nhân)bằng phương pháp hóa học, vật lí hoặc cơ học.
Đối với phương pháp hóa học, thường sử dụng các chất tẩy như SDS (Sodium dodecyl sulfat),
Triton X 100 với nồng độ thích hợp. Đối với phương pháp vật lí, người ta thường sử dụng sóng
siêu âm để phá vỡ màng tế bào. Đối với các mẫu mô thực vật, động vật, trước tiên cần sử dụng
phương pháp cơ học như xay, nghiền trong nitơ lỏng để thu nhận các tế bào đơn..
2. Loại bỏ protein
Để thu nhận acid nucleic (DNA, RNA) cần phải loại bỏ các thành phần không mong muốn
trong mẫu, chủ yếu là protein. Ở đây thường dùng hỗn hợp gồm phenol, chloroform và

isoamylalcohol theo tỉ lệ thể tích 25:24:1. Phenol có tác dụng làm biến tính protein và không hòa
tan nucleic acid. Chloroform cũng có tác dụng làm biến tính protein nhưng nó còn có tác dụng loại
bỏ hoàn toàn phenol ra khỏi phần dung dịch có chứa DNA. Isoamylalcohol giúp ổn định giữa hai
pha nước và pha chloroform.
Trong các phương tách chiết DNA thì phương pháp sử dụng phenol: chloroform là phương
pháp cơ bản. Ở nhiệt độ thường phenol ở dạng tinh thể rắn (tan chảy ở 80 °C) nhưng khi lẫn với
khoảng 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử phenol ở giữa với các phân
tử nước vây quanh. Khi pha hỗn hợp này vào dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kị nước nên
có khuynh hướng liên kết vào vùng kị nước của protein ở bên trong cấu trúc của các phân tử này,
kết quả làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhóm bên kị nước (của gốc amino acid) ra ngoài.
Các nhóm kị nước này của protein khi đó kết hợp với nhau tạo thành kết tủa gồm nhiều phân tử
protein khác nhau. Trong khi đó DNA vẫn tiếp tục là chất tan trong nước, dựa vào tính chất này có
thể phân tách DNA và protein nhờ vào kĩ thuật li tâm.
3. Tủa nucleic acid
Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận acid nucleic dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo
vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch
theo các nồng độ mong muốn. Hai cách tủa thông thường là:
- Tủa trong ethanol: việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng
độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 thể tích ethanol:1 thể tích mẫu), nhiệt độ
thấp thuận lợi cho việc tủa.
- Tủa trong isopropanol: điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện
diện của muối, thể tích isopropanol: thể tích mẫu = 0,8-1
Thực hành tách chiết DNA từ mẫu vi khuẩn
A. VẬT LIỆU
Dịch tế bào vi khuẩn bacillus subtilic
B. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ
- Micropipet đơn kênh loại 1000 µl, 200 µl
- Pipet thủy tinh
- Eppendorf loại 1,5 ml



- Máy li tâm lạnh
- Máy vortex (lắc rung)
C. HÓA CHẤT
- Dung dịch TE 10X
+ Tris pH 8.0 100mM
+ EDTA 50mM
- Dung dịch NaCl 0,5 M
- Dung dịch Phenol:Chloroform (1:1)
- Dung dịch Chloroform
- Dung dịch Ethanol tuyệt đối
- Dung dịch Ethanol 70%
D. CÁCH TIẾN HÀNH
- Hút 1,5 ml dịch tế bào vi khuẩn cho vào eppendorf. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút.
Thu cặn tủa.
- Hòa cặn tủa trong 500 µl dung dịch TE 1X, bổ sung thêm 50 µl NaCl 0,5 M và 50 µl SDS
10 %. Huyền phù nhẹ nhàng. Ủ hỗn hợp ở 650C trong 10 phút. Chuyển hỗn hợp sang ủ trên đá
trong 5 phút.
- Thêm một thể tích dung dịch phenol:chloroform vào hỗn hợp trên. Lắc mạnh bằng vortex
trong 30 giây.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C. Thu lấy phần dịch phía trên (là pha nước
có chứa DNA), nhẹ nhàng chuyển sang một eppenforf khác.
- Thêm một thể tích dung dịch chloroform, Lắc mạnh bằng vortex trong 30 giây.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, ở 40C. Thu lấy phần dịch phía trên (là pha nước
có chứa DNA), nhẹ nhàng chuyển sang một eppenforf khác.
- Thêm 50 µl dung dịch NaCl 0,5M. Bổ sung 2-2,5 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh (hoặc
0,8-1 thể tích isopropanol). Ủ ở -200C trong 1-2 giờ.
- Ly tâm 12000 vòng/phút, trong 30 phút, ở 40C. Thu cặn tủa.
- Thêm 500 µl dung dịch ethanol 70% để rửa tủa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút, ở
0

4 C. Thu cặn tủa. Để khô.
- Hòa tủa trong dung dịch TE 1X, bảo quản dịch DNA ở -200C.
Yêu cầu: SV nắm được nguyên tắc và ý nghĩa của các bước trong qui trình tách chiết DNA.
Câu hỏi: Nêu mục đích của các bước trong qui trình tách chiết DNA được sử dụng trong bài thực
hành.


