ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

----------oOo----------

PHẠM HẢI NHƯ

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
XYLAN 1,4-β-XYLOSIDASE TRONG
ESCHERICHIA COLI

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Công nghệ Sinh học
Hệ đào tạo chuẩn

Hà Nội - 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

----------oOo----------

PHẠM HẢI NHƯ

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
XYLAN 1,4-β-XYLOSIDASE TRONG
ESCHERICHIA COLI

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Công nghệ Sinh học
Hệ đào tạo chuẩn

Cán bộ hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Huyền
Đồng hướng dẫn: TS. Đinh Nho Thái

Hà Nội - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Huyền,
Trưởng phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học, người hướng dẫn đã
luôn quan tâm, giúp đỡ, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp này.
Với những tình cảm chân thành, tôi cũng xin được cảm ơn sự chỉ bảo và
giúp đỡ của toàn thể cán bộ phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học,
đặc biệt là NCS. Nguyễn Minh Giang, KS. Nguyễn Thị Minh Thu, những người đã
hướng dẫn, hỗ trợ và chỉ bảo nhiệt tình về chuyên môn cũng như kĩ năng trong suốt
quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của tôi.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Đinh Nho Thái, Bộ môn Di
truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia
Hà Nội cùng toàn thể thầy cô trong Khoa Sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến
thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt bốn năm học tập tại
trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã chia sẻ, động viên tôi trong
suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 30 tháng 5 năm 2016.

Sinh viên
Phạm Hải Như


CÁC TỪ VIẾT TẮT
APS

Ammonium persulfate

Bp

Base pair

DNA

Deoxyribonucleic acid

dH2O

Nước khử ion

E. coli

Escheriachia coli

EtBr

Ethydium bromide

ETDA


Axit etylen diamin tetra acetic

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

Kb

Kilo base

LB

Luria-bertani

OD

Optical density

ORF

Opean Reading Frame – Khung đọc mở

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodexyl dulfate


TAE

Tris acetate EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

pNPX

p-nitropheny-β-xylopyranoside

Gen xbx

Gen mã hóa cho xylan 1,4-β-xylosidase, có nguồn gốc từ
vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối Coptotermes gestroi

pET22xbx

Vector biểu hiện pET22b(+) đã được gắn gen xylan 1,4-βxylosidase có nguồn gốc từ vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU..................................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.....................................................................3
1.1. Đại cương về xylan 1,4-β-xylosidase............................................................3
1.1.1. Phân giải sinh khối thực vật..................................................................3
1.1.1.1. Thành phần trong sinh khối thực vật.......................................3

1.1.1.2. Enzym phân giải sinh khối thực vật........................................4
1.1.2. Nguồn thu nhận xylan 1,4-β-xylosidase trong tự nhiên .......................5
1.1.3. Phân loại xylan 1,4-β-xylosidase..........................................................5
1.1.3.1. Cấu trúc enzym.......................................................................6
1.1.3.2. Mô hình hoạt động trong thủy phân........................................6
1.1.4. Hoạt tính của xylan 1,4-β-xylosidase ...................................................7
1.1.5. Ứng dụng của xylan 1,4-β-xylosidase ..................................................8
1.2. Đại cương về biểu hiện gen...........................................................................9
1.2.1. Hệ biểu hiện gen trong E. coli ..............................................................9
1.2.1.1. Chủng tách dòng E. coli DH10B............................................9
1.2.1.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3).....................................9
1.2.1.3. Chủng biểu hiện E. coli SoluBL21 (DE3)............................10
1.2.1.4. Chủng biểu hiện E. coli Rosetta (DE3).................................10
1.2.1.5. Chủng biểu hiện E. coli JM109 (DE3).................................10
1.2.2. Vector biểu hiện..................................................................................11
1.2.3. Vector biểu hiện pET22b(+).....................................................13
1.2.3. Vector biểu hiện pET22xbx......................................................13
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP......................................................14
2.1. Vật liệu........................................................................................................14
2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid..............................................................14


2.1.2. Môi trường nuôi cấy...........................................................................14
2.1.3. Hóa chất và dung dịch sử dụng...........................................................14
2.1.4. Các thiết bị sử dụng............................................................................16
2.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................16
2.2.1. Tách DNA plasmid từ E. coli .............................................................16
2.2.2. Điện di trên gel agarose......................................................................18
2.2.3. Xử lý DNA plasmid bằng enzym cắt hạn chế.................................... 19
2.2.4. Biến nạp plasmid vào tế bào E. coli bằng sốc nhiệt...........................20

2.2.5. Biểu hiện gen xbx trong tế bào E. coli ................................................21
2.2.6. Điện di protein trên gel polyacrylamide - SDS.................................. 22
2.2.7. Thử hoạt tính của xylan 1,4-β-xylosidase.......................................... 24
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................25
3.1. Kiểm tra sự có mặt của gen xbx trong vector tái tổ hợp pET22xbx.............26
3.1.1. Biến nạp pET22xbx vào E. coli DH10B để nhân dòng......................26
3.1.2. Tách DNA plasmid từ 5 dòng E. coli DH10B ngẫu nhiên .................26
3.1.3. Kiểm tra các dòng plasmid đã tách bằng enzym cắt hạn chế..............27
3.2. Biểu hiện gen xbx........................................................................................29
2.2.1. Khảo sát chủng biểu hiện....................................................................30
2.2.2. Kiểm tra hoạt tính của xylan 1,4-β-xylosidase đã biểu hiện được.......33
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................... 33
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG....................... 35
2.2.5. Khảo sát thời gian thu mẫu.................................................................37
KẾT LUẬN............................................................................................................40
ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU...........................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................42


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Vị trí tác dụng của các enzym trên xylan .....................................................4
Hình 2. Cơ chế giữ nguyên cấu hình vòng sau khi thủy phân bởi glycoside
hydrolase...................................................................................................................6
Hình 3. Cơ chế nghịch chuyển cấu hình vòng sau khi thủy phân bởi glycoside
hydrolase ..................................................................................................................7
Hình 4. Vị trí cắt của xylan 1,4-β-xylosidase trên chuỗi xylan .................................7
Hình 5. Xylan 1,4-β-xylosidase thủy phân (1,4)-β-D-xylans ....................................8
Hình 6. Cấu trúc vector pET-22b(+) .......................................................................12
Hình 7. Trình tự ORF GL0112518 và trình tự axit amin mà ORF này mã hóa. ......13
Hình 8. Cấu trúc phân tử p-nitropheny-β-xylopyranoside (pNPX)..........................24

