Header Page 1 of 50.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM
KHOA SINH HỌC
[”\

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG

TẠO PHÔI BÒ (HOẶC PHÔI HEO) TỪ
NGUỒN TRỨNG ĐÔNG LẠNH BẰNG
KỸ THUẬT HỖ TRỢ SINH SẢN
Mã số: CS.2010.19.89.

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

ThS. NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỀN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 07/2010

Footer Page 1 of 50.


Header Page 2 of 50.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

KHOA SINH HỌC
[”\

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG

TẠO PHÔI BÒ (HOẶC PHÔI HEO) TỪ
NGUỒN TRỨNG ĐÔNG LẠNH BẰNG
KỸ THUẬT HỖ TRỢ SINH SẢN
Mã số: CS.2010.19.89.

NHỮNG NGƯỜI THAM GIA:

CN. Võ Thị Tuyết Nga
CN. Nguyễn Thành Trung
ThS. Ngô Thị Mai Hương
SV. Đỗ Hoàng Hùng

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 07/2011

Footer Page 2 of 50.


Header Page 3 of 50.

i

TÓM TẮT
Đề tài tiến hành nhằm nghiên cứu việc bảo quản trứng bò trưởng thành

bằng phương pháp thủy tinh hóa, đồng thời tạo phôi từ nguồn giao tử này bằng
kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization_IVF) và kỹ thuật tiêm
tinh trùng vào bào tương trứng (Intracytoplasmic Sperm Injection _ICSI). Thu
nhận trứng từ buồng trứng của bò cái bị giết mổ bằng phương pháp chọc hút.
Những trứng có ít nhất từ 3 lớp cumulus và đồng nhất về tế bào chất được chọn
để nuôi chín trong môi trường C3 (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG +
EGF) ở 38,5oC và 5% CO2, hơi nước bão hòa. Nội dung 1: Sau 22 - 24 h nuôi
cấy, chọn những tế bào trứng chín theo quan sát hình thái đem bảo quản bằng
phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ qua 2 bước: trứng được cho vào dung
dịch cân bằng VS1 (TCM-199 + 10% FBS + 10% DMSO + 10% EG) để trong 45
giây, tiếp theo cho vào dung dịch thủy tinh hóa VS2 (TCM-199 + 10% FBS +
20% DMSO + 20% EG + 1 M sucrose) để trong 25 giây, sau đó nạp từ 5 - 7 tế
bào trứng vào cọng rạ (0,25 ml) và nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng (khoảng 45 giây
kể từ khi trứng tiếp xúc với dung dịch bảo quản). Giải đông tế bào trứng như sau:
(i) lấy cọng rạ chứa tế bào trứng ra khỏi bình nitơ lỏng và để trong không khí 5
giây, nhúng vào nước ấm 37oC trong 10 giây, sau đó chuyển tế bào trứng vào đĩa
nhựa trống (Φ35); (ii) Các tế bào trứng lần lượt được chuyển qua môi trường rã
đông thứ nhất (RĐ1: TCM-199 + 10% FBS + 0,25 M sucrose) trong 1,5 phút,
RĐ2 (TCM-199 + 10% FBS + 0,15 M sucrose) khoảng 1,5 phút và RĐ3 (TCM199 + 10% FBS) trong 5 phút; (iii) Tiếp tục chuyển tế bào trứng qua môi trường
C3 trong khoảng 3 phút. Quá trình giải đông tiến hành ở nhiệt độ phòng (25oC).
Chọn những trứng còn nguyên vẹn về hình thái đem IVF (nội dung 2) và ICSI
(nội dung 3). Kết quả nội dung 1: Đông lạnh 3154 trứng dùng cho IVF, thu được
80,07 ± 2,72% trứng còn nguyên vẹn sau giải đông (theo quan sát hình thái);
Đông lạnh 837 trứng dùng cho ICSI, thu được 79,89 ± 5,28% trứng còn nguyên
vẹn sau giải đông (theo quan sát hình thái). Kết quả nội dung 2: Tiến hành thụ
tinh cho 1970 trứng sống tốt sau khi giải đông, chỉ có 306 trứng được thụ tinhgiai đoạn phôi 2 tế bào, chỉ đạt tỷ lệ 15,21 ± 3,48%. Trong khi ở lô đối chứng, tỷ
Footer Page 3 of 50.


Header Page 4 of 50.


ii

lệ thụ tinh đạt 58,5 ± 4,89% (234 phôi 2 tế bào). Có 82 (4,14%) phôi phát triển
đến giai đoạn phôi nang trong khi ở lô đối chứng có 93 phôi (23,25%).. Kết quả
nội dung 3: Tiến hành ICSI cho 595 trứng sống tốt sau khi giải đông và 375
trứng tươi chưa qua đông lạnh. Tỷ lệ thụ tinh ở lô thí nghiệm chỉ đạt 8,95%
(23/240 trứng) so với 30,82% (89/288 trứng) ở lô đối chứng; có 2 phôi phát triển
đến giai đoạn phôi nang so với 16 phôi (5,44%) ở lô đối chứng.

Footer Page 4 of 50.


Header Page 5 of 50.

iii

SUMMARY
This research aimed at bovine embryo production, using cryopreserved
mature bovine oocytes by vitrification, and cryopreserved sperms. The cumulusoocyte complexes (COCs) were obtained from cow ovaries by aspiration. COCs
with three or more layers of cumulus cells and homogeneous cytoplasm were
selected to be cultured in C3 medium (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + hCG +
EGF) under the condition at 38.5oC with humidified atmosphere of 5% CO2 in
air. Experiment 1: After 22 - 24 h incubation, matured oocytes

were

cryopreserved by vitrification method in straws in two steps: (i) oocytes were
first equilibrated in the VS1 solution (TCM-199 + 10% FBS + 10% DMSO +
10% EG) for 45 seconds; (ii) The oocytes were then transferred in the VS2

