BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN THỊ MỸ THỦY

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC
THEO NGUYÊN LÝ ĐIỆN HÓA KHÔNG SỬ DỤNG
CHẤT ĐÁNH DẤU ỨNG DỤNG TRONG Y SINH
Chuyên ngành: HÓA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGÀNH HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. HUỲNH ĐĂNG CHÍNH
2. PGS. TS. TRẦN ĐẠI LÂM

Hà Nội – 2012


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan Luận văn Thạc sỹ khoa học - ngành Hóa Học, đề tài
Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử
dụng chất đánh dấu ứng dụng trong y sinh là công trình nghiên cứu độc lập của
mình , các kết quả phân tích đợc thực hiện là chính xác không sử dụng của các tác
giả khác.
Trong luận văn tôi có tham khảo kết quả nghiên cứu của một số tác giả đợc
chỉ rõ trong danh mục tài liệu tham khảo. Mọi số liệu, tài liệu sử dụng trong luận
văn đều có nguồn gốc rõ ràng.

Hà Nội, ngày 26 tháng 03 năm 2012
Tác giả

Nguyễn Thị Mỹ Thủy


MỤC LỤC
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .....................................................................................3
I.1. CẢM BIẾN SINH HỌC ...................................................................................3
I.1.1. Sơ lược quá trình phát triển của cảm biến sinh học ..................................3
I.1.2. Cấu tạo chung của cảm biến ......................................................................4
I.1.3. Cảm biến theo nguyên lý điện hóa .............................................................7
I.1.4. Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học ....................................................8
I.1.5. Một số ứng dụng của cảm biến sinh học ....................................................9
I.2. ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL..............................10
I.2.1. Enzyme ......................................................................................................10
I.2.2. Cholesterol oxidase ..................................................................................17
I.2.3. Phản ứng với xúc tác ChOx......................................................................17
I.3. POLYME DẪN VÀ POLYANILIN...............................................................18
I.3.1 Polyme dẫn ................................................................................................18
I.3.2 Polyanilin ..................................................................................................22
I.4. HẠT NANO OXIT SẮT TỪ TÍNH ...............................................................29
I.4.1 Giới thiệu chung ........................................................................................29
I.4.2. Tính chất của hạt nano


................................................................30

I.4.3. Phương pháp tổng hợp hạt nano sắt từ ...................................................32
CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU .37
II.1. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ..............................................................37
II.1.1. Điện cực làm việc ....................................................................................37
II.1.2. Chế tạo hạt nano Fe3O4 được bọc bằng copolyme poly .........................38
II.1.3. Trùng hợp điện hóa màng PANi và PANi-

..................................40


II.1.4. Cố định enzyme Cholesterol ...................................................................41
II.1.5. Các phân tích điện hóa ...........................................................................43
II.1.6. Phân tích cholesterol bằng phương pháp CHOD-PAP ..........................44
II.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................45
II.2.1. Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier .....................................45
II.2.2. Phương pháp kính hiển vi điện tử quét ..................................................46
II.2.3. Các phương pháp nghiên cứu điện hóa ..................................................48
II.2.4. Phương pháp trắc quang .............................................................................50
CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................52
III.1. TỔNG HỢP ĐIỆN HÓA MÀNG NANOCOMPOSITE PANi/Fe3O4 .......52
III.2. HÀNH VI ĐIỆN HÓA CỦA ĐIỆN CỰC PANi VÀ PANi-Fe3O4..............54
III.3. PHÂN TÍCH HÌNH THÁI HỌC QUA ẢNH FE-SEM .................................1
III.3.1. Ảnh FE-SEM màng PANi và PANi-Fe3O4 .............................................55
III.3.2. Ảnh FE-SEM màng PANi và PANi-Fe3O4 cố định ChOx .....................55
III.4. PHỔ HỒNG NGOẠI PANi và PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx ..........................57
III.5. CÁC PHÉP ĐÁNH GIÁ ĐIỆN HÓA ĐỐI VỚI CẢM BIẾN ChOx ...........58
III.5.1. Phương pháp Von-Ampe vòng (CV) ......................................................58

III.5.2. Phương pháp quét thế tuyến tính (LSV) ................................................59
III.5. 3. So sánh đáp ứng dòng của các cảm biến PANi-ChOx, PANi-Fe3O4/ChOx và
PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx ....................................................................................60
III.6. KHOẢNG TUYẾN TÍNH,GIỚI HẠN PHÁT HIỆN,GIỚI HẠN ĐỊNH
LƯỢNG .................................................................................................................62
III.6.1. Khoảng tuyến tính ..................................................................................62
III.6.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ...........................................66
III.7. ĐÁNH GIÁ CẢM BIẾN ChOx ...................................................................66
III.7.1. Kiểm tra độ đặc hiệu của cảm biến ChOx .............................................66
III.7.2. Độ nhạy của cảm biến ...........................................................................67
III.7.3. Phân tích mẫu giả lập ............................................................................68
KẾT LUẬN ..............................................................................................................70
ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ......................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................72


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ANi

Aniline

CE

Điện cực phụ trợ

ChOx

Cholesterol oxidase

CoE


Coenzyme

CV

Phân cực vòng

E

Enzyme

p(St-co-AA)