BÀI 2: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH VÀ
ĐỊNH LƯỢNG THÔ DNA
Sau khi thu nhận DNA ở dạng sạch, người ta có thể tiến hành phân tích định tính và định
lượng chúng bằng một số phương pháp như đo mật độ quang, điện di, sắc kí…Trong bài thực hành
này, chúng ta tiến hành định lượng bằng quang phổ kế và điện di để kiểm tra độ tinh sạch cũng
như xác định hàm lượng DNA đã thu nhận được trong bài 1.
2.1. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế.
Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid (DNA, RNA) có
trong mẫu. Nguyên tắc của phương pháp này như sau: đối với nucleic acid, do sự tương tác giữa
các proton và các electron của vòng purine và pyrimine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ở
bước sóng 260 nm trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ 230 nm-240 nm và
không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310 nm. Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác
định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260
nm. Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường độ ion. Độ hấp thụ
tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm.
Nồng độ acid nucleic trong mẫu được xác định dựa vào tương quan như sau:
Một đơn vị OD 260nm tương ứng với một nồng độ là:
- 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi
- 40 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đơn hoặc RNA
- 20 µg/ml cho một dung dịch oligonucleotide.
Khi tính toán nồng độ dung dịch acid nucleic cần chú ý độ pha loãng của dung dịch. Cách
tính này chỉ đúng với các dung dịch acid nucleic sạch.
Trong mẫu acid nucleic thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm tăng độ

hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid được
đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm và 280nm. Được tính bằng
công thức sau:
Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280
Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch acid nucleic được xem là tinh sạch (không
tạp nhiễm protein)
❖ Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect)
Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm của DNA tăng lên khi DNA biến tính tức
là hai sợi đơn tách rời khỏi nhau. DNA không bền đối với nhiệt. Khi tăng nhiệt độ của DNA lên
quá nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) thì mạch đôi sẽ tách ra do sự phá vỡ của các liên kết Hidro.
Nểu để nhiệt độ giảm từ từ thì hai sợi đơn lại bắt cặp với nhau nhưng chúng không có khả năng bắt
cặp lại khi làm lạnh đột ngột sau khi biến tính.
Thực hành xác định nồng độ dung dịch DNA
A. Vật liệu
Dung dịch DNA thu được ở bài 1
B. Dụng cụ - thiết bị
- Micropipet đơn kênh loại 1000 µl, 200 µl
- Cuvet thủy tinh
- Eppendorf loại 1,5 ml
- Máy đo quang phổ UV-VIS
C. Hóa chất
- Dung dịch TE 1X (để pha loãng mẫu)
D. Cách tiến hành
Xác định độ tinh sạch và nồng độ dung dịch DNA


- Hút 20 µl dung dịch DNA, hòa trong 80 µl dung dịch TE 1X
- Tiến hành đo giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD 260) và 280 nm.
- Ghi nhận kết quả, tính nồng độ ban đầu của dung dịch DNA.
Quan sát hiện tượng siêu sắc.