solution (TCM-199 + 10% FBS + 20% DMSO + 20% EG + 1 M sucrose) for 25
seconds. Each straws were loaded with 5-7 oocytes. Straws were plunged directly
into liquid nitrogen within 45 seconds at the beginning of the exposure to second
step. After storage in liquid nitrogen, thrawing was performed by exposing the
straw to air for 5 seconds, and plunged into warm water (37oC) for 10 seconds,
and then transfered were oocytes into clean dish (Φ35); Oocytes were directly
expelled into RD1 medium (TCM-199 + 10% FBS + 0.25 M sucrose) 1.5
minutes, RD2 medium (TCM-199 + 10% FBS + 0.15 M sucrose) 1.5 minutes and
RD3 (TCM-199 + 10% FBS) medium 5 minutes; This oocytes were tranferred to
C3 medium and holding for 3 minutes. The thrawing was performed in a room at
25oC. Survival oocytes by morphology used for IVF (Experiment 2) and ICSI
(Experiment 3). In experiment 1: 3154 oocytes were vitrificatin which used for
IVF, morphological intact recovered rate was 80,07 ± 2,72%; 837 oocytes were
vitrification which used for ICSI, morphological intact recovered rate was 79,89
± 5,28%. In experiment 2: After 22-24h incubated with sperm, 306/1970 (15,21 ±
3,48%) vitrified oocytes were fertilized while the rate of fertilized oocytes in the
control samples is 234/400 (58,5 ± 4,89%); the rate embryo developed into
blastocyst stage in experiment and control was 4,14% (82 embryos) and 23,25%
(93 embryos), respectively. In experiment 3: After 22-24h incubated with sperm,

Footer Page 5 of 50.


Header Page 6 of 50.

iv

23/240 (8,95%) vitrified oocytes were fertilized while the rate of fertilized
oocytes in the control samples is 234/400 (58,5 ± 4,89%); 2 embryos developed
into blastocyst stage in experiment and control was 16 embryos.


Footer Page 6 of 50.


Header Page 7 of 50.

v

MỤC LỤC
Tóm tắt đề tài (tiếng Việt và tiếng Anh).........................................................i
Mục lục .........................................................................................................v
Danh mục bảng .............................................................................................vi
Danh mục hình..............................................................................................vi
Danh mục từ viết tắt......................................................................................iv
PHẦN MỞ ĐẦU ....................................................................................... viii
1. Tính cấp thiết của đề tài.............................................................................1
2. Mục tiêu đề tài ...........................................................................................2
3. Cách tiếp cận đề tài....................................................................................2
4. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................2
5. Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................3
6. Nội dung nghiên cứu .................................................................................3
7. Sản phẩm đề tài..........................................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................6
1.1. KHÁI QUÁT VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG ............................................6
1.1.1. Khái niệm đông lạnh trứng ..................................................................6
1.1.2. Mục tiêu của đông lạnh trứng ..............................................................6
1.2.3. Những nét cơ bản về bảo quản trứng đông lạnh bằng ...........................
phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification)..........................................7
1.2.4. Đông lạnh trứng trưởng thành bằng .....................................................
phương pháp thủy tinh hóa .................................................................9

1.2. KHÁI QUÁT VỀ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM.....................10
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu ............................................................................10
1.2.2. Cơ sở khoa học của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm...................11
1.3. KHÁI QUÁT VỀ KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG ............................
VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN ................................................................16
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu ............................................................................16
1.3.2. Cơ sở khoa học của kỹ thuật ICSI .....................................................17
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả ICSI..............................................21
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............24
2.1. NỘI DUNG 1: ĐÔNG LẠNH TRỨNG BÒ TRƯỞNG THÀNH ...........
BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA .......................................
TRONG CỌNG RẠ .............................................................................24
2.1.1. Thu nhận và nuôi trứng .....................................................................24
2.1.2. Đông lạnh trứng .................................................................................25
2.1.3. Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng ....................................................27
2.2. NỘI DUNG 2: TẠO PHÔI BÒ BẰNG KỸ THUẬT THỤ TINH...........
TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) ...........................................................27
2.2.1. Chuẩn bị tinh trùng ............................................................................27
2.2.2. Thụ tinh trong ống nghiệm ................................................................28
2.2.3. Nuôi phôi và đánh giá phôi................................................................29

Footer Page 7 of 50.


Header Page 8 of 50.

vi

2.2.4. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm từ trứng tươi......................29
2.3. NỘI DUNG 3: TẠO PHÔI BẰNG KỸ THUẬT TIÊM TINH. TRÙNG

VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG (ICSI) ..................................................30
2.3.1. Chuẩn bị hóa chất ..............................................................................30
2.3.2. Chuẩn bị trứng ...................................................................................30
2.3.3. Chuẩn bị hệ thống thao tác ................................................................31
2.3.4. Tiến hành ICSI...................................................................................31
2.3.5. ICSI trứng tươi...................................................................................32
2.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU..................................................................................32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................33
3.1. KẾT QUẢ NỘI DUNG 1 .....................................................................33
3.2. KẾT QUẢ NỘI DUNG 2 ....................................................................35
3.3. KẾT QUẢ NỘI DUNG 3 .....................................................................40
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ.........................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................46
Phụ lục

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả đông lạnh trứng dùng cho IVF.................................................33
Bảng 3.2. Kết quả đông lạnh trứng dùng cho ICSI................................................34

Bảng 3.3. Kết quả IVF từ trứng đông lạnh ..................................................35
Bảng 3.4. Các giai đoạn phát triển của phôi ................................................37
Bảng 3.5. Sự chuyển tiếp của phôi lên các giai đoạn chính ............................
ở trứng đông lạnh .......................................................................38
Bảng 3.6. Kết quả ICSI từ trứng đông lạnh .................................................40

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các giai đoạn phát triển của phôi ................................................14
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí toàn bộ thí nghiệm trong đề tài ................................24
Hình 2.2. Cọng rạ chứa trứng ................................................................................26


Hình 2.3. Lấy cọng rạ chứa tinh trùng ra khỏi bình nitơ lỏng .....................28
Hình 2.4. Giải đông tinh trùng trong nước ấm ............................................28
Hình 2.5. Đĩa bố trí các vi giọt cho ICSI .....................................................30
Hình 3.1. Trứng chín....................................................................................33
Hình 3.2. Biểu đồ kết quả đông lạnh trứng..................................................34
Hình 3.3. Biểu đồ kết quả thụ tinh từ nguồn trứng đông lạnh.....................36
Hình 3.4. Phôi 2 tế bào từ trứng đông lạnh (X10).......................................37
Hình 3.5. Biểu đồ các giai đoạn phát triển của phôi........................................
từ trứng đông lạnh ......................................................................38
Hình 3.6. Các giai đoạn chính của phôi tạo ra từ trứng đông lạnh..............39
Hình 3.7. Biểu đồ kết quả ICSI từ trứng đông lạnh.....................................43

Footer Page 8 of 50.


