TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
- -  - -

TRẦN HỒNG THU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO VẬT LIỆU KHỞI
ĐẦU VÀ BƢỚC ĐẦU TÁI SINH CHỒI IN VITRO
CÂY HOÀNG TINH HOA ĐỎ
(Polygonatum kingianum Coll et Hemls.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2017


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
- -  - -

TRẦN HỒNG THU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO VẬT LIỆU KHỞI
ĐẦU VÀ BƢỚC ĐẦU TÁI SINH CHỒI IN VITRO
CÂY HOÀNG TINH HOA ĐỎ
(Polygonatum kingianum Coll et Hemls.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

TS. LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. La Việt Hồng- Khoa Sinh
KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Phòng công nghệ AND
ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện để em hoàn thành
khóa luận này.
Em cũng xin chân thành cảm PGS.TS Lê Văn Sơn - Phòng Công nghệ
ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết
bị, phương tiện để em có thể hoàn thành khóa luận.
Trong thời gian thực hiện đề tài em cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng- Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2 cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện
Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để em hoàn thành đề tài
khóa luận.
Nhân đây em cũng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
góp ý cho em trong qua trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, tháng năm 2017
Sinh viên

TRẦN HỒNG THU


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em.Các số liệu
kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố.
Hà Nội, tháng năm 2017
Sinh viên

TRẦN HỒNG THU


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 4
1.1. Giới thiệu về chi Polygonatum ................................................................ 4
1.1.1. Phân loại ................................................................................................. 4
1.1.2. Mô tả chi Polygonatum ......................................................................... 4
1.1.3. Phân bố ................................................................................................... 4
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây thuộc chi Polygonatum ........................ 5
1.1.5. Giá trị dƣợc liệu .................................................................................... 5
1.1.6. Hiện trạng khai thác trong và ngoài nƣớc .......................................... 5
1.2. Một số phƣơng pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định
quan hệ di truyền ............................................................................................ 6
1.2.1. Giới thiệu DNA barcode ....................................................................... 7
1.3. Sơ lƣợc về nhân giống cây in vitro .......................................................... 9
1.3.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................... 9
1.3.2. Các giai đoạn nhân giống in vitro ...................................................... 10
1.3.3. Ƣu điểm của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật................. 11
1.3.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới nuôi cấy mô .............................................. 12
1.4. Các nghiên cứu về cây Hoàng tinh hoa đỏ ........................................... 15
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 16
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................ 16
2.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ............................................. 16

2.2.1. Vật liệu thực vật .................................................................................. 16
2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................... 16
2.2.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu............................................. 17
2.2.4. Hóa chất và môi trƣờng nuôi cấy ...................................................... 17


2.2.5. Điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................. 18
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 18
2.3.1. Thu thập mẫu và nhận dạng loài ....................................................... 18
2.3.2. Tái sinh chồi in vitro cây Hoàng tinh hoa đỏ .................................... 21
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 24
3.1. Đặc điểm phân loại loài Hoàng tinh hoa đỏ thu tại Sa Pa (Lào Cai) 24
3.1.1. Đặc điểm hình thái .............................................................................. 24
3.1.2. Đặc điểm phân loại loài bằng chỉ thị phân loại phân tử.................. 25
3.2. Tái sinh chồi in vitro cây Hoàng tinh hoa đỏ ....................................... 30
3.2.1. Tạo vật liệu khởi đầu .......................................................................... 30
3.2.2. Tái sinh chồi in vitro: .......................................................................... 32
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 38
4.1. Kết luận ................................................................................................... 38
4.2. Kiến nghị ................................................................................................ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi nhân bản gen barcode ................................... 17
Bảng 3.1: Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được
công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị psbA-trnH ........................ 28
Bảng 3.2: Hệ số tương đồng của mẫu nghiên cứu và của các loài đã được
công bố trên ngân hàng Genbank dựa trên chỉ thị RpoC ................................ 30
Bảng 3.3: Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu Hoàng Tinh Hoa Đỏ ................ 31

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi Hoàng Tinh Hoa
Đỏ sau 6 tháng nuôi cấy .................................................................................. 33
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IAA đến khả năng tạo chồi Hoàng
Tinh Hoa Đỏ sau 6 tháng nuôi cấy.................................................................. 35


