BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐẠO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
KHOA HÓA HỌC

BÀI TẬP MÔN HỌC
ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ NHANH
SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO TRONG ĐIỀU KIỆN
PHÒNG THÍ NGHIỆM
Chuyên ngành: Hóa Công nghệ - Môi trường

Người hướng dẫn khoa học : Cô Phạm Thanh Nga
Sinh viên

: Phạm Đăng Tuyên

Lớp

: K63B

Hà Nội - 2016

Mục lục


Trang

2


Nghiên cứu các phương pháp đánh giá nhanh sinh trưởng
của vi tảo trong điều kiện phòng thí nghiệm

Trong quá trình nuôi cấy, nghiên cứu vi sinh vật, việc đánh giá sinh trưởng
của VSV là một công đoạn cần thiết. Có nhiều phương pháp giúp chúng ta ghi
nhận các thông số của quá trình sinh trưởng ở VSV, với nguyên tắc chung nhất là
dựa vào sự biến đổi số lượng, chất lượng VSV trong điều kiện nuôi cấy. Với yêu
cầu cụ thể là đánh giá nhanh sinh trưởng của VSV, phòng thí nghiệm thường sử
dụng một số phương pháp như: đếm trực tiếp trong buồng đếm (đếm tế bào), đo
độ đục (mật độ quang – OD), đo sinh khối tế bào, đo gián tiếp nồng độ một số
chất trong môi trường nuôi cấy, …v.v. Mỗi phương pháp có nhưng ưu nhược
điểm riêng, phù hợp với từng điều kiện, từng trường hợp cụ thể.
I.

Chuẩn bị mẫu:

Trước khi tiến hành các phương pháp định lượng VSV thông thường phải
thực hiện việc chuẩn bị mẫu: gồm thao tác lấy mẫu và pha loãng mẫu:
1. Lấy mẫu:
Việc lấy mẫu có một số yêu cầu về khối lượng và số lượng để đảm bảo
phù hợp với mục đích:
− Lấy mẫu có tính chất đại diện
− Lấy mẫu với lượng vừa phải, đủ để thực hiện phân tích các đặc tính lý
hóa sinh
− Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng
− Lấy mẫu xong cần phân tích ngay, nếu ở nhiệt độ thường không để quá
30’, nếu hạ nhiệt độ xuống 0-5oC có thể để lâu hơn nhưng không để
quá 24h
− Mẫu phải có nhãn ghi vào sổ đặc điểm của mẫu cũng như nơi thu mẫu.
Trên nhãn cần ghi thông tin sau:
•
Mã số mẫu
•

Loại và mục đích lấy mẫu
•
Tên và chức năng người lấy mẫu
•
Yêu câu phân tích

3


2.

Pha loãng mẫu:

Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, một số ống
nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng và một số ống hút (1ml) vô trùng.
−

Mẫu ở trạng thái lỏng :
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:





−
−

Dùng pipet lấy 1ml dung dịch từ ống nuôi cấy gốc ban đầu cho vào ống
nghiệm chứa 9ml nước cất, ta được dung dịch có nồng độ bằng 10 -1 dung
dịch gốc (hay dung dịch có độ pha loãng 101 hoặc hệ số pha loãng 10-1)

Dùng pipet lấy 1ml dung dịch có độ pha loãng 10 1 cho vào ống nghiệm
chứa 9ml nước cất ta được dung dịch có độ pha loãng 10 2 (hoặc hệ số pha
loãng 10-2). Tiếp tục như vậy ta được các dung dịch có độ pha loãng cao
hơn
Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm)
Chuẩn bị 2 bình hình nón có dung tích 250 ml
+ Bình 1 chứa 90ml nước cất vô trùng
+ Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì

−
−
−
−

Khử trùng cối chày sứ bằng cách cho một ít cồn vào và đốt lên. Sau đó để
nguội.
Cân 1 g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ và nghiền nát mẫu.
Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2.
Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như mẫu ở trạng
thái lỏng.
4


−

Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều
hay ít
Sau khi có mẫu, bắt đầu tiến hành các phương pháp phân tích lí hóa sinh.