Header Page 9 of 50.

vii

Hình 3.8. Trứng trước khi vi tiêm................................................................43
Hình 3.9. Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI) ...............................43
Hình 3.10. Trứng sau khi vi tiêm thành công ..............................................43

Footer Page 9 of 50.


viii

Header Page 10 of 50.


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
IVF
ICSI
PCR
LAMP

In Vitro Fertilization
Intracytoplasmic

Thụ tinh trong ống nghiệm

Sperm

Injection
Polymerase

Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng

Chain

Reaction
Loop-Mediated
Isothermal Amplification

IVM

In Vitro Maturation

Nuôi trưởng thành trong ống nghiệm


ICM

Inner Mass Cell

Khối tế bào bên trong

TE

Trophectoderm Cell

Tế bào nuôi phôi

ZP

Zona Pellucidas

Màng trong suốt, màng thụ tinh

CPA

Cryoprotectant additive

Chất bảo quản lạnh

PVP

Polyvinylpyrolidone

FBS


Fetal Bovine Serum

FCS

Fetal Calf Serum

DMSO

Dimethylsulphoxide

EG

Ethylene glycol

BO

Brackett and Oliphant

Môi trường BO

RĐ

Rã đông

cs.

Cộng sự

TN


Thí nghiệm

ĐC

Đối chứng

Footer Page 10 of 50.


1

Header Page 11 of 50.

Mở đầu

PHẦN MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

T

hế kỷ XXI được mệnh danh là thế kỷ của Công nghệ Sinh học
hiện đại. Kỷ nguyên này sẽ tạo ra những bước nhảy vọt về năng
suất, chất lượng giống cây trồng, vật nuôi và trên hết là khả năng

ứng dụng thực tiễn trên con người. Trong đó phải kể đến Công nghệ hỗ trợ sinh
sản, nổi bật là kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization_IVF),
tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (Intracytoplasmic Sperm Injection _ICSI),
đông lạnh. Chúng ta có thể tạo ngân hàng phôi, giao tử phục vụ cho các nghiên
cứu khoa học (chuyển gen, nhân bản, thu nhận tế bào gốc phôi…) đồng thời có

thể nhân nhanh số lượng lớn đàn giống cao sản, lai tạo hoặc chọn lọc các cá thể
chất lượng cao thông qua việc sử dụng trứng và tinh trùng chất lượng tốt.
Hiện nay, nhằm đáp ứng mục tiêu của “Chiến lược phát triển chăn nuôi đến
năm 2020” do chính phủ đề ra, nhiều phương pháp đã được áp dụng nhưng thực
tế vấp phải rất nhiều hạn chế khi đưa vào sản xuất trên qui mô công nghiệp như
kỹ thuật IVF, ICSI thành công chưa cao vì phụ thuộc nhiều vào nguồn mẫu. Có
thể thấy rõ điều này khi ứng dụng kỹ thuật IVF, ICSI để nhân nhanh đàn bò sữa
nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ sữa bò ngày càng gia tăng trong những năm trở
lại đây do chất lượng, nguồn cung cấp mẫu không ổn định, hạn chế trong việc
vận chuyển và bảo quản mẫu… Vì thế, nghiên cứu và sử dụng nguồn trứng đông
lạnh trở thành giải pháp hữu hiệu cho những vấn đề trên. Tuy nhiên, quá trình thụ
tinh với nguồn trứng đông lạnh sẽ cho kết quả thấp hơn so với bình thường. Điều
này là do trong quá trình đông lạnh – giải đông, trứng đã bị những tổn thương về
thoi vô sắc, nhiễm sắc thể, và đặc biệt là màng tế bào, gây trở ngại cho quá trình
thụ tinh. Cho đến nay, người ta đã thu nhận được một số kết quả thụ tinh trong
ống nghiệm từ tế bào trứng đông lạnh: năm 2003, Shinichi Hochi đã thành công
với tỷ lệ trứng bò thụ tinh sau giải đông là 36% và tỷ lệ phát triển lên blastocyst

Footer Page 11 of 50.


2

Header Page 12 of 50.

Mở đầu

là 5% [44]; năm 2008, Morato đã đưa ra tỷ lệ thụ tinh đối với tế bào trứng bò sau
khi thủy tinh hóa bằng vi giọt là 46,1% và sau sự thụ tinh trong ống nghiệm 5,3%
trứng bò phát triển đến giai đoạn phôi nang [37]. Vì thế, các nghiên cứu nhằm

nâng cao tỷ lệ tạo phôi nang (blastocyst) từ trứng bò đông lạnh vẫn đang được
thực hiện ở nhiều nước.
Tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm từ trứng bò đông lạnh ở nước ta mới
chỉ có Nguyễn Thị Thương Huyền và cs. thực hiện (2009) với tỷ lệ thụ tinh là
11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang [3]. Những công trình nghiên cứu theo
hướng này còn rất ít cũng như tỷ lệ thành công còn thấp. Chính vì vậy, chúng tôi
đề xuất đề tài “Tạo phôi bò (hoặc phôi heo) từ nguồn trứng đông lạnh bằng
kỹ thuật hỗ trợ sinh sản”. Hy vọng kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp
phần thúc đẩy và hoàn thiện công nghệ tạo phôi in vitro từ nguồn trứng bò đông
lạnh nói riêng và trứng đông lạnh của động vật hữu nhũ nói chung tại Việt Nam.
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Tạo được phôi bò từ nguồn trứng đông lạnh bằng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản
3. CÁCH TIẾP CẬN ĐỀ TÀI
• Tiếp cận với nhu cầu đòi hỏi của xã hội và tầm quan trọng của vấn đề
này trong cuộc sống; đồng thời các điều kiện về kiến thức, điều kiện
phòng thí nghiệm cho phép ứng dụng Công nghệ Sinh học.
• Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật,
kinh nghiệm: Tham gia lớp học về các kỹ thuật thu nhận, nuôi, đông
lạnh trứng, thụ tinh trong ống nghiệm trên đối tượng bò heo tại Viện
Chăn nuôi quốc gia, Hà Nội (tháng 05/2008) do TS. Otoi (Người Nhật)
và các cán bộ của viện đảm trách…
• Tra cứu các tài liệu liên quan trong và ngoài nước
• Tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại: hệ thống máy đông lạnh và giải
đông trứng, kỹ thuật vi thao tác, PCR…

Footer Page 12 of 50.