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cây Hoàng tinh hoa đỏ ................................................................... 4
Hình 3.1: Mẫu cây thu tại Sa Pa-Lào Cai. ...................................................... 24
Hình 3.2: Kết quả điện di DNA tổng số của mẫu Hoàng tinh hoa đỏ nghiên
cứu ................................................................................................. 25
Hình 3.3: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR gen P10 (psbA-trnH) và gen
RpoC1 M: thang Marker 1Kb ....................................................... 26
Hình 3.4: Cây phân loại dựa trên chỉ thị psbA-trnH của mẫu nghiên cứu
(HoangTinhHoaDo) ...................................................................... 28
Hình 3.5: So sánh trình tự psbA-trnH (kí hiệu HTHD_Sapa_01) thu từ cây
Hoàng tinh hoa đỏ thu tại Sa Pa và của loài P.kingianum (Mã số
trên Genbank: KJ745828.1). ......................................................... 29
Hình 3.6: Cây phân loại dựa trên chỉ thị RpoC của mẫu nghiên cứu
(HoangTinhHoaDo) ...................................................................... 30
Hình 3.7: Quy trình tạo vật liệu Hoàng tinh hoa đỏ bằng phương pháp in vitro............32
Hình 3.8: Chồi in vitro của Hoàng tinh hoa đỏ sau 6 tháng nuôi cấy trên môi
trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng ........................... 34
Hình 3.9: Chồi in vitro của Hoàng tinh hoa đỏ sau 6 tháng nuôi cấy trên môi
trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng ........................... 36
Hình 3.10: Mẫu Hoàng tinh hoa đỏ sau 8 tháng nuôi cấy trên môi trường MS
bổ sung chất kích thích sinh trưởng .............................................. 37


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bp

Base pair

CBOL

Consortium for the Barcode of Life

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Kb

Kilobase

PCR


Polymerase Chain Reaction

TAE

Tris - Acetic acid - EDTA

Taq polymerase

Thermus aquaticus polymerase

NAA

Napthlacetic acid

BA

Benzyl adenin

IBA

Indol butyric acid

2,4-D

2,4- Dichlorophenoxy acetic aicd

BAP

6-Benzyl amino purin


MS

Murashige và Skoog


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Xu hướng phát triển hiện nay của nền y học Việt Nam cũng như một số
nước trong khu vực Đông Nam Á là quay về với nền y học cổ truyền, sử dụng
những bài thuốc dân gian dưới tác dụng của các loài cây dược liệu. Cây của
chi Polygonatum là một trong những loài dược liệu quý, được sử dụng rộng
rãi trong nghiên cứu và dùng để chữa trị nhiều bệnh [22]. Trong những năm
gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có một số nghiên cứu về chi
Polygonatumvà cho thấy Polygonatum là một chi khá phức tạp với số lượng
NST (2n= 16, 18, 20, 21, 22, 24, 26, 27, 28, 30, 31, 36, 38, 40,…) [18], được
đại diện bởi 60 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực ôn đới từ dãy
Himalaya đến Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, và Malaixia. Ở Trung Quốc có
32 loài gồm 20 loài là đặc hữu, trong đó có loài Polygonatum kingianum Coll.
Et Hemsl [22].Đây là một chi khá phức tạp nên việc nhận dạng loài nói chung
và nhận dạng cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ (Polygonatum kingianum Coll. Et
Hemsl) nói riêng là tương đối khó khăn. Hiện nay, phương pháp DNA
barcode là một trong những công cụ phục vụ định danh loài chính xác, nhanh
chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là
chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode). Việc xác định loài bằng
DNA chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài thực vật trong khi
những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định
danh hoặc phân biệt loài [12].
Hoàng tinh hoa đỏ là cây dược liệu thuộc chi Polygonatum được sử dụng
phổ biến trong Y học cổ truyền phương Đông với tên vị thuốc "Thục hoàng".
Theo Y học cổ truyền, Thục hoàng có tác dụng kiện tỳ, nhuận phế, ích thận,

được sử dụng để điều trị chứng ho khan, các bệnh về phổi nhờ tác dụng kháng
khuẩn hiệu quả; ngoài ra còn được dùng làm thuốc bổ. Ở nước ta, Hoàng tinh

