BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

Trần Thị Phƣơng Thảo

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU CHUẨN VẮC XIN BẠI LIỆT UỐNG
SỬ DỤNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN OPV TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. LÊ THỊ LUÂN
2. PGS. TS. TRƢƠNG QUỐC PHONG

Hà Nội - Năm 2015


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu sản xuất mẫu chuẩn Vắc xin Bại
liệt uống sử dụng trong kiểm định vắc xin OPV tại Việt Nam” là công trình
nghiên cứu của tôi cùng nhóm nghiên cứu sản xuất mẫu chuẩn vắc xin OPV thuộc
Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế thực hiện dƣới sự hƣớng
dẫn của GS.TS Lê Thị Luân và TS.Trƣơng Quốc Phong. Tôi đã nhận đƣợc sự đồng
ý của trƣởng nhóm và tất cả các thành viên trong nhóm nghiên cứu về việc công bố

các nội dung thực hiện và kết quả thu đƣợc. Các nội dung nghiên cứu và kết quả
đƣợc trình bày trong luận văn là trung thực và rõ ràng
Học viên
Trần Thị Phƣơng Thảo

Xác nhận của cơ quan
(Trung tâm Nghiên cứu sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế)


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến GS.TS. Lê Thị Luân, phó giám
đốc Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế đã tận tình giúp đỡ
em trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Trƣơng Quốc Phong, Trung tâm Nghiên cứu
và phát triển Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực
phẩm, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tận tình chỉ bảo cho em trong suốt
quá trình làm luận văn.
Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực
phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong quá
trình học tập và rèn luyện.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu tôi đã nhận đƣợc sự chỉ dạy tận tình
đầy trách nhiệm của tập thể cán bộ nghiên cứu thuộc Trung tâm nghiên cứu sản xuất
vắc xin và sinh phẩm y tế, tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã
luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bƣớc trên con đƣờng học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 9 năm 2015

Học viên
Trần Thị Phƣơng Thảo


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ARN

Axit Ribonucleic

CCID50
FBS

Cell Culture Infective Dose 50 (liều gây hủy hoại 50% tế bào)
Fetal Bovin serum (huyết thanh bê bào thai)

GM

Growth Medium (Môi trƣờng phát triển)

GMP
Hep2C

Good Manufacture Practice (Thực hành sản xuất tốt)
Tế bào ung thƣ thanh quàn của ngƣời

IgA


Imuno globulin A

IgG
IgM
LH

Imuno globulin G
Imuno globulin M
Lactalbumin Hydrolysate

LH3E
LHE
LM
MCB
MEM
MS

Lactabumine Hydrolysate 0,5% trong đệm Earle
Lactabumine Hydrolysate 0,5% trong đệm Hanks
Liquid medium
Master Cell Bank (ngân hàng tế bào gốc)
Minimum Essential Medium (Môi trƣờng cần thiết tối thiểu)
Master Seed (chủng giống gốc)

PBS

Phospate Buffer Solution
Center for Research and Production of Vaccines and Biologicals


POLYVAC
TCMR
TGC
TKTP
SCD
VLP
VP

(Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế)
Tiêm chủng mở rộng
Thioglycolate
Tế bào thận khỉ tiên phát
Soybean Casein Digest
Virus like particle
Virus protein

Vero
WHO/ TCYTTG

Tế bào thận khỉ Cercopithecus aethiops
World Health Organization / Tổ chức y tế thế giới


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

Mục lục
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ...................................................................................................... 3

1.1. Các nguyên tắc chung cơ bản khi sản xuất vắc xin mẫu chuẩn .................................. 3
1.1.1. Mẫu chuẩn quốc tế ............................................................................................... 3
1.1.2. Mẫu chuẩn quốc gia ............................................................................................. 5
1.2. Vắc xin mẫu chuẩn Bại liệt ......................................................................................... 6
1.2.1. Vi rút Bại liệt ....................................................................................................... 6
1.2.2. Vắc xin Bại liệt .................................................................................................... 9
1.2.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng vắc xin mẫu chuẩn Bại liệt ............ 11
1.2.4. Tiêu chuẩn cơ sở cho vắc xin mẫu chuẩn bại liệt ............................................. 13
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 15
2.1. Vật liệu ...................................................................................................................... 15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................................... 16
2.2.1. Phƣơng pháp sản xuất vắc xin ........................................................................... 16
2.2.2. Phƣơng pháp kiểm tra chất lƣợng cho mẫu chuẩn vắc xin Bại liệt ................... 24
2.2.2.1. Quan sát trạng thái .......................................................................................... 25
2.2.2.2. Kiểm tra vô trùng ............................................................................................ 26
2.2.2.3. Kiểm tra Mycoplasma ..................................................................................... 27
2.2.2.4. Chuẩn độ hiệu giá vắc xin thành phẩm OPV .................................................. 28
2.2.2.5. Thử nghiệm nhận dạng ................................................................................... 34
2.2.2.6. Kiểm tra pH .................................................................................................... 38
2.3. Phƣơng pháp lựa chọn vắc xin Bại liệt mẫu chuẩn nội bộ ....................................... 38
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................................. 41
3.1. Kết quả sản xuất các ứng cử viên cho lựa chọn vắc xin mẫu chuẩn nội bộ vắc xin
OPV đơn typ và vắc xin tam liên. .................................................................................... 41
3.2. Kết qủa lựa chọn vắc xin Bại liệt mẫu chuẩn ........................................................... 42
3.2.1. Kết quả kiểm tra chất lƣợng của các ứng cử viên vắc xin Bại liệt đơn typ và tam
liên ............................................................................................................................... 42
3.2.2. Thiết lập phạm vi quản lý hiệu giá cho mẫu chuẩn nội bộ vắc xin Bại liệt ....... 42
KẾT LUẬN.......................................................................................................................... 52
KIẾN NGHỊ ......................................................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 54



Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

Danh mục các bảng
Bảng 1. Tiêu chuẩn chất lƣợng của vắc xin OPV ................................................................ 13
Bảng 2. Kết quả kiểm chất lƣợng các ứng cử viên vắc xin Bại liệt đơn typ và tam liên ... 42
Bảng 3. Kết quả thiết lập giá trị quản lý mẫu chuẩn vắc xin Bại liệt đơn giá typ I ............ 43
Bảng 4. Kết quả thiết lập giá trị quản lý mẫu chuẩn vắc xin Bại liệt đơn giá typ II ........... 44
Bảng 5. Kết quả thiết lập giá trị quản lý mẫu chuẩn vắc xin Bại liệt đơn giá typ III ......... 45
Bảng 6. Kết quả thiết lập giá trị quản lý mẫu chuẩn vắc xin Bại liệt tam liên PR-0113 ... 46
Bảng 7. Kết quả hiệu giá xác định tính ổn định mẫu chuẩn vi rút bại liệt đơn typ và tam
liên ....................................................................................................................................... 49