3


Header Page 13 of 50.

Mở đầu

4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• Phương pháp trực quan (nghiên cứu trực tiếp): thu nhận trứng và xử lý
trứng, đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa, giải đông
trứng, tạo phôi từ trứng đã đông lạnh…
• Phương pháp xử lý tinh trùng để chọn tinh trùng tốt thụ tinh với trứng
• Phương pháp tổng hợp
• Phương pháp so sánh
5. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
ƒ Trứng bò thu tại cơ sở giết mổ gia súc Thành Vinh, địa chỉ: 38 ấp Đức
Ngãi I – Xã Đức Lập Thượng – Huyện Đức Hòa – Tỉnh Long An
ƒ Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ được mua tại Trung tâm Nghiên
cứu và Chuyển giao tiến bộ Kỹ thuật Chăn nuôi – Viện Chăn nuôi. Địa
chỉ: 80 Nguyễn Văn Nghi, Phường 7, Quận Gò Vấp, Tp. Hồ Chí Minh.
6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• NỘI DUNG 1: Đông lạnh trứng bò trưởng thành bằng phương pháp
thủy tinh hóa trong cọng rạ
• NỘI DUNG 2: Tạo phôi bò bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm
(IVF)
• NỘI DUNG 3: Tạo phôi bò bằng kỹ thuật tịêm tinh trùng vào bào
tương trứng (ICSI)

Footer Page 13 of 50.


4


Header Page 14 of 50.

Mở đầu

7. SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI
Kết quả khoa học
Đã tiến hành được quy trình thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) từ nguồn
trứng bò đông lạnh thành công.
Đã tiêm được tinh trùng vào bào tương trứng bò đông lạnh (ICSI).
Kết quả sản phẩm
•

Đã đông lạnh được 3991 trứng bò trưởng thành: 3154 trứng dùng cho thí
nghiệm IVF với tỷ lệ sống sau giải đông là 80,07 ± 2,72%; 837 trứng được
dùng cho thí nghiệm ICSI với tỷ lệ sống sau giải đông là 79,89 ± 5,28%.

•

Đã thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm cho 1970 trứng đông lạnh với tỷ lệ
thụ tinh đạt 15,21 ± 3,48% và đã có 4,14 ± 1,86% (82 phôi) phát triển đến
giai đoạn phôi nang; 400 trứng tươi với tỷ lệ thụ tinh đạt 58,5 ± 4,89% và đã
có 23,25 ± 2,94% (93 phôi) phát triển đến giai đoạn phôi nang.

• Đã thực hiện tiêm tinh trùng vào bào tương trứng cho (1) 595 trứng đông
lạnh: 240 vi tiêm thành công, 23 trứng đã thụ tinh (8,95 ± 7,49%) và đã có
được 6 phôi phát triển đến giai đọan phôi dâu, 2 phôi phát triển đến giai đoạn
phôi nang; (2) 375 trứng tươi: 288 trứng vi tiêm thành công, 89 trứng đã thụ
tinh (30,82 ± 4,27%) và đã có được 23 phôi phát triển đến giai đọan phôi
dâu, 16 phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang.


Kết quả đào tạo
02 cử nhân
Đỗ Hoàng Hùng: Thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro
fertilization_IVF) trên tế bào trứng bò, 2010.
Lương Thiện Nghĩa: Khảo sát hiệu quả thụ tinh của trứng bò đông lạnh
bằng kỹ thuật ICSI (intracytoplasmic sperm injection), 2009.

Footer Page 14 of 50.


5

Header Page 15 of 50.

Mở đầu

Kết quả bài báo, báo cáo đã công bố
• 01 bài đăng trong tạp chí Công nghệ Sinh học, 2009 (Tạo phôi bò bằng kỹ
thuật thụ tinh in vitro từ nguồn giao tử đông lạnh). Tập 7, Số 2, Trang
161-167.
• 01 bài báo cáo tại hội nghị Công nghệ hỗ trợ sinh sản Châu Á thường
niên, 2009 (Experiment on frozen in vitro bovine embryo transfer after
sexing by LAMP method), Tại Cambodia, Trang 108.

Footer Page 15 of 50.


6

Header Page 16 of 50.


Tổng quan

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁI QUÁT VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG
1.1.1. Khái niệm đông lạnh trứng
Đông lạnh trứng là kỹ thuật bảo quản chức năng bình thường của trứng
trong một thời gian dài khi giảm nhiệt độ sinh lý của trứng (từ 37OC, 5% CO2)
xuống dưới nhiệt độ xảy ra các phản ứng sinh hóa ở -196OC (nhiệt độ dưới nhiệt
độ sinh lý). [5]
Theo các nhà khoa học trên thế giới, quy trình đông lạnh và giải đông trứng
thường được tiến hành qua 5 bước chính: (1) Đặt trứng vào dung dịch chất bảo
quản; (2) Làm lạnh xuống nhiệt độ dưới 0oC; (3) Bảo quản ở nhiệt độ dưới 196oC; (4) Làm ấm và giải đông trong dung dịch thích hợp; (5) Chuyển trứng vào
môi trường nuôi cấy. [5, 8, 28]
1.1.2. Mục tiêu của đông lạnh trứng
Quá trình đông lạnh gây ra nhiều tổn thương trong cấu trúc và chức năng
của trứng. Trong đó, tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những
bất lợi chính quyết định đến sự bảo quản trứng thành công. Do vậy, mục tiêu của
đông lạnh trứng bao gồm việc giảm thể tích vật chứa, giảm tính độc chất bảo
quản, tăng gradient nồng độ, thay đổi tỷ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích
(SA/V) của tế bào là nhằm giảm stress cho trứng trong quá trình đông lạnh. [5, 8]
Các phương pháp đông lạnh thông thường thực hiện quá trình khử nước rất
lâu, hình thành nhiều tinh thể đá, điều này làm giảm khả năng sống của trứng sau
giải đông. Chính vì vậy, mục tiêu của quy trình đông lạnh trứng nói chung và
đông lạnh trứng bằng phương pháp thủy tinh hóa nói riêng là hoàn tất sự thủy
tinh hóa nội bào, loại trừ tinh thể đá cả trong và ngoài tế bào với tốc độ làm lạnh
cực nhanh nhằm duy trì khả năng sống, ngăn stress cho tế bào đồng thời lại phải
dễ dàng trong thao tác. [28]


Footer Page 16 of 50.


