Header Page 1 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN MẠNH HÙNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG SINH HỌC VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI HẢI MIÊN TẠI
VÙNG BIỂN ĐÀ NẴNG VIỆT NAM THÔNG QUA NGHIÊN CỨU METAGENOMICS
BẰNG KỸ THUẬT 16S rRNA MISEQ SEQUENCING.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016

Footer Page 1 of 126.


Header Page 2 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN MẠNH HÙNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG SINH HỌC VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI HẢI MIÊN TẠI
VÙNG BIỂN ĐÀ NẴNG VIỆT NAM THÔNG QUA NGHIÊN CỨU METAGENOMICS
BẰNG KỸ THUẬT 16S rRNA MISEQ SEQUENCING.
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGUYỄN THỊ KIM CÚC
TS. PHẠM ĐỨC NGỌC

Hà Nội – Năm 2016

Footer Page 2 of 126.


Header Page 3 of 126.

Lời cam đoan.
Tôi xin cam đoan kết quả thể hiện trong bản luận văn này là công trình nghiên cứu thực
tế. Toàn bộ số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách
quan, chƣa đƣợc công bố công khai bởi một ai khác.

Footer Page 3 of 126.


Header Page 4 of 126.

Lời cảm ơn.
Đề tài này là kết quả của một quá trình học tập và nghiên cứu khoa học của bản thân,
cùng với sự giúp sức của rất nhiều cá nhân và tập thể.
Để có đƣợc thành công này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến
PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Cúc, ngƣời đã giúp tôi rất nhiều bằng chính sự tâm huyết và

đam mê với lĩnh vực nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin đƣợc tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các cán bộ thuộc phòng Công nghệ
sinh học, viện Hoá sinh biển; Viện nghiên cứu khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm
khoa học Việt Nam đã có những hỗ trợ, đóng góp, tƣ vấn rất nhiệt tình giúp tôi hoàn
thiện đề tài.
Tôi thật sự rất biết ơn ngƣời thân, bạn bè và đồng nghiệp đã giành tình cảm, đặt niềm
tin, hỗ trợ, động viên; đồng thời cũng là nguồn động lực to lớn góp phần giúp tôi hoàn
thiện đề tài này. Với sự hỗ trợ về kiến thức; các nguồn dữ liệu bổ sung; các công trình
nghiên cứu khoa học có liên quan ở trong nƣớc và trên thế giới-Tập thể các Thầy cô
thuộc khoa sinh học; Bộ môn Vi sinh vật học và đặc biệt TS Phạm Đức Ngọc đã giúp
tôi làm nên sự thành công của đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 27 tháng 12 năm 2016.

Nguyễn Mạnh Hùng

Footer Page 4 of 126.


Header Page 5 of 126.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 8
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 9
1.1.

Sơ lƣợc về hải miên ............................................................................................ 9

1.2.


Vai trò và tầm quan trọng của vi sinh vật liên kết với hải miên....................... 12

1.3.

Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên........................................... 18

1.4.

Sơ lƣợc về gen 16S rRNA ................................................................................ 23

1.5.

Sơ lƣợc về MiSeq Sequencing.......................................................................... 24

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not
defined.
2.1 VẬT LIỆU ............................................................ Error! Bookmark not defined.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... Error! Bookmark not defined.
2.2.1 Tách DNA ...................................................... Error! Bookmark not defined.
2.2.2 Thiết kế thƣ viện 16S rRNA cho MiSeq ........ Error! Bookmark not defined.
2.2.3 Phân tích thƣ viện 16S rRNA ......................... Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................ Error! Bookmark not defined.
3.1 KẾT QUẢ ............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.1.1. Tách DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miênError! Bookmark
not defined.
3.1.2. Khuếch đại vùng siêu biến V4 của gen 16S rRNA và gắn barcodes .... Error!
Bookmark not defined.
3.1.3. Đa dạng các cộng đồng vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng..... Error!
Bookmark not defined.
3.2 THẢO LUẬN ....................................................... Error! Bookmark not defined.


Footer Page 5 of 126.


Header Page 6 of 126.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................ Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 28
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
Hình 1.1: Hình thái Porifera, (Ruppert et al., 2004).
Hình 1.2: Cấu trúc cơ thể hải miên và các tế bào chức năng
Hình 1.3: Sinh sản hữu tính ở hải miên
Hình 1.4 Đa dạng vi khuẩn liên kết với hải miên (Tabares 2011).
Hình 1.5: Mô mesohyl của (A) Ancorina alata, hải miên có vi khuẩn liên kết phong
phú
Hình 1.6: Gene 16S rRNA có 9 vùng biến đổi nằm xen giữa các vùng bảo thủ.
Hình 3.1: Điện di đồ DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng
trên agarose gel 0,8%. Lane 1: DN 9 ; lane 2: DN10; lane
Hình 3.2: Ảnh điện di PCR khuếch đại vùng V4 gen 16S rRNA của vi sinh vật liên kết
hải miên biển Đà Nẵng. M: Marker DNA 1 kb (GeneRuler™); 1, 2, 3: Sản phẩm PCR
vùng V4 của mẫu DN9, DN10 và DN12, tƣơng ứng.
Hình 3.3: Sản phẩm PCR sau khi gắn barcodes. M: Marker DNA 1 kb (GeneRuler™);
1, 2, 3: Mẫu DN9, DN10 và DN12, tƣơng ứng.
Hình 3.4: Đồ thị biểu hiện tỉ lệ vi khuẩn và cổ khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên
Hình: 3.5: Đồ thị biểu hiện thành phần các ngành vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải
miên DN9; DN10; DN12.
Hình: 3.6: Đồ thị biểu hiện thành phần các lớp vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên
DN9; DN10; DN12.

Footer Page 6 of 126.



Header Page 7 of 126.