Copolyme polystyren và polyacrylic axit

EIS

Phổ tổng trở điện hóa

EM

Emeraldine

ES

Muối Emeraldine

FT-IR

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier


GS

Phân cực dòng tĩnh

IDE

Điện cực có cấu trúc răng lược

IUPAC

Hiệp hội quốc tế về hoá học lý thuyết và hóa ứng dụng

LE

Leucoemeraldine

MEMS

Micro-Electro-Mechanical Systems

PANi

Polyanilin

PBS

Dung dịch đệm muối phosphat

PE


Pernigraniline

PEDOT

Poly (3, 4-ethylenedioxythiophene)

PPy

Polypyrol

PS

Phân cực thế tĩnh

RE

Điện cực so sánh

SCE

Điện cực calomen bão hòa

SEM

Kính hiển vi điện tử quét

USB

Universal Serial Bus


WE

Điện cực làm việc


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng III. 1. Chênh lệch cường độ dòng khi thêm cholesterol vào hệ điện hóa ........64
Bảng III. 2. Kết quả đo chênh lệch cường độ dòng của mẫu trắng...........................66
Bảng III. 3. Độ nhạy của cảm biến............................................................................68
Bảng III. 4. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi cholesterol trên mẫu giả lập theo hai
phương pháp ...........................................................................................69


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình I. 1. Mô hình cảm biến Glucose thế hệ đầu tiên [11] .........................................3
Hình I. 2. Phòng sạch tại Viện ITIMS, ĐH Bách Khoa Hà Nội .................................4
Hình I. 3. Sơ đồ cấu tạo chung của cảm biến sinh học ..............................................5
Hình I. 4. Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học ...................................6
Hình I. 5. Một hệ cảm biến điện hóa ...........................................................................7
Hình I. 6. (a) Mô hình Fisher (b) Mô hình Koshland...............................................12
Hình I. 7. Xúc tác Enzyme làm giảm năng lượng của phản ứng ..............................14
Hình I. 8. Cholesterol Oxidase (ChOx).....................................................................17
Hình I. 9. Vinylferrocene ..........................................................................................19
Hình I. 10. Một số polyme dẫn điện tử .....................................................................20
Hình I. 11. Polyme trao đổi ion (poly 4-Vilynpyridine với Fe(CN)63-) ....................20
Hình I. 12. Công thức tổng quát của PANi ...............................................................23
Hình I. 13. Quá trình chuyển đổi cấu trúc điện tử PANi trong môi trường oxy hóakhử ...........................................................................................................24
Hình I. 14: Đường CV của PANi trong dung dịch HCl 1M và sự thay đổi màu của
PANi ở các giai đoạn oxy hoá khác nhau ở tốc độ quét thế 50 mV/s [2]25

Hình I. 15. Dạng bipolaron của PANi .......................................................................26
Hình I. 16. Cấu trúc hạt nano Fe3O4 [38] ..................................................................30
Hình I. 17. Cơ chế hình thành và phát triển hạt nano trong dung dịch .....................32
Hình I. 18. Công thức phân tử của glutaraldehyde ...................................................35
Hình I. 19. Phương pháp liên kết chéo (cross-linking) .............................................35
Hình II. 1. Sơ đồ chế tạo vi điện cực tích hợp ..........................................................38
Hình II. 2. Vi điện cực tích hợp ................................................................................38
Hình II. 3. Hệ điện hóa đa năng Autolab/PGSTAT12 ..............................................41
Hình II. 4. Hệ ủ hơi GA cố định enzyme ..................................................................42
Hình II. 5. Sơ đồ nguyên lý của máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier .........46
Hình II. 6. Sơ đồ các bộ phận của kính hiển vi điện tử quét .....................................48
Hình II. 7. Phương pháp quét thế tuyến tính đa chu kỳ ............................................49
Hình II. 8. Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong phương pháp CV ..................49


Hình II. 9. Sơ đồ nguyên lý máy trắc quang .............................................................51
Hình II. 10. Đường chuẩn và cách xác định nồng độ (Cx) theo phương pháp đường
chuẩn từ Ax đo được ................................................................................51
Hình III. 1 Phổ trùng hợp điện hóa theo phương pháp CV màng (a) PANi và (b)
PANi-Fe3O4 trên vi điện cực Pt ...............................................................52
Hình III. 2. So sánh cường độ dòng phổ CV (chu kỳ thứ 20) của quá trình trùng hợp
màng PANi và PANi-Fe3O4 ....................................................................53
Hình III. 3. Ảnh hệ điện cực trước và sau khi trùng hợp ..........................................54
Hình III. 4 Phổ CV của điện cực Pt/PANi và Pt/PANi-Fe3O4 trong đệm PBS (KCl
0,9%) .......................................................................................................54
Hình III. 5 Ảnh FE-SEM màng (A) PANi và (B) PANi-Fe3O4 trùng hợp theo
phương pháp CV trên vi điện cực Pt .......................................................55
Hình III. 6 ảnh FE-SEM của (A) hạt nano Fe3O4, điện cực (B) Pt/PANi/ChOx, (C)
Pt/PANi-Fe3O4/ChOx và (D) Pt/PANi-Fe3O4/ Fe3O4-ChOx...................56
Hình III. 7. Phổ FT-IR của (đường a) PANi và (đường b) PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx ....57