II .

1.
a.
−

−

−

b.
∗
−

Phương pháp định lượng vi sinh vật:
Phương pháp đếm trực tiếp:
Nguyên tắc:
Sử dụng kính hiển vi quan sát mẫu VSV trên các buồng đếm, đếm trực
tiếp số lượng tế bào vi khuẩn trong một thể tích phòng đếm, kết hợp với
độ pha loãng để tính toán được mật độ tế bào trong dung dịch ban đầu.
Đối với tế bào động vật nguyên sinh ta có thể dùng phòng đếm PetroffHausser, còn với các tế bào sinh vật nhân nguyên thủy và nhân chuẩn ta
thường dùng phòng đếm Neubauer-Thomas (phòng đếm hồng cầu) để
đếm. Với các tế bào sinh vật nhân sơ thường có thể nhuộm màu hoặc sử
dụng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang (phaseconstrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát.
Có thể đếm số lượng tế bào VSV theo phương pháp đếm trực tiếp trên lam
phết kính (Breed). Nguyên tắc đếm trực tiếp số tế bào trên một vi trường,
lặp lại nhiều lần để có được số tế bào trung bình, kết hợp với diện tích một
vi trường cùng độ pha loãng để tính toán ra mật độ VSV trong mẫu gốc.
Ngoài ra có thể sử dụng máy đếm điện tử Coulter Counter. Nguyên lý là
hai bên mỗi lỗ nhỏ có điện cực và nối điện. Khi tế bào trong dịch huyền
phù đi qua lỗ nhỏ thi cứ mỗi tế bào đi qua thì điện trở lại tăng lên (hoặc
tinh dẫn điện giảm xuống) và sinh ra một tin hiệu điện, máy đếm sẽ tự

động ghi số.
Phương pháp tiến hành:
Phương pháp đếm trực tiếp trên lam phết kính:
Tiêu bản VSV đã được nhuộm màu (nhuộm đơn)
Phết kính:
+ Dùng lam sạch và bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ một hình vuông S = 400
mm2, ở mặt trên lam. Mục đích không cho vi sinh vật lan ra khỏi diện tích
đếm.
+ Hút 0.02-0.2 ml dung dịch pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt
trên lam.
5


−

+ Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu
ra xung quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông.
+ Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen.
+ Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100.
Cách đếm:
+ Đếm số tế bào VSV trên 1 đơn vị vi trường (VT)
+ Đếm hết tất cả 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính

Sơ đồ di chuyển vật kính trong hình vuông phết kính để đếm số VSV/1VT
−

Công thức tính mật độ tế bào trong mẫu:
Số tế bào/1ml mẫu =
Trong đó:


X là số vi khuẩn đếm được trong một V
S là diện tích hình vuông phết kính (400mm2)
S

là diện tích 1 vi trường, πR2=0.0004mm2
6


=> số lượng vi trường có trong S
V là thể tích giọt vi khuẩn phết kính
H là hệ số pha loãng mẫu
∗
−

Phương pháp đếm trực tiếp trong buồng đếm:
Để quan sát vi tảo thông thường sẽ sử dụng buồng đếm hồng ngoại.
Cấu tạo buồng đếm:
+ Buồng đếm là một phiến kính trong, dày từ 2-3mm, hình chữ nhật
+ Giữa phiến kính là một phần lõm phẳng làm đĩa đếm, có kẻ một hoặc
hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ, xung quanh có một rãnh nhỏ. Đĩa đếm
thấp hơn bề mặt phiến kính khoảng 1/10mm, có hình tròn vì thế khi phủ
lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa
đếm có diện tích 1mm2. Bên ngoài buồng đếm có ghi tên loại buồng đếm
và một số thông số kĩ thuật đặc trưng:

Cấu tạo buồng đếm
−

Cấu tạo khung đếm đĩa đếm: khung đếm thường có cấu tạo
+ Trường hợp 1: khung đếm có 16 ô lớn, mỗi ô lớn có 25 ô nhỏ. Một

khung do đó có 400 ô nhỏ
+ Trường hợp 2: khung đếm có 25 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ. Một
khung do đó có 400 ô nhỏ
+ Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400mm2
Vậy thể tích 1 ô nhỏ là V= 0.1mm x 1/400mm2 = 1/4000mm3

7


Cấu tạo khung đếm
−

Cách tiến hành:
+ Trước khi tiến hành quan sát cần cho thêm vài giọt fomalin vào trong
mẫu, trộn đều
+ Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm
+ Lắc mạnh dịch huyền phù đã pha loãng, sau đó dùng pipet hút dung dịch
mẫu đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu.
+ Dùng đầu pipet đặt vào cạnh buồng đếm tiếp giáp lammen kính, dịch
huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được
8


chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm
được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh chung quanh thì không
bị dính ướt.
+ Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn sang các
khoang. Khi đó dịch trong khoang có độ dày 0.1mm
+ Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng
đếm

+ Thao tác, điều chỉnh kính hiển vi, ban đầu dùng vật kính x10 để điều
chỉnh sơ bộ trước, sau đó sử dụng vật kính x40 để quan sát và đếm. Chú ý
bắt đầu đếm sau khi nhỏ giọt dung dịch từ 3-5’
+ Đếm số tế bào có trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh và 1 ô ở giữa), đếm lần lượt
từng ô nhỏ trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm
hẳn trong ô trước, sau đó đếm các tế bào ở cạnh bên trên và bên phải ô
+ Đếm tất cả 80 ô nhỏ trong 5 ô lớn (TH1: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ)
+ Đếm tất cả 125 ô nhỏ trong 5 ô lớn (TH2: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ)

Thao tác thực hiện đếm số tế bào

9


−

Công thức tính:
Số tế bào/1ml mẫu =
Trong đó:

−

a là số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ
V là thể tích của 1 ô nhỏ (tính theo ml)
H là hệ số pha loãng

Một số chú ý:

+ Nên tiến hành nhuộm màu tiêu bản (methylen blue) để dễ quan sát và
đếm chính xác

+ Nồng độ dịch huyền phù pha loãng thích hợp sao cho mật độ trong mỗi
ô nhỏ không úa 10 tế bào
+ Sử dụng buồng đếm xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô
+ Để đạt độ chính xác cao, mật độ trung bình của tế bào đếm được trong 1
ô nhỏ vào khoảng 2.5 < a < 10
c.
−
−

Ưu – nhược điểm:
Ưu điểm: phương pháp đếm trực tiếp có ưu điểm là có thể nhanh chóng
xác định được nhanh chóng mật độ VSV trong mẫu, thao tác đơn giản
Nhược điểm:
+ Không nhận biết được tế bào VSV sống và các tế bào chết
+ Dễ nhầm lẫn tế bào VSV với các dị thể trong mẫu
+ Độ chính xác ở mức tương đối
+ Không phù hợp với huyền phù VSV có mật độ thấp

Phương pháp đo mật độ quang
Nguyên tắc:
Số lượng VSV có trong mẫu có thể được xác định gián tiếp thông qua
phương pháp đo độ đục hay đo mật độ quang. Nguyên tắc chung của phương
pháp này là sự tương quan giữa nồng độ, hay mật độ tế bào VSV và số lượng
photon trong ánh sáng bị phân tán (thông thường với các mẫu không quá đậm
đặc thì mật độ VSV tỉ lệ thuận với số photon bị phân tán). Việc đo độ đục có thể
2.
a.

10



tiến hành theo 3 cách đó là: đo bằng quang phổ kế, dùng máy đếm điện tử và sử
dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau.
− Với việc đo bằng quang phổ kế:
+ Sử dụng chùm sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa VSV cần
đo. Các tế bào VSV trong huyền phù sẽ làm phân tán bớt chùm tia
sáng, tùy theo số lượng nhiều hay ít của chúng trong mẫu. Số tia sáng
còn lại đi qua mẫu sẽ kích thích một tế bào quang điện. Cường độ
chùm sáng đi qua sẽ làm dịch chuyển cây kim trên thước đo, cho ta
biết phần trăm ánh sáng bị phân tán trên bảng chỉ thị. Từ kết quả thu
được ta mang đối chiếu với một bảng chuẩn và kết hợp với độ pha
loãng để biết được mật độ VSV trong mẫu.

