ĐẠI HỌC QUỐC GIA T.P HỒ CHÍ MINH
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Thầy cô hướng dẫn : Cô Phan Nguyễn Quỳnh Anh
Nhóm 3 , chiều thứ 3
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Thái Duy Linh
Nguyễn Vũ Phương Liên
Đặng Quang Trung Kiên
Lê Hải Hà Linh
Nguyễn Công Khoa
Trần Thị Kim Huyền

T.P Hồ Chí Minh , Tháng 9/2016

MỤC LỤC

MSSV:6130
MSSV:6130
MSSV:6130

MSSV:6130
MSSV:61301853
MSSV:6130


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

1.PHƯƠNG THỨC VẬN HÀNH HPLC
1.1.Cách thức chuẩn bị mẫu
1.1.1.Mẫu thử:
+ Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc:
+ Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp
dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
+ Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách
lọc hay chiết.
+ Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0.2-0.45µm.
+ Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột, có thể gây ra
nghẽn cột.
1.1.2.Mẫu chuẩn:
Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về
nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ
khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.
1.2.Loại cột sử dụng
Dựa vào các tài liệu, Dược điển, thành phần và tính chất các chất có trong mẫu phân
tích, ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hoặc các loại
cột khác nhau.
Thường dùng 2 loại cột pha thuận (NP) và pha đảo (RP). Ngoài ra còn một số loại cột
khác như cột CN, cột NH2…

1.2.1.Cột pha thuận (NP) : Silicagel trung tính
+ Pha tĩnh: Loại cột này dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực. Trên
bề mặt có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước.
+ Pha động: Dung môi không phân cực hoặc ít phân cực.
1.2.2.Cột pha đảo (RP): Silicagel đã alkyl hóa
+ Pha tĩnh: Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có
thể tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế
nguyên tử H bằng các mạch carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18)
2|Page


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

hay các mạch carbon vòng (Phenyl- tương đương cột Phenyl) vì thế nó ít phân cực hay
phân cực rất ít . Ví dụ như cột Lichrosor -Lichrospher RP 8 (ODS), cột Nucleosil C18.

Cấu trúc cột ODS
+ Pha động: Pha động dùng trong loại này là các dung môi phân cựcPha động dùng
trong loại này là các dung môi phân cực như: methanol (MeOH), acetonitrile (ACN)
và tetrahydrofuran (THF). Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ
để giảm khả năng rửa giải.
1.3.Thành phần pha động:
Dựa vào các tài liệu, Dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu
phân tích… ta lựa chọn pha động phù hợp để quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất
có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày, đồng thời phải có
thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian phân
tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị.
Pha động có thể làm thay đổi :

+ Độ chọn lọc α
+ Thời gian lưu
+ Hiệu năng tách của cột
+ Độ phân giải
+ Tính đối xứng của peak

3|Page


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù
hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân
tích. Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có.
+ Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt
phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm
tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột) Ví dụ: đệm phosphat rửa
ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột.
+ Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất pha động
không bị phân hủy trong suốt thời gian phân tích mẫu.
+ Phải có độ tinh khiết cao.
+ Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
+ Phải phù hợp với loại Detector: Ví dụ UV - VIS thì dung môi không được hấp thụ
quang (ví dụ acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung
môi không được phát quang.
+ Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt.
1.4.Các chế độ vận hành và phân tích mẫu

1.4.1.Chế độ rửa giải Gradient:
Pha động với thành phần thay đổi trong quá trình chạy.

4|Page


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

Ưu điểm:
+ Khả năng tách tốt.
+ Thành phần pha động khá chính xác, đặc biệt với hệ gradient áp suất cao.
+ Có thể thay đổi rất nhiều thành phần trong pha động. Độ chính xác của thành
phần theo thời gian gần như không đổi.
+ Thời gian phân tích khá ngắn.
Nhược điểm
+ Thiết bị đắt tiền hơn, đặc biệt là hệ gradient áp suất cao.
+ Độ chính xác của thành phần pha động kém hơn hệ isocratic.
+ Khi một thành phần có tỉ lệ nhỏ, thành phần pha động sẽ kém chính xác và không
ổn định.
1.4.2.Chế độ Isocratic:
Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình.