Hình III. 8. Phổ CV của Pt/PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx với các tốc độ quét thay đổi từ
10 tới 100mV/s với bước 10mV (đường a tới j) .....................................58
Hình III. 9. Phổ CV điện cực Pt/PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx trong PBS khi không có
cholesterol và khi có 0,5mM cholesterol.................................................59
Hình III. 10. Đường LSV của điện cực Pt/PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx trong đệm PBS
(đường a) 0,0mM cholesterol, (đường b) khi thêm 0,15mM cholesterol
và (đường c) khi thêm 0,3mM cholesterol ..............................................60
Hình III. 11. So sánh khả năng đáp ứng dòng của cảm biến PANi-ChOx, PANiFe3O4/ChOx và PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx..............................................61
Hình III. 12. Cơ chế phản ứng oxy hóa cholesterol trên điện cực PANiFe3O4/Fe3O4-ChOx ..................................................................................62
Hình III. 13. Đặc tuyến đáp ứng dòng của cảm biến ChOx ......................................63
Hình III. 14. Đường chuẩn của cảm biến ChOx .......................................................65
Hình III. 15. Độ đặc hiệu của cảm biến ChOx ..........................................................67


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chất và
tinh thần của con người được nâng cao. Chất lượng bữa ăn được cải thiện nên một
số căn bệnh và các yếu tố nguy cơ cũng gia tăng, điển hình trong đó là các bệnh về
tim mạch, huyết áp cao, tai biến mạch máu não... Có rất nhiều nguyên nhân gây ra
các bệnh tim mạch, nhưng một trong những nguyên nhân quan trọng là do hàm
lượng cholesterol trong cơ thể tăng cao. Con người ngày càng chăm lo đến sức khỏe
của bản thân và điểm đến của họ là các bệnh viện để kiểm tra sức khỏe của mình.
Để chẩn đoán chính xác tình trạng bệnh, các bác sĩ chuyên khoa trong bệnh viện cần
có sự kết hợp của các khoa cận lâm sàng, đó là các xét nghiệm, chụp chiếu x-quang
v.v... Hiện nay các xét nghiệm sinh hóa và huyết học đã tiến bộ rất nhiều nhờ sự
phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật. Đối với một số bệnh thường gặp hiện
nay như: đái tháo đường, tăng huyết áp, rối loạn mỡ máu... thì kết quả xét nghiệm
cần được kiểm tra thường xuyên để có hướng điều trị kịp thời. Tuy nhiên các
phương pháp phân tích được sử dụng ở các bệnh viện, các trung tâm nghiên cứu
thường đòi hỏi đầu tư máy móc của các hãng nước ngoài rất đắt tiền, thời gian phân

tích lâu, người sử dụng phải có chuyên môn, người bệnh phải chịu chi phí cao, mất
nhiều thời gian chờ đợi...
Cảm biến sinh học đo tín hiệu điện hóa (electrochemical biosensor) đáp ứng
được các yêu cầu của hóa học phân tích hiện đại đó là có khả năng phân tích nhanh
theo thời gian thực (real-time), có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao; thiết bị
phân tích nhỏ gọn, sử dụng đơn giản, có giá thành phù hợp. Với sự phát triển của
công nghệ vi điện tử, công nghệ nano và các loại vật liệu mới, khả năng chế tạo và
ứng dụng cảm biến sinh học ngày một hiện thực hơn, phương pháp không đòi hỏi
nhiều hóa chất, dung môi; chỉ cần lượng mẫu phân tích nhỏ đây là tiền đề của hóa
học phân tích xanh là chủ đề của hóa học hiện đại đang hướng tới. Do vậy việc
dùng cảm biến sinh học xác định nồng độ các chất như ure, glucose, cholesterol,

1


amylase ... được coi là một phương pháp bổ sung cho các phương pháp phân tích
tiêu chuẩn hiện có tại các bệnh viện.
Do tính hữu ích và khả năng ứng dụng cao, luận văn “Nghiên cứu phát triển
cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng
trong y sinh”, hướng tới chế tạo cảm biến sinh học với điều kiện công nghệ hiện có
ở trong nước, khảo sát các kết quả của cảm biến đã chế tạo, so sánh với các kết quả
đã được kiểm tra đối chứng tại khoa hóa sinh Bệnh viện Bạch mai. Qua đó ứng
dụng để xác định nhanh chỉ số cholesterol trong các chế phẩm sinh học.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
I.1. CẢM BIẾN SINH HỌC (BIOSENSORS)
I.1.1. Sơ lược quá trình phát triển của cảm biến sinh học