+

+

Lượng ánh sáng truyền qua mấu sinh khối tỉ lệ thuận với lượng tế bào
và có thể tính theo công thức sau:
T=
Trong đó:
Để có được đơn vị đo thích hợp, người ta sử dụng đơn vị hấp thụ ánh
sáng của vật chất A (Absorance) thay cho đơn vị truyền ánh sáng T. Ta
có mối liên hệ:

Độ hấp thụ tăng tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Thuật ngữ độ hấp thụ (A)
còn được gọi là mật độ quang (OD)
Cách đo thứ 2 là sử dụng máy đếm điện tử, có thể đo được hàng ngàn tế
bào trong vòng vài giây. Nguyên tắc của phép đo này là tế bào được đưa


+
−

11


qua tia sáng của máy điện tử, VSV cản tia sáng và ghi dấu hiệu trên bộ
đếm của máy.
− Cách thứ 3 là sử dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống nghiệm
Macfaland). Một dãy ống nghiệm chứa BaSO4 có độ pha loãng khác nhau
tương ứng với độ pha loãng có bảng đối chiếu của nồng độ vi khuẩn tương
ứng. Đối chiếu độ đục của ống nghiệm chứa mẫu cần đo với dãy ống
nghiệm Macfaland, sau đó đối chiếu với bảng ta sẽ biết được nồng độ của
vi khuẩn tương ứng.
b. Cách tiến hành:
∗ Phương pháp đo bằng quang phổ kế:
Tế bào VSV có chứa nhiều phân tử có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước
sóng khác nhau (AND từ 254-260nm; protein 280nm; xitocrom 400-500nm…)
Khi đo độ đục tế bào người ta thường chọn các bước sóng có độ hấp thụ nhỏ, hay
dùng nhất là bước sóng 600-620nm. Tùy vào đối tượng mang đo mà ta chọn
bước sóng cho phù hợp. Bên cạnh đó, do sự ảnh hưởng của thành phần bên trong
tế bào đối với sự khuếch tán hay hấp thụ ánh sáng mà phương pháp này có tính
đặc thù riêng với mỗi loại VSV.
Tiến hành đo:
− Lấy 1 ống nghiệm chứa mẫu VSV cần đo và 4 ống nghiệm vô trùng, tiến
hành pha loãng theo dãy thập phân.
− Chuẩn bị máy quang phổ đo độ đục, có thể sử dụng máy quang phổ đơn
giản hoặc máy quang phổ UV-vis
− Tiến hành đo độ đục của các mẫu đã pha loãng trên quang phổ kế ở
620nm, ứng với mỗi độ pha loãng mẫu sẽ thu được một giá trị OD. Theo

định luật Lambert thì độ hấp thụ chỉ tỉ lệ thuận với mật độ VSV trong
khoảng giá trị từ 0.1-0.8. Nếu lớn hơn 0.8 thì mật độ vật chất cao, các
VSV sẽ tạo ra các bóng che khuất nhau làm cho sai lệch kết quả.
− Song song với việc đo độ đục cần tiến hành nuôi cấy và đếm số lượng tế
bào ở các độ pha loãng tương ứng trên môi trường thạch, từ đó thiết lập
hàm tương quan giữa độ hấp thụ và số lượng tế bào sống. Hàm có dạng
bậc nhất:
A = a. + b
Trong đó:

12


−

∗
−

−

−

c.
−

−

Sau khi xây dựng được hàm tương quan, các lần đo tiếp theo ta chỉ cần đo
giá trị mật độ quang (OD) rồi sau đó dựa vào hàm tương quan để tính toán
ra mật độ VSV trong mẫu