7

Header Page 17 of 50.

Tổng quan

1.2.3. Những nét cơ bản về bảo quản trứng đông lạnh bằng phương pháp
thủy tinh hóa (Vitrification)
• Lịch sử nghiên cứu
Phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall và Fahy thực
hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 [42]. Vài năm sau đó, kỹ
thuật này được thực hiện rộng rãi trên gia súc. Tuy nhiên, quy trình này chỉ được
Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào năm 1999 và sau
đó vài tháng, được thực hiện đầu tiên trên phôi người đang phát triển ở giai đoạn
phôi nang bởi Lane. Ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh
bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ra đời. [28, 34, 53]
Hiện nay, đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đang là một kỹ thuật
được các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm lớn trong khu vực và thế giới đưa
vào ứng dụng trong thực tiễn điều trị và đang dần thay thế phương pháp hạ nhiệt
độ chậm trước đây. Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng không ngừng thực hiện
những kiểm chứng lâm sàng nhằm chứng minh kỹ thuật này thật sự an toàn đối
với con người.
• Khái niệm về phương pháp thủy tinh hóa
Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất
nhanh. Sau khi được cân bằng với môi trường có nồng độ chất bảo quản đông
lạnh rất cao (4 – 8M), nồng độ thẩm thấu vào khoảng 4000mOSm, tốc độ khử
nước rất nhanh và trứng ngay lập tức được đặt vào nitơ lỏng (-1960C). Nước ở

điều kiện này không chuyển thành đá (ice) thông qua sự kết tinh (crystallization)
mà chuyển thành dạng giống như thủy tinh (glass – like). Ở dạng thủy tinh, phân
tử nước và các chất hòa tan được giữ nguyên vị trí. Kỹ thuật này giúp tế bào
tránh được những tổn thương do sự hình thành tinh thể nước đá gây ra trong quá
trình đông lạnh. Mẫu trứng hoặc phôi được cho vào các dụng cụ chứa và nhúng
trực tiếp vào nitơ lỏng, không qua quá trình hạ nhiệt độ theo từng bước như trong
đông lạnh chậm. Tốc độ làm lạnh của phương pháp này cực nhanh (ultra – rapid),
khoảng 20000 – 25000oC / phút. [28, 33, 49]

Footer Page 17 of 50.


8

Header Page 18 of 50.

Tổng quan

Thủy tinh hóa có thể được thực hiện theo hai cách: tăng tốc độ hạ nhiệt;
tăng nồng độ chất bảo quản. Chính vì hai phương thức đó, chất bảo quản đông
lạnh được sử dụng với một lượng tối thiểu (khoảng 1µl) nhưng nồng độ rất cao
và tốc độ làm lạnh thường dùng vào khoảng 15.000oC – 30.000oC /phút. [28]
Với quy trình đông lạnh sử dụng phương pháp làm lạnh cực nhanh, tế bào
đặt trong chất bảo quản (thường ở nhiệt độ phòng) có nồng độ rất cao trong
khoảng thời gian ngắn nhất có thể, trứng được chứa trong các dụng cụ chứa
chuyên biệt (straw, cryotop, cryoloop) có thể tích nhỏ, sau đó được nhúng trực
tiếp vào nitơ lỏng mà không thông qua quá trình hạ nhiệt từ từ. Sự khử nước
được thực hiện rất nhanh do nồng độ rất cao của chất bảo quản, đồng thời nhiệt
độ thấp của nitơ lỏng (-196OC) sẽ làm tế bào đông đặc nhanh chóng khiến nước
trong tế bào không kịp hình thành tinh thể đá gây tổn thương đến tế bào. [28, 49]

Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong phương pháp thủy tinh
hóa cao gấp 4 – 5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong
phương pháp đông lạnh chậm trước đây. Ưu thế này giúp cho quá trình khử nước
bên trong tế bào xảy ra nhanh và hoàn toàn hơn. Kết quả là không có sự hình
thành tinh thể đá bên trong tế bào, nhờ đó tế bào có thể tránh được những tổn
thương màng và các bào quan do tinh thể đá gây ra. [12, 14, 15, 28]
Tuy nhiên để nâng cao hiệu quả đông lạnh cần lưu ý một số vấn đề sau:
-

Loại và nồng độ chất bảo quản đông lạnh sử dụng. Mỗi loại hóa chất bảo

quản khác nhau sẽ thích hợp với loại tế bào trứng khác nhau và mỗi loại sẽ có
nồng độ bảo quản khác nhau tùy vào quy trình và loại tế bào cần đông lạnh.
-

Nhiệt độ của dung dịch thủy tinh hóa mà tế bào tiếp xúc.

-

Khoảng thời gian mà trứng tiếp xúc với chất bảo quản đông lạnh lần cuối

trước khi nhúng vào nitơ lỏng. Thông thường thời gian tiếp xúc với nồng độ cao
nhất (cuối cùng) không quá 30 giây.
-

Tốc độ làm lạnh càng nhanh càng nâng cao tỷ lệ sống của trứng.

-

Loại dụng cụ dùng trong phương pháp thủy tinh hóa.


-

Chất lượng và trạng thái phát triển của trứng đem đông lạnh.

Footer Page 18 of 50.


9

Header Page 19 of 50.