Hình: 3.7: Đồ thị biểu hiện thành phần các bộ vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên
DN9; DN10; DN12.
Hình: 3.8: Đồ thị biểu hiện thành phần các họ vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên
DN9; DN10; DN12.
Hình: 3.9: Đồ thị biểu hiện thành phần các chi vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên
DN9; DN10; DN12.
Bảng 1: Phần mềm, các công cụ dựa trên Web và các cơ sở dữ liệu sử dụng để phân
tích metagenome
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA metagenome
Bảng 3.2: Kết quả nhận dạng các mẫu hải miên
Bảng 3.3 Tóm tắt kết quả phân loại vi sinh vật liên kết với hải miên
Bảng 3.4: Kết quả phân loại vi sinh vật liên kết với hải miên ở mức giới
Bảng 3.5: Kết quả phân loại các ngành vi sinh vật liên kết với hải miên
Bảng 3.6 Kết quả phân loại các lớp vi sinh vật liên kết với hải miên
Bảng 3.7 Kết quả phân loại các bộ vi sinh vật liên kết với hải miên
Bảng 3.8 Kết quả phân loại các bộ vi sinh vật liên kết với hải miên
Bảng 3.9: Kết quả phân loại các chi vi sinh vật liên kết với hải miên.

Footer Page 7 of 126.


Header Page 8 of 126.

Footer Page 8 of 126.



Header Page 9 of 126.

MỞ ĐẦU
Hải miên là vật chủ của nhiều vi sinh vật và vai trò của những vi sinh vật này thay đổi
theo nguồn dinh dƣỡng và sự cộng sinh với hải miên. Dựa trên những nghiên cứu cộng
đồng vi sinh vật bằng các phƣơng pháp nhƣ điện di gel gradient biến tính (Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis_DGGE), giải trình tự gen 16S rRNA và lai huỳnh quang
in-situ (Fluorescense In Situ Hybridization_FISH), ngƣời ta nhận thấy ngoài các thành
viên của Archaea còn có tới hơn 25 ngành vi khuẩn liên kết với hải miên. Trong số đó
có

Proteobacteria,

Nitrospira,

Cyanobacteria,

Bacteriodetes,

Actinobacteria,

Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia. Chƣa rõ
về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống nhƣ virus đƣợc phát hiện trong nhân tế
bào của Aplysina (Verongia) cavernicola. Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết với
hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 40% - 50% thể tích hải miên và cộng
đồng này đặc trƣng cho từng hải miên. [40]. Mối liên hệ giữa vi sinh vật với hải miên
gần đây đang đƣợc quan tâm nghiên cứu do: (i) phát hiện nhiều hải miên có liên kết với
cộng đồng vi khuẩn dày đặc và đa dạng, (ii) chúng là một nguồn giàu các chất chuyển
hóa hoạt tính sinh học có ý nghĩa trong lĩnh vực dƣợc phẩm và công nghệ sinh học
[50].

Việc phân lập, nuôi cấy vi sinh vật sinh trƣởng trong điều kiện đặc biệt thƣờng khó
khăn, đặc biệt vi sinh vật liên kết với các dạng sống khác nhƣ hải miên bởi mối tƣơng
tác giữa chúng khá phức tạp. Cũng không thể khai thác hải miên để tách chiết các hoạt
chất vì nguồn nguyên liệu này có hạn, khó phục hồi và gây hủy hoại môi trƣờng.
Đề tài này đƣợc thực hiện với mục đích nghiên cứu sự đa dạng của vi sinh vật liên kết
với hải miên biển trên cơ sở phân tích dữ liệu metagenome của vi sinh vật. Kết quả
nghiên cứu sẽ cung cấp nguồn cơ sở dữ liệu có giá trị cho các nghiên cứu tiếp theo về
mối liên hệ giữa vi sinh vật-hải miên biển.

9

Footer Page 9 of 126.


Header Page 10 of 126.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Sơ lƣợc về hải miên
Hải miên (bọt biển) là động vật ăn lọc, đa bào, cổ xƣa thuộc ngành động vật thân lỗ
(Porifera). Ngành Porifera là một nhóm đa ngành bao gồm ba lớp chính, đƣợc đặc
trƣng bởi cơ cấu gai của chúng: (1) Hexactinellida (glass sponges -bọt biển thủy tinh)
chứa gai silic trong cấu trúc hexactine; (2) Calcarea (calcareous sponges -bọt biển vôi)
chứa gai vôi (calcareous spicules); (3) Demospongiae (demosponges) có khoảng 85%
các loài đƣợc công nhận hiện nay, thƣờng có một bộ khung khoáng chất bao gồm gai
silic (siliceous spicules). Tuy nhiên, một số loài trong Demospongiae không chứa bộ
khung [21]. Hải miên có cấu trúc cơ thể đơn giản nhất trong tất cả các loài động vật đa
bào: thiếu cơ quan và mô thực; không có cơ, hệ thần kinh, hệ tiêu hóa, hệ tuần hoàn, cơ
quan bên trong, và khả năng vận động. Các tế bào của hải miên sắp xếp có thứ tự gồm
nhiều lớp tế bào chuyên biệt (Hình 1.2) phù hợp với lối sống ăn lọc. Hầu hết hải miên
có bộ khung cứng đƣợc hình thành từ canxi cacbonat và các gai silic dioxide. Các sợi

Collagen và spongin có tác dụng hỗ trợ thêm sự cứng chắc và đàn hồi cho bộ khung
[21]. Ngoài các loại tế bào xốp khác nhau, mật độ cao của các vi sinh vật cũng đƣợc
tìm thấy trong các mesohyl của một số loài hải miên. Độ sâu phổ biến tìm thấy hải
miên từ 5-10m.
Động vật thân lỗ, trong đó có hải miên thƣờng ăn bằng cách hút nƣớc qua các lỗ chân
lông. Một dòng chảy đƣợc duy trì liên tục qua cơ thể để lấy thức ăn, ôxy cũng nhƣ loại
bỏ chất thải. Khi nƣớc đã đƣợc lọc qua các khoang choanocyte, nó bị thải ra khỏi cơ
thể qua các osculum, về cơ bản là vô trùng [43, 44]. Hầu hết hải miên có thể bơm một
lƣợng nƣớc tƣơng đƣơng với khối lƣợng cơ thể của nó mỗi 5 giây [47], điều này có thể
bằng vài ngàn lít mỗi ngày [55]. Mối liên hệ giữa vi sinh vật với hải miên gần đây đang
đƣợc quan tâm nghiên cứu do: (i) phát hiện nhiều hải miên có liên kết với cộng đồng vi

10

Footer Page 10 of 126.