- Lấy toàn bộ dung dịch DNA ở trên cho vào một eppendorf sạch. Đun ở 100 0C trong 10
phút rồi nhanh chóng làm lạnh trên đá trong 5 phút.
- Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch DNA vừa biến tính ở bước sóng 260 nm (OD
260 *)
- So sánh giá trị OD 260 ban đầu và OD 260 của dung dịch DNA sau biến tính.
2.2. Phương pháp điện di
Phương pháp này được sử dụng trong phân tích định tính và trong việc thu nhận mẫu acid
nucleic.
Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic. Đó là các
đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động một điện trường, chúng
sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của các phân tử acid nucleic phụ thuộc
vào hai yếu tố chính: khối lượng phân tử và nồng độ các chất thành gel. Ngoài ra, cấu hình của
phân tử cũng ảnh hưởng đến khả năng di động.
Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu acid nucleic là gel polyacrylamide và gel
agarose. Việc lựa chọn gel cũng như nồng độ của chất cấu thành gel phụ thuộc vào kích thước
trung bình của các đoạn acid nucleic cần phân tách.
Trong bài thực hành này, chúng ta sẽ tiến hành điện di trên gel agarose. Đây là loại gel
thông dụng nhất, thao tác đơn giản, có thể phân tách được những đoạn có kích thước trong khoảng
0,1-20kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm
ngang.
Quá trình điện di thường sử dụng một số dung dịch điện li như Tris-acetate-EDTA (TAE),
Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,57,8. Các dung dịch này không những thiết lập một giá trị pH thích hợp để bảo vệ cấu trúc acid
nucleic trong quá trình điện di, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho quá trình dẫn điện
(conductivity).
Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được quan sát dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một chất có
tên là Ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của các acid
nucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang (màu đỏ cam). Trong bài thực hành
này, EtBr sẽ được cho vào gel trước khi đổ.
Ngoài ra, để ước lượng kích thước của các trình tự acid nucleic trong gel agarose, người ta
sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử “, Đó là tập hợp nhiều trình tự DNA có kích

thước đã biết trước (gọi là thang DNA).
Thực hành điện di mẫu DNA thu được
A. Vật liệu
Dung dịch DNA thu được ở bài 1
Thang DNA
B. Hóa chất – dụng cụ - thiết bị
Agarose 1%
Dung dịch điện di TBE 1X
Dung dịch tải mẫu
Dung dịch Ethidiume bromide 10mg/ml
Bộ điện di nằm ngang
Bộ đổ gel
C. Cách tiến hành
❖ Chuẩn bị gel agarose 1%


Trong bài thực hành này, chúng ta tiến hành điện di trên gel agarose 1 % và sử dụng dung
dịch điện di TBE
Cân 1g agarose, bổ sung 100 ml dung dịch TBE. Đun cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để
nguội và bổ sung 2 µl dung dịch EtBr 10 mg/ml. Tiến hành lắp lược và đổ gel vào khuôn như hình
vẽ.
Chú ý: Ethidium bromide là một tác nhân gây đột biến. Vì thế, luôn đeo găng tay khi thao tác.

-

Lấy 20 µl dung dịch DNA, hòa trong 5 µl dung dịch tải mẫu 5X. Trộn đều.

-

Tiến hành nạp mẫu vào giếng như hình vẽ


-

Điện di trong 30 phút, ở hiệu điện thế 90-120 V

-

Quan sát kết quả dưới ánh sáng tử ngoại.

Yêu cầu: Sinh viên tính toán nồng độ dung dịch DNA tách chiết được ở bài 1, đồng thời ghi nhận
lại kết quả điện di. Nhận xét.
Trường hợp mẫu DNA không tinh sạch thì cách xử lí như thế nào?


BÀI 3: THIẾT LẬP PHẢN ỨNG PCR
( POLYMERASE CHAIN REACTION)
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
enzyme polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 là một kỹ thuật được sử dụng
phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại. PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài mồi (primer)
nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị luân
nhiệt (thermocycler) còn gọi là máy PCR (Hình 3.1).

Hình 3.1. Máy PCR của Hãng Bio-Rad.

3.1. Nguyên tắc của PCR
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều
cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp
bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành các mạch
mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa vào các đặc tính của các DNA polymerase. Taq
polymerase là một loại DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus

aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có bốn loại
deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai mồi (mồi xuôi và mồi ngược), trên cơ
sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới
hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được
nhân lên gấp nhiều lần. Mồi xuôi (forward primer, ký hiệu là F) sẽ bắt cặp đặc hiệu trên mạch
DNA 3’→5’. Mồi ngược (reverse primer, ký hiệu là R) sẽ bắt cặp đặc hiệu trên mạch DNA 5’→3’.
Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
- Biến tính (denaturation)
Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi
đơn (single strands). Quá trình biến tính được thực hiện ở nhiệt độ ở 94-95oC trong vòng 30 giây 1 phút.
- Bắt cặp mồi (annealing)
Trong giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt
cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng ở 40-65oC, tùy thuộc vào
Tm của mồi sử dụng.
- Kéo dài (extension)
Giai đoạn này, nhiệt độ được tăng lên đến 70-72oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq
polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có mồi theo chiều 5’→3’. Thời gian kéo
dài tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần nhân bản.


Hình 3.2. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase (PCR).