Tổng quan

Trên thực tế, tốc độ làm lạnh bị giới hạn, một giới hạn sinh học mà tại đó tế
bào có thể chịu được nồng độ chất bảo quản đông lạnh trong suốt quá trình thủy
tinh hóa. Vì thế, việc cân bằng giữa tốc độ làm lạnh cực đại với nồng độ chất bảo
quản tối thiểu là rất quan trọng. [16, 18, 28, 49]
Thành phần chính của môi trường đông lạnh gồm:
-

Chất bảo quản lạnh (Cryoprotectant additive _ CPA)

-

Chất bảo quản ngoại bào

-

Môi trường cơ bản: môi trường đệm phosphate (PBS) hoặc môi trường

nuôi cấy có bổ sung 20% huyết thanh. [52]

1.2.4. Đông lạnh trứng trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa
Trứng trưởng thành ở hầu hết động vật có vú chứa thoi vô sắc bị trì hoãn ở
giai đoạn MII. Thoi vô sắc được tạo thành từ các vi ống liên kết với các nhiễm
sắc thể của mẹ (Aigner và cs., 1992). Lúc này trứng có nhân và tế bào chất
trưởng thành, thể cực thứ nhất bị đẩy ra, nhiễm sắc thể đặc lại và xếp trên mặt
phẳng xích đạo của thoi vô sắc. [19, 28]
Nghiên cứu sử dụng trứng trưởng thành cho thấy khả năng sống của trứng
sau đông lạnh và rã đông bị ảnh hưởng bởi một số nhân tố. Về nhân tố hình thái,
trứng mất cumullus trong suốt quá trình đông lạnh có thể tác động trực tiếp lên
khả năng sống của chúng sau rã đông. Trứng trưởng thành không đồng nhất trong
sự phân bố và tổ chức các bào quan trong bào tương có thể ảnh hưởng đến kết
quả của quy trình đông lạnh. [28]
Trứng ở giai đoạn MII dễ bị tổn thương do đông lạnh vì thoi vô sắc nguyên
phân nơi NST bắt đầu xếp thẳng hàng rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp. Đông lạnh
trứng trong thời gian ngắn có thể gây ra sự phá vỡ không phục hồi thoi vô sắc khi
quá trình khử nước xảy ra nhanh ở nhiệt độ thấp. [46]
Sự sắp xếp các vi sợi thoi vô sắc thích hợp là điều cần thiết để tách và sắp
xếp đúng NST. Vì vậy, trứng đông lạnh càng tăng khả năng bị đa bội thể sau khi
thể cực thứ 2 bị đẩy ra ngoài. Đông lạnh còn gây tổn thương cấu trúc xương tế
bào, thay đổi cấu tạo các bào quan. [46]

Footer Page 19 of 50.


10

Header Page 20 of 50.


Tổng quan

Theo một số nghiên cứu, ở tất cả các loài động vật có vú, các vi ống và thoi
vô sắc ở giai đoạn nguyên phân của trứng không tập trung và không kết hợp khi
trứng tiếp xúc với nhiệt độ gần 0oC trong khoảng vài phút (Parks và Ruffing,
1992). Trứng cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với các chất bảo quản đông lạnh
khác nhau. Johnson và Pickering (1987) cho thấy trường hợp trứng tiếp xúc lâu
với DMSO kết quả là không tập trung thoi vô sắc và NST bị phân tán. Tuy nhiên,
họ lại kết luận là do nhiệt độ, tại nhiệt độ nào đó chất bảo quản đông lạnh không
thể thấm vào tế bào một cách nhanh chóng, vì vậy có rất ít chất bảo quản đông
lạnh trong tế bào. [25, 28, 46]
1.2. KHÁI QUÁT VỀ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu [8], [28]
• Vài nét tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 1954, lần đầu tiên kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro
fertilization_IVF) được nhóm nghiên cứu do Dauzier đứng đầu thực hiện trên
thỏ. Đến năm 1982, kỹ thuật này được Brackett ứng dụng vào chăn nuôi bò sữa.
Từ đó, IVF được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi ở các nước có ngành chăn nuôi
phát triển. [5, 8]
Năm 1997, Shinichi Hochi và cs. nghiên cứu khả năng thụ tinh của trứng bò
đông lạnh rã đông ở các giai đoạn chưa trưởng thành, đang trưởng thành và
trưởng thành. Đến năm 2003, nhóm nghiên cứu này báo cáo tỉ lệ trứng thụ tinh
sau rã đông là 36% và tỷ lệ phát triển lên blastocyst là 5%. [45]
Năm 2007, Gupta và cs. thử nghiệm quy trình thủy tinh hóa bằng cách sử dụng
kết hợp EG và DMSO đối với trứng giai đoạn túi mầm, kết quả được cải thiện. Tuy
nhiên, chỉ 3,4% phát triển đến blastocyst so với lô đối chứng là 20,1%. [23]
Năm 2008, Morato và cs. đã đưa ra tỷ lệ IVF đối với trứng bò sau khi thủy
tinh hoá bằng vi giọt là 46,1% và 5,3% trứng bò phát triển đến giai đoạn
blastocyst. [37]
Năm 2010 nhóm nghiên cứu do Zhou XL và cs. thuộc Trường Đại học

Dublin, Ireland đã tiến hành IVF trên trứng bò trưởng thành được đông lạnh với

Footer Page 20 of 50.


11

Header Page 21 of 50.