1


hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll. Et Hemsl) mọc tự nhiên ở vùng đồi núi
các tỉnh phía Bắc như Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang... Cây thường mọc dưới
tán rừng ở khu vực có khí hậu mát, độ ẩm cao, đất nhiều mùn và tái sinh tự
nhiên bằng hạt [1], [4], [5]. Tuy nhiên, khả năng nảy mầm tự nhiên của hạt là
rất thấp, chất lượng cây con không đồng đều, hạt bị nhiễm bệnh,.. Ngày nay,
với kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật thì ngoài điểm là
có khả năng nhân giống từ nhiều bộ phận khác nhau của thực vật còn tạo ra
cây giống sạch bệnh, đảm bảo chất lượng củ.
Xuất phát từ thực trạng trên, nhằm góp một phần vào quy trình bảo tồn
Hoàng tinh hoa đỏ cũng như tạo ra nguồn giống sạch bệnh. Vì vậy, tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình tạo vật liệu khởi đầu và bước
đầu tái sinh chồi invitro cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ(Polygonatum kingianum
Coll et Hemls.)”
2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1 Mục đích nghiên cứu:
- Xác định hai chỉ thị phân tử của loài bằng kĩ thuật DNA Barcode.
- Xây dựng quy trình tạo vật liệu khởi đầuin vitro Hoàng Tinh Hoa Đỏ.
- Bước đầu tái sinh chồi cây Hoàng Tinh Hoa Đỏin vitro.
2.2 Nghiệm vụ nghiên cứu
- Phân lập, giải trình tự hai gen psbA-trnH, RpoC1
- Ảnh hưởng của javen đến quá trình khử trùng bề mặt tạo vật liệu khởi
đầu
- Ảnh hưởng của benzylamino purine(BAP) và BAP kết hợp với Axit βindol axetic (IAA) đến khả năng tạo chồi ở cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ và ảnh
hưởng của 2,4- Di Clo phenoxi axetic (2,4D) đến khả năng tạo mô sẹo.


2


3. Ý nghĩa
3.1 Ý nghĩa khoa học: là công trình đầu tiên ở Việt Nam nhằm bảo tồn
gen dược cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ
3.2 Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể sử dụng để thay thế
phương pháp truyền thống (hom củ) Hoàng Tinh Hoa Đỏ.

3


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về chi Polygonatum
1.1.1. Phân loại
Giới: Thực vật
Bộ: Măng tây (Asparagales)
Họ: Hoàng tinh (Convallariaceae)

Hình 1.1: Cây Hoàng tinh
hoa đỏ
1.1.2. Mô tả chi Polygonatum
Chi Polygonatum là thực vật có hoa, sống nhiều năm.Thân rễ (củ) to,
phân nhánh mọc ngang, chia đốt. Cây của chi Polygonatum đặc biệt ưa ẩm và
ưa bóng; thường mọc rải rác trên đất có nhiều mùn hoặc trên các hốc mùn đá,
dọc theo các bờ khe suối, dưới tán rừng kín thường xanh trên núi đá vôi. Độ
cao từ 1.000 - 1.700 m. Ở những nơi có hoàng tinh mọc tự nhiên, khí hậu
quanh năm mát, nhiệt độ trung bình từ 13,5 - 16,5°C. Cây sinh trưởng phát

triển mạnh trong mùa mưa ẩm, đến mùa đông toàn bộ phần trên mặt đất tàn
lụi và sẽ mọc lại vào đầu mùa xuân năm sau [8].
1.1.3. Phân bố
Chi Polygonatum được đại diện bởi 60 loài trên thế giới, phân bố chủ
yếu ở khu vực ôn đới từ dãy Himalaya đến Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, và
Malaixia. Ở Trung Quốc có 32 loài gồm 20 loài là đặc hữu [22]. Ở Việt Nam,
được tìm thấy ở Hà Giang (huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ); Sơn La
(Mường La); Điện Biên (Tủa Chùa); Lai Châu (Sìn Hồ, Phong Thổ, Than