Header Page 11 of 126.

khuẩn dày đặc và đa dạng, (ii) chúng là một nguồn giàu các chất chuyển hóa hoạt tính
sinh học có ý nghĩa trong lĩnh vực dƣợc phẩm và công nghệ sinh học [50].
*) Cấu trúc chung của một cơ thể hải miên:
Porifera có 3 dạng hình thái cơ thể từ đơn giản (asconoid và syconoid) đến phức tạp
(leuconoid) đƣợc hình thành bằng cách thay đổi mức độ gấp của màng cơ thể bên
trong và sự thay đổi phức tạp của hệ thống kênh [9].

Hình 1.1: Hình thái Porifera, (Ruppert et al., 2004).
Pinacoderm: Bề mặt bên ngoài, đƣợc hình thành bởi các tế bào biểu mô đƣợc gọi là
pinacocytes. Ở lớp ngoài này nƣớc sẽ đƣợc rút ra qua các lỗ (Ostia).
Mesohyl:Một matrix ngoại

bào giữa pinacoderm và
choanoderm có vai trò nhƣ
một hệ khung dàn, chiếm
phần lớn cơ thể hải miên.
Các hạt thức ăn đƣợc
chuyển từ choanocytes tới

Hình 1.2: Cấu trúc cơ thể hải miên và các tế bào chức năng

archaeocytes di động (hoặc amoebocytes) để thực bào. Amoebocyte là nhóm các tế
bào toàn năng (totipotent), thực hiện việc phân phối dinh dƣỡng từ Choanocytes tới
các tế bào khác; giúp các tế bào trứng (Oocyte) phát triển, chuyển tinh trùng từ
choanocytes tới các tế bào trứng; có khả năng biệt hóa thành các loại tế bào có chức
năng khác nhau. Ví dụ nhƣ collencytes, sản xuất ra các sợi collagen, sclerocytes hình
thành spicule và spongocytes sản xuất spongin.
11

Footer Page 11 of 126.


Header Page 12 of 126.

Choanoderm: Một lớp tế bào bên trong hình thành bởi các tế bào hình roi
(choanocytes) cho phép nƣớc đi qua hệ thống aquiferous. Hệ thống này đƣợc hình
thành bởi một loạt các kênh, dẫn đến một kênh chính (atrium). Nƣớc ra khỏi cơ thể
hải miên thông qua một lỗ thoát cuối cùng (osculum). Vi sinh vật và thức ăn đƣợc lọc
ra khỏi nƣớc tuần hoàn (circulating water) bởi choanocytes.
Với tổ chức đơn giản nhƣng hải miên là động vật đa bào thực. Ngoài cấu trúc cố định
của cơ thể, hải miên còn thể hiện khả năng biến đổi hình thái tuyệt vời. Cơ thể chúng
xuất hiện nhiều màu sắc do sự hiện diện của các tế bào sắc tố xốp và/hoặc từ vi khuẩn

lam cộng sinh và vi tảo. Hải miên đa dạng về hình thái, từ dạng các lớp đóng cặn chỉ
vài mm chiều cao tới các dạng khổng lồ, ví dụ: Xestospongia muta có đƣờng kính và
chiều cao hơn một mét [35].
*) Sinh sản ở hải miên
Hải miên có 2 hình thức sinh sản bao gồm vô tính và hữu tính.
Sinh sản vô tính: Xuất hiện các chồi mọc ra từ cơ thể trƣởng thành. Các chồi trải qua
quá trình phát triển, tăng lên về kích thƣớc cuối cùng tách khỏi cơ thể ban đầu và phát
triển thành cơ thể mới. Ở hình thức sinh sản hữu tính, hải miên không có sự chia tách
cụ thể về giới tính. Cả hai loại tế bào trứng và tinh trùng đều có nguồn gốc từ một cơ
thể hải miên. Các tế bào tinh trùng đƣợc phóng thích vào môi trƣờng nƣớc, sau đó sẽ
thụ tinh với tế bào trứng ở cơ thể hải miên
khác. Ấu trùng hình thành sẽ phát triển và
tách khỏi cơ thể mẹ nhờ sự tác động của
nƣớc. Đây là giai đoạn duy nhất cho sự vận
động của hải miên. Ấu trùng sau đó sẽ bám
vào bề mặt cứng và phát triển thành cơ thể
trƣởng thành. Trong suốt giai đoạn đó hải
miên không có sự di chuyển.

Hình 1.3: Sinh sản hữu tính ở hải miên
12

Footer Page 12 of 126.


Header Page 13 of 126.

1.2.

Vai trò và tầm quan trọng của vi sinh vật liên kết với hải miên.


Môi trƣờng biển đƣợc chứng minh là nguồn đa dạng sinh học và hóa học giàu có. Đƣợc
biết có tới 109 taxa vi khuẩn trên trái đất, trong đó 106 taxa là từ đại dƣơng. Sự phân bố
của vi sinh vật biển là 105 tế bào/ml và dự báo các đại dƣơng chứa 3.6x1029 tế bào vi
sinh vật, với phần lớn sinh khối là từ vi khuẩn, archaea, protist và nấm đơn bào. Trong
nƣớc biển vi khuẩn chiếm ƣu thế thuộc về một số loài: Pseudomonas sp., Vibrio sp.,
Achromobacter sp., Flavobacterium sp., và Micrococcus sp.
Cộng đồng vi sinh vật biển vô cùng đa dạng, phong phú và phức tạp. Vì biển là môi
trƣờng cực đoan, nơi có sự đa dạng về các điều kiện sinh thái dẫn đến có rất nhiều cộng
đồng vi sinh vật đặc trƣng cho từng điều kiện sống khác nhau, nhƣ vi sinh vật ƣa nhiệt,
ƣa acid, ƣa kiềm, … Vi sinh vật biển là các nhà sản xuất sinh khối đầu tiên trong đại
dƣơng, thu nhận ánh sáng và cố định cacbon, và là những tác nhân chuyển hoá dinh
dƣỡng đầu tiên. Vi sinh vật biển cũng đƣợc biết tham gia vào chu trình toàn cầu của
các nguyên tố sinh học nhƣ nitơ, cacbon, oxy, photpho, sắt, lƣu huỳnh và các yếu tố vi
lƣợng. Do tính linh hoạt của các khả năng sinh hóa và sinh khối to lớn của chúng trong
hệ sinh thái biển, chúng đƣợc tin rằng là các thành phần chính chịu trách nhiệm cho
việc duy trì các chu trình này, giúp ổn định các hệ sinh thái.
Hải miên là động vật có đời sống ở biển, là vật chủ của nhiều vi sinh vật khác nhau. Vì
vậy cộng đồng vi sinh vật có liên kết với hải miên cũng nhƣ cộng đồng vi sinh vật tồn
tại ở những vật chủ khác đều là những thành phần tạo nên sự đa dạng, phong phú, phức
tạp về hệ sinh thái vi sinh vật biển nói chung. Đến nay, nhiều công trình khoa học trong
nƣớc và trên thế giới đã có những công bố về số lƣợng thành phần các vi sinh vật liên
kết với hải miên lên tới hơn 25 ngành vi khuẩn khác nhau.
Ngƣời ta cũng phát hiện ra nhiều điều thú vị khi nghiên cứu về mối quan hệ giữa vi
khuẩn với hải miên. Nhiều dẫn chứng đã đƣợc đƣa ra đều khẳng định vai trò to lớn và
vô cùng quan trọng mà những dạng sống có kích thƣớc vô cùng nhỏ bé này mang lại
13