Ưu điểm:
+ Thành phần pha động chính xác.
+ Hệ thống phân tích đơn giản, rẻ tiền.
5|Page



Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

+ Đường nền ổn định do thành phần không đổi nên sử dụng tốt cho các đầu dò
thành phần nền ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu như độ dẫn (CDD), đo chỉ số khúc xạ
(RI)…
+ Thành phần pha động có thể trộn trước bằng tay hoặc trộn liên tục.
Nhược điểm:
+ Khả năng tách kém, đặc biệt trong các mẫu phức tạp.
+ Việc khảo sát thay đổi thành phần pha động cho phù hợp thành phần mẫu không
thể thực hiện nhanh.
+ Thời gian phân tích dài nếu muốn tách tốt.
+ Nếu trộn trước (khi không có bộ gradient áp suất thấp) thành phần pha động có
thể thay đổi theo thời gian khi để lâu.

2.NHẬN XÉT VÀ TÍNH TOÁN VỀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH
2.1.Đề bài
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC có thông số sau :
-

Chiều dài cột : 150 mm
Tốc độ dòng :0.8 ml/phút
Thể tích pha động (Vm): 1.6 ml
Thể tích pha tĩnh (Vs): 0,752 ml

Sau khi cho qua cột, hỗn hợp curcuminoid, thu được sắc ký đồ (như file đính kèm)
với dữ liệu như sau :
-


Thời gian lưu của cấu tử không bị lưu giữ bởi cột (tM) : 1.5 phút
Hỗn hợp curcuminoid thu được gồm 3 thành phần chính: BDMC (BisDemethoxycurcumin), DMC (demethoxy curcumin) và curcumin I.

Curcumin I

6|Page


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

Demethoxy curcumin (DMC)

Bis-Demethoxycurcumin (BDMC)
2.2. Phương pháp sắc ký được sử dụng là phương pháp pha thuận hay pha đảo ?
Vì sao ?
+ Phương pháp sắc ký được sử dụng là phương pháp pha đảo.
+ Hỗn hợp curcuminoid gồm ba thành phần chính: BDMC (Bis-Demethoxycurcumin),
DMC (Demethoxy curcumin), Curcumin I. Cả ba thành phần trong hỗn hợp trên đều là
những chất phân cực, vì vậy dung môi muốn hòa tan được mẫu trên phải phân cực. Về
nguyên tắc dung môi không được tương tác với pha tĩnh trong sắc ký lỏng, chính vì
vậy chúng phải khác bản chất. Dung môi là chất phân cực thì pha tĩnh phải là không
phân cực. Suy ra phương pháp sắc ký được sử dụng trong bài trên là phương pháp pha
đảo với pha tĩnh không phân cực (thường dùng cột C18).
2.3. Thứ tự các chất (3 thành phần chính của curcuminoid) lần lượt

xuất hiện trong kết quả phân tích ?
Thứ tự các chất (3 thành phần chính của curcuminoid) lần lượt xuất hiện trong kết quả
phân tích:

(1)

7|Page


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

Bis-Demethoxycurcumin (BDMC)

(2)

Demethoxy curcumin (DMC)
(3)

Curcumin I
Giải thích : Vì phương pháp sắc kí sử dụng là sắc kí pha đảo, pha tĩnh không phân cực
nên sẽ tương tác với các cấu tử ít phân cực hơn. Trong đó BDMC là cấu tử phân cực
nhất, ít tương tác với pha tĩnh nhất nên ra trước, tiếp theo là DMC và cuối cùng là
Curcumin I ít phân cực nhất (vì trong phân tử có nhóm –OCH 3 tạo hiệu ứng +C vào
vòng làm cho nhóm –OH ít phân cực).
2.4. Cách thức pha mẫu và chuẩn bị mẫu ?
Chuẩn bị mẫu thực nghiệm : Cân m(g) mẫu thử . Chuyển phần mẫu thử vào bình định
mức 10ml.Định mức bằng acetonitrile, lắc đều. Đánh siêu âm khoảng 5 phút . Pha
lơngx mẫu 20 lần . Lọc qua giấy lọc 0.45 m .Dung dịch sau khi lọc được tiêm vào
máy
2.5. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi peak, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn
của N và chiều cao đĩa lý thuyết của cột.
Theo tài liệu tham khảo [1] có được phổ UV-VIS