4


Uyên); Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát); Yên Bái (Mù Căng Chải)... Gần đây mới
phát hiện một địa điểm phân bố tại xã Mường Hoong, huyện Đăk Glei, tỉnh
Kon Tum [8].
1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây thuộc chi Polygonatum
Nhiều nhóm nghiên cứu về thực vật trên thế giới đã phát hiện về sự đa
dạng của các hợp chất từ chi Polygonatum chủ yếu tập trung ở phần rễ (củ) là
saponin, các phytohoocmon, glycosides, flavonoid và alkaloids [14].
1.1.5. Giá trị dƣợc liệu
Chi Polygonatum là nguồn gen hiếm và độc đáo, đồng thời cũng là cây
thuốc quý. Thân rễ (củ) chế biến thành “thục hoàng” dùng làm thuốc bổ cho
người già, cơ thể bị suy kiệt, hoặc mới ốm dậy. Ngoài ra sử dụng trong điều
trị ho khan, các vấn đề về phổi, làm mát phổi, chữa huyết áp thấp [8]. Nó
được khuyên trong điều trị viêm dạ dày, kiết lỵ mãn tính, các rối loạn liên
quan đến hệ tiêu hóa [14]... Một số nghiên cứu cho thấy, trong thành phần hóa
học của các cây thuộc chi này có tác dụng giảm đau, lợi tiểu, hạ sốt, chống sốt
rét, chất chống oxy hóa, kháng khuẩn [13]...chính vì có giá trị dược liệu cao
mà chi này đang ở tình trạng suy giảm nghiêm trọng, hiện trở nên rất hiếm
gặp. Trong đó có nhiều loài như Hoàng tinh hoa đỏ, Hoàng tinh đốm... đã

được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) [8].
1.1.6. Hiện trạng khai thác trong và ngoài nƣớc
Chi Polygonatum đã bị khai thác nhiều lần ở tất cả các địa phương kể
trên. Đặc biệt trong những năm của thập kỷ 70 thuộc thế kỷ trước, ngành Y tế
đã thu mua được từ vài tấn đến vài chục tấn củ tươi mỗi năm. Do khai thác
liên tục nhiều năm, cộng với nạn phá rừng làm mất môi trường sống, đã làm
cho cây thuốc này bị giảm sút nghiêm trọng. Hoàng tinh thậm chí đã trở nên
rất hiếm gặp ngay cả những vùng được coi là có nhiều nhất ở Việt Nam cũng
như ở Trung Quốc hay phía Bắc của Lào [8].

5


Để bảo tồn, Hoàng tinh hoa đỏ đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam
(1996); Danh lục Đồ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001, 2006) và có tên trong
Danh mục II.A của Nghị định số 32/2006/NĐ - của Chính phủ (30/3/1006).
1.2. Một số phƣơng pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định
quan hệ di truyền
Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác
định loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên
nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống
nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có
thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với
thực vật, đặc điểm hình thái học của các loài thực vật qua nhận biết hình thái
lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực
quan tuy nhiên hiệu quả chưa cao. Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn khi
các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài.
Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian
sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện
đại.

Các phương pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hướng
nghiên cứu được phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, được xây dựng dựa
trên việc nhận biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon
sinh vật. Hiện nay, các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp có
hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài.
Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh
loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có
những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài. Để nhận dạng gen hay
đánh giá mức độ tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là
gen ribosome rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA

6


18S, 5S và 16S hay được dùng để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh
vật. So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá học, chỉ thị DNA cho độ chính xác
cao hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào [3].
1.2.1.Giới thiệu kỹ thuật DNA barcode
Kỹ thuật DNA barcode “DNA mã vạch” lần đầu tiên được sử dụng vào
năm 1993 (Arnon, 1993), trong một bài báo mà không nhận được sự chú ý
nhiều từ cộng đồng khoa học, và gần đây thuật ngữ này được sử dụng lại
trong nhiều nghiên cứu. Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng mộ
tkhu vựcDNA (400-800 bp) như là một tiêu chuẩn để nhận dạng các loài một
cách nhanh chóng và chính xác.Kỹ thuật DNA mã vạch giúp các nhà phân
loại họctrong công tác phân loại và xác định loài. Ngoài ra, kỹ thuật này có
triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa học
pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm.
Phương pháp này vô cùng có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinh
học cần giám định loài đã được qua xử lý, chế biến như các dạng chế phẩm
thuốc hay thực phẩm đã qua chế biến…