Phương pháp dãy ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống nghiệm
Macfaland)
Dùng 10 ống nghiệm sạch, trong, có kích thước bằng nhau. Nhỏ vào mỗi
ống một lượng dung dịch BaCl2 theo thứ tự từ ống 1 đến ống 10, ống 1
nhỏ 0,1ml, ống 2 nhỏ 0,2ml,.. cứ thế đến ống 10 là 1ml. Tiếp theo cho vào
mỗi ống vừa đủ 10ml dung dịch H2SO4 và hàn kín miệng ống.
Lấy ống nghiệm chứa mẫu cần đo cho vào máy li tâm, gạn rửa. Cho nước
cất vào tiếp tục li tâm, gạn rửa 2-3 lần nữa. Cuối cùng cho nước cất vào
một lượng ngang với lượng dung dịch nuôi cấy.
Đặt ống nghiệm chứa VSV đã gạn rửa vào giữa 2 ống Macfaland áng
chừng có màu tương tự. Số lượng VSV có trong 1ml dung dịch sẽ nằm
trong khoảng 2 mức chuẩn của ống Macfaland.

Ưu – nhược điểm:
Ưu điểm: phương pháp đo mật độ quang cho kết quả nhanh chóng, dễ
dàng, phương pháp đo với máy quang phổ thường được ứng dụng để theo
dõi, nghiên cứu sự sinh trưởng của VSV trong PTN hoặc trong sản xuất.
Việc đo độ đục với máy quang phổ có thể phân biệt được tế bào sống và tế
bào chết.
Nhược điểm:
+ Phương pháp đo với máy quang phổ dễ bị sai số do thao tác và sai số
của máy đo

13


+ Phương pháp dãy ống nghiệm Macfaland cho kết quả rơi vào một
khoảng, không phải mật độ cụ thể
+ Cần lưu ý khi pha loãng mẫu để đo trên máy quang phổ cần pha sao cho
OD rơi vào khoảng <0.8

Phương pháp đo sinh khối:
Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng về số lượng cá thể trong quần
thể, khi số lượng tăng lên sẽ đi kèm với sự tăng lên của sinh khối. Mặt khác, hàm
lượng độc tố có liên quan mật thiết với lượng chất khô trong mẫu hơn là số
lượng cá thể, nên số lượng cá thể chưa phải là thước đo lý tưởng để đánh giá
kích thước quần thể hay độc tính tiềm tàng. Do đó, trong nghiên cứu thường sử
dụng phương pháp đo sinh khối vi sinh vật.
Có 2 phương pháp đo sinh khối là đếm số lượng tế bào và xác định hàm
lượng sắc tố.
3.1.
Phương pháp đếm và xác định thể tích tế bào:
Nguyên tắc:
− Thể tích sinh học (biovolume) có thể đạt được từ số lượng tế bào bằng
cách xác định thể tích trung bình của tế bào từng loài hay đơn vị đếm rồi
nhân với số lượng tế bào hiện có trong mẫu. Kết quả là tổng thể tích của
mỗi loài.
− Với tế bào phù du thì 1mm 3 được coi là 1mg, thể tích sinh học tương ứng
với sinh khối.
− Thể tích trung bình xác định bằng cách giả dịnh một kiểu hình học cho
mỗi loài (đối với tế bào Microcystis được coi là hình cầu), đo độ dài hình
học của 20-30 tế bào (phụ thuộc độ biến động) của loài và tính toán thể
tích trung bình tương ứng.
3.

Ví dụ: để xác định 20 tế bào Microcystis, có đường kính trung bình là
5μm. Với giả định dạng hình học của tế bào là hình cầu ta sẽ tính được thể tích tế
bào trung bình là 4/3πr3 = 65,4μm3. Theo thống kê có khoảng 1 triệu tế bào trong
1mL như vậy tổng thể tích sinh học là 65,4.106μm3mL-1
Xét ví dụ 2: Đo 30 tế bào hình sợi Planktothrix cho kết quả chiều dài trung
bình là 225μm và đường kính trung bình là 6μm. Giả định tế bào có hình trụ, khi

đó thể tích trung bình là 2πr2.L=6,359μm3. Thống kê cho thấy có khoảng 10000
14


tế bào sợi trong 1mL. Như vậy thể tích sinh học của Planktothrix là
63,6.106μm3mL-1.