Danh mục các hình
Hình 1. Hình thái học Polyovirus ......................................................................................... 6
Hình 2. Hình ảnh lọ vắc xin Bại liệt uống sản xuất tại Polyvac ......................................... 11
Hình 3. Hình ảnh mổ lấy thận và thận khỉ sau khi đƣợc đƣa ra khỏi cơ thể....................... 18
Hình 4. Hình ảnh tế bào phát triển bình thƣờng, không có các CPE bất thƣờng................ 21
Hình 5. Hình ảnh tế bào thận khỉ bị hủy hoại bởi vi rút Bại liệt......................................... 23
Hình 6. Dây truyền sản xuất vắc xin thành phẩm ............................................................... 24
Hình 7. Mầu môi trƣờng đối chứng (-) ............................................................................... 28
Hình 8. Mức độ thay đổi mầu môi trƣờng tƣơng ứng với mức độ (+) ............................... 28
Hình 9. Hiệu giá các ứng cử viên mẫu chuẩn Bại liệt đơn typ I, II, III và tam liên ........... 47


Luận văn thạc sĩ


Trần Thị Phương Thảo – CB130717

MỞ ĐẦU
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 1988 trên toàn cầu có
khoảng 350.000 bệnh nhân bị mắc bệnh bại liệt nhƣng đến năm 2013, sau thời gian
25 năm đã giảm xuống chỉ còn 417 trƣờng hợp. Từ đầu năm 2014 cho đến nay trên
thế giới đã ghi nhận có 74 bệnh nhân bại liệt, trong đó 59 trƣờng hợp phát hiện tại
Pakistan. Các chuyên gia cảnh báo bệnh bại liệt đang quay trở lại và có nguy cơ đe
dọa sức khỏe của cộng đồng khi chúng xuất hiện mà không có biện pháp ngăn chặn.
Năm 2000, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ở khu vực Tây Thái Bình Dƣơng tuyên
bố đã thanh toán đƣợc bệnh bại liệt và vào thời điểm này Việt Nam cũng đã công bố
thanh toán đƣợc bệnh bại liệt. Tuy nhiên do còn nhiều nƣớc trên thế giới vẫn chƣa
thanh toán đƣợc bệnh bại liệt nên Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo việc phòng
bệnh bằng vắc xin cho trẻ em cần đƣợc tiếp tục thực hiện. Trên thực tế hiện nay,
mặc dù có một số bệnh truyền nhiễm đã tuyên bố thanh toán, công bố loại trừ bệnh
ra khỏi cộng đồng nhƣng sau một thời gian vắng bóng chúng có thể quay trở lại bất
cứ lúc nào khi miễn dịch trong cộng đồng giảm xuống ở mức độ thấp. Nguy cơ
bùng phát dịch với hậu quả nghiêm trọng là điều không thể lƣờng trƣớc đƣợc. [1]
Vắc xin Bại liệt là một trong nhiều loại vắc xin sống thiết yếu phòng bệnh
cho trẻ nhỏ dƣới 1 tuổi. Vắc xin bại liệt OPV đƣợc sản xuất tại Polyvac đã góp phần
vào thành quả thanh toán bệnh bại liệt tại Việt Nam năm 2000. Hàng năm Polyvac
vẫn tiếp tục sản xuất và cung cấp khoảng gần 10 triệu liều vắc xin bại liệt OPV cho
chƣơng trình TCMR để sử dụng cho trẻ em từ 2-4 tháng tuổi.
Để kiểm định chất lƣợng các vắc xin, ngoài việc kiểm tra tính vô khuẩn, an
toàn... còn phải xác định nồng độ vi rút vắc xin (hiệu giá vắc xin). Việc xác định
hiệu giá của vắc xin thử nghiệm luôn cần đƣợc tiến hành song song với vắc xin mẫu
chuẩn. Do đó, vắc xin mẫu chuẩn là sinh phẩm không thể thiếu trong quá trình xác
định hiệu giá của vắc xin. Chuẩn độ hiệu giá là thử nghiệm đo hàm lƣợng vi rút có
trong một liều vắc xin, thử nghiệm đòi hỏi phải có độ chính xác nhất định. Mặt khác
các vi rút vắc xin sống rất nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ, quá trình chuẩn độ sẽ

không tránh khỏi những tác động bên ngoài không mong muốn đến kết quả chuẩn
1


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

độ hiệu giá. Do vậy việc chuẩn độ hiệu giá cần có mẫu chuẩn để làm đối chứng
nhằm xác định kết quả chuẩn độ hiệu giá đó có tin cậy đƣợc hay không. Mẫu chuẩn
phải đảm bảo sự ổn định về hiệu giá trong suốt thời gian bảo quản, hiệu giá phải
nằm trong khoảng giao động cho phép theo toán thống kê. Để đảm bảo vắc xin dùng
cho trẻ em Việt Nam đạt yêu cầu về hiệu giá theo quy định của Dƣợc điển Việt
Nam IV và theo tiêu chuẩn của WHO nhất thiết phải sử dụng mẫu chuẩn khi thực
hiện thử nghiệm. Hiện nay mẫu chuẩn quốc gia về các vắc xin chƣa có do vậy để
kiểm tra hiệu giá các vắc xin sản xuất Trung tâm đã phải sử dụng vắc xin mẫu
chuẩn từ Nhật Bản, Hoa Kỳ với chi phí cao và bị động nên gây trở ngại rất lớn cho
việc sản xuất, kiểm định, do vậy thiết lập mẫu chuẩn là điều cần thiết cho cơ sở sản
xuất vắc xin.
Xuất phát từ yêu cầu trên, Trung tâm tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu
sản xuất mẫu chuẩn Vắc xin Bại liệt uống sử dụng trong kiểm định vắc xin OPV
tại Việt Nam” nhằm giải quyết các mục tiêu sau:
 Nghiên cứu qui trình sản xuất vắc xin mẫu chuẩn, sản xuất ít nhất 3 loạt vắc
xin Bại liệt liên tiếp trên tế bào thận khỉ tiên phát để tuyển chọn mẫu chuẩn.
Chia lọ và bảo quản ứng cử viên mẫu chuẩn vắc xin tại nhiệt độ - 700C;
 Kiểm tra chất lƣợng 3 loạt vắc xin dự tuyển mẫu chuẩn nội bộ ngay sau khi
sản xuất năm 2013 (theo qui chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới);
 Thiết lập phạm vi quản lý hiệu giá cho vắc xin mẫu chuẩn vắc xin OPV nội
bộ: chuẩn độ hiệu giá ứng cử viên mẫu chuẩn và đƣa ra phạm vi quản lý giá
trị hiệu giá cho các loạt vắc xin đƣợc lựa chọn làm mẫu chuẩn.

 Kiểm tra tính ổn định hiệu giá của các lô vắc xin đƣợc lựa chọn làm mẫu
chuẩn sau 2 năm bảo quản ở - 700C.