Năm 1962, các nhà khoa học là Clark và Lyons đã có công bố lần đầu tiên về
cảm biến sinh học (cảm biến enzyme glucose) [1]; trong hơn 50 năm qua cảm biến
sinh học đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế
giới nhằm hoàn thiện công nghệ chế tạo, nâng cao hiệu quả phân tích, hạ giá thành
sản phẩm và đưa ra thương phẩm phục vụ đời sống con người. Ở Việt Nam, khái
niệm “cảm biến sinh học” và polyme dẫn điện lần đầu tiên được nghiên cứu tại
trường Đại học Bách Khoa Hà Nội bởi tác giả Doãn Thái Hòa vào năm 1993 [2]. Từ
đó tới nay, một số nhóm nghiên cứu tại Đại học Bách Khoa Hà Nội, Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh đã đi sâu
nghiên cứu và thu được các kết quả tương đối khả quan như cảm biến xác định
glucose [3, 4], cảm biến phát hiện sự biến đổi gen ở đậu tương [4, 5], cảm biến phát
hiện dư lượng thuốc trừ sâu, cảm biến phát hiện virut Herpes, virus cúm A, HIV...
[6-9] , cảm biến miễn dịch phát hiện ung thư cổ tử cung [10].

Hình I. 1. Mô hình cảm biến Glucose thế hệ đầu tiên [11]

3


Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) thì: “Cảm
biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin
phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết
sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi” [12]
Nhờ có sự phát triển về khoa học và công nghệ cũng như sự đầu tư trọng
điểm của nhà nước, phòng thí nghiệm công nghệ vi cơ điện tử tại trường Đại học
Bách Khoa Hà Nội và Viện Khoa học Vật liệu – Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã có thể chế tạo đựa các vi linh kiện ở kích thước micromet với độ ổn định và
chính xác cao. Đây chính là cơ sở để tác giả có được các vi linh kiện là các vi điện
cực tích hợp trên nền silic ứng dụng cho chế tạo cảm biến sinh học đo theo nguyên
lý điện hóa.


Hình I. 2. Phòng sạch tại Viện ITIMS, ĐH Bách Khoa Hà Nội

I.1.2. Cấu tạo chung của cảm biến
Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm bốn bộ phận chính:
- Đầu thu sinh học
- Tác nhân cố định
- Bộ phận chuyển đổi tín hiệu
- Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra

4


Mục đích là để dò tìm, phân tích các tác nhân cần phát hiện một cách chọn lọc.

Hình I. 3. Sơ đồ cấu tạo chung của cảm biến sinh học

- Tác nhân cần phát hiện : được phân loại theo cấu tạo như sau
+ Các vi khuẩn như vi khuẩn E-coli, vi khuẩn Candida...
+ Các phân tử nhỏ như glucose, ure, thuốc trừ sâu,…
+ Các phân tử sinh học có kích thước lớn như phân tử ADN, RNA, protein...
- Đầu thu sinh học (Biological Receptor) có tác dụng bắt cặp và phát hiện
sự có mặt của các tác nhân sinh học cần phân tích. Đầu thu sinh học phản ứng trực
tiếp với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học.
+ Đầu thu sinh học làm từ enzyme là dạng phổ biến nhất: đầu thu làm từ các
enzyme urease, glucose oxidase, ...
+ Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên.
+ Ngoài ra đầu thu sinh học làm từ các protein , các axit nucleic như ADN, ARN

5



Protein

Kháng thể

ADN

Hình I. 4. Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học

- Tác nhân cố định: đây là một phần rất quan trọng trong cảm biến sinh học.
Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên trên đế, đây là bộ
phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học (có nguồn gốc từ cơ
thể sống) với thành phần vô cơ. Những tác nhân này vừa phải đảm bảo độ bền cơ
học, vừa phải đảm bảo khả năng chuyền tải tín hiệu giữa bộ phận sinh học và bộ
phận chuyển đổi. Vì vậy việc nghiên cứu lựa chọn những tác nhân cố định thích hợp
giúp nâng cao độ nhạy, độ ổn định cho cảm biến sinh học là cần thiết. Việc phát
minh polyme dẫn điện vào năm 1977 đã nhanh chóng trở thành tâm điểm chú ý của
các nhà khoa học đặc biệt trong lĩnh vực chế tạo cảm biến [13, 14]. Những nghiên
cứu gần đây cho thấy pha tạp (doping) các vật liệu vô cơ có kích thước nano vào
màng polyme dẫn không những làm tăng độ dẫn điện của màng mà còn tăng độ bền
hơn nhiều lần so với polyme tinh khiết [15]. Một số loại polyme dẫn điện đang
được ứng dụng phổ biến hiện nay đó là polyanilin, polypyrrol, polythiophen...
- Bộ phận chuyển đổi tín hiệu giúp chuyển các biến đổi sinh học thành các tín
hiệu có thể đo đạc được. Có nhiều dạng chuyển đổi như chuyển đổi điện hoá, chuyển
đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng
các hệ vi cơ. Trong đó, chuyển đổi theo nguyên lý điện hoá có nhiều ưu điểm như chế

6



tạo đơn giản, có độ nhạy và độ chính xác cao phù hợp trong chế tạo cảm biến sinh
học ứng dụng phân tích nhanh. Chuyển đổi điện hoá bao gồm chuyển đổi dựa trên
điện thế (potentiometric), dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric) .
- Bộ phận xử lý và đọc tín hiệu: bộ phận này có tác dụng chuyển, khuếch đại
thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị hiển thị khác đưa ra kết quả cho
người cần phân tích.
I.1.3. Cảm biến theo nguyên lý điện hóa
Cảm biến sinh học dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa có tính ứng dụng cao đo
nguyên lý đơn giản, độ ổn định và độ nhạy cao. Nhờ những phản ứng hóa học hay
sinh học đều có thể gây ra các tương tác sinh điện tử một cách trực tiếp (như lai hóa
của ADN, oxy hóa khử của enzyme…) nên rất thích hợp để phát hiện nhanh trong
phân tích cận lâm sàng .