Hình 9. Các dòng E. coli DH10B được biến nạp với plasmid pET22xbx được cấy
trải trên đĩa LBA......................................................................................................26
Hình 10. Điện di đồ kiểm tra DNA plasmid từ 5 dòng E. coli DH10B tái tổ hợp . .27
Hình 11. Vị trí cắt của enzym HincII, XhoI và NcoI trên vector pET22xbx...........28
Hình 12. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm kết quả cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym
XhoI + NcoI và HincII............................................................................................28
Hình 13. Điện di đồ kiểm tra sự biểu hiện của gen xbx trong các tế bào biểu hiện E.
coli Rosetta, JM109, BL21 và SoluBL21 trên gel polyacrylamide 12,6%..............30
Hình 14. Biểu đồ mô tả giá trị OD 600 tại thời điểm thu mẫu của các chủng biểu
hiện.......................................................................................................................... 31
Hình 15. Điện di đồ kiểm tra tính tan của xylan 1,4-β-xylosidase ở E. coli BL21 và
E. coli Rosetta trên gel polyacrylamide 12,6%.......................................................32
Hình 16. Kết quả thử hoạt tính của xylan 1,4-β-xylosidase đã biểu hiện được........33
Hình 17. Điện di đồ kiểm tra biểu hiện của gen xbx trong tế bào E. coli Rosetta, khi
biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau, trên gel polyacrylamide 12,6%........................34
Hình 18. Biểu đồ mô tả giá trị OD 600 thu mẫu của các dòng biểu hiện ở các nhiệt độ
khác nhau................................................................................................................. 35


Hình 19. Điện di đồ kiểm tra biểu hiện của gen xbx trong tế bào E. coli Rosetta, khi
cảm ứng các nồng độ IPTG khác nhau, trên gel polyacrylamide 12,6%..................36
Hình 20. Biểu đồ mô tả giá trị OD 600 thu mẫu của các dòng cảm ứng với nồng độ
IPTG khác nhau.......................................................................................................37
Hình 21. Điện di đồ kiểm tra biểu hiện củaa gen xbx theo các thời gian thu mẫu,
trong tế bào E. coli Rosetta (DE3) trên gel polyacrylamide 12,6%........................38
Hình 22. Biểu đồ mô tả giá trị OD600 thu mẫu của các dòng biểu hiện ở các thời gian
thu mẫu khác nhau...................................................................................................38


MỞ ĐẦU

Sinh khối thực vật là nguồn nguyên liệu tái tạo có nhiều tiềm năng sử dụng.
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nguồn sinh khối này, đặc biệt là sinh
khối phế phụ phẩm nông nghiệp ngày càng được tận dụng có hiệu quả để chuyển
hóa thành các sản phẩm ứng dụng vào thực tiễn cuộc sống, trong đó, phải kể đến
những ứng dụng chính như chế biến thức ăn chăn nuôi, sản xuất giấy, sợi, hóa chất
và tái chế rác thải thành năng lượng sinh học [10]. Đứng trước thực trạng cạn kiệt
dần về tài nguyên và yêu cầu bảo vệ môi trường để phát triển bền vững, việc tận
dụng sinh khối thực vật đang được đề cao hơn bao giờ hết, đặc biệt ở các nước nông
nghiệp như Việt Nam.
Việc sử dụng hữu hiệu sinh khối thực vật phụ thuộc chủ yếu vào khả năng
chuyển hóa hiệu quả và kinh tế các polyme trong chúng thành các monome. Để giải
quyết bài toán này, sau các bước phân giải vật lý, hóa học, các nhóm enzym thủy
phân lignocellulose đã được áp dụng để chuyển hóa sinh khối thành đường đơn.
Tuy nhiên ở thời điểm hiện tại, giá thành của các sản phẩm từ phế phụ phẩm nông
nghiệp còn rất cao, chưa thể cạnh tranh do nguyên nhân chính là nguồn enzym chưa
thực sự thủy phân nhanh chóng và hiệu quả sinh khối thành đường.
Vì vậy, trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước
đang tìm cách để thu được enzym có hoạt tính mạnh và có tốc độ chuyển hóa nhanh
sinh khối thành đường theo ba hướng chính: (1) phân lập, sàng lọc chủng tự nhiên
sinh enzym có hoạt tính tốt. Đây là phương pháp truyền thống được rất nhiều phòng
thí nghiệm trên thế giới tiến hành và thu được nhiều kết quả rất khả quan; (2) tìm
kiếm, phân lập gen mới mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ các vi sinh vật
bằng kỹ thuật Metagenomics. Hướng này cho phép các nhà sinh học khai thác được
các gen quý từ các vi sinh vật không nuôi cấy được vốn chiếm 99-99,9% vi sinh vật
có trong môi trường sinh thái; (3) Gây đột biến định hướng một số gen mã hóa
enzym đã được nghiên cứu để làm tăng hoạt tính của enzym.
Trong số các enzym tham gia chuyển hóa sinh khối, xylan 1,4-β-xylosidase
là một trong những enzym chìa khóa. Enzym này có khả năng cắt (1,4)-β-D- xylan
từ đầu không khử để giải phóng các gốc đường D-xylose [3]. Xylan 1,4-βxylosidase có mặt ở cả động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm.... Tuy nhiên, chỉ vi sinh