2


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Các nguyên tắc chung cơ bản khi sản xuất vắc xin mẫu chuẩn
Để sản xuất vắc xin mẫu chuẩn, Tổ chức Y tế Thế giới có nhiều hƣớng dẫn,
từ việc định nghĩa thế nào là một sinh vật phẩm chuẩn, cách chọn, điều chế sinh vật
phẩm chuẩn, tính đồng nhất, tính ổn định đến cách đóng ống, lọ, bảo quản, dán nhãn
và cuối cùng là cách xác định đơn vị công hiệu của chúng.
1.1.1. Mẫu chuẩn quốc tế
Theo hƣớng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới về xây dựng các sinh phẩm
chuẩn, mẫu chuẩn quốc tế là mẫu chuẩn có hoạt tính đƣợc biểu thị bằng đơn vị quốc
tế hoặc đơn vị hoạt tính phù hợp dựa trên số liệu có đƣợc trong nghiên cứu hợp tác
quốc tế và đƣợc sử dụng khắp thế giới. Mẫu chuẩn quốc tế đƣợc cấp cho Kiểm định
quốc gia của các nƣớc với mục đích xây dựng mẫu chuẩn quốc gia hoặc mẫu chuẩn
địa phƣơng.
Xây dựng mẫu chuẩn quốc tế là chế phẩm đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới xác
nhận sau hàng loạt các nghiên cứu hợp tác quốc tế và thƣờng đƣợc biểu thị bằng
đơn vị quốc tế. Tuy nhiên đối với một chế phẩm chuẩn, ví dụ: mẫu chuẩn để chuẩn
độ vắc xin Bại liệt, vắc xin rota, thì việc dùng đơn vị quốc tế là không phù hợp,
trong những trƣờng hợp đó, đơn vị hoạt tính của mẫu chuẩn sẽ biểu thị bằng những
đơn vị phù hợp khác. Mẫu chuẩn sinh học không nhất thiết phải có độ tinh khiết
cao.

Hiện nay trên thế giới có 4 trung tâm đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới chỉ định là
phòng thí nghiệm chế phẩm sinh học quốc tế. Các phòng thí nghiệm này xây dựng,
lƣu giữ và cung cấp các mẫu chuẩn quốc tế cho kiểm định quốc gia các nƣớc. Trong
cơ cấu của Tổ chức Y tế Thế giới có Uỷ ban tiêu chuẩn hoá sinh phẩm chịu trách
nhiệm về các vấn đề tiêu chuẩn hoá trong đó có mẫu chuẩn quốc tế.
Chức năng của mẫu chuẩn quốc tế dùng để: Kiểm tra bất kỳ một sản phẩm
sinh học nào trong thực tiễn Y học hoặc thú y lƣu hành trong phạm vi hơn một quốc
gia. Mẫu chuẩn quốc tế kiểm tra một sản phẩm sinh học mới sẽ đƣa vào sử dụng
trong phạm vi hơn một quốc gia. Mẫu chuẩn quốc tế sử dụng để hiệu chỉnh mẫu

3


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

chuẩn quốc gia và so sánh các kết quả nghiên cứu liên quan đến các vật liệu sinh
học trong lĩnh vực dự phòng, chuẩn đoán, điều trị bệnh.
Bản chất, nguồn gốc và bảo quản mẫu chuẩn quốc tế: Thành phần của vật
liệu sử dụng làm mẫu chuẩn quốc tế phải giống thành phần của mẫu thử. Mẫu chuẩn
phải có độ ổn định cao, có hoạt tính đặc hiệu phù hợp và tính đồng nhất. Nói chung,
lƣợng mẫu chuẩn có thể đủ sử dụng trong nhiều năm. Vật liệu dùng làm mẫu chuẩn
không nhất thiết phải có độ tinh khiết cao, miễn là đạt đƣợc những tiêu chuẩn phù
hợp cho mẫu chuẩn. Để xây dựng mẫu chuẩn có thể lấy một phần hoặc hoặc toàn bộ
mẻ bán thành phẩm (hoặc thành phẩm). Cũng có thể lấy hộn từ vài mẻ bán thành
phẩm (hoặc thành phẩm) trong trƣờng hợp này phải hộn thật kỹ để chắc chắn đạt
đƣợc tính đồng nhất. Lƣợng mẫu chuẩn trong một lọ có thể khác nhau phụ thuộc
vào loại mẫu chuẩn. Thông thƣờng một lọ mẫu chuẩn có thể chứa một lƣợng đủ cho
vài thử nghiệm. Mẫu chuẩn phải đƣợc bảo quản điều kiện thích hợp. Trong mọi

trƣờng hợp lọ đựng mẫu phải có độ bền vững để chịu đƣợc các điều kiện bảo quản
nhƣ nhƣ đông đá, tan đá, đóng mở…
Các tiêu chuẩn chất lượng: vắc xin mẫu chuẩn phải đƣợc kiểm tra về nhận
dạng, công hiệu, tính ổn định, và tính vô khuẩn.
Công hiệu: để biết chắc vắc xin mẫu chuẩn có công hiệu không bị mất trong
quá trình xử lý, sử dụng. Công hiệu cần phải đƣợc xác định ở nhiều thời điểm và
nhiệt độ bảo quản khác nhau.
Tính vô khuẩn: tính vô khuẩn là điều kiện tối cần thiết cho tính ổn định lâu
dài và chất lƣợng của sản phẩm.
Tính ổn định: thử nghiệm tính ổn định là yêu cầu cần thiết đầu tiên. Qua
tính ổn định ta ƣớc tính đƣợc thời gian sử dụng, lƣu trữ và phân phát.
Hồ sơ: Toàn bộ hồ sơ của quá trình sản xuất và kiểm định phải đƣợc lƣu trữ.
Phải kiểm tra thƣờng xuyên số sản phẩm còn, số sản phẩm lƣu hành và báo cáo
hàng năm cho Tổ chức Y tế thế giới.
Đối với vắc xin mẫu chuẩn Quốc tế, ngoài những khuyến cáo trên Tổ chức Y
tế thế giới còn khuyến cáo việc hợp tác quốc tế để nghiên cứu, tổ chức đánh giá vắc
xin mẫu chuẩn, xin lập chuẩn quốc tế.

4


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

1.1.2. Mẫu chuẩn quốc gia
Đối với vắc xin mẫu chuẩn quốc gia, Tổ chức Y tế thế giới khuyến cáo về
nguyên tắc chung không có gì khác với vắc xin mẫu chuẩn quốc tế, song có một số
điểm cần lƣu ý [14,15]
Về thuật ngữ: sinh vật phẩm chuẩn quốc gia là chế phẩm sinh học mang đơn

vị quốc tế, sau khi đƣợc tiến hành so sánh với chuẩn quốc tế, có tính ổn định cao,
chỉ sử dụng trong nƣớc.
Phƣơng pháp điều chế, tính đồng nhất, tính ổn định, đóng ống, xác định công
hiệu giống nhƣ vắc xin mẫu chuẩn quốc tế. Song khi xác định công hiệu không cần
thiết phải hợp tác nghiên cứu quốc tế mà cần thiết phải có sự tham gia của Viện
kiểm định quốc gia. Chuẩn quốc gia đƣợc quy về đơn vị quốc tế (IU) khi so trực
tiếp với chuẩn quốc tế.
Tài liệu mới nhất của Tổ chức y tế thế giới [17] năm 1995 có khuyến cáo:
Mỗi quốc gia tùy điều kiện riêng để sản xuất vắc xin mẫu chuẩn và có các phƣơng
pháp sản xuất khác nhau. Điều bắt buộc vắc xin mẫu chuẩn tối thiểu phải đạt đƣợc 3
tiêu chuẩn chung sau đây:
Thành phần: vắc xin mẫu chuẩn phải có thành phần giống vắc xin dùng để
thử nghiệm.
Tính ổn định: vắc xin mẫu chuẩn phải ổn định khi giữ trong điều kiện thích hợp
Số lƣợng: số lƣợng mỗi lô sản xuất đủ dùng cho nhu cầu trong nhiều năm.
Có nhiều quy định chung về sản xuất mẫu chuẩn, nhƣng quy trình sản xuất cụ thể
cho từng loại vắc xin mẫu chuẩn tùy từng nơi có những phƣơng pháp và thành phần
khác nhau.