Hình I. 5. Một hệ cảm biến điện hóa

7


Quá trình nhận biết tín hiệu có thể thực hiện bằng các phép đo dòng, đo thế
và độ dẫn [11, 16, 17].
Phép đo dòng: Dựa trên sự thay đổi dòng điện gây ra do sự oxy hóa - khử
điện hóa của chất cần phát hiện. Phương pháp này được thực hiện bằng cách áp một
điện thế giữa điện cực làm việc (WE) và điện cực so sánh (RE), tín hiệu dòng sẽ
được đo giữa điện cực làm việc (WE) và điện cực phụ trợ (CE). Khi điện thế đạt
đến một giá trị nào đó (thường là điện thế oxi hoá), thì hiện tượng oxi hoá xuất hiện
và các electron được sinh ra. Dòng điện thu được liên quan trực tiếp đến nồng độ
chất cần phân tích [16, 18].
Phép đo thế: Liên quan đến việc xác định sự chênh lệch thế giữa một điện
cực chỉ thị và một điện cực chuẩn hoặc hai điện cực chuẩn so sánh cách nhau bởi

một lớp màng mỏng nào đó không có dòng đi qua. Bộ chuyển đổi này có thể là điện
cực chọn lọc ion (ISE). Hầu như các thiết bị đo thế phổ biến nhất hiện nay là các
điện cực pH; hay các ion như F-, I-, CN-, Na+, K+, Ca2+, NH4+... [16]
Đo độ dẫn: Độ dẫn điện là đại lượng đặc trưng cho khả năng dẫn điện của
vật liệu. Phản ứng giữa đầu dò và các phần tử đích làm thay đổi thành phần của chất
dẫn điện khiến độ dẫn điện của chất đó thay đổi. Các phản ứng enzyme như urê và
nhiều thụ thể màng sinh học có thể được kiểm soát bởi các thiết bị đo trở kháng hay
độ dẫn ion sử dụng các vi điện cực xen kẽ nhau [16].
I.1.4. Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học
Một số tiêu chí đánh giá, cũng như các yêu cầu đối với cảm biến sinh học:
- Khoảng tuyến tính (Linearity): giá trị hàm lượng lớn nhất của chất phân
tích mà tín hiệu phân tích còn tuân theo phương trình tuyến tính bậc nhất.
- Độ nhạy (Sensitivity): là tính đáp ứng của cảm biến khi thay đổi nồng độ
chất phân tích hay khả năng phát hiện sự thay đổi tín hiệu khi có sự thay đổi nhỏ
nhất về nồng độ chất phân tích.

8


- Độ chọn lọc (Selectivity): chỉ mức độ ảnh hưởng của các chất nền tới phép
xác định chất phân tích.
- Thời gian đáp ứng (Response time): là khoảng thời gian cần thiết để dòng
của hệ đo đạt được 90% giá trị dòng cân bằng, khi có sự tiếp xúc của điện cực
nghiên cứu với dung dịch đo hoặc khi có sự thay đổi nồng độ chất trong dung dịch
tiếp xúc với điện cực. Đây là một trong những tiêu chuẩn của cảm biến mà các
nghiên cứu đang tập trung cải tiến.
Bên cạnh đó là các tiêu chuẩn khác khi thực hiện các phép phân tích định
lượng như độ lặp lại (repeatability), độ nhiễu, độ chụm (precision), độ phân giải, độ
chính xác (accuracy)...
I.1.5. Một số ứng dụng của cảm biến sinh học

Các cảm biến sinh học đã tỏ ra có nhiều ưu điểm so với các phương pháp
truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh, đơn giản và chính xác. Chính vì
vậy nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống.
- Thực phẩm và kiểm soát môi trường
Ngày nay vấn đề môi trường và vầ sinh an toàn thực phẩm là mối quan tâm
của toàn xã hội. Các hệ cảm biến được phát triển và ứng dụng đó là phân tích nhanh
dư lượng các loại thuốc trừ sâu, dư lượng các chất kháng sinh, các nâm mốc độc hại
tồn tại trong lưới thức ăn như sabutamon, aflatoxin... [19]
-An ninh Quốc phòng :
Một số báo cáo gần đây cho thấy đã chế tạo thành công mũi điện tử phát hiện
thuốc nổ TNT [20], phát hiện các vụ tấn công hóa sinh và các chất phóng xạ với độ
nhạy cao.
- Y học, sinh học:
Cảm biến sinh học ứng dụng phát hiện các protein ung thư và các siêu vi trùng
tiềm ẩn. Nhiều loại cảm biến như cảm biến đo nồng độ oxi, lượng glucose trong máu,
cảm biến huyết áp, … những cảm biến giúp người bệnh có thể thường xuyên theo dõi