vật mới cung cấp được lượng lớn xylan 1,4-β-xylosidase đáp ứng cho sản xuất, đem
lại giá trị thương mại cao. Do đó, xylan 1,4-β-xylosidase có nguồn gốc vi sinh vật
hiện đang là đối tượng được nhiên cứu và ứng dụng nhiều trong sản xuất. Từ năm
2012, phòng Kỹ thuật di truyền đã sử dụng kỹ thuật Metagenomics để phân tích
toàn bộ DNA đa hệ gen của vi sinh vật trong ruột mối Coptotermes gestroi. Trong
số 125431 ORFs thu được, bằng phần mềm tin sinh học, 41 ORFs đã được ước
đoán mã hóa cho enzym xylan 1,4-β-xylosidase. Bằng mẫu dò do phòng Kỹ thuật di
truyền thiết kế, gen mang mã số GL0112518 mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase đã
được lựa chọn cho nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá đặc điểm enzym - đây
là bước khởi đầu cho nghiên cứu ứng dụng enzyme vào giải quyết các vấn đề thực
tiễn. Khóa luận “Biểu hiện gen mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase trong chủng
Escherichia coli” là một phần nhỏ trong nghiên cứu này.
Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công
nghệ sinh học. Thời gian thực hiện khóa luận từ tháng 8/2015 đến tháng 5/2016.
Mục tiêu của đề tài là biểu hiện thành công gen mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase
trong tế bào vi khuẩn E. coli , tạo cơ sở cho việc nghiên cứu và sản xuất các enzym
phân giải sinh khối thực vật.

8


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về xylan 1,4-β-xylosidase
1.1.1. Phân giải sinh khối thực vật
1.1.1.1. Thành phần trong sinh khối thực vật
Sinh khối thực vật gồm ba thành phần chính là cellulose (40-50%), hemicellulose (25-30%), và polyme thơm lignin (10-30%) [10]. Tỷ lệ các thành phần này
thay đổi tùy theo nguồn sinh khối (cỏ, ngũ cốc, gỗ mềm, gỗ cứng, phế phẩm nông
nghiệp, rác thải nhà máy đường, nhà máy gỗ...). Nhưng tựu chung ở các nguồn sinh
khối, cellulose và hemicellulose đều có hàm lượng nhiều hơn cả.

Cellulose là polyme đồng nhất, mạch thẳng, được cấu thành từ các tiểu phần
D-glucopyranosyl liên kết với nhau bởi liên kết 1,4-glycosit.
Hemicellulose là polyme hỗn hợp, mạch nhánh, có cấu trúc phức tạp. Trong
tự nhiên, hemicellulose của các loài thường gồm nhiều loại polyme với tỷ lệ đa
dạng. Trong đó, phổ biến nhất là glucuronoxylan, arabino-glucuronoxylan,
arabinogalactan,... Tuy đa dạng về chủng loại polyme, song hemicellulose ở các
nguồn đều được cấu thành từ các monome cơ bản là: pentose (D-xylose, Larabinose), hexose (D-mannose, D-glucose, D-galactose) và axit đường (Dgalacturonic acid, D-glucuronic acid, 4-O-methylglucuronic acid). Ở số ít loài còn
có cả L-rhamnose, L-fuctose [7].
Tỷ lệ thành phần của hemicellulose thay đổi tùy theo nguồn thu. Ví dụ:
-

Hemicellulose từ thân gỗ chứa 89,3% xylose; 1% arabinose; 1,4%
glucose và 8,3% anhydrouronic acid [10].
Hemicellulose từ lúa chứa 46% xylose; 44,9% arabinose; 6,1%
galactose; 1,9% glucose và 1,1% anhydrouronic acid [10].

Ở hầu hết các nguồn, xylose thường là thành phần chính của hemicellulose.
Các tiểu phần D-xylose nối với nhau bởi liên kết β-1,4, tạo nên loại mạch chính chủ
đạo ở hemicellulose là xylan.

9


1.1.1.2. Enzym phân giải sinh khối thực vật
Quá trình phân giải sinh khối thực vật cần đến nhiều loại enzym bởi cấu trúc
phức tạp của nó. Trong đó, quá trình phân giải cellulose, polyme có hàm lượng lớn
nhất trong sinh khối thực vật, chiếm vị trị trung tâm.
Hàm lượng hemicellulose trong sinh khối thực vật cũng đứng thứ hai, chỉ sau
cellulose [7] nên việc phân giải hemicellulose đóng vai trò quan trọng trong chuyển
hóa sinh khối thực vật.

Sự phân giải hemicellulose cần đến nhiều loại enzym: xylanase (EC 3.2.1.8;
endo-1,4-β-xylanase) giúp phân giải mạch chính thành các xylo-oligomer; xylan
1,4-β-xylosidase (EC 3.2.1.37; xylan 1,4-xylan 1,4-β-xylosidase) phân cắt tiếp các
xylo-oligomer này thành các tiểu phần D-xylose; và hàng loạt các enzym giúp phân
giải mạch nhánh khác như α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), α-glucuronidase
(EC 3.2.1.139), acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.72), … [7].

Hình 1. Vị trí tác dụng của các enzym trên xylan [6].
A. Mô hình thủy phân xylan mạch nhánh.
B. Vị trí tác dụng của xylan 1,4-β-xylosidase.

10


Trong giới hạn nghiên cứu của khóa luận này, chúng tôi sẽ chỉ tập trung tìm
hiểu về xylan 1,4-β-xylosidase (EC 3.2.1.37). Đây là enzym cuối cùng trong chuỗi
chuyển hóa xylan, có vai trò quyết định đến hiệu quả phân giải hemicellulose nói
riêng và sinh khối thực vật nói chung.
Ngoài tên hệ thống là xylan 1,4-β-xylosidase và tên thường gọi là βxylosidase, enzym này còn có một số tên gọi khác là: xylobiase exo-1,4-xylan 1,4β-xylosidase, β-D-xylopyranosidase, exo-1,4-xylosidase, exo-1,4-β-D-xylosidase và
1,4-β-D-xylan xylohydrolase, xylobiase [25].
1.1.2. Nguồn thu nhận xylan 1,4-β-xylosidase trong tự nhiên
Xylan 1,4-β-xylosidase thường được tìm thấy ở các sinh vật dùng sinh khối
thực vật làm nguồn nguyên liệu sinh trưởng, phần lớn trong số đó là vi khuẩn và
nấm. Một số nguồn thu nhận xylan 1,4-β-xylosidase đã được tìm thấy là gan cừu
[4]; vi sinh vật cộng sinh trong dạ cỏ [9]; các loài nấm Fusarium proliferatum [18],
Aspergillus japonicas [22]; vi khuẩn Thermoanaerobacter ethanolicus [19],
Bacillus stearothermophilus [14];… Ngoài ra, người ta cũng tìm thấy vai trò dãn
thành tế bào của enzym này trong quá trình phát triển tiểu bào tử và hạt phấn, ở một
số loài thực vật [11].
Xylan 1,4-β-xylosidase có nguồn gốc đa dạng. Tuy nhiên, chỉ vi sinh vật mới