5


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

Các tiêu chuẩn cần có của mẫu chuẩn quốc gia:
Mẫu chuẩn quốc gia sau khi qua giai đoạn sản xuất và đóng lọ, phải qua
kiểm tra về các mặt hóa lý và sinh học, đặc biệt về hiệu giá, tính đồng nhất, tính ổn
định hiệu giá của các lọ vắc xin và sinh phẩm.

Hiệu giá của mẫu chuẩn phải thực hiện để chắc chắn vắc xin, sinh phẩm có
hiệu giá tƣơng đƣơng mẫu chuẩn quốc tế và không bị mất hiệu giá trong quá trình
xử lý, sử dụng và phải đƣợc xác định tại nhiều thời điểm khác nhau.
Tính ổn định hiệu giá của mẫu chuẩn quốc gia cần phải làm để đánh giá đƣợc
vắc xin sinh phẩm có bị giảm hiệu giá khi bảo quản và xác định đƣợc điều kiện
thích hợp để bảo quản vắc xin sinh phẩm đó. Việc đánh giá hiệu giá của vắc xin,
sinh phẩm phải đƣợc thực hiện theo một phƣơng pháp thống nhất.
1.2. Vắc xin mẫu chuẩn Bại liệt
1.2.1. Vi rút Bại liệt
 Về hình thái học
Dƣới kính hiển vi điện tử, vi rút Bại liệt có
dạng hình khối cầu đƣờng kính khoảng
27-30nm bao gồm 1 protein capsit có cấu
trúc bền vững bao bọc lấy ARN của vi rút.
Capsit bao gồm 60 tiểu đơn vị giống hệt
nhau xếp đối xứng 20 mặt, mỗi tiểu đơn vị
gồm 4 chuỗi polypeptit là VP1; VP2;
VP3; và VP4. Bằng phƣơng pháp chiếu xạ

Hình 1. Hình thái học Polyovirus

tia X ngƣời ta biết chi tiết cấu trúc của hạt
vi rút hoàn chỉnh.[2;5]
 Về thành phần hóa học của vi rút Bại liệt


Axit nucleic: Là ARN một sợi dƣơng, có chiều dài 2,4m, trọng lƣợng phân tử
2,5 X 106dalton cuộn lại nằm gọn trong vỏ capsit. Đầu 5" có một đoạn
polypeptit đƣợc gọi là VPg gồm 11 axit amin gắn vào còn đầu 3" bị polyadenyl
hóa. ARN của vi rút đƣợc chia thành 3 vùng chủ yếu: Vùng không mã hóa đầu

5" bao gồm 740 nucleotide, chiếm khoảng 10% vật liệu di truyền. Khung đọc
6


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

mở đơn bao gồm 6635 nucleotide chiếm khoảng 89% vật liệu di truyền. Vùng
không mã hóa 3" bao gồm 75 nucleotide, chiếm khoảng 1% vật liệu di truyền
[2;5]


Protein: Protein capsit của vi rút Bại liệt bao gồm 4 chuỗi polypeptit. VP1 bao
gồm 306 axit amin có trọng lƣợng phân tử 34 kDal; VP2 bao gồm 272 axit
amin có trọng lƣợng phân tử 30 kDal; VP3 gồm 238 axit amin có trọng lƣợng
phân tử 26 kDal và VP4 gồm 69 axit amin, trọng lƣợng phân tử 7 kDal. Trong
đó VP1, VP2, VP3 tạo nên cấu trúc bề mặt của vi rúts còn VP4 nằm trong vỏ
capsit và liên kết với axit nhân (ARN). Các Protein bề mặt tạo nên các vị trí
kháng nguyên trung hòa. Ngoài ra vỏ capsit còn có tác dụng bảo vệ axit nhân và
quyết định khả năng hấp phụ của vi rút lên bề mặt tế bào thông qua các thụ thể
đặc hiệu.[2]



Lipit: Vi rút Bại liệt không chứa lipit nên không nhạy cảm với tác động của ete,
cồn, phenol 1% và các thuốc tẩy thông thƣờng. Dựa vào đặc tính này ngƣời ta
sử dụng cloroform để xử lý bệnh phẩm trƣớc khi phân lập vi rút mà không làm
mất hoạt tính của vi rút. [2]


 Về tính chất hóa lý
Vi rút Bại liệt rất nhạy cảm với nhiệt độ. Ở 560C vi rút bị bất hoạt hoàn toàn
trong vòng 30 phút. Ở nhiệt độ 20-240C vi rút bị bất hoạt vào cuối tháng thứ 3. Ở
nhiệt độ 370C vi rút giảm hiệu giá hàng ngày vào khoảng 0,15 lg. [4]
Vi rút Bại liệt tăng tính chịu nhiệt khi có mặt của của ion canxi hoặc ion magie ở
nồng độ 1M.
Vi rút Bại liệt bền vững với dải pH rộng từ 2-10, nhƣng pH thích hợp nhất tại
pH 6,5-7,2.
Ngoài ra vi rút Bại liệt bị bất hoạt hoàn toàn bởi formalin nhƣng tính kháng
nguyên vẫn bảo tồn nguyên vẹn. [3]

7


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

 Về cấu tạo của kháng nguyên
Kháng nguyên của hạt vi rút hoàn chỉnh có khả năng gây nhiễm trùng gọi là
kháng nguyên D (hay còn gọi là kháng nguyên N). Khi hạt vi rút bị đun nóng 50600C hình thái của hạt vi rút bị thay đổi và kháng nguyên D chuyển thành kháng
nguyên C (hay còn gọi là kháng nguyên H). Kháng nguyên D có hằng số lắng là
160S còn kháng nguyên C có hằng số lắng là 80-90S.
Kháng nguyên D là hạt vi rút hoàn chỉnh bao gồm cả ARN và vỏ capsit còn
kháng nguyên C chỉ là vỏ capsit không có axit nhân và VP4. Kháng nguyên D và C
không có phản ứng miễn dịch chéo. Hai kháng nguyên này đƣợc phát hiện bằng
phản ứng kết hợp bổ thể và phản ứng kết tủa trên thạch.
Kháng nguyên D có khả năng tạo kháng thể trung hòa đặc hiệu typ và bám
vào thụ thể của tế bào cảm thụ, nhờ chức năng này mà vi rút có thể xâm nhập vào
bên trong tế bào cảm thụ để nhân lên.