Footer Page 13 of 126.



Header Page 14 of 126.

nhiều lợi ích cho chính vật chủ của nó cũng nhƣ cho con ngƣời. Qua đó giúp chúng ta
hiểu rõ hơn về quá trình tiến hoá, quá trình trao đổi chất, các chu trình chuyển hoá vật
chất, đa dạng sinh học và cân bằng sinh thái[4]; [16]; [38]. Ở từng đối tƣợng cụ thể, hệ
vi sinh vật có những vị trí và vai trò khác nhau.
1.2.1. Đối với hải miên:
Chức năng cộng sinh của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dƣỡng, ổn định
khung hải miên, xử lý chất thải trao đổi chất, sản sinh các chất trao đổi thứ cấp, quang
hợp, oxy hoá metan, nitorat hoá, cố định nitơ, khử sulphat và khử halogen
(dehalogenation).
Một số nghiên cứu đã tìm thấy sự xuất hiện của chu trình lƣu huỳnh ở hai loài hải miên
nƣớc lạnh Geodia barrette và Aplysina aerophoba. Chu trình này đƣợc thực hiện trong
điều kiện vắng mặt oxy, lúc quá trình bơm đẩy không hoạt động ở hải miên. Ở hải
miên Geodia barrette, ngƣời ta ƣớc tính đƣợc tỉ lệ khử sulphur là rất cao lên tới
1200nmol/cm3 hải miên/ngày [22]. Các gen mã hoá cho enzyme APS (aprA)-một
enzyme quan trọng trong việc khử sulphate và oxy hoá sulphur đƣợc tìm thấy ở hải
miên nƣớc sâu Polymastia corticata thuộc biển Caribe [36]. Cả hai loại vi khuẩn oxy
hoá sulphur và khử sulphate đều đƣợc phát hiện ở nhiều loài hải miên [50]. Vi khuẩn
khử sulphate thuộc các chi Desulfoarculus, Desulfomonile. Chi Syntrophus đƣợc tìm
thấy ở hải miên nƣớc lạnh Geodia barretti [22].
Quá trình oxy hoá metan cũng đƣợc tìm thấy ở nhiều loài hải miên đƣợc khảo sát.
Chẳng hạn, loài hải miên ăn thịt sống ở vùng nƣớc sâu Cladorhiza methanophila đƣợc
phát hiện có liên quan đến hai nhóm vi khuẩn, trong số đó có ít nhất một loại là vi
khuẩn methane (methanotrophic) [52, 53]. Dehalogenation (khử halogen) cũng đƣợc
chứng minh có xuất hiện ở hải miên có cộng sinh với vi sinh vật. Một số hải miên đƣợc
biết là nguồn tự nhiên cung cấp các hợp chất brome nhƣ bromophenols và
14


Footer Page 14 of 126.


Header Page 15 of 126.

bromoindoles. Ở hải miên Aplysina aerophoba khử halogen có thể đƣợc thực hiện qua
trung gian là vi khuẩn [2].
Với lối sống dị dƣỡng, quá trình chuyển hoá cacbon ở hải miên có thể diễn ra bằng
cách tiêu thụ trực tiếp vi khuẩn từ nƣớc biển hoặc sử dụng nguồn cacbon hữu cơ đƣợc
hấp thu từ vi khuẩn cộng sinh với hải miên [62]. Trong môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng,
hải miên vẫn có thể phát triển do cộng sinh với vi khuẩn quang hợp, đặc biệt là vi
khuẩn lam Synechococcus spongiarum [14]. Ở khu vực có sự xuất hiện của những rạn
san hô, nơi mà dinh dƣỡng hoà tan và các vật chất hữu cơ khan hiếm, hải miên sẽ phải
đối mặt với môi trƣờng sống thiếu nitơ. Trong trƣờng hợp này, nhóm vi khuẩn tự
dƣỡng (cyanobacteria) và dị dƣỡng cộng sinh với hải miên [60] sẽ là nguồn bổ sung
nitơ cho hải miên thông qua quá trình cố định nitơ từ khí quyển [37]. Bằng chứng đầu
tiên để kiểm định điều này là việc phát hiện ra hoạt tính của enzyme nitrogenase có
trong hải miên đƣợc khảo sát ở Biển đỏ [60]. Bằng chứng tiếp theo đƣợc phát hiện
trong những năm gần đây thông qua việc sử dụng kỹ thuật đo tỉ lệ đồng vị nitơ [59] và
việc giải trình tự gen mã hoá cho enzyme nitrogenase ở vi khuẩn [37] đã cho thấy có sự
xuất hiện quá trình nitrat hoá ở hải miên. Ngƣời ta cũng tìm thấy chi vi khuẩn
Nitrosospira và Nitrosococcus oxy hoá ammonia thành nitrite ở hải miên [38]. Cổ
khuẩn oxy hoá ammonia lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở hải miên Axinella mexicana
thuộc vùng biển California. Vi khuẩn oxy hoá nitrite thành nitrate là Nitrospina và
Nitrospira cũng đƣợc tìm thấy trong nhiều loài hải miên.
Vi sinh vật liên kết với hải miên biển có vai trò chủ yếu trong việc bảo vệ vật chủ
chống lại các loài ăn thịt do chúng sản sinh ra các chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính
sinh học. Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn quang hợp cố định cacbon cung cấp đến gần
50% nhu cầu cacbon cho hải miên. Ngoài ra, có quan hệ cộng sinh với vi khuẩn quang
hợp giúp hải miên nhận đƣợc một số sản phẩm từ quá trình quang hợp nhƣ glycerol.