cung cấp được lượng lớn enzym đáp ứng cho sản xuất, đem lại giá trị thương mại
cao. Do đó, xylan 1,4-β-xylosidase có nguồn gốc vi sinh vật hiện đang là đối tượng
được nhiên cứu và ứng dụng nhiều trong sản xuất [23].
Hầu hết các loại xylan 1,4-β-xylosidase đều là enzym nội bào [6]. Tuy nhiên,
vẫn có một số trường hợp đặc biệt như xylan 1,4-β-xylosidase ở nấm Fusarium
proliferatum [18], Aspergillus japonicas [22].
1.1.3. Phân loại xylan 1,4-β-xylosidase
Xylan 1,4-β-xylosidase thuộc nhóm enzym glycoside hydrolase (EC 3.2.1.x).
Đây là một nhóm enzym lớn, có khả năng thủy phân liên kết glycoside giữa
cacbonhydrat và các thành phần khác.
Dựa trên cơ chất đặc hiệu, cơ chế phản ứng và trình tự amino axit, đến nay
đã có 135 họ glycoside hydrolase được phân loại. Từ 135 họ glycoside hydrolase

11


này, 14 bộ gồm các họ enzym tương đồng (về cơ chế phản ứng, cơ chất đặc hiệu,
trình tự) cũng đã được thống kê [26].
Từ các nguồn đã được tìm thấy hiện nay, xylan 1,4-β-xylosidase được sắp
xếp vào các họ glycoside hydrolase 1, 3, 30, 39, 43, 51, 52, 54, 116 và 120 [26].
Tuy nhiên, vẫn còn nhiều loại xylan 1,4-β-xylosidase chưa được phân loại rõ, bởi
chúng không có đặc tính rõ ràng hoặc mang đặc tính của nhiều họ.
Xylan 1,4-β-xylosidase ở các họ GH 1, 39, 52, 116, 120 đều có nguồn gốc vi
khuẩn, và ở họ GH 51, 54 đều có nguồn gốc nấm. Các họ còn lại chứa xylan 1,4-βxylosidase có nguồn gốc hỗn hợp [26].
1.1.3.1. Cấu trúc enzym
Cho đến nay, cấu trúc không gian của xylan 1,4-β-xylosidase vẫn chưa được
nghiên cứu đầy đủ. Trong 10 họ GH chứa xylan 1,4-β-xylosidase, mới chỉ xác định
được cấu trúc 3D của 5 họ là:
- Họ GH 1, 30, 39 và 51 thuộc bộ các họ enzym tương đồng GH-A. Bộ
này có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn [26].

- Họ GH43 thuộc bộ các họ enzym tương đồng GH-F. Bộ này có cấu trúc
xác định gồm 5 lần nếp gấp β [26].
1.1.3.2. Mô hình hoạt động trong thủy phân
Glycoside hydrolase thủy phân liên kết glycoside theo hai cơ chế:
+ Cơ chế giữ nguyên cấu hình vòng (retaining): phản ứng xảy ra nhờ cơ chế
thế kép, nên vòng cacbon vẫn giữ được cấu hình dưới xúc tác của enzym.

Hình 2. Cơ chế giữ nguyên cấu hình vòng sau khi
thủy phân bởi glycoside hydrolase [27]
+ Cơ chế nghịch đảo cấu hình vòng (inverting): enzym xúc tác phản ứng theo
hai bước, ở hai phía của phân tử đường. Đầu tiên, enzym tạo điều kiện để tách

12


nhóm khử ở một bên. Sau đó, hấp dẫn phân tử nước vào bên đối diện của vòng
cacbon để hoàn thành phản ứng thủy phân. Vòng cacbon sau phản ứng sẽ bị chuyển
dạng, như thể hiện ở hình 3.

Hình 3. Cơ chế nghịch đảo cấu hình vòng sau khi
thủy phân bởi glycoside hydrolase [27].
Xylan 1,4-β-xylosidase của các họ GH 1, 3, 30, 39, 51, 52, 54, 116 và 120
đều sử dụng cơ chế giữ nguyên cấu hình vòng, chỉ có GH43 sử dụng cơ chế nghịch
đảo cấu hình vòng [26].
1.1.4. Hoạt tính của xylan 1,4-β-xylosidase
Xylan 1,4-β-xylosidase (E.C 3.2.1.37) là một enzym có khả năng xúc tác
phản ứng cắt liên kết β(1→4) glycoside ở đầu không khử của chuỗi polymer xylan
(non-reducing end exo-acting).

Hình 4. Vị trí cắt của xylan 1,4-β-xylosidase trên chuỗi xylan [27].

Hoạt tính chủ yếu của xylan 1,4-β-xylosidase là loại bỏ các gốc khử Dxylose khỏi đầu không khử (non-reducing end) của (1,4)-β-D-xylan
oligosaccharide, nhờ đó (1,4)-β-D-xylan oligosaccharide được thủy phân thành các
tiểu phần β-D-xylanpyranose.
Cũng nhờ khả năng phân cắt liên kết β-1,4 này, mà xylan 1,4-β-xylosidase
còn có khả năng thủy phân xylobiose (phân tử đường đôi gồm 2 monome xylose
liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4). Một số hoạt tính exoglycosidase khác của
enzym này cũng được tìm thấy ở gan cừu [4].