Kháng nguyên C là kháng nguyên chung cho tất cả các typ, nó kích thích cơ
thể tạo ra kháng thể kết hợp bổ thể nhƣng nếu dùng kháng nguyên này để chế tạo
kháng huyết thanh thì sẽ không thu đƣợc kháng thể trung hòa. [4]
 Về tính sinh miễn dịch
Miễn dịch thụ động đƣợc truyền từ mẹ sang con. Kháng thể này chỉ xuất hiện
ở trẻ sơ sinh sau đó giảm dần và biến mắt khi trẻ đƣợc 6 tháng tuổi.
Miễn dịch chủ động là sự đáp ứng miễn dịch khi cơ thể bị nhiễm vi rút tự
nhiên hoặc sử dụng vắc xin. Đây là loại miễn dịch quan trọng mà loài ngƣời đã biết
ứng dụng để phòng bệnh bằng cách dùng vắc xin. Khi bị nhiễm vi rút Bại liệt hoang
dại hoặc vi rút vắc xin, cơ thể tạo ra miễn dịch đặc hiệu chống lại vi rút Bại liệt.
Kháng thể đặc hiệu chủ yếu là miễn dịch dịch thể bao gồm IgM, IgG và IgA.
Miễn dịch dịch thể liên quan tới tế bào lypho B và với thế hệ sau nó là bào
tƣơng. Bào tƣơng sản xuất các globulin miễn dịch. Khi tế bào B gặp kháng nguyên
Bại liệt trƣớc đó đã đƣợc kháng thể trên bề mặt nhận biết sẽ kích thích cơ thể tăng
sinh kháng thể. Kháng thể IgM và IgG phát hiện đƣợc sau khi nhiễm vi rút 2-3
ngày. Hiệu giá kháng thể cao ở những ngày đầu và hết sau 2-3 tháng. Hiệu giá
kháng thể IgG tăng và tồn tại lâu nhất trong cơ thể có thể tới 40 năm, đây là kháng

8


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

thể trung hòa có khả năng chống lại vi rút Bại liệt đến hệ thần kinh trung ƣơng.
Hiệu giá kháng thể IgA phát hiện 2-6 tuần sau khi nhiễm vi rút nhƣng hiệu giá thấp,
tăng chậm trong 3 tháng đầu sau khi nhiễm vi rút và tồn tại trong 6 năm. [3;5]
1.2.2. Vắc xin Bại liệt
Vắc xin phòng bệnh Bại liệt bao gồm 2 loại: Vắc xin sống giảm độc lực và

vắc xin Bại liệt bất hoạt. Vắc xin Bại liệt bất hoạt đƣợc làm từ những hạt vi rút đã bị
bất hoạt không có khả năng gây nhiễm trùng. Vắc xin sống giảm độc lực đƣợc làm
từ những hạt vi rút còn khả năng gây nhiễm nhƣng đã đƣợc làm giảm độc lực đến
mức không còn khả năng gây bệnh nữa.
 Vắc xin Bại liệt bất hoạt (IPV)
Năm 1936, Brodie, Park và Kolmer đã dùng phƣơng pháp hóa học để bất
hoạt hỗn dịch vi rút thu đƣợc sau khi gây nhiễm vi rút vào hệ thống thần kinh trung
ƣơng của khỉ. Nhƣng do khả năng kiểm tra tính an toàn của vắc xin chƣa đƣợc tốt
nên vắc xin gây ra nhiều tai biến và không đƣợc sử dụng.
Năm 1948 Morgan đã chứng minh hỗn dịch vi rút Bại liệt typ II đƣợc bất
hoạt bằng Formalin có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên khỉ. Cũng theo phƣơng
pháp đó, ngƣời ta đã thực hiện với vi rút typ I. Nghiên cứu trên chuột đã khẳng định
rằng vi rút Bại liệt typ II gây đƣợc miễn dịch trên loài gặm nhấm. Năm 1952 tiến
hành thử nghiệm trên đƣời ƣơi và 6 ngƣời tình nguyện cho thấy kháng thể tồn tại
trên 6 tháng. Những kết quả nghiên cứu này cho thấy vi rút bất hoạt bằng Formalin
có khả năng gây đáp ứng miễn dịch bảo vệ cơ thể khỏi bị bệnh Bại liệt
Một phát hiện có tính đột phá là vi rút Bại liệt có khả năng nhân lên trên các
nuôi cấy tế bào mô thần kinh của ngƣời và khỉ, sau đó ngƣời ta biết đƣợc rằng vi rút
Bại liệt có khả năng nhân lên trên nuôi cấy tế bào thận khỉ. Hỗn dịch gặt đƣợc từ
nuôi cấy tế bào thận khỉ đƣợc bất hoạt bằng Formalin có khả năng gây đáp ứng
miễn dịch. Hiệu lực bảo vệ của cả 3 typ vắc xin bất hoạt bằng Formalin đã đƣợc
chứng minh qua một thử nghiệm lớn trên thực địa của Thomas Francis năm 1954.
Kết quả của thử nghiệm này cho thấy vắc xin có hiệu lực bảo vệ đạt 80-90% trong
đó typ I là 60-70%, typ II và typ III là 90 và trên 90%. Sự khác biệt giữa các typ và
hiệu lực thấp hơn so với dự kiến là do sự có mặt của Thimerosal một chất dùng làm

9


Luận văn thạc sĩ


Trần Thị Phương Thảo – CB130717

chất bảo quản trong đó hàm lƣợng của chất này trong typ I lớn hơn typ II và typ III.
Vấn đề này đƣợc chứng minh một cáh rõ ràng khi ngƣời ta thay thế Thimerosal
bằng chất khác. Vắc xin bất hoạt còn gọi là vắc xin Salk, đƣợc sản xuất trên tế bào
thận khỉ tiên phát, bất hoạt vi rút bằng formalin có nồng độ cuối cùng là 1/4000
Tháng 4/1955, vắc xin Bại liệt bất hoạt đã đƣợc sử dụng trƣớc mùa dịch Bại
liệt tại Mỹ. Đến năm 1961 số trẻ mắc bệnh giảm xuống tới 90%so với giai đoạn
trƣớc khi dùng vắc xin. Kết quả này đạt đƣợc khi 54% dân số đã nhận đủ 3 hoặc
hơn 3 liều vắc xin bất hoạt chủ yếu là trẻ em. Tiếp theo đó IPV đã đƣợc sản xuất và
sử dụng ở nhiều nƣớc trên thế giới, cho đến nay IPV vẫn là vắc xin chủ yếu phòng
bệnh.
 Vắc xin Bại liệt sống giảm độc lực (OPV)
Vào năm 1950 Hilary Koprowski và cộng sự báo cáo khả năng đáp ứng miễn
dịch của ngƣời đối với vắc xin Bại liệt sống giảm độc lực typ II. Ngay sau đó nhiều
báo cáo khác về việc làm giảm độc lực của vi rút hoang dại để làm vắc xin đã đƣợc
công bố. Các chủng làm giảm độc lực bằng cách cấy truyền nhiều lần vi rút trên các
nuôi cấy tế bào khác nhau với đậm độ cao, sau đó thu thập các hạt vi rút giảm độc
lực bằng cả phƣơng pháp pha loãng giới hạn và phƣơng pháp tạo đám hoại tử. Sabin
và cs đã phát hiện ra rằng vi rút vắc xin giảm độc lực có khả năng thâm nhiễm tốt
trong ống tiêu hóa của con ngƣời. Ông đã nghiên cứu nghiên cứu trên khỉ về các thế
hệ vi rút đƣợc nhân lên từ vi rút vắc xin đƣợc đào thải ra ngoài theo đƣờng tiêu hóa,
sau đó tiến hành trên ngƣời thấy rằng trong đƣờng tiêu hóa của con ngƣời vi rút vắc
xin cũng nhân lên tốt và kết quả này cũng đƣợc khẳng định vào năm 1959 khi một
thử nghiệm lớn đƣợc thực hiện trên nhiều nƣớc khác nhau với những điều kiện khác
nhau. Từ kết quả nghiên cứu trên, một câu hỏi đặt ra đối với các thế hệ vi rút đƣợc
nhân lên từ vi rút vắc xin là tính ổn định của chúng hay khả năng quay trở lại độc
lực của chúng có hay không?
Ngƣời ta cũng đã nghiên cứu về tính ổn định của vắc xin và nhiều thử

nghiệm đã đƣợc ứng dụng cho mục đích này. Kết quả cho thấy chủng Sabin đạt yêu
cầu. Tuy vậy ngƣời ta cũng nhanh chóng phát hiện ra rằng chủng này cũng có tai
biến cho ngƣời uống vắc xin và ngƣời tiếp xúc tuy tỷ lệ rất nhỏ.