9


tình hình bệnh tật của mình mà không nhất thiết phải đến các trung tâm y tế. Ngày
nay, các cảm biến dạng này không những tăng độ tin cậy, giảm thời gian hồi đáp mà
còn được chế tạo theo hướng càng ngày càng nhỏ gọn, rẻ và dễ sử dụng.
Nếu như cảm biến glucose đã được thương mại hóa trên thị trường, bất cứ
người nào đều có thể mua và sử dụng dễ dàng với giá thành ngày một hạ thì cảm
biến xác định nhanh cholesterol toàn phần vẫn còn khá mới mẻ [21]. Chính vì thế
trong nội dung luận văn này đã lựa chọn cholesterol là đối tượng nghiên cứu.
I.2. ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL
I.2.1. Enzyme [22]
Sự sống là mộtquá trình trao đổi chất liên tục. Quá trình trao đổi chất bao

gồm hang loạt các phản ứng hóa học diễn ra liên tục và liên quan chặt chẽ với nhau.
Trong quá trình hóa học ấy đều có vai trò xúc tác của các chất mà người ta gọi là
enzyme (E). Do vậy enzyme là chất xúc tác sinh học, bản chất là protein,được tạo ra
bởi cơ thể sống. Nhờ có enzyme mà các quá trình hóa học trong và ngoài cơ thể xảy
ra rất nhạy với tốc độ nhanh trong điều kiện sinh lý bình thường.
I.2.1.1. Cấu trúc phân tử của Enzyme
Bản chất enzyme là những protein đặc hiệu có cấu tạo phân tử rất phức tạp,
do vậy nó có tất cả các thuộc tính hóa học của protein. Enzyme có khả năng và hiệu
lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu rất cao. Để đảm bảo cho chức năng của enzyme
là chất xúc tác sinh học, cấu trúc của enzyme phải rất tinh vi và phức tạp. Enzyme
là những loại phân tử lớn, phần nhiều những enzyme đã được nghiên cứu có trọng
lượng phân tử từ 10.000 đến 1.000.000 dalton.
Thành phần cấu tạo
Enzyme là những protein thuần: là những enzyme khi thủy phân hoàn toàn là
những axit amin.
Enzyme là những protein tạp trong thành phẩn của chúng gồm hai thành
phần: phần protein thuần gọi là apoenzyme; phần không phải là protein, thường là

10


những chất hữu cơ đặc biệt, có nhiệm vụ cộng tác với enzyme trong quá trình xúc
tác, phần chất hữu cơ này gọi là coenzyme (CoE).
Tính chất cơ bản của enzyme do apoenzym quyết định. Đa số các enzyme có
chứa kim loại. Kim loại có thể là thành phần cấu tạo phân tử enzyme hoặc phức hợp
enzyme - cơ chất, có thể là chất cộng tác trong hoạt động xúc tác của enzyme, hoặc
cũng có thể vừa là thành phần cấu tạo, vừa là chất cộng tác của enzyme.
Trung tâm hoạt động của enzyme
- Tất cả các enzyme đều hoạt động xúc tác thông qua những bộ phận đặc
hiệu của phân tử enzyme, được gọi là trung tâm hoạt động (TTHĐ).

- Trung tâm hoạt động bao gồm những nhóm chức hóa học của mạch bên
(gốc R) của các axit amin (a.a) trong phân tử, phân tử H2O liên kết, các nhóm chức
của CoE. Các nhóm chức của a.a thường gặp trong TTHĐ là nhóm SH của Cys;
nhóm – OH của Tyr; nhóm carboxyl của Glu, Asp; nhóm amin ở đầu N hoặc nhóm
ε-amin của Lys, vòng imidazol của His…Các nhóm chức trong TTHĐ của E có thể
có vai trò khác nhau :kết hợp hoặc xúc tác , các gốc khác thì có vai trò đối với tính
đặc hiệu của E.
- TTHĐ có cấu hình không gian xác dịnh được giữ vững nhờ mạng lưới liên
kết hydrogen mạng lưới này đủ linh động để có thể thay đổi cấu hình không gian
của TTHĐ dưới tác dụng của các yếu tố bên ngoài,khi tương tác với cơ chất hoặc
các chất khác.
- Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa TTHĐ và cơ chất được hình
thành trong quá trình E tiếp xúc với cơ chất (S).
E Fisher đề ra giả thuyết giữa E và S , theo đó sự tương ứng về cấu trúc của
TTHĐ của E và S sắn có và cố định trong quá trình E kết hợp với S, thuyết này đã
được thừa nhận trong nhiều năm vì giải thích được tính đặc hiệu của E , nhưng
không phù hợp với đặc tính cấu trúc không gianmềm dẻo của phân tử protein. Năm
1958, Koshland đã đưa ra giả thuyết “ khớp phản ứng”,theo đó quá trình E kết hợp S sẽ
làm thay đổi cấu trúc không gian ,tạo nên sự tương ứng về cấu trúc giữa E và S.