13


Hình 5. Xylan 1,4-β-xylosidase thủy phân (1,4)-β-D-xylan [28].
1.1.5. Ứng dụng của xylan 1,4-β-xylosidase
Bởi những đặc tính trên, xylan 1,4-β-xylosidase đóng vai trò quan trọng
trong phân giải hemicellulose – nguồn nguyên liệu cho nhiều lĩnh vực như:
-

Sản xuất xylose, chất tạo ngọt nhân tạo xylitol, furfural [3].
Tiềm năng sử dụng như chất kết dính, chất ổn định hay vật liệu tạo

-

màng của hemicellulose trong rơm dạ [20].
Thuốc giảm cholesterol và chất ức chế HIV [8].
Một số loại hemicellulose, từ thực vật bậc cao và cỏ, còn là nguồn
nguyên liệu tiềm năng để cung cấp các polysaccharide có tính dược
lý. Ví dụ như glucuronic axit phân lập từ lá tre, thân cây ngô cũng như
gỗ cứng đã được kiểm chứng là có khả năng kiềm hãm sự phát triển
của sarcoma-180 và nhiều loại khối u khác [5].


Khả năng tăng hiệu quả phân hủy sinh khối thực vật của xylanase nói chung,
và xylan 1,4-β-xylosidase nói riêng, cũng được ứng dụng trong nhiều ngành như:
-

-

-

Sản xuất xăng sinh học bioethanol [10].
Giúp chuyển hóa sợi, giảm sử dụng chất tẩy trong sản xuất vải, bột
giấy và giấy [20].
Cải thiện quá trình nhào bột [20], tăng khả năng hấp thụ nước và độ
xốp của bánh [13] trong công nghiệp thực phẩm.
Xylanase cũng được thêm vào bột ngũ cốc để giảm tính nhớt khi ủ
bia, sản xuất rượu [3] và triết xuất cà phê, tinh dầu từ các loại cây
[23].
Xylanase, và tổ hợp một số enzym khác cũng được công nghiệp dược
phẩm như một thực phẩm chức năng giúp tăng khả năng tiêu hóa.
Trong sản xuất thức năng chăn nuôi, xylanase cũng được thêm vào để
giảm độ nhớt và tăng khả hấp thụ của gia súc [20].
Xử lý chất thải từ nhà máy mía đường [24].

14


1.2. Đại cương về biểu hiện gen
Hiện nay, có 5 hệ biểu hiện thường được sử dụng là: E. coli , B. subtilis, nấm
men (S. cerevisiae, P. pastoris), tế bào động vật và thực vật. Nhưng do việc biểu
hiện gen ngoại lai vẫn còn mang tính thực nghiệm với từng gen, nên chưa có một
mô hình tối ưu nào được đưa ra. Trong số các hệ biểu hiện thường được dùng trong

thực tế, E. coli vẫn là chủng được sử dụng rộng rãi nhất, bởi giá thành rẻ, tốc độ
sinh trưởng nhanh và mang nhiều ưu điểm cho việc biểu hiện [1].
1.2.1. Hệ biểu hiện gen trong E. coli
E. coli là vi khuẩn Gram âm, có khả năng sinh sản với tốc độ cao trên môi
trường nuôi cấy đơn giản và điều đặc biệt là chúng có khả năng thu nhận nhiều yếu
tố di truyền vận động từ môi trường ngoài như plasmid, phage… Các yếu tố này có
thể tồn tại và tái bản nhiều lần trong tế bào E. coli , đã được cải biến, để sử dụng
như một vật chủ hữu hiệu trong kỹ huật tách dòng và biểu hiện gen [1].
1.2.1.1. Chủng tách dòng E. coli DH10B
E. coli DH10B là chủng vi khuẩn thường được dùng trong các thí nghiệm
tách dòng. Khác với các loại vi khuẩn thông thường, gen mã hóa cho endonuclease I
của chủng này đã bị loại bỏ bằng đột biến endA, do đó tránh được hiện tượng cắt bỏ
DNA ngoại lại. Mặt khác, chủng này còn mang đột biến recA giúp hạn chế sự tái tổ
hợp của DNA ngoại lai và DNA của tế bào chủ, làm tăng tính ổn định của đoạn
DNA đưa vào. Quá trình vận chuyển nucleoside của DH10B cũng được cải biến để
tăng khả năng nhận plasmid ngoại lai [15].
Bởi những đặc tính trên, chúng tôi nhận thấy DH10B là chủng phù hợp để
biến nạp vector pET22xbx với mục đích nhân lên và kiểm tra vector.
1.2.1.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3)
Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai, vấn đề thường gặp phải là các
protein ngoại lai, sau khi được biểu hiện, bị các protease nội bào phân giải. Để bảo
vệ protein ngoại lai, người ta có thể tạo các chủng biểu hiện mang gen đột biến làm
mất khả năng tổng hợp protease của vật chủ. Chủng biểu hiện E. coli BL2 là một
chủng đột biến như vậy. Tế bào E. coli BL21 chứa đột biến khiến lon protease (một
protease nội bào) và ompT protease (một protease ngoại bào) không còn khả năng
thủy phân protein [15].