Ngƣợc lại, vi khuẩn sẽ đƣợc cung cấp giá thể và cơ chất từ hải miên mà nó có quan hệ
15

Footer Page 15 of 126.


Header Page 16 of 126.

cộng sinh [6]. Một số vi sinh vật đƣợc cho là sinh các chất trao đổi thứ cấp có khả
năng bảo vệ vật chủ. Các chức năng khác nhƣ loại bỏ các sản phẩm phụ của quá trình
trao đổi chất có hại. Đổi lại hải miên làm cho vi sinh vật có thể nhận đƣợc ánh sáng
mặt trời, chỗ ẩn náu khỏi các loài săn mồi, cơ chất để bám và cung cấp dinh dƣỡng
[58].
1.2.2. Các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật liên kết hải miên
Vi sinh vật liên kết với hải miên và một số vật chủ biển khác có cả nội bào và ngoại
bào. Hiện nay, cộng đồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chƣa đƣợc hiểu
rõ. Ngƣời ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên kết
với nó sinh ra. Ví dụ diketopiperazines của Tedania ignis đƣợc qui cho là sản phẩm
trao đổi chất của Micrococcus sp. liên kết với hải miên. Kháng sinh polybrominated
biphenyl ether tách từ hải miên Dysidea herbacea (Demospongiae) thực tế do
cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra. Vi khuẩn Salinispora
phân lập từ hải miên P. clavata đƣợc nhận dạng là nguồn kháng sinh rifamycin.
Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng vi sinh vật liên kết với hải miên sản sinh các chất
có hoạt tính sinh học thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, ức chế
miễn dịch…và cũng có hoạt tính chữa bệnh tim, hô hấp và tiêu hóa (Grasa et al., 2013).
- Các chất có hoạt tính kháng khuẩn.
Polyketide synthases (PKS) và Non ribosomal peptide synthases (NRPS) tham gia sản
xuất rất nhiều các sản phẩm tự nhiên. NRPS liên quan đến tạo ra một số thuốc chống
khối u, ức chế miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, và hàng trăm các sản
phẩm tự nhiên, gồm các hợp chất giảm cholesterol lovastatin là từ PKS (Brakhage,

2013). Yung và cs (2010) đã sử dụng Metagenomics chức năng để sàng lọc các protein
kháng khuẩn mới từ vi sinh vật liên kết với hải miên Cymbastela concentrica và đã
chọn đƣợc 2 dòng là CcAb1 và CcAb2 có hoạt tính kháng Staphyloccus aureus và
Alteromonas sp., cả hai dòng đều thuộc lớp Gammaprotebacteria. Các tác giả cũng
16

Footer Page 16 of 126.


Header Page 17 of 126.

nhận diện đƣợc các enzyme thủy phân mới từ cộng đồng vi sinh vật liên kết với hải
miên và phần lớn chúng thuộc lớp Alphaproteobacteria và Gammaproteobacteria.
Phần lớn các chất kháng khuẩn đƣợc nhận dạng bởi chọn lọc metagenomic là những
phân tử nhỏ, chẳng hạn nhƣ palmitoylputrescine, violacein, turbomycin A và B,
indirubin và indigo. Những nghiên cứu trƣớc đây cũng tìm thấy các enzyme lipolytic
mới bằng sàng lọc thƣ viện gen metagenomic của vi sinh vật liên kết hải miên Aplysina
aerophoba và Hyrtios erecta (Karpushova et al., 2005; Okamura at al. 2010). Lipases
tác động lên lipids giải phóng acid béo có độ dài khác nhau, chúng đƣợc biết có phổ
đối kháng vi sinh vật rộng. Phƣơng thức hoạt động của chúng đƣợc cho là liên quan
đến các đặc tính tẩy (detergent) của các acid này, cho phép chúng tạo các lỗ nhỏ hoặc ở
nồng độ cao làm cho tế bào bị tiêu bởi màng tế bào bị phân hủy (Desbois et al. 2010).
Sử dụng phƣơng pháp chọn lọc chức năng từ thƣ viện metagenomic hải miên biển Nhật
Bản Discodermia calyx đã phân lập đƣợc cyclodipeptides có hoạt tính kháng khuẩn
(He et al., 2013).
- Các chất có hoạt tính ức chế protease
Protease là enzyme có các chức năng cần thiết trong rất nhiều con đƣờng truyền tín
hiệu, sự phát triển của một số loại ung thƣ cũng nhƣ các bệnh truyền nhiễm. Khoảng
32 chất ức chế protease hiện đang sử dụng trong lâm sàng, phần lớn cho đến nay là
tổng hợp hóa học và đƣợc thiết kế dựa trên cấu trúc. Miraziridine A, chất ức chế

cathepsins B và L đƣợc phân lập từ hải miên biển Theonella mirabilis. Các chất ức chế
enzyme đƣợc chú ý nhƣ một công cụ hữu hiệu, không những để nghiên cứu cấu trúc
enzyme và cơ chế tác động mà còn có tiềm năng sử dụng trong dƣợc học và nông
nghiệp. Các chất ức chế protease là công cụ mạnh để bất hoạt các proteases đích trong
quá trình gây các bệnh ở ngƣời nhƣ khí thũng (emphysema), viêm khớp (arthritis),
nghẽn mạch (throbosis), huyết áp cao, loạn dƣỡng cơ, ung thƣ và AIDS (Wahyudi et
al., 2010). Abdelmohsen và cs (2012) đã tách đƣợc Diazepinomicin từ chủng
Micromonospora sp. RV115 liên kết với hải miên Aplysina aerophoba (Croatia) có
17

Footer Page 17 of 126.