8|Page


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

9|Page

Nhóm 3 , Chiều thứ 3


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

Ta thấy cả ba chất cần phân tích đều có bước sóng hấp thu cực đại từ 420-430nm
Vậy nên cài đặt bước sóng cho đầu dọc UV-VIS của máy HPLC là từ 420-430nm
Chọn phổ 2 để tính toán cho các câu sau

10 | P a g e


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

-

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

Các giá trị thời gian lưu và chiều rộng chân peak xem trên sắc ký đồ tại bước sóng
hấp thu cực đại nên chọn bước sóng 422,4:

N = 16 × (

BDMC
DMC
Curcumin I

-

tR1=
tR2=
tR3=

W=
W=
W=

0,1842
0,1285
0,1368
Trung bình

N1=
N2=
N3=
N=

Số đĩa lý thuyết trung bình :
N tb =

-


4,305
4,769
5,307

tR 2
)
W

8739.5 + 22037.807 + 24079.417
= 18285.578 (đĩa)
3

Độ lệch chuẩn:
(8739 − 18285) 2 + (22037 − 18285) 2 + (24079 − 18285) 2
σ=
= 6801
3

-

Chiều cao đĩa lý thuyết của cột:

11 | P a g e

8739,5092
22037,807
24079,417
18285,578



Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại
L
150
H=
=
= 0,008203186
N tb 18285

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

(mm)

2.6.Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử.
Hệ số chứa k'X
k'X =

t R − tM
tM

Hệ số phân bố KX
KX = k ' X

VM
VS

BDMC
DMC
Curcumin I


k'1=
k'2=
k'3=

1,87
2,18
2,54

K1=
K2=
K3=

3,98
4,64
5,4

2.7.Độ phân giải Rs và độ chọn lọc α đối với hai cấu tử DMC (demethoxy
curcumin) và curcumin I.
Giữa hai cấu tử DMC và curcumin I
Độ phân giải RS
Rs =

tR3 − tR 2
= 4.06
W3 / 2 − W2 / 2

Độ chọn lọc α
α=

K3

= 1.16
K2

2.8.Dựa trên phương trình đường chuẩn, tính toán giá trị nồng độ của curcumin
I.
phương trình đường chuẩn của curcumin I, thay y=8534,22363 mAU.x
Nồng độ curcumin I x (mg/ml)
x=0.1806 mg/ml
2.9.Nhận xét
+ Đánh giá kết quả tính toán
-

Kết quả tính toán cho thấy phương pháp sử dụng:
• Tốc độ nhanh: thời gian lưu ngắn.

12 | P a g e


Báo cáo thí nghiệm phân tích hiện đại

Nhóm 3 , Chiều thứ 3

Độ tách tốt: các peak đẹp, không bị chồng lên nhau.
Độ nhạy cao
Kết quả tính toán đáng tin cậy: nồng độ Curcumin và diện tích peak gần như là
•
•

-


đường thẳng.
+ Cơ sở của việc lựa chọn phương pháp
Hỗn hợp cần phân tích là hỗn hợp lỏng.
Các cấu tử là hợp chất hữu cơ và đều phân cực (có nhóm –OH).
3. KẾT LUẬN
Thí nghiệm với mục tiêu phân tách mẫu có chứa 3 chất Curcumin I, Demethoxy
curcumin (DMC) và Bis-Demethoxycurcumin (BDMC) thu được các kết quả sau:
+ Nồng độ Curcumin I là 0,186mg/ml
+ Độ phân giải và độ chọn lọc đối với 2 cấu tử DMC và Curcumin I: Rs = 4.06; α=1,16
Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao cho hiệu quả
cao nhờ sử dụng chất nhồi có kích thước nhỏ, tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao.
Thí nghiệm này giúp hiểu rõ hơn nguyên lí hoạt động của máy HPLC cũng như
phương pháp sắc kí nói chung, phương pháp sắc kí lỏng nói riêng.

4. TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Tách và tinh chế dẫn xuất curcumin trích ly từ củ nghệ vàng – Sinh viên Nguyễn
Thị Mạc Hương , năm 2008
[2] Phân tích định lượng – Nguyễn Thị Thu Vân – năm 2012

13 | P a g e