11


Hình I. 6. (a) Mô hình Fisher (b) Mô hình Koshland

- Tương tác giữa E và S là các tương tác yếu ,dễ dàng bị cắt đứt trong quá
trình phản ứng để giải phóng E và sản phẩm tương ứng.
I.2.1.2. Đặc điểm sự xúc tác của enzyme
Chất xúc tác là chất làm tăng cường phản ứng hóa học, nhưng không bị
biến đổi tiêu hao và tham gia vào thành phần sản phẩm của phản ứng.Chỉ cần một

lượng nhỏ xúc tác cũng đủ biến đổi một lượng lớn chất tham gia phản ứng. Chất
xúc tác làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học bằng cách tạo nhiều
phản ứng trung gian mà các các phản ứng này chỉ đòi hỏi năng lượng hoạt hóa ít
hơn nhiều so với khi không có chất xúc tác tham gia. Chất xúc tác không làm thay
đổi chiều phản ứng.
Enzyme có đầy đủ các tính chất cơ bản của chất xúc tác, ngoài ra nó còn có đặc
điểm riêng là tính chất đặc hiệu rất cao và hiệu lực xúc tác rất lớn. Enzyme làm giảm
năng lượng hoạt hóa nhiều hơn so với các chất xúc tác hóa học. Hoạt tính của enzyme
chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố lý, hóa và sinh học như nhiệt độ, ánh sáng, tia cực
tím, sóng siêu âm, pH của môi trường,bản chất hóa học và nồng độ của cơ chất, nồng
độ của enzyme, thời gian tác dụng của enzyme, tác dụng của chất ức chế, tác dụng của
chất hoạt hóa, sản phẩm của phản ứng enzyme và các chất chuyển hóa khác.

12


Những đặc tính ưu việt của E với các chất xúc tác khác
- Có hiệu quả xúc tác cao, có thể làm tăng vận tốc phản ứng lên 105 - 1012 lần
so với khi không có chất xúc tác.
- Có thể hoạt động ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường (nhiệt độ 2040oC, pH từ 5-8).
- Có tính đặc hiệu cao: chỉ tác dụng lên những cơ chất nhất định và xúc tác
cho những phản ứng nhất định do vậy ít có sản phẩm phụ tạo ra đồng thời hiệu suất
thu được sản phẩm chính cao.
- Nhiều E không bị mất hoạt tính trong dung môi hữu cơ.
- Sử dụng E đem lại hiệu quả kinh tế lớn không gây ảnh hưởng xấu dến
môi trường.
Điều chỉnh các yếu tố vật lý, hóa học thích hợp cho hoạt động của E sẵn có
để chuyển hóa cơ chất sẵn có trong nguyên liệu khi không tách E khỏi nguyên
liệu.Tách E khỏi nguyên liệu, sản xuất các chế phẩm E có độ sạch khác nhau để sử
dụng trên nhiều đối tượng khác nhau và nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu cấu

trúc phân tử;phân tích các chất, xác định chính xác hàm lượng các chất; ứng dụng
trong các ngành công nghiệp;ứng dụng trong y, dược.
I.2.1.3. Cơ chế xúc tác của E
Các phản ứng do E xúc tác có thể được khái quát bằng phương trình phản
ứng chung dưới đây:
E + S Ù ES Ù ES* Ù E + P
Trong đó E là enzyme; S là cơ chất (substrate); ES là phức chất hình thành
giữa E và cơ chất; ES* là phức chất giữa E với cơ chất, trong đó cơ chất đã được
biến đổi thành dạng gần như sản phẩm của phản ứng; P là sản phẩm (product) của
phản ứng.

13


Bước 1: cơ chất gắn vào trung tâm hoạt động của E tạo thành phức hợp
enzyme – cơ chất (ES).
E + S Ù ES
Bước 2: dưới tác dụng nhóm hoạt động của E ,cấu tạo điện tử của cơ chất bị
biến đổi, những liên kết chịu tác dụng của enzyme bị căng ra, độ bền vững của liên
kết giảm đi,hoạt tính hóa học của cơ chất tăng lên rất nhiều, do đó chỉ cần năng
lượng hoạt hóa rất nhỏ cũng làm phản ứng xảy ra rất nhanh.
ES Ù ES*
Bước 3: cơ chất được biến đổi thành sản phẩm (P) và enzyme được giải
phóng ra dưới dạng tự do.

Hình I. 7. Xúc tác Enzyme làm giảm năng lượng của phản ứng

I.2.1.4. Tính đặc hiệu của enzyme
Mỗi E đều có tác dụng chọn lọc đối với một cơ chất hoặc một loại cơ chất
nhất định đối với một loại phản ứng nhất định.Tính chất xúc tác chọn lọc này được

gọi là tính đặc hiệu của E. Đây là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất
của E, do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử E và đặc biệt là trung tâm hoạt động
mà E có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường khác.