Hình 3.3. Các chu kỳ của kỹ thuật khuếch đại PCR.
Một chu kì gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm tăng gấp đôi số
lượng bản sao của lần trước.
Thực hành khuếch đại gen mã hóa enzyme cellulose của vi khuẩn bacillussubtilic bằng PCR
A. Vật liệu
DNA bản mẫu tách chiết ở bài 1
B. Hóa chất – Dụng cụ - Thiết bị
Mồi xuôi và mồi ngược: mỗi mồi nồng độ 10 pmol/μl.

Enzyme Taq polymerase (Fermentas) và dung dịch đệm
dNTP (gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Dung dịch MgCl2
Nước cất 2 lần đã hấp khử trùng
Các hóa chất dùng cho Điện di (kiểm tra sản phẩm)
Eppendorf dùng cho phản ứng PCR
Máy luân nhiệt PCR (Bio-Rad)
Hệ thống điện di nằm ngang
C. Cách tiến hành


Trong bài thực hành này, chúng ta sẽ tiến hành nhân bản gen từ DNA bộ gen bacillus
subtilic thu nhận được trong bài 1. Gen có kích thước khoảng 750 bp
Mỗi nhóm tiến hành thiết lập một phản ứng PCR (thể tích V= 25 µl) như sau:
Nước cất 2 lần

11,5 µl

Dung dịch đệm

2,5 µl

MgCl2

5 µl

dNTP

2,5 µl


Dịch DNA

1 µl

Mồi xuôi

1 µl

Mồi ngược

1 µl

Taq polymerase

0,5 µl

+Chu kì nhiệt
950C - trong 5 phút
950C - trong 1 phút
550C - trong 30 giây
720C - trong 1 phút
720C - trong 5 phút

30 chu kì

Điện di kiểm tra sản phẩm sau phản ứng PCR-Điện di trên gel Agarose (1 %)
Tiến hành tương tự như bài 2.
Yêu cầu: Mỗi nhóm dựa vào kết quả điện di, xác định kích thước sản phẩm PCR của nhóm. Vẽ lại
kết quả điện di. Nhận xét kết quả.



BÀI 4: TÁCH CHIẾT PLASMID
Hiện tại, có 3 phương pháp chính thường được dùng để tách DNA plasmid ra khỏi vi khuẩn
(thường là E. coli):
-

Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm

-

Phương pháp đun sôi

-

Phương pháp dùng Lithium

Việc chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào điều kiện thí nghiệm và mục đích nghiên cứu.
Trong thực nghiệm thì cả 3 phương pháp trên đều cho hàm lượng và chất lượng DNA tốt, đảm bảo
cho các thí nghiệm tiếp theo.
Cả 3 phương pháp đều liên quan đến việc thu nhận DNA plasmid mạch vòng từ hỗn hợp lẫn tạp
với DNA genome mạch thẳng.
Việc xử lý hoặc là bằng base hay bằng chất tẩy đều với mục đích là phá huỷ mối liên kết giữa
các cặp base (của DNA) làm cho DNA genome mặch thẳng bị biến tính và dễ dàng loại bỏ bằng ly
tâm. Trong khi đó, vì DNA plasmid ở dạng siêu xoắn (supercoiled configuration) có đặc điểm là
dễ dàng phục hồi lại hình dạng ban đầu dưới điều kiện hồi tính.
1- Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm (alkaline lysis)
Vi khuẩn bị dung giải (lysis) khi xử lý với dung dịch chứa SDS (sodium dodecyl sulfate) và
NaOH. Trong đó, SDS sẽ làm biến tính protein – phá vỡ màng tế bào và NaOH (nằm trong Sol II)
sẽ làm biến tính DNA genome và DNA plasmid. Sau đó, hỗn hợp được trung hoà bằng potassium
acetate (CH3COOK) (nằm trong Sol III). Khi dung dịch đã được dung hoà thì DNA plasmid vòng