Header Page 18 of 126.

hoạt tính không những kháng khối u phổ rộng, mà còn có khả năng chống ôxy hóa và
ức chế protease. Ba chủng vi khuẩn SAB S-2; SAB 17; SAB S-21 đƣợc phân lập từ hải
miên Jaspis sp. có hoạt tính ức chế serine protease (subtilisin), metalloprotease
(thermolysin) và dịch chiết thô của vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus (tụ cầu
khuẩn) và Pseudomonas aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh). Chủng SAB S-2 tƣơng
đồng với Providencia dựa trên trình tự gen 16S rRNA; chủng SAB 17 – Pracoccus và
SAB S-21- Bacillus sp. Một sản phẩm tự nhiên khác có hoạt tính ức chế protease là các
dẫn xuất của tetromycins 1-4 đƣợc tách từ xạ khuẩn Streptomyces axinellae Po1001T
liên kết với hải miên Axinella polypoides ở biển Mediterranean. Các sản phẩm tự nhiên
này có hoạt tính ức chế một vài cystein proteases [36].
- Các chất có hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư.
Dịch chiết ethyl acetate của nấm Eurotium cristatum phân lập từ hải miên Mycale sp.
đã đƣợc nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học. Kết quả nhận đƣợc cho thấy dịch
chiết thô có hoạt tính ức chế sinh trƣởng của 3 dòng tế bào ung thƣ: ung thƣ vú, ung
thƣ phổi và ung thƣ da-tế bào hắc tố (melanoma) (Almeida et al., 2010). Có thể tìm

thấy trong hải miên Discodermia dissoluta và Theonella swinhoei các hợp chất chống
ung thƣ discodermolide, onnamide và theopederin. Ngoài ra, vi khuẩn Salinispora
phân lập từ hải miên Pseudoceratina clavata đƣợc nhận dạng là nguồn kháng sinh
rifamycin, đƣợc sản xuất bởi hệ PKS. Kháng sinh polybrominated biphenyl tách từ hải
miên Dysidea herbacea thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng
sinh tạo ra. Lên men chủng nấm lớp Hyphomycetes đƣợc phân lập từ hải miên Jaspis
affjohnstoni thu đƣợc tricyclic sesquiterpenes coriolin B, dihydrocoriolin C cũng nhƣ
chloriolines A-C mới. Coriolin B có hoạt tính ức chế ung thƣ vú mạnh và dòng tế bào
CNS, với IC50 0.7 µg (vú) và 0.5 µg (neuroblastoma) (Thomas et al., 2010). Một taxa
thú vị khác liên kết với hải miên có tầm quan trọng dƣợc học là Cyanobacteria nhƣ:

18

Footer Page 18 of 126.


Header Page 19 of 126.

Lyngbya, Oscillatoria, Symploca, Calothrix, Leptolyngbya, Dichothrix, Geitlerinema,
Schizothrix, Aphanothece, Blennothrix, và Synechocystis (Tabares, 2011).
1.3.

Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên

Bằng công nghệ sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy, kính hiển vi và kỹ thuật
nuôi cấy vi sinh vật, ngƣời ta đã phát hiện có sự liên kết của các loài thuộc ba giới là
Bacteria, Archaea và Eukarya với hải miên (Taylor et al., 2007). Các quần thể vi sinh
vật khác sống trong hải miên còn có vi nấm và vi tảo. Sự đa dạng này có thể giải thích
một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hƣởng
đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa. Vi sinh vật liên kết với hải miên có cả nội bào và

ngoại bào [7] [8]. Cộng đồng vi sinh vật này đặc hiệu cho hải miên.
Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phƣơng pháp nhƣ điện di
gel gradient biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis_DGGE), giải trình tự
gen 16S rRNA và lai huỳnh quang in-situ (Fluorescense In Situ Hybridization_FISH),
ngƣời ta nhận thấy ngoài các thành viên của Archaea còn có tới hơn 25 ngành vi khuẩn
liên kết với hải miên. Trong số đó có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria,
Bacteriodetes,

Actinobacteria,

Chloroflexi,

Planctomycetes,

Acidobacteria,

Poribacteria và Verrucomicrobia. Chƣa rõ về virus trong hải miên, mặc dù các hạt
giống nhƣ virus đƣợc phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola.
Ở Việt Nam, chỉ có một số nghiên cứu về thành phần hải miên ở vịnh Hạ Long, Nha
Trang cho thấy thành phần loài của chúng rất đa dạng [1], [2].
Có hai con đƣờng để hải miên tạo nên vi khuẩn liên kết, một là hấp thu vi khuẩn đặc
hiệu từ nƣớc xung quanh khi nƣớc đi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là
truyền thẳng vi khuẩn thông qua giao tử (gametes) của hải miên bằng cách đƣa cả vi
khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae) (Wang et al., 2006; Li et al.,
2007).

19

Footer Page 19 of 126.



Header Page 20 of 126.

Hình 1.4: Đa dạng vi khuẩn liên kết với hải miên (Tabares 2011).
Sự phân bố tổng thể của vi khuẩn ở hải miên dƣờng nhƣ đi theo một mẫu chung. Ở các
lớp bên ngoài tiếp xúc với ánh sáng thƣờng đƣợc liên kết với các sinh vật quang hợp,
vi khuẩn lam và tảo nhân chuẩn (Wilkinson, 1992). Các mesohyl chứa phần lớn các vi
sinh vật, cả dị dƣỡng và tự dƣỡng, thƣờng liên kết ở ngoại bào (Hentschel et al., 2006).
Trong một số trƣờng hợp xuất hiện các vi sinh vật có ở trong tế bào thậm chí ngay
trong nhân tế bào của một số hải miên (Vacelet và Gallissian, 1978; Friedrich et al.,
1999).
Một số hải miên, đặc biệt là demosponges đƣợc liên kết dày đặc bởi nhiều tế bào vi
khuẩn (từ 108 – 1010 tế bào vi khuẩn trên 1g trọng lƣợng hải miên tƣơi) đƣợc gọi là hải
miên có đa dạng vi khuẩn cao („high-microbial-abundance‟ (HMA) sponges) (Hình
1.5a) (Hentschel et al., 2006). Ngƣợc lại các loài hải miên liên kết với vi sinh vật ở mật
độ thấp hơn (105 – 106 tế bào vi khuẩn trên 1g trọng lƣợng hải miên tƣơi) (Hentschel et
al., 2006) đƣợc gọi là hải miên có đa dạng vi khuẩn thấp („low-microbial abundance
(LMA) sponges‟) (Hình 1.5b). HMA và LMA có thể cùng tồn tại trong môi trƣờng

20

Footer Page 20 of 126.