15



Ngoài những đặc điểm trên thì trong DNA hệ gen của E. coli BL21(DE3)
còn chứa gen mã hóa cho T7 ARN polymerase (đột biến DE3), đặt dưới sự điều
khiển của operon lac. Cải biến này giúp tăng khả năng tổng hợp protein ngoại lai
khi được thêm chất cảm ứng IPTG, đặc biệt là những gen được đưa vào hệ vector
pET (plasmid for Expression by T7 ARN polymerase).
1.2.1.3. Chủng biểu hiện E. coli SoluBL21 (DE3)
E. coli SoluBL21 (DE3) là một chủng biến thể từ E. coli BL21(DE3).
Chúng được tạo ra nhờ đột biến định hướng nhằm tăng khả năng biểu hiện protein ở
dạng tan và khả năng biểu hiện protein gây độc cho tế bào, mà khi biểu hiện ở E.
coli BL21 (DE3) không cho kết quả mong đợi. Thêm vào đó, E. coli SoluBL21
(DE3) vẫn giữ được những ưu điểm của E. coli BL21 (DE3) như các đột biến
protease, thêm gen mã hóa T7 polymerase,…
1.2.1.4. Chủng biểu hiện E. coli Rosetta (DE3)
Tần số sử dụng 61 codon thay đổi theo loài. Do đó, có thể xảy ra hiện tượng
các condon cần để mã hóa protein mong muốn lại là codon hiếm ở vật chủ biểu
hiện. Điều này có thể dẫn đến sự bất ổn của mRNA (giảm tốc độ dịch mã); dừng
biểu hiện giữa chừng, tạo protein không hoàn chỉnh hay hiện tượng dịch mã nhầm.
Để khắc phục hạn chế này, một biến thể khác của E. coli BL21 (DE3) là E.
coli Rosetta đã được tạo ra. E. coli Rosetta vẫn giữ được các ưu điểm của E. coli
BL21 (DE3) như các đôt biến protease, T7 promoter,… nhưng đã được thêm gen
mã hóa tRNA vận chuyển argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL, metT, thrT, tyrU,
thrU và bổ sung thêm codon hiếm [15].
1.2.1.5. Chủng biểu hiện E. coli JM109 (DE3)
Khác với 3 chủng biểu hiện thuộc dòng B vừa giới thiệu, E. coli JM109
(DE3) là một biến thể từ E. coli JM109 thuộc dòng K12. Bởi tốc độ sinh trưởng
chậm hơn dòng B, chúng giúp protein mong muốn có thời gian gấp xoắn đầy đủ
hơn. Nhờ đó khả năng tan của protein ngoại lai có thể được cải thiện.
Bên cạnh đó, E. coli JM109 (DE3) vẫn giữ được các ưu điểm của E. coli
JM109 như đột biến endA, recA giúp tăng tính ổn định của vector tái tổ hợp trong tế
bào, làm chủng biểu hiện bền vững hơn.


16


1.2.2. Vector biểu hiện
1.2.2.1. Vector biểu hiện pET22b(+)
Năm 1986, dựa trên cơ sở hệ điều khiển promoter mạnh có nguồn gốc từ
phage T7, Studier và các cộng sự đã thiết kế ra hệ vector pET. Đây là hệ vector
đang được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gen tái tổ hợp, nhờ khả năng tổng hợp
protein mạnh và thiết kế thuận tiện cho việc kiểm soát lượng protein mong muốn,
thời điểm bắt đầu biểu hiện,... Ngày nay, vector đã có hơn 42 dạng, được sử dụng
trong 15 loại vật chủ khác nhau [16].
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng vector pET22b(+) làm vector biểu
hiện. Vector pET22b(+) có chiều dài 5493 bp, được sử dụng chủ yếu để biểu hiện
gen tái tổ hợp trong E. coli . Về cấu tạo, vector này gồm promoter T7, vùng khởi
đầu phiên mã (T7 transcription start), trình tự mã hóa tín hiệu tiết pelB, vị trí đa
điểm cắt (multiple cloning site – MCS), trình tự mã hóa đuôi His-tag, vùng kết thúc
phiên mã (T7 terminator), trình tự mã hóa lacI, tâm tái bản pBR32, trình tự mã hóa
dấu chuẩn chọn lọc (AmpicillinR) và tâm tái bản f1 [17].
Thiết kế của vector pET22b(+) mang nhiều ưu điểm:
-

T7lac promoter giúp kiểm soát chặt chẽ thời điểm biểu hiện. Plasmid
pET22b(+) chứa trình tự mã hóa operator lac ở ngay sau T7 promoter.
Chúng cũng mang cả lac repressor (lacI) và promoter tự nhiên, được sắp
xếp sao cho T7lac promoter ngược chiều với promoter của lacI.
LacI mã hóa chất ức chế gắn vào operator lac. Chất ức chế này ngăn cản
RNA polymerase tiến hành quá trình phiên mã, do đó protein không được
biểu hiện. Khi thêm chất cảm ứng IPTG, IPTG sẽ kết hợp với chất ức
chế, ngăn cản chúng gắn vào operator lac. Nhờ đó mà T7 ARN

polymerase tiếp xúc được với T7 promoter để tiến hành quá trình phiên
mã, và gen mong muốn được biểu hiện.
T7 promoter là một promoter mạnh, giúp tăng hiệu suất biểu hiện.
Các cải biến này của pET22b(+) rất phù hợp với các chủng biểu hiện có
đột biến DE3 – đột biến thêm gen mã hóa cho T7 ARN polymerase.

-

Trên vector đã thiết kế sẵn gen quy định đoạn peptid tín hiệu tiết pelB
trước đầu tận cùng N của protein, có tác dụng định hướng protein tái tổ

17


hợp chuyển ra khoang chu chất của tế bào. Sau khi protein đã ra khỏi
màng trong, chuỗi peptide tín hiệu bị cắt bỏ bởi protease tại vị trí xác
định. Môi trường trong khoang chu chất tạo điều kiện cho các enzym xúc
tác quá trình hình thành và sắp xếp các mối liên kết disulfide, tạo ra cấu
trúc không gian đúng cho chuỗi polipeptide hoàn chỉnh. Ở khoang chu
chất, khả năng bị protein tái tổ hợp bị phân hủy bởi protease của tế bào
cũng giảm xuống.
-

Phía sau vị trí cắt đa điểm có một đoạn trình tự mã hóa cho 6 axit amin
Histidine tích điện âm được gọi là đuôi His-tag. Đuôi His-tag giúp
protein tái tổ hợp được giữ lại khi chúng đi qua cột sắc kí ái lực do lực
hút tĩnh điện giữa phần điện tích âm của đuôi His-tag với điện tích dương
của các cation có trong cột tinh sạch. Các protein này sẽ được tách khỏi
cột khi cho qua dịch đệm có pH thích hợp.


Bởi những đặc tính vượt trội trên, chúng tôi chọn pET22b(+) làm vector biểu
hiện gen xbx trong nghiên cứu này.

Hình 6. Cấu trúc vector pET-22b(+) [17].