10


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

Hình 2. Hình ảnh lọ vắc xin Bại liệt uống sản xuất tại Polyvac

Nhƣ vậy vắc xin sống giảm độc lực còn gọi là vắc xin Sabin đƣợc sản xuất
trên tế bào thận khỉ tiên phát hoặc thứ phát (tế bào Vero). Chủng của 3 typ dùng để
sản xuất vắc xin Sabin đƣợc nhận từ chủng giảm độc lực do Sabin cấy truyền và cải
tạo từ chủng hoang dại. Vi rút vắc xin Sabin là vi rút giảm độc lực nên vi rút kích
thích cơ thể tạo cả miễn dịch tại chỗ và miễn dịch dịch thể. Vì vậy OPV vừa ngăn
chặn vi rút hoang dại vào hệ thống thần kinh trung ƣơng vừa ngăn chặn vi rút Bại
liệt hoang dại xâm nhập và nhân lên tại đƣờng xâm nhập. OPV tạo miễn dịch sớm
và tồn tại lâu dài, giá thành rẻ, dễ sử dụng nên sử dụng rộng rãi trên toàn cầu đặc
biệt là các nƣớc nhiệt đới. Tuy nhiên dùng vắc xin Sabin có nhƣợc điểm là vi rút
sabin đƣợc tạo ra từ chủng hoang dại nên trong quá trình phát triển tự nhiên vi rút
Sabin có xu thế trở về cội nguồn đặc biệt là typ III. Trong quá trình nhân lên của vi
rút có một vài vị trí đột biến, nhƣng rất hiếm nguy cơ liệt liên quan đến vắc xin.
Trên cơ sở một vài nghiên cứu trong 10 năm của Tổ chức Y tế Thế giới ƣớc tính 1
trƣờng hợp bị liệt/ 2-4 triệu liều vắc xin.
Vắc xin Bại liệt sống uống không bền vững với nhiệt độ nên các nhà nghiên
cứu đẫ tìm chất ổn định nhiệt cho vi rút vắc xin. Hiện nay các nhà sản xuất đang
dùng MgCl2 hoặc đƣờng sacharoza trong môi trƣờng đệm nhƣ là chất ổn định nhiệt

cho vắc xin.
1.2.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng vắc xin mẫu chuẩn Bại liệt
* Vắc xin mẫu chuẩn quốc tế đang có hiện nay:
 Mẫu chuẩn vi rút Bại liệt Sabin typ I
- Mã NIBSC: 01/528 ngày 8/4/2010. Chế phẩm 01/528 đƣợc thiết lập thông qua
nghiên cứu cộng tác Quốc tế bao gồm 6 phòng thí nghiệm Bại liệt chuẩn thức toàn
cầu của Tổ chức Y tế Thế giới, đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm chuẩn để xác
11


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

định độ nhạy của tế bào cho nhiễm vi rút Bại liệt và những phƣơng pháp thử
nghiệm khác. Hiệu giá của mẫu chuẩn 01/528 là 5,1 log10CCID50/0,1ml trên tế bào
RD và 4,9 log10CCID50/0,1ml trên tế bào L20. Mỗi lọ chứa 800ul dung dịch bao
gồm: vi rút Sabin typ I chủng LS-c, 2a pha trong môi trƣờng tối thiểu có huyết
thanh bê bào thai, không có chất ổn định nhiệt. Chế phẩm đƣợc bảo quản tại -200C
hoặc lạnh hơn. Tránh đông tan băng nhiều lần.
- Mã: WR1-94. Hiệu giá 108,67 CCID50/ml trên tế bào Hep2, dạng dung dịch. Mỗi
ampul 1ml. Sử dụng cho chuẩn độ hiệu giá vắc xin Bại liệt đơn giá typ I. Bảo quản
ở -700C. Tránh đông tan nhiều lần, đƣợc sản xuất tại Viện nghiên cứu Bại liệt Nhật
Bản JPRI năm 1994.[10]
 Mẫu chuẩn vi rút Bại liệt Sabin typ II
- Mã: WR2-98. Hiệu giá 108,29 CCID50/ml trên tế bào Hep2. Dạng dung dịch. Mỗi
ampul 1ml. Sử dụng cho chuẩn độ hiệu giá vắc xin Bại liệt đơn giá typ II. Bảo quản
-700C, tránh đông tan nhiều lần, đƣợc sản xuất tại Viện nghiên cứu Bại liệt Nhật
Bản JPRI năm 1998. [10]
 Mẫu chuẩn vi rút Bại liệt Sabin typ III.

- Mã NIBSC 01/532 ngày 11/3/2008. Chế phẩm 01/532 đƣợc thiết lập thông qua
nghiên cứu cộng tác Quốc tế bao gồm 6 phòng thí nghiệm Bại liệt chuẩn thức toàn
cầu của Tổ chức Y tế thế giới. Đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm chuẩn để xác
định độ nhạy của tế bào cho nhiễm vi rút Bại liệt. Hiệu giá của mẫu chuẩn 01/532 là
5,3 log10 CCID50/0,1ml trên tế bào RD và 4,9 log10 CCID50/0,1ml trên tế bào L20.
Mỗi lọ chứa 800ul dung dịch bao gồm: vi rút Sabin typ III chủng RSO2 pha trong
môi trƣờng tối thiểu có huyết thanh bê bào thai, không có chất ổn định nhiệt. Chế
phẩm đƣợc bảo quản tại -700C hoặc lạnh hơn, tránh đông tan băng nhiều lần.
- Mã: WR3-93. Hiệu giá 108,97 CCID50/ml trên tế bào Hep2. Dạng dung dịch. Mỗi
ampul 1ml. Sử dụng cho chuẩn độ hiệu giá vắc xin Bại liệt đơn giá typ III. Bảo
quản ở -700C, tránh đông tan nhiều lần, đƣợc sản xuất tại Viện nghiên cứu Bại liệt
Nhật Bản JPRI năm 1993.[10]

12


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

 Mẫu chuẩn vắc xin Bại liệt tam liên.
- Mã: JP-52. Hiệu giá typ I: 106,11 CCID50/0,05ml; Hiệu giá typ II: 105,17
CCID50/0,05ml; Hiệu giá typ III: 105,49 CCID50/0,05ml đƣợc chuẩn độ trên tế bào
Hep2. Dạng dung dịch. Mỗi ampul 1ml. Sử dụng cho chuẩn độ hiệu giá vắc xin Bại
liệt thành phẩm. Bảo quản -700C. Tránh đông tan nhiều lần. Đƣợc sản xuất tại Viện
nghiên cứu Bại liệt Nhật Bản JPRI [10]
1.2.4. Tiêu chuẩn cơ sở cho vắc xin mẫu chuẩn bại liệt
Vắc xin mẫu chuẩn phải đạt đƣợc các tiêu chuẩn của vắc xin OPV theo yêu
cầu của WHO và dƣợc điển Việt Nam nhƣ bảng sau [6;13]
Bảng 1. Tiêu chuẩn chất lượng của vắc xin OPV