Header Page 21 of 126.

sống giống nhau nhƣng lý do cho những khác biệt trong sự phong phú của vi sinh vật
vẫn chƣa đƣợc biết đến.

Hình 1.5: Mô mesohyl của (A) Ancorina alata, hải miên có đa dạng vi khuẩn liên

kết cao (HMA); (B) Polymastia sp, có đa dạng vi khuẩn liên kết thấp (LMA). Mũi
tên chỉ ra các tế bào vi khuẩn Polymastia sp. (S. Schmitt; Kamke et al., 2010).
Tài nguyên biển vô cùng đa dạng và ẩn chứa nhiều tiềm năng có ích cho đời sống con
ngƣời. Vì vậy việc nghiên cứu về mối liên hệ giữa vi sinh vật với hải miên đã và đang
tiếp tục đƣợc thực hiện bởi các nhà khoa học cả ở trong nƣớc và trên thế giới.
*) Trên thế giới
Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy, rất nhiều nghiên cứu đã
khảo sát tính đa dạng của vi sinh vật cộng sinh với hải miên ở các hệ sinh thái biển
khác nhau và một số tác giả thấy rằng vi khuẩn liên kết với hải miên bền vững theo
không gian và thời gian. Nhƣng kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác lại không
thống nhất với giả thuyết này. Chẳng hạn, Cymbastela concentric có cộng đồng vi sinh
vật ít thay đổi giữa các khoảng cách địa lý nhỏ, cộng đồng vi sinh vật ở vùng ôn đới
khác với cộng đồng vi sinh vật trong Cymbastela concentric thuộc vùng nhiệt đới của
Australia (Hill et al., 2006; Ouyang et al., 2009).
Những nghiên cứu phát sinh loài đã nhận diện đƣợc 26 ngành vi khuẩn khác nhau liên
kết hải miên biển, trong đó ngành Poribacteria hầu nhƣ chỉ tìm thấy trong hải miên
[15], điều này cho thấy thành phần vi sinh vật liên kết hải miên biển rất phức tạp. Theo
21

Footer Page 21 of 126.


Header Page 22 of 126.

Schmitt et al. (2012) [15], các loài hải miên khác nhau chứa quần thể vi khuẩn gồm các
loài khác nhau (quần thể đặc trƣng loài) và có quần thể nòng cốt. Nhƣng các loài vi
khuẩn trong các loài hải miên khác nhau vẫn có mối quan hệ gần hơn so với các loài vi
khuẩn ở môi trƣờng nƣớc xung quanh. Li et al. (2006) [8] đã sử dụng phƣơng pháp
đánh dấu diện di gel gradien biến tính gen 16S rDNA (16S rDNA-DGGE
fingerprinting) không qua nuôi cấy, phân tích phát sinh loài và sự đa dạng của cộng

đồng vi sinh vật liên kết với 4 loài hải miên Stelletta tenui, Halichrondria, Dysidea
avara và Craniella australiensis ở biển nam Trung Quốc. Kết quả cho thấy,
Proteobacteria (α, β và γ) là những vi khuẩn chiếm ƣu thế và có lẽ có quan hệ cộng
sinh mật thiết với hải miên. Hải miên Craniella australiensis có sự đa dạng vi sinh vật
lớn nhất, với 4 ngành vi khuẩn là Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes và
Actinobacteria; tiếp

đến là

Dysidea avara với 2 ngành Proteobacteria và

Bacteroidetes; và hải miên Stelletta tenui, Halichrondria với ngành Proteobacteria.
Lee et al. (2009) [7] đã sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy và không nuôi cấy để đánh giá
liệu hải miên cùng loài hoặc cùng chi quanh đảo San Juan (Washington) có các quần
thể vi sinh vật đặc hiệu hay không. Kết quả cho thấy, quần thể vi sinh vật liên kết
Myxilla incrustans

và

Haliclona rufescens rất giống nhau, trong khi với loài

Halichondria panacea lại rất khác [7].
Thú vị là thành viên của Poribacteria - ứng viên đặc hiệu ở hải miên có rất ít trong
nƣớc biển dẫn đến giả định Poribacteria là thành viên hiếm hoi trong sinh quyển biển
có thể là những mầm giống cho vi khuẩn liên kết hải miên biển. Những ngành (phyla)
vi khuẩn liên kết hải miên hay gặp là Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi,
Nitrospira và Proteobacteria.
Nghiên cứu trình tự khu hệ vi sinh vật liên kết hải miên đƣợc công bố vào năm 2011
[Lee et al, 2011]. Phân tích 3 hải miên từ Red sea, nghiên cứu đã tăng các ngành vi
khuẩn phát hiện trong hải miên biển lên 30. Nhƣng thú vị hơn là cặp mồi sử dụng nhắm


22

Footer Page 22 of 126.


Header Page 23 of 126.

tới cả gen 16S rRNA của vi khuẩn và cổ khuẩn. Mẫu hải miên Raspailia ramose của
Ireland có khu hệ vi sinh vật rất phong phú, trong khi đó hải miên Stelligera stuposa tại
cùng điểm lấy mẫu có sự đa dạng ít hơn [Jackson et al., 2012]. Khu hệ vi sinh vật của
hải miên có tính đặc hiệu theo vùng và loài, nhƣng nghiên cứu của Schmitt và cs
(2012) cho thấy có sự liên kết vi sinh vật – hải miên đặc hiệu cho vùng nhiệt đới, vì các
mẫu hải miên ở các điểm rất xa nhau về địa lý có sự tƣơng đồng lớn về khu hệ vi sinh
vật liên kết với chúng. White và cs (2012) nghiên cứu sự thay đổi khu hệ vi sinh vật
liên kết hải miên theo mùa nhƣng thấy rằng hầu nhƣ chúng không thay đổi. Phƣơng
thức chính để giữ mối quan hệ cộng sinh giữa vật chủ không xƣơng sống và vi sinh vật
hoặc là truyền ngang hoặc dọc hoặc cả hai. Ở hải miên biển đƣợc cho là tồn tại cả 2
cách này.
*) Một số nghiên cứu trong nước
Những năm gần đây, Việt Nam đã xúc tiến một số chƣơng trình nghiên cứu và giám sát
đa dạng sinh học biển, đặc biệt là sự hợp tác lâu năm với Viện hàn lâm Khoa học Nga
và các chuyến đi biển dài ngày của tàu Oparin nhằm thu thập mẫu vật tại các vùng biển
của Việt Nam. Các nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ động vật
biển nhƣ hải miên, san hô mềm… cũng đƣợc tiến hành tại một số cơ sở nghiên cứu. Từ
hải miên Spongia sp. của Việt Nam đã tách chiết đƣợc sesquiterpene quinines với hoạt
tính chống oxy hoá (Utkina & Deniseko 2011), C29-Sterols từ hải miên Ianthella sp.
có đặc tính chống ung thƣ (Nguyen Huu Tung et al. 2009). Từ hải miên biển Việt Nam
Xestospongia testudinaria đã phân lập đƣợc 3 C29 sterol mới, xác định cấu trúc và khả
năng ức chế sự bám dính của Pseudoalteromonas spp. và Polaribacter sp. (Xuan