14


Tính chất đặc hiệu gắn liền với cơ chất : mỗi E chỉ xúc tác cho sự chuyển
hóa một chất nhất định(hoặc một cặp cơ chất nhất định trong phản ứng hai cơ chất)
theo một phản ứng xác định tạo thành các sản phẩm xác định.Ví dụ: Urease chỉ xúc
tác quá trình thủy phân ure.Các E có tính đặc hiệu tuyệt đối được sử dụng để định
lượng chính xác cơ chất của chúng.Trên thực tế ,nhiều E không có tính đặc hiệu
tuyệt đối,tính đặc hiệu của chúng chỉ là tương đối. Chúng có tác dụng với cả một
nhóm cơ chất có cấu trúc gần giống nhau hoặc có một bộ phận phân tử giống
nhau.Ví dụ: một số esterase xúc tác cho phản ứng có thể tác dụng vào liên kết ester
của nhiều axit béo với những alcol khác nhau.
Tính chất đặc hiệu gắn liền với phản ứng: phần lớn mỗi E đều có tính đặc
hiệu với mỗi loại phản ứng nhất định.Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại
phản ứng hóa học thì mỗi loại phản ứng phải có một E đặc hiệu xúc tác. Ví dụ: a.a
có khả năng xảy ra phản ứng khử cacboxyl, phản ứng oxy hóa khử amin và phản
ứng trao đổi nhóm amin, vì vậy mỗi loại phản ứng trên cần có một E đặc hiệu tương
ứng xúc tác là decacboxylase,axit amin oxydase,aminotransferase. Ngược lại, có
những E có khả năng xúc tác nhiều loại phản ứng. Nhiều enzyme protease như
trypsin, chymotrypsin ngoài xúc tác đặc hiệu phản ứng thủy phân liên kết peptid,
còn xúc tác phản ứng liên kết este.
I.2.1.5. Đơn vị đo hoạt độ chế phẩm Enzyme
Hoạt độ của enzym là đơn vị dùng để đo khả năng xúc tác của enzym. Đơn
vị hoạt độ là lượng cơ chất mà emzym xúc tác chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm
được tạo thành trong một thời gian và các điều kiện như nhiệt độ, pH,... xác định.
Hoạt độ riêng (specific activity): Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng

số đơn vị hoạt độ enzyme trên một đơn vị khối lượng (miligam hay gam) protein.
Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Một đơn
vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.
Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc
tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của

15


enzyme (1U) là lượng enzyme xúc tác sự biến đổi 1 µmol cơ chất sau 1 phút ở điều
kiện nhất định.
1 U = = 1 µmol cơ chất (10-6mol)/phút
Đơn vị Katal(kat): Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo
nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme. Một Katal là lượng
enzyme xúc tác sự biến đổi 1 mol cơ chất trong 1 giây và trong những điều kiện
nhất định
1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây
1µKat/l = 60 U/l
U/l = 16,67 nKat/l (nanokatal)
Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).
I.2.1.6. Enzyme không tan và điện cực enzyme
E không tan là các E bị giữ hoặc được cố định trong một vùng, một khoang
nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bình thường,vẫn giữ được hoạt động
xúc tác,có thể sử dụng liên tục và lặp lại nhiều lần. Do đặc tính không bị hòa tan mà
vẫn giữ được hoạt độ xúc tác ,nên ưu điểm của E không tan là : có thể sử dụng lặp
lại nhiều lần một lượng E xác định,do đó làm giảm đáng kể giá thành chế phẩm E.
Ngoài ra nó còn có độ bền với các yếu tố hóa lý hơn khi ở dạng hòa tan. Một số E
xúc tác cho quá trình oxi hóa khử cũng là dạng E không tan.
Biosensor điện cực enzyme, cũng gọi là điện cực E không tan có thành phần
cấu tạo sinh học của điện cực này là E, được cố định trên bề mặt của điện cực, đáp

ứng với nồng độ của một trong các cơ chất, hoặc các sản phẩm của phản ứng do E
xúc tác.Điện cực E được sử dụng để xác định nồng độ nhiều chất khác nhau như:
glucose, ure, một số axit hữu cơ, amino axit, alcol….Những thành tựu trong nghiên
cứu E không tan,chế tạo các E-biosensor đã làm tăng hiệu quả và mở rộng phạm vi
ứng dụng của E trong thực tế ở qui mô ngày càng lớn.

16


I.2.2. Cholesterol oxidase [23-25]
Cholesterol oxidase còn có các tên gọi khác như Cholesterol-O2 oxidoreductase;
beta-hydroxy steroid oxidoreductase; beta-hydroxysteroid: oxygen oxidoreductase.

Hình I. 8. Cholesterol Oxidase (ChOx)

Cholesterol oxidase thuộc nhóm 1 (Oxydoreductase) (EC 1.1.3.6) có tác
dụng xúc tác cho phản ứng oxy hóa-khử. Cholesterol oxidase thường được thu từ
Streptomyces, Pseudomonas, Brevibacterium...
Enzyme này có tính đặc hiệu cao đối với cholesterol trong khoảng pH thích
hợp từ 4,0 đến 7,0 (tính đặc hiệu cao nhất tại pH=7,0).
Đặc tính: enzyme là chất đặc hiệu để phát hiện và định lượng cholesterol.
I.2.3. Phản ứng với xúc tác ChOx
Phản ứng oxy hóa cholesterol dưới tác dụng của ChOx tạo ra H2O2:
ChOx
Cholesterol + O2 ⎯⎯⎯
→ cholest-4-en-3-one + H2O2

o

O


17