sẽ được hồi tính nhanh chóng và hoà tan vào trong dung dịch. Ngược lại, DNA genome và các
protein khác bị kết tủa và “vướng” vào trong phức hợp SDS-kali, sau đó được loại bỏ bằng ly tâm.
Chú ý: Phản ứng cắt enzyme sẽ không tốt khi DNA bị lẫn NaOH/SDS hay là kali acetate, do đó
cần phải rửa tủa cẩn thận bằng cồn 70%.
2- Phương pháp đun sôi (boiling)
Vi khuẩn có chứa DNA plasmid được phá vỡ bằng lysozyme, Triton-X100 (một chất tẩy phi ion –
nonionic detergent) và nhiệt độ. DNA genome sẽ vẫn bám vào màng tế bào vi khuẩn và được loại
bỏ bằng ly tâm. Trong khi đó, DNA plasmid được giải phóng và hoà tan vào trong dung dịch và
được thu nhận bằng cách tủa với alcohol.
Chú ý: Phương pháp này nhanh nhưng chất lượng DNA thấp hơn so với phương pháp thuỷ phân
bằng kiềm.
3- Phương pháp dựa vào Lithium
Khi xử lý với hỗn hợp Triton X-100/LiCl thì chỉ có màng trong (inner plasma membrane) của tế
bào vi khuẩn sẽ bị phân huỷ. Do đó, ở phương pháp này vẫn giữ được hình dạng của tế bào (vì
màng ngoài không bị phá huỷ), và tất nhiên là DNA plasmid vẫn còn bị giữ lại trong tế bào. Nhưng
sau khi bổ sung phenol/chloroform vào làm biến tính và kết tủa các protein nội bào. Đồng thời tế
bào sẽ co lại nhanh chóng và đẩy dung dịch nội bào (bao gồm cả DNA plasmid) ra ngoài, trong khi
đó thì DNA genome và protein sẽ bị giữ lại trong sinh khối tế bào và được loại bỏ bằng ly tâm.
Bảo quản DNA plasmid
- Bảo quản Plasmid trong tế bào:
Plasmid có thể được bảo quản thời gian ngắn (khoảng 1 tháng) khi tồn tại trong tế bào vi khuẩn và
được cất ở 40C.
Nếu muốn bảo quản tế bào chứa plasmid lâu hơn thì nên bổ sung 1V glycerol hoặc DMSO và
đông lạnh ở -70°C.
- Bảo quản DNA plasmid: DNA plasmid có thể được bảo quản trong đệm TE ở 4°C trong
một vài tuần. Nếu ở -20°C thì được vài năm.


Thực hành tách chiết palamid vi khuẩn Ecoli
A.


Vật liệu

- Tế bào Ecoli Bl21
B.

Hóa chất – Dụng cụ - Thiết bị

+ TE-RNAnase :

10mM Tris-HCl

pH = 8

1mM EDTA
100µg/ml RNAnase
100µl RNAnase (10mg/ml) vào 10ml TE (10:1)- được 100µg/ml RNAnase
+ SolI (solution I) : 50mM tris – HCl (pH=8)
10mM EDTA
Khử trùng????
+ Sol II:

NaOH 200mM
SDS 1%

+ Sol III: KAC (potassium acetate CH3COOK ) 3M pH = 5,5
Các hóa chất dùng cho Điện di (kiểm tra sản phẩm)
Eppendorf
Hệ thống điện di nằm ngang
C.


Cách tiến hành

- Hút 1,5 ml dịch tế bào vi khuẩn cho vào eppendorf. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút.
Thu cặn tủa.
- Hòa cặn tủa trong 150 µl dung dịch SolI, Lắc mạnh bằng vortex
- Thêm 150 µl dung dịch SolII, lắc nhẹ
- Thêm 150 µl dung dịch SolIII, đảo nhẹ.
- Thêm 450 µl chloroform:isoamylalcohol (24:1), đảo vài lần.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, ở 40C. Thu lấy 400 µl phần dịch phía trên (là pha
nước có chứa DNA plasmid), nhẹ nhàng chuyển sang một eppenforf khác.
- Thêm 40 µl (tỉ lệ 1:10) dung dịch NaOAC 3M và 1 ml Etanol 100%, lắc đảo vài lần.
(hoặc thêm 500µl isopropanol không NaOAC).Ủ ở -200C trong 2 giờ (hoặc -85 trong 30 phút)
- Ly tâm 12000 vòng/phút, trong 20 phút, ở 40C. Thu cặn tủa.
- Thêm 500 µl dung dịch ethanol 70% để rửa tủa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, ở
0
4 C. Thu cặn tủa. Để khô trong box (hoặc trong speedVac).
- Thêm 40 µl TE-ARN-nase, ủ 37°C từ 1-2h, bảo quản -20°C


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo chính:

[1] Nguyễn Hoàng Lộc, Giáo trình “Công nghệ AND tái tổ hợp”, 2005 , NXB DDHQG
TP Hồ Chí Minh.
[2] Nguyễn Thị Lang, Sinh học phân tử- giới thiệu phương pháp và ứng dụng, NXB
Nông nghiệp 2005
Tham khảo thêm:
[3]. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục 2008.
[4]. Hồ Huỳnh Thùy Dương và cộng sự, Thực tập Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc Gia

TPHCM.
[5]. E-book, Current Protocol in Molecular Biology
[6]. Jonh Wiley & Sons, Current protocols in molecular Biology, 2003.