Cuong Nguyen et al., 2013). Viện Hoá sinh biển có hợp tác với KORDI Hàn Quốc:
“Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ các đối tƣợng san hô
mềm và hải miên thu thập tại Hạ Long, Quảng Ninh”. Nghiên cứu thành phần hoá học

23

Footer Page 23 of 126.


Header Page 24 of 126.

một số loài hải miên và vi sinh vật cộng sinh thuộc biển Việt Nam với đối tác Pháp và
Bảo tàng lịch sử thiên nhiên quốc gia Pháp.
Các nghiên cứu về hải miên tại Việt Nam còn hạn chế và chƣa có nghiên cứu nào về hệ
vi sinh vật liên đới với hải miên cũng nhƣ phát hiện các chất có hoạt tính sinh học từ hệ
vi sinh vật này, đặc biệt là việc sử dụng kỹ thuật metagenomics để phát hiện và sàng
lọc các gen có hoạt tính sinh học từ nguồn môi trƣờng tiềm năng này.
1.4.

Sơ lƣợc về gen 16S rRNA

Là đoạn trình tự tƣơng đối ngắn, bảo thủ và đặc trƣng cho mỗi loài. Những khảo sát về
gen trên rRNA đƣợc thực hiện trực tiếp từ DNA môi trƣờng đã cho thấy, số lƣợng loài
vi khuẩn và vi khuẩn cổ đã tìm thấy trƣớc đây bằng phƣơng pháp giải trình tự truyền
thống chỉ tƣơng đƣơng khoảng 1% số lƣợng thực của chúng trong môi trƣờng. Gen
16S rRNA là thành phần của bộ máy tổng hợp protein có từ lâu đời. Hơn nữa, các
rRNA là những phân tử có chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống
sống và có độ bảo tồn vừa phải cho phép phản ánh sự liên quan tiến hoá giữa các loài
sinh vật.
Zuckerkand và Pauling (1967) cho rằng 16S rRNA có các đặc điểm phù hợp làm thƣớc

đo tiến hoá vì: (i) phân tử có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát; (ii) phân tử không
truyền qua lại giữa các loài; (iii) trình tự của phân tử có độ bảo tồn và biến động thích
hợp trong khoảng cách tiến hoá khảo sát; (iv) phân tử có kích thƣớc đủ lớn để chứa
nhiều thông tin. Mặc dù các tRNA có mặt ở hầu hết các vi sinh vật nhƣng chúng không
đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hoá do kích thƣớc quá nhỏ (75 ribonucleotides).
Ba loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể đƣợc chọn
làm thƣớc đo tiến hoá. Tuy nhiên chỉ có 16S rRNA là sự lựa chọn phù hợp cho các
nghiên cứu hiện nay do có kích thƣớc vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotides). Còn lại
5S có kích thƣớc quá nhỏ (khoảng 120 ribonucleotides), mang ít thông tin của quá trình
tiến hoá nên ít đƣợc chọn. 23S rRNA là phân tử có kích thƣớc lớn (khoảng 2900

24

Footer Page 24 of 126.


Header Page 25 of 126.

ribonucleotides), nên hiện không mấy thuận lợi cho việc nghiên cứu. Phân tử 16S
rRNA đƣợc coi nhƣ “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học. Tuy nhiên, do RNA dễ bị
phân huỷ nên cần phải rất cẩn trọng trong thao tác, vì vậy khuynh hƣớng hiện nay là sử
dụng gene 16S rDNA mã hoá cho RNA trong các nghiên cứu. Gene 16S rRNA của các
vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có một đặc điểm rất đặc biệt là có những vùng bảo tồn
cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau giữa các loài trong
cùng nhóm này. Tuy là những vùng biến động, nhƣng những vùng này lại là những
vùng bảo tồn ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở các cấp độ khác nhau đã giúp
cho gen 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên của các nhà nghiên cứu khi tiến hành
định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn.
Ở prokaryote, gene 16S RNA ribosome (rRNA 16S) dài khoảng 1.500 bp và chứa chín
vùng biến đổi rải rác giữa các vùng bảo thủ. Vùng biến đổi 16S rRNA thƣờng đƣợc sử

dụng trong phân loại phát sinh loài nhƣ chi hoặc loài trong đa dạng quần thể vi sinh
vật.

Hình 1.6: Gene 16S rRNA có 9 vùng biến đổi nằm xen giữa các vùng bảo thủ.
1.5.

Sơ lƣợc về MiSeq Sequencing

Platforms Illumina là họ sản phẩm đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Kỹ thuật đƣợc đƣa ra
vào năm 2006 và nhanh chóng đƣợc các nhà khoa học sử dụng bởi có thể tạo ra lƣợng
lớn số liệu với chi phí hiệu quả hơn. Theo thời gian, chiều dài read đƣợc tăng lên và
những ngƣời thƣờng sử dụng 454 đã chuyển sang Illumina platform do hiệu quả kinh
tế của kỹ thuật này. Mặc dù phƣơng pháp giải trình tự bằng tổng hợp nhƣ của 454,
nhƣng phƣơng pháp Illumina có 2 điểm nổi bật khác với 454: (1) sử dụng flow cell với
25

Footer Page 25 of 126.