Tên thử
nghiệm

Phƣơng pháp

Tiêu chuẩn chấp thuận

Vắc xin trong suốt, màu
Quan sát lọ vắc xin trên đèn
Cảm quan
vàng ánh đỏ, không có dị vật
1000 Lux
lạ
pH
Sử dụng máy đo pH chuẩn
6,5-7,2
Lọc và nuôi trong môi
Tính vô
Không có sự phát triển của
trƣờng Thioglycolate và
khuẩn
vi khuẩn và nấm (Âm tính)
Soybean casein
Lọc và nuôi cấy trực tiếp
Không có sự phát triển của
Mycoplasma
trên môi trƣờng LM I và
Mycoplasma
LM II

Nhận dạng
Trung hòa vi lƣợng
Là virus Polio
Hiệu giá vắc
xin đơn typ
(log10CCID50
/0,1ml)

Trung hòa vi lƣợng

Typ I: ≥ 6,5
Typ II: ≥ 5,5
Typ III: ≥ 6,0

Hiệu giá vắc
xin tam liên
(log10CCID50
/0,1ml)

Trung hòa vi lƣợng

Typ I: ≥ 6,0
Typ II: ≥ 5,0
Typ III: ≥ 5,5

Trung hòa vi lƣợng

Chênh lệch hiệu giá giữa 3
lần kiểm tra không vƣợt quá
0,5 log10 CCID50/ 0,1ml


Tính đồng
nhất và ổn
định

13

Tài liệu tham
chiếu

- Báo cáo kỹ
thuật số 840,
phụ lục 3,
1994, Tổ chức
Y tế thế giới
(trang
117118)
- Dƣợc điển
Việt Nam IV
(trang
660661, 2009)


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

Điều kiện bảo quản:
Trƣớc khi đƣợc sản xuất, phân phối, tất cả vắc xin thô hay vắc xin thành
phẩm đã đƣợc đóng ống phải giữ liên tục ở dạng đông băng ở nhiệt độ dƣới -200C.

Sau khi đã phân phối, nếu có thể đƣợc vắc xin đóng trong ống phải đƣợc bảo quản ở
dạng đông băng. Ở những nơi không thể bảo quản ở nhiệt độ thấp nhƣ vậy, vắc xin
nên đƣợc bảo quản ở nhiệt độ -80C hay thấp hơn. Những thí nghiệm có giới hạn sẽ
chứng minh đông băng, tan băng nhiều lần liên tiếp với vắc xin Bại liệt uống không
ảnh hƣởng có ý nghĩa đến hiệu giá, miễn là các thao tác phải đƣợc làm nhanh.
Hạn dùng:
Vắc xin có thể dùng đƣợc sau thời gian 2 năm kể từ lần chuẩn độ hiệu giá
cuối cùng mà vẫn đạt tiêu chuẩn nhƣ đã mô tả ở phần trên khi vắc xin phải đƣợc
bảo quản liên tục ở nhiệt độ dƣới -200C.
Nhà sản xuất có thể đƣợc phép ghi hạn dùng dài hơn nếu những dữ liệu phù
hợp đã đƣợc trình lên cơ quan kiểm định quốc gia.

14


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Mẫu chuẩn:
Bại liệt đơn typ của Nhật Bản có hiệu giá lần lƣợt: JP-I có hiệu giá: 7,67
log10CCID50/ 0,1 ml; JP-II có hiệu giá: 7,29 log10CCID50/ 0,1 ml; JP-III có hiệu giá:
7,97 log10CCID50/ 0,1 ml
Mẫu chuẩn Bại liệt tam liên của Nhật Bản (JP-52) có hiệu giá: Typ I: 6,41
log10CCID50/ 0,1 ml; Typ II: 5,47 log10CCID50/ 0,1 ml; Typ III: 5,89 log10CCID50/
0,1 ml
Chủng vi rút:
Vi rút Bại liệt typ I: WHO-IS-90C do Viện nghiên cứu Bại liệt Nhật Bản

cung cấp. Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO). Đƣợc cấy truyền 2 lần (SO+2).
Hiệu giá: 108,3 CCID50/ml.
Vi rút Bại liệt typ II: WHO-IIS-90A do Viện nghiên cứu Bại liệt Nhật Bản
cung cấp. Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO). Đƣợc cấy truyền 2 lần (SO+2).
Hiệu giá: 108 CCID50/ml.
Vi rút Bại liệt typ III: WHO-IIIS-79A do Viện nghiên cứu Bại liệt Nhật
Bản cung cấp. Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO). Đƣợc cấy truyền 3 lần
(SO+3) và 2 lần chọn lọc bằng cách tạo đám hoại tử (SO+3+2 plaque). Hay còn gọi
là chủng RSO+2. Hiệu giá: 108,3 CCID50/ml.
-

Chai Roux nuôi cấy tế bào

-

Các loại môi trƣờng và dung dịch dùng cho tách (Trypsin- Versen), nuôi cấy

(LHE) và gây nhiễm tế bào (LH3E) do Polyvac sản xuất.
-

Lọ thủy tinh 2 ml/ ampul 1,5ml

-

Nắp nhôm

-

Dung dịch pha loãng vắc xin Hanks-MgCl2 (Polyvac)


-

Máy đóng ống, máy dập nắp nhôm - Suzuki Nhật Bản

15


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp sản xuất vắc xin
Qui trình công nghệ sản xuất vắc xin Bại liệt sống, giảm độc lực, uống
Khỉ dùng cho sản xuất



Khỉ trƣởng thành, trọng lƣợng 2,5-3,5 kg.

Cách ly 6 tuần.
Kiểm tra sự nhiễm các tác nhân gây bệnh nhƣ vi rút Polio, SV40,
SIV, vi khuẩn lao.
Tách và nuôi cấy tế bào
thận khỉ



Tế bào thận khỉ sau khi đƣợc tách khỏi nhu mô thận sẽ


đƣợc nuôi cấy trên các chai nuôi cấy.
Sau 7 ngày tế bào phát triển thành một lớp. Những chai đủ tiêu
chuẩn sẽ đƣợc dùng để nhiễm vi rút.

Gây nhiễm vi rút



3 typ vi rút Bại liệt đƣợc gây nhiễm riêng rẽ trên các loạt

tế bào khác nhau.
Tế bào sau khi nhiễm vi rút phải đƣợc nuôi cấy tại một nhiệt độ ổn
định. Độ giao động của nhiệt độ <0,30C. Thời gian nuôi cấy không
quá 96 giờ.
Gặt vắc xin



Khi tế bào bị hủy hoại >80% thì các chai nuôi cấy đƣợc

lắc kỹ và để đông đá tại nhiệt độ dƣới -200C.
Hỗn dịch vi rút tiếp tục đƣợc tan băng và đông băng một vài lần
rồi hộn lại trong một bình lớn cho đồng nhất.
Lọc vô trùng



Hỗn dịch vi rút đƣợc lọc vô trùng.

Cho thêm chất ổn định.

Hỗn dịch vi rút sau đó đƣợc bảo quản nghiêm ngặt ở trạng thái
đông đá trong các chai đƣợc nút chặt.
Pha vắc xin thành phẩm



Vắc xin bán thành phẩm đơn typ I,II,III đƣợc hộn lại

thành vắc xin bán thành phẩm cuối cùng sao cho hiệu giá của mỗi
typ lần lƣợt lớn hơn 6; 5 và 5,5 lg CCID50/0,1ml.
Vắc xin đƣợc đóng lọ với 20 liều/lọ.
Vắc xin thành phẩm đƣợc bảo quản đông đá.