18


1.2.2.2. Vector biểu hiện pET22xbx
Sử dụng mẫu dò (probe) được thiết kế dựa trên các xylan1,4-β-xylosidase đã
được nghiên cứu đặc tính trên dữ liệu CAZy, ORF (GL0112518) mã hóa xylan1,4β-xylosidase đã được lựa chọn từ hơn 12000 ORFs có liên quan tới chuyển hóa
carbohydrate của vi sinh vật trong ruột mối Coptotermes gestroi. Gen này dài 1077
bp có tình tự như hình 7 và được đặt tổng hợp nhân tạo tại công ty Genscript (Mỹ).
Gen không chứa trình tự kết thúc đã được đưa vào vector pET22b(+) tại vị trí NcoI
và XhoI.
1- atggataaagttaccaatccggtgcttaccggttttcacgccgacccctcgattgtgaga
M D K V T N P V L T G F H A D P S I V R
61-gtcggggattatttttacatcgctaattccacttttgaatggtatccaggcgtggaactg
V G D Y F Y I A N S T F E W Y P G V E L
121-caccgttcaaaaaacttggcgaattgggaatcgctgccttcgccgctgggcgaacggcgg
H R S K N L A N W E S L P S P L G E R R
181-cttctggacatggaaggcgcgcgcgcgtcctgcggcatctgggcgccctgcttgagctac
L L D M E G A R A S C G I W A P C L S Y
241-gccgacgggcttttctggctcatctataccaacgtgcgcacctggaacgcggggccgtgg
A D G L F W L I Y T N V R T W N A G P W
301-aaggactgccccaactacctgacaaccgccaagtcaatcgaaggcccgtggtcagacccc
K D C P N Y L T T A K S I E G P W S D P
361-gtgttcctcaactgctcaggctttgacccctcgctttttcatgacgatgacggcagaaag
V F L N C S G F D P S L F H D D D G R K
421-tggctggtcaacatggagtgggactaccgcaagccgggcgaccccgaaggcccgcagttt

W L V N M E W D Y R K P G D P E G P Q F
481-tcgggcatactgattcaggaatacagccccgcggaaaaaaggctcgcggggccggttcgc
S G I L I Q E Y S P A E K R L A G P V R
541-aagattttcacgggttccccgatagcctgcgtggaaggcccgcacgtctacaagcgggac
K I F T G S P I A C V E G P H V Y K R D
600-ggctggtactacctgctcaccgccgagggcggcacggtgtataaccacgcggcgaccctt
G W Y Y L L T A E G G T V Y N H A A T L
661-gcccgctcccgcgcgttggaagggccttacgagattcacccgcagaacccgcttatcagt
A R S R A L E G P Y E I H P Q N P L I S
721-tcgcgggggaagccggaactgcgcctgcaaaaagcggggcacgcgagctggtgcgagacc
S R G K P E L R L Q K A G H A S W C E T
781-gccgacggcagaacctacctggccttcttgtgcgggaggccgctgcccggcacgcaaaac
A D G R T Y L A F L C G R P L P G T Q N
841-tgcccgctggggcgggagacttcgatagccgagctggtctggcacgaggggtggccgtat
C P L G R E T S I A E L V W H E G W P Y
901-gtcaaaggcgaagacggaaacaggcagaatttccccgcggacactttcgagcctcccgtg
V K G E D G N R Q N F P A D T F E P P V
961-aaaattgccgccccggcgcgaaagaggcgcgggcgctctatcagtttgacggccccgcca
K I A A P A R K R R G R S I S L T A P P
1021-tccacggcgacttcaagactctccgcgttcccgccgaccctgaacgctgctcgttga -1077
S T A T S R L S A F P P T L N A A R -

Hình 7. Trình tự ORF GL0112518 và trình tự axit amin mà ORF này mã hóa.

19


Chương 2:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu

2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid
- Chủng vi khuẩn E. coli DH10B dùng trong thí nghiệm tách dòng, kiểm tra
vector biểu hiện pET22xbx.
- Chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3), Rosetta (DE3), SoluBL21 (DE3) và
JM109 (DE3) dùng trong thí nghiệm biểu hiện gen.
- Vector pET22b(+) dùng làm vector biểu hiện trong E. coli BL21.
Các chủng vi khuẩn và vector gốc được cung cấp bởi Novagen.
2.1.2. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường LB lỏng: 1% bacto-trypton; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl (có
pH khoảng 7.0).
- Môi trường chọn lọc LBA lỏng: gồm môi trường LB, bổ sung ampicillin
đến nồng độ cuối cùng là 100 μl/ml.
- Môi trường chọn lọc LBA đặc: môi trường LB bổ sung thêm 1,5% agar và
ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 μl/ml.
- Môi trường chọn lọc LBA – IPTG: thành phần như LBA nhưng bổ sung
thêm IPTG với nồng độ phù hợp với từng mục đích thí nghiệm biểu hiện gen.
2.1.3. Hóa chất và dung dịch sử dụng
- Hóa chất: bacto-trypton, cao nấm men (BactoTM, Mỹ); SDS, axit acetic,
Tris-HCl, NaCl, ampicillin (Merck, Đức); agar (Prolabo, Tây Ban Nha); agarose
(Bio Basic, Canada); kali acetat, methanol, glycerol, NaOH, isoamylalcohol, EtBr,
ethanol, chloroform (Rohde, Đức); EDTA, APS, TEMED, acrylamide, protein
marker (Fermentas, Đức); 4-nitrophenyl β-Dxylopyranoside (4NPX).
- Enzym: NcoI, XhoI (BioLabs, Mỹ); ARNase (Thermo scientific, Mỹ).

20


- Các loại đệm phù hợp và dH2O.
- Các dung dịch sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ E. coli
1. Dung dịch Sol I (50 ml): glucose 0,45 g; Tris-HCl 1 M (pH = 8,0) 1,25

ml; EDTA 0,5 M (pH = 8,0) 1 ml, dH2O 47,3 ml.
2. Dung dịch Sol II (50 ml): NaOH 10N 1 ml; SDS 10% 5 ml; dH2O 44 ml.
3. Dung dịch Sol III (100 ml): kali acetat 5 M 60 ml; axit acetic dạng băng
11,5 ml; H2O 28,5 ml.
4. Dung dịch chloroform : isoamylalcohol (24:1) gồm 24 phần thể tích
chloroform và 1 phần thể tích isoamylalcohol.
- Các dung dịch sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose 0,8%
1. Dung dịch đệm TAE 1X: pha loãng 50 lần từ dung dịch TAE 50X.
Dung dịch TAE 50X (100 ml): Tris-base 24,2 g; axit acetic dạng băng
5,71 ml; EDTA 0,5 M (pH = 8,0) 10 ml.
2. Loading dye (6X): bromophenol blue 0,25%; xylen cyanol FF 0,25%;
glycerol 30%.
3. Dung dịch nhuộm gel: ethidium bromide (EtBr) pha loãng trong nước với
nồng độ 0,5μl/ml.
- Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide – SDS.
1.
2.
3.
4.
5.