Tổng quan

tỷ lệ thụ tinh là 11,3% và 4% phát triển đến giai đoạn blastocyst [51]. Trong khi
đó nhóm nghiên cứu của Trường Đại học Suranaree, Nhật Bản do Sripunya N
báo cáo tỷ lệ phân chia là 41,6% và có 10,3% phát triển đến giai đoạn blastocyst
khi tiến hành IVF từ trứng bò MII được thủy tinh hóa. [38]
• Tình hình nghiên cứu trong nước
Kỹ thuật tạo phôi từ trứng đông lạnh đã được ứng dụng vào Việt Nam từ
vài năm qua. Tuy nhiên chủ yếu áp dụng trên người, đi đầu là bệnh viện Từ Dũ
nhằm giúp hỗ trợ cho các đôi vợ chồng hiếm muộn. Các nghiên cứu và ứng dụng
kỹ thuật đông lạnh trong bảo quản trứng, mô, phôi trên động vật hữu nhũ ở Việt
Nam còn rất ít. [53]
Năm 2003, trường hợp thai lâm sàng đầu tiên từ cả trứng và tinh trùng
người đông lạnh được thực hiện ở bệnh viện Từ Dũ. [53]
Ngày 24/05/2004, trường hợp em bé đầu tiên của Việt Nam ra đời từ trứng
trữ lạnh tại bệnh viện Từ Dũ. Và cho đến nay, bệnh viện Từ Dũ đã trữ lạnh trứng
cho 12 trường hợp; thực hiện rã đông trứng và tạo phôi cho 8 trường hợp.
Việc trữ lạnh phôi người được thực hiện đầu tiên ở bệnh viện Từ Dũ vào
tháng 3/2002. Đến tháng 7/2003, bệnh viện bắt đầu triển khai chương trình trữ
lạnh trứng. Em bé đầu tiên ra đời từ trứng trữ lạnh vào 25/4/2004. [53]
Tuy nhiên, các nghiên cứu, thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm từ trứng bò

đông lạnh mới chỉ có ở lab của ThS. Phan Kim Ngọc (2009) với tỷ lệ thụ tinh là
11,67%, 3,72% phát triển lên phôi nang. [3, 7]
1.2.2. Cơ sở khoa học của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm
1.2.2.1. Khái niệm
Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization_IVF) là quá trình kết hợp
giữa tinh trùng (giao tử đực) với trứng (giao tử cái) để tạo ra hợp tử, được thực
hiện bên ngoài cơ thể mẹ - trong phòng thí nghiệm với môi trường sinh học nhân
tạo có các điều kiện thích hợp: nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt, yếu tố dinh dưỡng, pH,
áp suất thẩm thấu… cùng các chỉ tiêu sinh học khác phải được đảm bảo bình
thường gần giống như trong cơ thể mẹ. [5, 8, 28]

Footer Page 21 of 50.


Header Page 22 of 50.

12

Tổng quan

Quy trình IVF gồm những bước cơ bản: thu nhận và chọn lọc giao tử đực
và cái; thụ tinh; nuôi hợp tử phát triển thành phôi; cấy truyền phôi tươi hoặc phôi
đông lạnh cho con cái nhận phôi. Mỗi bước trong quy trình đều đóng vai trò quan
trọng như nhau nhằm đảm bảo được khả năng hình thành và phát triển phôi tối
đa.
Nguồn trứng sử dụng cho IVF có thể thu từ những động vật sống được kích
hoạt bằng kích dục tố để gây rụng trứng hàng loạt; từ buồng trứng động vật giết
mổ hay sử dụng trứng đông lạnh. Theo Long và cs. (1993), các nang trứng có
đường kính 2-8 mm hiện diện ở vùng vỏ của buồng trứng được sử dụng cho việc
thu nhận các trứng chưa trưởng thành phục vụ cho kĩ thuật IVF. Trong kĩ thuật

IVF, nếu sử dụng các trứng chưa trưởng thành cần có sự hỗ trợ của quá trình nuôi
trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM). Ngoài ra, sử dụng trứng đông
lạnh trong quá trình IVF cũng là một thử thách lớn vì tỉ lệ thụ tinh và phát triển
phôi không cao do những tổn thương khó phục hồi ở màng nội chất và màng thụ
tinh của trứng trong quá trình bảo quản. [8, 28]
Sự xâm nhập thành công của tinh trùng vào các trứng đã được thực hiện
với tinh tươi hoặc tinh đông lạnh qua giải đông. Ở nhiều phòng thí nghiệm, do
khó khăn trong bảo quản lạnh nên tinh tươi vẫn là nguồn tinh trùng chính cho các
nghiên cứu IVF. Tuy nhiên, theo nghiên cứu, trong tinh dịch tươi có một số thành
phần không có lợi cho hoạt động của tinh trùng. Mục đích của các phương pháp
thu nhận tinh trùng theo các nghiên cứu nhằm chọn được các tinh trùng bình
thường có độ di động tốt, loại được các tế bào chết, các vi sinh vật và các chất
độc, hoạt hóa đầu tinh trùng, tạo thuận lợi cho quá trình thụ tinh với trứng. [13]
Hệ thống thụ tinh IVF đòi hỏi nghiêm ngặt về các điều kiện nhiệt độ, độ
ẩm, thời gian thụ tinh, áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy. Hầu hết các
môi trường IVF cần bổ sung những yếu tố có vai trò hoạt hóa tinh trùng, tăng khả
năng hoạt động của chúng. Ngoài ra, cũng bổ sung những yếu tố cần thiết giúp
chúng duy trì khả năng thụ tinh. Bên cạnh đó, môi trường IVF cũng ảnh hưởng
đến tỉ lệ thụ tinh đa tinh trùng. Martinez-Mardrid và cs. (2001) đã sử dụng hai

Footer Page 22 of 50.


13

Header Page 23 of 50.