Trên thực tế, DNA barcode bắt đầu có tầm ảnh hưởng từ nghiên cứu
của Hebert và cs (2002), kết quả của nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng các cá thể
từ bộ sưu tập của 200 loài có quan hệ gần gũi với nhau thuộc bộ cánh vảy có
thể xác định với độ chính xác 100% bằng cách sử dụng gen ty thể cytochrome
c oxidase tiểu đơn vị I (COI) [21]. Sau đó, nhiều nghiên cứu về định danh loài
bằng chỉ thị DNA đã thành công trên động vật như chim, cá, ốc, nhện và một
số loài côn trùng thuộc bộ Cánh cứng. Gần đây, hệ thống chỉ thị DNA đang
được thiết lập cho các nhóm sinh vật khác như thực vật, tảo, nấm, sinh vật
nguyên sinh và vi khuẩn đã thu được hiệu quả đáng kể.
Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcode cho tất cả sinh vật nhân chuẩn,
CBOL (Consortium for the Barcode of Life ) đã được thành lập vào tháng 5

7


năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia. Với mục tiêu ban đầu là xây
dựng một thư viện trực tuyến trình tự barcode cho tất cả các loài chưa được
biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào. Với sự hỗ
trợ của CBOL, DNA barcode ngày càng phát triển và trở thành một phương
pháp phân loại và định danh loài mới.
Trong bối cảnh của nền kinh tế phát triển nhanh và hậu quả tác động
đến động vật, thực vật của các quốc gia khác nhau, sự xác định loài sử dụng
phương pháp nhanh là cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học của các khu vực
này nhằm bảo vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp. Tuy nhiên cần lưu ý
rằng DNA barcode không thể thay thế phân loại nhưng nó là công cụ hữu ích
để tạo ra thông tin về đơn vị phân loại chưa biết. Hiện nay, trên thế giới, kỹ
thuật này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà
khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế
biến thực phẩm….
1.2.1.1. Trình tự gen trnH-psbA

Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi
từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài
cao. Locus trnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín
và hạt trần. Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích
thước rất ngắn (~ 300 bp). Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử
dụng trnH-psbA như chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với
matK. CBOL thấy rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất
(69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị
barode bổ sung. TrnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba locus
khi hệ thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích
[21].

8


1.2.1.2. Trình tự gen RpoC1
Trong các nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7 locus và thấy
rằng khả năng phân biệt loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%). Mặc dù
vậy, trong nghiên cứu Liu và cộng sự (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một chỉ thị rất
hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài bryophytes.
1.3. Sơ lƣợc về nhân giống cây in vitro
1.3.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học
thuyết về tính toàn năng của tế bào do Haberlandt G. nêu ra năm 1902. Theo
quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào thực vật là mỗi
tế bào riêng rẽ đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ
của cơ thể sinh vật đó, khi gặp điều kiện thuận lợi thì mỗi tế bào có khả năng
tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả
của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Trong đó:

- Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau.
- Khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng riêng biệt,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình mà trong trường hợp
cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và
phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào và ngược lại
với sự phân hóa tế bào.
Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ
thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách
rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng). Đây là một điểm rất quan trọng vì
trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện kĩ thuật tiên tiến
cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng.

9


1.3.2. Các giai đoạn nhân giống in vitro
Giai đoạn 1: Tạo vật liệu in vitro
Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình
nhân giống in vitro.Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu
thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Khử trùng mô thực vật người
ta thường dùng một số chất hoá học như HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2. Tuỳ
thuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoá
chất thích hợp.
Giai đoạn 2: Tái sinh mô nuôi cấy
Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồi
hoặc chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra, tùy từng đối tượng mà người ta còn có
thể dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa,...Mục đích của
giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy.Quá trình
này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ các hợp chất auxin, cytokinin ngoại

sinh đưa vào môi trường nuôi cấy.Tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh
lý của mẫu cấy, thường các mô non chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Giai đoạn này được xem là giai đoạn then chốt của quá trình.Để tăng hệ
số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo
các chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, Gibberelin), các chất bổ
sung khác như nước dừa, nước chiết dấm men... kết hợp với các yếu tố nhiệt
độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có
thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi),
hay sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ
phôi vô tính.