Hình ảnh tế bào Microcystis

Công thức tính thể tích tế bào hình cầu
(V là thể tích tế bào hình câu; A là diện tích bề mặt; r là bán kính mặt cắt;
d là đường kính mặt cắt)

Hình ảnh tế bào sợi Planktothrix

Công thức thể tích tế bào hình trụ (h: đường cao, d: đường kính đáy)

15


Như vậy, mặc dù số lượng cá thể của Planktothrix nhỏ hơn 100 lần so với
Microcystis, thể tích sinh khối của chúng khá tương đương nhau do thể tích của
một cá thể Planktothrix lớn hơn 100 lần so với tế bào Microcystis. Cả hai loài
đều mang độc tố microcystins, và có thể nhận thấy rằng mối giữa thể tích sinh
học hay sinh khối với lượng độc tố sinh ra có quan hệ mật thiết hơn là khi so
sánh về số lượng cá thể.
3.2.
Phương pháp xác định hàm lượng sắc tố chlorophyll a:
a. Nguyên tắc:
− Sắc tố chlorophyll a nói chung chiếm khoảng 0,5-1% trọng


−

b.
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−

lượng sinh
khối khô của các cơ thể thực vật phù du. Mặc dù hàm lượng sắc tố biến
đổi theo từng giai đoạn sinh lý cơ thể, chlorophyll a vẫn được sử dụng
rộng rãi và được chấp nhận như một thước đo sinh khối. Đây là một phép
đo đặc biệt thông dụng đối với quá trình nở hoa của vi khuẩn xiano, khi
các thực vật phù du chủ yếu bao gồm vi khuẩn xiano, thường chỉ của một
loài. Tuy nhiên, khi phép xác định chlorophyll a được dùng với hỗn hợp
quần thể thực vật phù du (gồm vi khuẩn xiano và các loài khác) sẽ gây ra
sự ước tính quá cao sinh khối của vi khuẩn xiano. Việc ước lượng vi thô về
mối quan hệ chia sẻ của tế bào vi khuẩn xiano giữa tập hợp thực vật phù
du có thể sử dụng để hiệu chỉnh sự ước tính quá cao
Phân tích chlorophyll đòi hỏi dụng cụ tương đối đơn giản là thiết bị lọc,
máy li tâm, máy đo quang phổ. Chlorophyll được tác chiết bằng cách xử lý
mẫu tế bào VKL với một dung môi hữu cơ, thường là etanol.

Hóa chất, dụng cụ:
Máy đo quang phổ phù hợp để đọc bước sóng 750nm
Cuvette thủy tinh độ dài sáng 1cm hoặc 5cm đôi với nồng độ thấp
Máy li tâm
Ống li tâm 15mL có nắp đậy
Bể điều nhiệt ở 75oC hoặc dụng cụ làm nóng để đun sôi etanol
Giấy lọc sợi thủy tinh (GF/C) đường kính 47 mm
Phễu lọc, máy hút chân không
Cối, chày nghiền mẫu hay máy siêu âm
Pipet hoặc các dụng cụ tương tự lấy axit
Etanol (90%)
Axit clohidric HCl 1M
16