Tổng quan

môi trường IVF khác nhau gồm môi trường đệm Tris cải tiến (mTBM) và môi

trường Tyrode cải tiến (mTALP) để so sánh. Kết quả này cho thấy, trong
mTALP tinh trùng có tỉ lệ xâm nhập cao hơn (92-94% so với 61-67%). Vì thế,
lựa chọn môi trường IVF thích hợp cũng là một yếu tố quan trọng để giảm tối
thiểu tỷ lệ đa tinh trùng nhưng đạt tỉ lệ thụ tinh cao. [28, 31, 39]
1.2.2.2. Sự phát triển của phôi trong điều kiện in vitro
Trong điều kiện in vitro với môi trường chứa dịch muối cân bằng, các cơ
chất cung cấp năng lượng và protein và điều kiện môi trường 5% CO2 và ở
38,5oC, trứng bò sau khi thụ tinh vẫn có khả năng phát triển bình thường. Sau khi
thụ tinh, hợp tử phân chia bằng cách nguyên phân liên tục sau mỗi 24 giờ, tạo
thành các tế bào phôi. Cũng là quá trình nguyên phân nhưng nguyên phân ở tế
bào phôi khác ở các tế bào sinh dưỡng là sau mỗi lần phân chia kích thước tế bào
phôi gần bằng ½ kích thước tế bào mẹ trước đó. Như vậy, sau mỗi lần phân chia,
số lượng tế bào phôi tăng lên trong khi đó kích thước phôi tổng thể không thay
đổi. Hơn thế nữa, mỗi tế bào phôi sẽ tự thiết lập một chương trình phát triển riêng
để chuẩn bị cho sự biệt hóa thành các dòng tế bào chức năng cho cơ thể. [28, 39]
• Giai đoạn trứng hai tiền nhân: khoảng 16 – 18 giờ sau khi thụ tinh một trong
hai tiền nhân chứa thông tin di truyền từ trứng và phần còn lại chứa thông tin di
truyền từ tinh trùng. Tính phân cực của tiền nhân và sự phân phát của hạch nhân
giữa hai tiền nhân cho thấy chất lượng tiềm tàng của phôi đang trên đà phát triển.
Cuối cùng hai tiền nhân sẽ biến mất, hợp tử bây giờ đang trong giai đoạn chuyển
thành phôi. [21, 23]
• Giai đoạn phôi hai tế bào: Sau 18-20 giờ thụ tinh, hợp tử sẽ bắt đầu chu kỳ
phân chia đầu tiên thành hai tế bào. Sự phân chia được thực hiện trên trục và mặt
phẳng phân chia lấy thể cực thứ hai làm mốc. [33, 35]
• Giai đoạn phôi bốn tế bào và tám tế bào: Chu kỳ phân chia tế bào thứ hai
xảy ra với mặt phẳng phân chia nằm vuông góc tại vị trí xích đạo của trục phân
chia thứ nhất. Kết thúc giai đoạn này, phôi tạo thành 4 tế bào có kích thước tương
đối bằng nhau (42-54 giờ sau khi thụ tinh). Chu kỳ phân bào tiếp tục diễn ra. Vào

Footer Page 23 of 50.



Tổng quan

14

Header Page 24 of 50.

ngày thứ 3 sau khi thụ tinh, người ta có thể quan sát được phôi ở giai đoạn 8 tế
bào. [28, 35]
• Giai đoạn phôi dâu (morula) và phôi nang (blastocyst): Sau ngày thứ 4 các
tế bào phôi bắt đầu mất dần ranh giới giữa chúng. Màng tế bào phôi trở nên khó
phân biệt, lúc này phôi có hình dạng và kích thước rất khác nhau giai đoạn này
gọi là giai đoạn nén (compaction). Ở giai đoạn này, phôi được gọi là phôi dâu.
Giai đoạn tiếp theo là sự hình thành khoang phôi (cavitation) khoảng 100 giờ sau
khi thụ tinh. Khoang phôi tích lũy dịch ngày càng nhiều và lớn dần, kích thước
của khối tế bào bên trong (Inner Mass Cell _ICM) trở nên nhỏ và bắt đầu nén
chặt, lớp tế bào nuôi phôi (Trophectoderm Cell _TE) cũng giảm dần kích thước
sau lần phân chia và dẹp hơn. Phôi ở giai đoạn này gọi là phôi nang khoảng ngày
thứ 6 đến 8 sau thụ tinh. [5, 8, 34, 35]

Giai đoạn 2 tiền nhân

Phôi 2 tế bào

Phôi 4 tế bào

Phôi 8 tế bào

Phôi dâu


Phôi nang

Hình 1.1. Các giai đoạn phát triển của phôi

Footer Page 24 of 50.


15

Header Page 25 of 50.

Tổng quan

1.2.2.3. Các nhân tố ảnh hưởng đến phôi in vitro
Tạo phôi in vitro là một lĩnh vực tiềm năng của công nghệ sinh học sinh sản
trong việc tăng nguồn giống gia súc và là một công cụ quan trọng cho những
nghiên cứu về phôi học. Tuy nhiên, có một số dấu hiệu cho thấy rằng vẫn có
những khác biệt về hình thái và cấu trúc phân tử của phôi giữa việc tạo thành
phôi in vivo và in vitro. Điều này có thể do các nhân tố như chất lượng nang
trứng, trứng, môi trường nuôi phôi, thời gian thụ tinh…
• Kích thước nang trứng
Bình thường, sự trưởng thành của trứng bên trong nang trứng đòi hỏi một
thời gian dài. Trong suốt giai đoạn đó, trứng cần được cung cấp đầy đủ các chất
dinh dưỡng cần thiết để thực hiện quá trình giảm phân tạo thành trứng trưởng
thành cho quá trình thụ tinh và sự phát triển của phôi sau này. Do đó, chất lượng
của trứng liên quan chặt chẽ đến thành phần trong nang trứng. Có nhiều báo cáo
cho thấy có một mối liên hệ giữa kích thước nang trứng và khả năng của trứng.
Một số báo cáo cho thấy rằng những trứng thu từ những nang có đường kính hơn
2-3mm sẽ cho những phôi có tỷ lệ phát triển tốt (Yang và cs., 1998). Ngược lại,

những trứng thu từ những nang có đường kính nhỏ hơn có tỷ lệ phát triển rất
thấp, do những nang trứng chưa tích tụ đầy đủ những chất cần thiết cho trứng trải
qua quá trình giảm phân. [4, 5, 28]
• Thời gian thụ tinh
Cơ hội thụ tinh và sự phát triển sẽ tốt hơn nếu tiến hành thụ tinh cho trứng
khoảng 4 giờ sau khi hình thành thể cực đầu tiên. Ở các động vật như chuột, nếu
thụ tinh muộn, trứng thường có cực đầu to và phôi phát triển không bình thường.
• Mật độ tinh trùng
Trong quá trình thụ tinh trong ống nghiệm, người ta không thể xác định
được chính xác tỷ lệ tinh trùng thực sự được hoạt hóa. Do đó, để đảm bảo cho sự
thụ tinh thành công, tinh trùng thường được sử dụng với một lượng rất lớn.
Trong điều kiện nuôi cấy thông thường, mật độ tinh trùng vào khoảng 105-106 tinh
trùng/ml hoặc 104-105 tinh trùng/trứng. Tuy nhiên, điều này sẽ gây ra tỷ lệ thụ

Footer Page 25 of 50.