Khỉ dùng cho sản xuất: Là khỉ chƣa đƣợc dùng vào bất kỳ một thử nghiệm
nào. Chúng đƣợc nhốt cách ly trong 6 tuần trƣớc khi dùng và đƣợc tiến hành lấy

16


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

máu kiểm tra sự nhiễm các yếu tố ngoại lai nhƣ vi rút Bại liệt, SV40, SIV, vi khuẩn
lao, vi rút B... Bất cứ khỉ nào bị nhiễm một trong các tác nhân gây bệnh trên đều bị
loại. Khi khỉ không có biểu hiện của sự nhiễm bất kỳ một tác nhân nào thì tế bào
thận đƣợc dùng để sản xuất vắc xin.
Môi trường dùng trong sản xuất: Các loại môi trƣờng dùng trong sản xuất
phải đƣợc tiến hành kiểm tra vô trùng trƣớc khi đƣa vào sản xuất. Ngoài ra, các loại
môi trƣờng dùng trong nuôi cấy tế bào và nuôi cấy vi rút phải đƣợc tiến hành thử

nghiệm trên nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát để đánh giá sự ảnh hƣởng của các
loại môi trƣờng này trên nuôi cấy tế bào. Khi các tế bào thử nghiệm phát triển bình
thƣờng, không phát hiện ra bất cứ dấu hiệu nào cho thấy bất thƣờng thì loạt môi
trƣờng đó đƣợc dùng để sản xuất vắc xin. Đối với trypsin và huyết thanh bê nhà
cung cấp phải chứng minh đƣợc rằng chúng không bị nhiễm các tác nhân ngoại lai
mà TCYTTG qui định.
 Tách và nuôi cấy tế bào
 Mổ lấy thận khỉ:
Khỉ đƣợc gây mê sâu bằng Ketamin. Dùng kéo cắt toàn bộ da bụng để bộc lộ
lớp cơ thành bụng. Sát trùng lớp cơ bụng bằng cồn i-ốt và dùng kéo cắt bỏ toàn bộ
cơ thành bụng theo vùng da đã bộc lộ cách vạt cắt da 0,5-1cm. Gạt bỏ nội tạng
xuống dƣới để bộc lộ thận. Bóc tách lấy toàn bộ thận, động mạch thận và động
mạch chủ bụng đảm bảo không đƣợc làm tổn thƣơng đến nhu mô thận và động
mạch thận.
Thận đƣợc bảo quản trong một bình có nút đậy kín trong chứa 100ml môi
trƣờng bảo quản thận đã đƣợc ủ ấm trƣớc ở 370C. Sau đó đƣợc chuyển đến phòng
trypsin hoá.

17


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

Hình 3. Hình ảnh mổ lấy thận và thận khỉ sau khi được đưa ra khỏi cơ thể

 Trypsin hoá thận khỉ:
Đây là khâu hết sức quan trọng. Nó quyết định đến số lƣợng và chất lƣợng
của nuôi cấy tế bào sau này. Từ đó, quyết định đến chất lƣợng của vắc xin cũng nhƣ

đảm bảo đƣợc vấn đề kinh tế trong sản xuất.
Tại phòng trypsin hoá, thận đƣợc đặt trong một đĩa petri vô trùng. Dùng kéo
vi phẫu cắt dọc theo chiều dài động mạch chủ bụng ở chính giữa sao cho không cắt
đứt động mạch thận để bộc lộ vị trí xuất phát của động mạch thận. Dùng 2 kim tiêm
đầu tù đã đƣợc tiệt trùng luồn vào 2 động mạch thận sao cho đầu kim vừa đến chỗ
mà động mạch thận phân chia (cách rốn thận khoảng 2-3mm). Dùng 2 kẹp không
mấu kẹp cố định 2 kim lại.
Nối 2 kim này với các bình chứa dung dịch trypsin, versen qua ống bằng
silicon đã đƣợc lắp sẵn vào bơm lƣợn sóng.
Đầu tiên truyền khoảng 150-200ml dung dịch versen 0,02% đã đƣợc ủ ấm
trƣớc tại 370C với tốc độ 15-20ml/phút để đẩy toàn bộ máu đọng ở trong nhu mô
thận và các dịch trong tổ chức thận ra ngoài. Tiếp theo truyền dung dịch trypsin
0,25% cũng đƣợc ủ ấm trƣớc ở 370C với tốc độ nhƣ trên. Truyền cho tới khi thấy
nhu mô thận trắng đều, tổ chức lỏng lẻo và có thể có một số vết nứt nhỏ trên bề mặt
của thận.

18


Luận văn thạc sĩ

Trần Thị Phương Thảo – CB130717

Thận đƣợc đặt vào một đĩa petri vô trùng khác và tiến hành bóc tách vỏ xơ
của thận. Dùng 2 móc câu đã đƣợc đính với nút cao su qua một dây xích bằng thép
không rỉ móc vào vỏ xơ của thận tại vùng rốn thận. Cho thận vào trong bình chứa
80-100ml môi trƣờng LHE (không có huyết thanh) ở trạng thái treo, nút chặt và
dùng tay lắc nhẹ nhàng, cho đến khi môi trƣờng hoá đục, nhƣ vậy tế bào đã đƣợc
tách ra. Hỗn dịch tế bào này sau mỗi lần lắc đƣợc thu giữ lại trong một bình chứa
100-150ml huyết thanh bê và đƣợc giữ lạnh. Làm nhiều lần nhƣ vậy cho đến khi

nhu mô thận tan hết chỉ còn lại xơ thì thôi.
Hỗn dịch tế bào đƣợc cho thêm môi trƣờng LHE cho vừa đủ 1000ml hay
1500ml với nồng độ huyết thanh bê đạt 10% và đƣợc bảo quản lạnh (4-80C) cho đến
khi đƣợc nuôi cấy.
Hỗn dịch tế bào thu đƣợc sau khi trypsin hoá đƣợc đếm bằng buồng đếm
hồng cầu Burcker-Turck (0,1mm3). Quá trình này đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Pha 1ml hỗn dịch tế bào trong 0,5ml thuốc nhuộm (tỷ lệ pha loãng 1,5 lần).
Trộn đều bằng pipet. Nhỏ hỗn dịch tế bào đã nhuộm vào buồng đếm và đếm số
lƣợng tế bào trên kính hiển vi. Những tế bào sống hình tròn, nguyên sinh chất sáng
không bắt màu thuốc nhuộm.
Đếm tất cả 4 ô vuông ở 4 góc. Lấy giá trị trung bình của 1 ô. Mỗi mẫu đƣợc
đếm 2 lần trên 2 buồng đếm khác nhau.
 Tính kết quả:
Số lƣợng tế bào (A) đƣợc tính theo công thức:
A= tb × h × Vhd × 104
Trong đó:

tb: là số tế bào trung bình của 1 ô đếm đƣợc

h: là hệ số pha loãng (1,5 lần)
Vhd: là thể tích của hỗn dịch tế bào thu đƣợc
104: là hệ số chuyển đổi của buồng đếm
Nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát:
Môi trƣờng phát triển:
-

LHE (50% LH 0,5% + 50% Eargle)

19