Bis-acrylamide 30%: 30 g acrylamide; 0,8 g bis-acrylamide.
Tris pH = 8,8: Tris 0,75 M; SDS 0,2%, dùng HCl chỉnh đến pH = 8,8.
Tris pH = 6,8: Tris 0,25 M; SDS 0,2%, dùng HCl chỉnh đến pH = 6,8.
SDS 10%.
Đệm xử lý mẫu (Sample Buffer 6X): Tris 0,375 M (pH = 8), glycerol

60%, SDS 12%, bromophenol blue 0,06%, 2-mecaptoethanol 3/10 (v/v).
6. Đệm chạy điện di: Tris 0,05 M; glycine 0,192 M; SDS: 0,1%.
7. Dung dịch nhuộm gel (coomassie blue staining): coomassie brilliant blue

0,025%; methanol 40%; acetic acid: 10%.
8. Dung dịch tẩy rửa 1: methanol 5%, acetic acid 7,5%.
9. Dung dịch tẩy rửa 2: ethanol 35%, glycerol 1-2%.
10. Thành phần gel (công thức cho 2 bản gel):
Hóa chất

Gel tách (12,6%)

Gel cô (5%)

H2 O

1 ml

1,3 ml

21


Tris 1,5M (pH 8,8)

2,25 ml

Tris 0,5M (pH 6,8)

0,5 ml

Glycerol 50%

1,8 ml


Acrylamide 30%

3,8 ml

0,35 ml

SDS 10%

90 μl

10 μl

APS 10%

60 μl

20 μl

TEMED 100%

6 μl

2 μl

2.1.4. Các thiết bị sử dụng
-

Bể ổn nhiệt.
Máy lắc ổn nhiệt (N-Bioteck).

Máy ly tâm lạnh (Legend Micro 21R, Thermo Scientific).
Máy vortex (Rotolab, OSI).
Máy làm khô (Vortemp 56).
Máy điện di DNA trên gel agarose (Mupid-2 plus, Advance).
Máy soi gel (DNA-UV Transilluminator, Vilber Lourmat).
Máy đo OD (Spectro SC, LaboMed.Inc).
Máy phá tế bào bằng sóng siêu âm (Micronix).
Máy biến tính protein (Techne Dri-Block DB 1M).
Máy điện di protein trên gel polyacrylamide (Bio-Rad).

Và các dụng cụ, thiết bị cần thiết khác như lò vi sóng, cân điện tử, tủ cấy vô
trùng, ống eppendorf, đầu côn, pipet các loại, đĩa petri,…

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách DNA plasmid từ E. coli (Alkaline lysis)
2.2.1.1. Cơ sở lý thuyết
Phương pháp thủy phân bằng kiềm lần đầu tiên được phát triển bởi Birnboim
và Doly vào năm 1979 [29], và cho đến hiện nay, đây vẫn là phương pháp phổ biến
nhất để tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli . Phương pháp gồm các bước
chính như sau:

22


+ Tế bào mang plasmid được nuôi qua đêm đến pha cân bằng, rồi ly tâm để
thu lại tế bào.
+ Ổn định tế bào ở thể huyền phù bằng dung dịch (thường được gọi là “Sol
I”) gồm Tris-HCl, EDTA, glucose. EDTA giúp ổn định màng tế bào còn
glucose duy trì áp suất thẩm thấu, tránh làm vỡ tế bào. Tris-HCl tạo môi
trường pH=8,0, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng phân giải tiếp theo.

+ Màng tế bào bị phá vỡ bởi chất tạo sức căng bề mặt SDS có trong dung
dịch Sol II. Ngoài SDS, dung dịch Sol II còn chứa NaOH, hóa chất cũng giúp
phá vỡ tế bào. Nhưng vai trò còn quan trọng hơn của NaOH là làm gẫy các
liên kết hiđrô giữa hai mạch DNA, chuyển các DNA sợi đôi (bao gồm cả
DNA của tế bào và plasmid) thành sợi đơn. SDS còn có tác dụng biến tính
protein, giúp phân tách protein khỏi DNA plasmid ở giai đoạn sau.
+ Hồi tính DNA bằng cách trung hòa dung dịch với kali acetat có trong dung
dịch Sol III. Vì DNA plasmid có kích thước nhỏ nên dễ hồi tính, còn DNA
của tế bào quá lớn nên rất khó để gắn trở lại. DNA plasmid được hòa tan
trong dung dịch, trong khi DNA của tế bào, SDS và protein bị biến tính dính
lại với nhau.
+ DNA hệ gen và protein được tủa lại bằng chloroform : isoamylalcohol
(24:1). Phần tủa bị loại bỏ khỏi DNA bằng ly tâm.
2.2.1.2. Quy trình
1. Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy qua đêm (ở 37oC) vào vào eppendorf.
2. Ly tâm thu tế bào 6000 vòng/phút trong 5 phút.
3. Bổ sung 100 μl Sol I, đánh tan tủa bằng máy vortex. Giữ ở nhiệt độ
phòng trong 5 phút.
4. Bổ sung 200 μl Sol II. Đảo nhẹ (nếu hóa chất pha đúng, dung dịch sẽ
chuyển từ đục sang trong do màng tế bào bị phá vỡ). Giữ ở nhiệt độ
phòng 5 phút.
5. Bổ sung 150 μl Sol II. Đảo nhẹ ngay lập tức 5-6 lần (nếu hóa chất pha
đúng, sẽ thấy xuất hiện tủa trắng). Giữ trên đá trong 10 phút.
6. Thêm 450 μl chloroform:isoamylalcohol (24:1) để tủa protein và DNA
hệ gen còn trong dung dịch.
7. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút.
8. Chuyển dịch nổi chứa DNA plasmid sang ống eppendorf mới.

23