10


Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau từ 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng
lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các Auxin, vì auxin là hoocmon thực
vật quan trọng và có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này,
các chất IAA, IBA, α-NAA và 2,4-D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất.
Giai đoạn 5: Đƣa cây ra đất
Ở giai đoạn này, đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra
đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định
khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất.
Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ, để
tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc. Để đảm bảo cho cây có tỷ lệ
sống cao thì cần phải đưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ
10 - 15 ngày, lúc này rễ mới sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó chuyển

cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thường.
1.3.3. Ƣu điểm của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở
ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là những
ưu điểm chính:
- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, có tiềm năng sinh trưởng, phát
triển và đạt năng suất cao.
- Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã
chọn lọc.
- Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội).
- Bảo quản và lưu trữ tập đoàn gen.
- Có khả năng sản xuất quanh năm.

11


- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh
thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém.
- Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào
sản xuất đại trà
1.3.4.Các yếu tố ảnh hƣởng tới nuôi cấy mô
1.3.4.1. Mô nuôi cấy
Murashige (1974) đã đưa ra việc lựa chọn mẫu cấy thích hợp và chỉ ra
hầu hết những cơ quan có thể dùng nuôi cấy mô [19]. Điều quan trọng cho
thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm: Kiểu gen, cơ quan được chọn
lọc, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn
mẫu.
- Kiểu gen: Ảnh hưởng sâu sâu sắc tới quá trình nuôi cấy. Với loài
thuốc lá được sử dụng như kiểu cây mẫu, Cheng và Smith (1973) đã ghi nhận
sự khác nhau giữa genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lá.

- Chọn cơ quan: Murashige (1914) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và
mô đều có khả năng sử dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy
khác nhau ở các loài khác nhau như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy.
- Tuổi sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm
của mẫu nuôi cấy cho thấy ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và
tuổi sinh lý.
- Mẫu in vitro: Trong nhiều năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho
thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng
ruộng hay trong vườn ươm như cây Azalea (Economou & Read, 1986).
- Sức sống của mẫu: Điều cần thấy rằng mẫu của cây mẹ có ảnh hưởng
quan trọng đến nuôi cấy in vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng để loại virut sản xuất những cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng
cần phải cẩn thận chọn lọc mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bệnh, nếu

12


nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ tạo ra một số lượng lớn những cây bệnh được nhân
lên.
1.3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là từ 200C - 270C. Theo Murashige
(1974), nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển của cây in
vitro qua những quá trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào và cơ
quan.
13.4.3. Cường độ ánh sáng
Cường độ ánh sáng là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến nuôi cấy in
vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng có sự liên quan tới các loài, có
loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng yếu hoặc tối. Việc
nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện 1000 Lux [2]
1.3.4.4. Môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát
triển Hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi
trường nuôi cấy.
Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy là rất cần
thiết.Về mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng chất dinh
dưỡng khác nhau. Mặt khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân
hoá của mô cấy, tuỳ theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ,
tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tuỳ theo
loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô,
bộ phận nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường sử dụng
cũng khác nhau khá cơ bản, môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn
sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần
và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy đều bao gồm

13


các thành phần: các nguyên tố khoáng đa, vi lượng, nguồn cacbon, vitamin và
các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, agar (đối với môi trường rắn). Ngoài
ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino
acid, EDTA…) và một số chất có thành phần không xác định như nước
dừa, dịch chiết nấm men…
1.3.4.5. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Phytohoocmon)
Phytohoocmon là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản phẩm thiên nhiên
của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) chúng có tác dụng điều tiết
các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật.Tuy nhiên, các
phytohoocmon chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà không tham gia
trực tiếp vào quá trình trao đổi chất, nó không thể dùng thay thế chất dinh
dưỡng.Tác dụng của chất điều hoà sinh trưởng liên quan đến hiện tượng kìm