•
−

−

−

c.
−

−

−

−


−
−

Lưu ý:
Cần thực hiện các thao tác trong điều kiện ánh sáng yếu, vì sắc tố rất dễ
mất màu dưới ánh sáng, đặc biệt là ánh sáng ban ngày và ánh sáng đèn
huỳnh quang.
Thêm một lượng nhỏ MgCO3 vào acetone trước khi nghiền. Điều này có
thể loại bỏ lượng dư axit có từ dịch tảo hay mô tảo lớn đem phâm tích hay
từ các dụng cụ thủy tinh. Axit sẽ loại Mg 2+ từ chlorophyll hình thành
phaeophytin
Giữ dịch chiết trong điều kiện mát để tránh sắc tố bị phá hỏng, sử dụng
dung môi đã được làm lạnh và thực hiện thao tác nghiền, giữ dịch chiết
trong bể đá.
Các bước tiến hành:
Cô đặc tế bào:
+ Li tâm một thể tích đã biết dịch nuôi cấy thành một giọt và cẩn thận
hút phần dịch ra
+ Lọc môt thể tích đã biết dịch nuôi cấy tảo trên một giấy lọc GF/C có
bông thủy tinh. Khi giấy lọc khô, đặt chúng vào trong ống li tâm
thủy tinh. Trong trường hợp chưa có điều kiện phân tích ngay, các
giấy lọc chứa mẫu có thể được giữ ở -20oC.
Đặt giấy lọc vào trong cối nghiền, thêm 2-3mL etanol 90% đun sôi giữ
trong đá lạnh, khuấy bằng que thủy tinh và nghiền cho đến khi các sợi tách
ra.
Rót dịch nổi (đối với tảo lọc) và một ống li tâm thủy tinh có chia độ và
nếu cần thì tách chiết lại với etanol một lần nữa. Rót dịch nổi ra và gộp với
các phần dịch nổi trước. Dùng etanol để đưa dịch chiết tới thể tích không
đổi là 10mL. Đậy kín ống li tâm và giữ trong tối, ở 20oC trong 24-48 giờ.

Li tâm trong 15 phút ở 3000-5000 vòng/phút để loại tất cả các chất cặn
còn sót lại. Chuyển dịch nổi vào trong ống li tâm sạch khác. Đo thể tích
dịch nổi
Đặt mẫu vào trong cuvette và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 750 và
665mm (750a và 665a).
Thêm 0,01mL của dung dịch HCl 1M vào mẫu trong cuvette (điều chỉnh
thể tích cho phù hợp với thể tích cuvette, khoảng 0,003mL của 1mol/L

17


d.

HCl/mL dịch etanol) và khuấy trong 1 phút. Đo độ hấp thụ pử 750 và
665nm (750b, 665b).
Tính toán kết quả
Sử dụng độ hấp thụ đã điều chỉnh để tính toán kết quả
Chlorophyll a = 29,62(665a-665b)..l (mg/m3)
Phaeophytin a = 20,73(665b)..l (mg/m3)
Trong đó: Ve là thể tích dịch chiết etanol (L)
Vs là thể tích mẫu nước (L)
l là độ dài ánh sáng (cm)

Lưu ý rằng tỉ lệ của chlorophyll a so với phaepphytin a là dấu hiệu đánh
giá trạng thái của quần thể vi khuẩn xiano, nhưng cũng có thể phản ánh hiệu quả
của việc xử lý và bảo quản mẫu, do hàm lượng cao của phaeophytin a biểu thị sự
suy giảm của chlorophyll a do quần thể suy thoái hoặc do quá trình nghiên cứu.
Trong quá trình lọc mẫu, các tế bào có thể chết, dẫn đến hậu quả là ngay lập tức
làm giảm chất phaeo. Nếu sau khi lọc mẫu không được chiết ngay hoặc làm lạnh,
nồng độ chlorophyll a sẽ suy giảm. Bên cạnh đó, nhiều nguyên nhân trong quá

trình nghiên cứu có thể làm giá trị chlorophyll a thu được rất nhỏ.
Xét biểu thức:
Chlorophyll a + Phaeophytin a = mg.m-3
Phép tính trên sẽ cho kết quả gần với tổng nồng độ các chất tính riêng rẽ.

Ý KIẾN CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
Nhận xét chung :
………………………................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
18


............................................................................................................................................
............................................................................................................................................
....................Điểm số :
……………………………………………………………………………………
Hà Nội ngày….tháng….năm 2016
Giáo viên phản biện

19


Ý KIẾN CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
Nhận xét chung :
Điểm số
Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Giáo viên phản biện


20