hãm và cảm ứng tổng hợp enzim trong cơ thể thực vật, hoạt hoá các bộ phận
của phân tử DNA9. Mỗi chất điều hoà sinh trưởng đều mang chức năng riêng,
nhưng trong cơ thể thực vật để điều khiển những hoạt động của thực vật. Tuỳ
vào mỗi giai đoạn nuôi cấy, mỗi giai đoạn phát triển của thực vật thì sự kết
hợp của các chất này là khác nhau.Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô tế bào, hai
nhóm chất điều hoà sinh trưởng được sử dụng rộng rãi là cytokinin và auxin.
- Auxin:
Auxin có tác dụng chủ yếu là làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự
hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa,
rụng quả. Auxin hoạt hoá các hợp chất cao phân tử (Protein, cenllulose,
pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng.Auxin được xem là hoocmon thực vật
quan trọng nhất vì nó có vai trò cơ bản trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá
tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của cơ thể. Trong nuôi cấy sử
dụng một số chất như: Indol acetic acid (IAA), Naphthyl acetic acid (NAA),
2,4 - D Dichlorophenol acetic acid(2,4- D), Indol butyric acid (IBA)

14


- Cytokinin:
Nhóm cytokinin bao gồm các chất sau: 6- Benzylaaminopurin (BAP),
Kinetin (Ki)
Cytokinin có tác dụng kích thích sự dinh trưởng của tế bào cấy mô và
làm tăng tốc độ phân bào. Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo
chồi, đồng thời ức chế sự phân hoá rễ của mô nuôi cấy.Cytokinin có hiệu quả
rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokinin cần thiết song
không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và
auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokinin cao hơn
auxin sẽ kích thích tạo chồi, và ngược lại auxin cao hơn cytokinin sẽ kích
thích tạo rễ.

Trong cơ thể thực vật, cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự
tổng hợp ADN và protein, kích thích quá trình trao đổi chất.
1.4. Các nghiên cứu về cây Hoàng tinh hoa đỏ
Y học cổ truyền là một ngành còn tương đối mới, ít có đề tài nghiên cứu
sâu.Haroon Khan và cộng sự (2012) đã đi sâu phân tích thành phần hóa học
của các chất có củ, có ý nghĩa lớn đối với ngành y học cổ truyền.Chính vì có
giá trị cao đối với ngành y – dược học nên số lượng chi Polygonatum giảm
một cách đáng kể. Tuy nhiên, chỉ có một vài công trình nghiên cứu đề cập đến
vấn đề nhân giống chi Polygonatumnhư Iyyakkannu Sivanesan và cộng sự
[15], Shivani Bisht và cộng sự [20], và chưa thấy công trình nghiên cứu nào
về cây Hoàng tinh hoa đỏ (Polygonatum kingianum Coll et Hemls.).
Vì vậy, đề tài: “Xây dựng quy trình tạo vật liệu khởi đầu và bước đầu tái
sinh chồi invitro cây Hoàng Tinh Hoa Đỏ(Polygonatum kingianum Coll et
Hemls.)” nhằm góp một phần vào việc bảo tồn Hoàng tinh hoa đỏ cũng như
tạo ra nguồn giống sạch bệnh.

15


CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thí nghiệm được tiến hành từ 1/2016 đến 3/2017 tại Phòng thí nghiệm
Sinh lý học Thực vật - Khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2 và Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Vật liệu thực vật
Mẫu Hoàng tinh hoa đỏ được thu tại trạm Nghiên cứu Trồng cây thuốc
Sa Pa - Lào Cai
2.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ

Các thiết bị:
Tên thiết bị

Model & hãng sản xuất

Máy PCR System 9700

Appied Biosystem, Mỹ

Máy điện di Powerpac300

Bio-Rad, Mỹ

Máy soi DNA

Mini- transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ

Máy vortex

Mimishaker, IKA, Đức

Cân kĩ thuật

GM612, Đức

Tủ lạnh sâu

FRIGO

Máy đo pH


HM30G/TOA, Đức

Nồi hấp khử trùng

HV - 110/HIRAYAMA, Nhật

Tủ lạnh Hitachi

31AG5D, Thái lan

Máy cất nước hai lần

Mỹ

Buồng cấy vô trùng

AV - 110/TELSTAR

Máy khuấy từ gia nhiệt

ARE/VELP, Italia

Cân phân tích

CP224S, Đức

Tủ ấm

UNIVERSAL 320R/ HETTICH, Đức


16