BÁO CÁO THỰC HÀNH TIN SINH HỌC
Bài 9: THIẾT KẾ MỒI
1. PCR và thiết kế mồi
1.1. Kỹ thuật PCR
 Quá trình sao chép DNA trong tế bào

 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction):
◦ PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản (tạo ra
nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ống nghiệm mô phỏng bộ máy sinh tổng
hợp DNA của tế bào sống.


◦ Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
như sau :
▪ Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation):
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 –
95 0C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2
mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch
bổ sung mới.
▪ Bước 2: (bắt cặp, annealing):
Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer,
cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động
trong khoảng 55 – 65 0C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài


từ 30 – 60 giây.
▪ Bước 3: (kéo dài, elongation – extension):
Nhiệt độ được tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác
động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ
sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự
DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Sự khuếch đại này có thể được

tính như sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m * 2^n
m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa.
n: Là số chu kỳ.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và
nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân
bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao.
 Mồi (Primer) là những đoạn nucleotide ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với
một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn
primer này được kéo dài để hình thành mạch mới.
Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần
khuếch đại.
1.2. Thiết kế mồi cho PCR
Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR.
Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang lại kết quả về sự
khuếch đại của một mảnh DNA đơn. Việc lựa chọn primer cần tuân thủ theo một số
nguyên tắc sau:
 Chiều dài của đoạn mồi:
Độ dài của đoạn mồi khoảng từ 18-30 Nu, chiều dài tối ưu là 18-22 bp.
Độ dài này là đủ dài cho độ đặc hiệu thích hợp và đủ ngắn để mồi để liên kết một
cách dễ dàng với khuôn ở nhiệt độ ủ.
 Độ đặc hiệu: Phụ thuộc vào chiều dài của mồi, trình tự mồi và khuôn PCR.
◦ Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn hơn 3kb và chiều dài lý tưởng là nhỏ
hơn 1kb.
◦ Runs: Những mồi với những dải dài liên tiếp của 1 base duy nhất nói chung
nên tránh vì nó có thể gắn mồi không đặc hiệu.
Các đoạn mồi không nên chứa hơn 4 Nu giống nhau xếp liên tiếp.
◦ Repeats: 1 đoạn lặp lại là 1 trình tự 2 Nu xuất hiện nhiều lần liên tiếp, nó có
thể gây nên gắn mồi không đặc hiệu.
Số lượng tối đa của đoạn lặp lại 2 Nu có thể chấp nhận là 4 lần lặp lại.
◦ Cross Homology:

Để tăng độ đặc hiệu của mồi ta cần phải thiết kế mồi tránh các đoạn tương đồng. Các
mồi được thiết kế cho 1 trình tự phải không nhân lên các đoạn gen khác trong hỗn hợp.
Mồi được thiết kế và sau đó sử dụng BLAST để kiểm tra độ đặc hiệu.
 Tỷ lệ G-C:
Tỷ lệ G-C lý tưởng trong đoạn mồi vào khoảng 40 – 60 % để nhiệt độ bắt cặp của đoạn


mồi là không quá thấp.
 Nhiệt độ biến tính (Tm -Melting temperature) của mồi:
 Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nửa DNA sợi kép sẽ phân
tách thành sợi đơn và thể hiện độ bền của sợi kép.
 Nhiệt độ nóng chảy của mồi trong khoảng 52-58 oC thường tạo ra sản phẩm
kết quả tốt nhất. Nhiệt độ nóng chảy cao hơn 65 oC có xu hướng cho sản phẩm
thứ cấp.
 Tỷ lệ G-C trong trình tự ảnh hưởng quan trọng đến Tm:
Tm = 2 * (A+T) + 4 * (G+C).
◦ Nhiệt độ nóng chảy Tm phụ thuộc vào: chiều dài của primer, thành phần base
của mồi (tỷ lệ G-C), nồng độ base, nồng độ muối trong phản ứng PCR.
Tm được tính bằng cách sử dụng thuyết nhiệt động học (the nearest neighbor
thermodynamic theory) là phương pháp tốt hơn tốt nhất hiện nay để ước lượng nó.
◦ Công thức tính Tm của mồi:
Melting Temperature Tm(K) = {ΔH/ΔS + R * ln(C)},
Or Melting Temperature Tm(oC) = {ΔH/ΔS + R * ln(C)} – 273.15
Trong đó:
▪ ΔH (kcal/mole) : H is the Enthalpy. Enthalpy is the amount of heat energy
possessed by substances. ΔH is the change in Enthalpy. In the above
formula the ΔH is obtained by adding up all the di-nucleotide pairs enthalpy
values of each nearest neighbor base pair.
ΔH là độ biến thiên Entanpi.
▪ ΔS (kcal/mole) : S is the amount of disorder a system exhibits is called

entropy. ΔS is change in Entropy. Here it is obtained by adding up all the
di-nucleotide pairs entropy values of each nearest neighbor base pair. An
additional salt correction is added as the Nearest Neighbor parameters were
obtained from DNA melting studies conducted in 1M Na+ buffer and this is
the default condition used for all calculations.
ΔS là độ biến thiên Entropi.
ΔS (salt correction) = ΔS (1M NaCl )+ 0.368 * N * ln([Na+])
Where:
N is the number of nucleotide pairs in the primer ( primer length -1).
[Na+] is salt equivalent in mM.
[Na+] calculation: [Na+] = Monovalent ion concentration + 4 * free Mg2+.
◦ Nhiệt độ nóng chảy của 2 mồi không nên cách nhau quá xa, vì nếu sự chênh
lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn
primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA.


Độ chênh lệch Tm giữa 2 mồi không quá 5 oC.
 Nhiệt độ gắn mồi (Ta - Annealing Temperature):
◦ Nhiệt độ nóng chảy của mồi là ước lượng độ bền vững của lai DNA-DNA và
quan trọng trong việc xác định nhiệt độ ủ. Nhiệt độ ủ (Ta) quá cao sẽ tạo ra
không đủ cặp lai mồi-khuôn dẫn đến sản lượng sản phẩm PCR thấp. Ta quá
thấp có thể có thể dẫn đến sản phẩm không đặc hiệu gây ra bởi một số lượng
lớn các sai lệch cặp base.
Sức chịu đựng không tương xứng đã được tìm thấy có ảnh hưởng mạnh nhất đến độ đặc
hiệu của PCR.
◦ Annealing Temperature-Ta = 0.3 * Tm(primer) + 0.7 * Tm(product) – 14.9
Trong đó:
Tm(primer) = Melting Temperature of the primers: Nhiệt độ nóng chảy của
mồi.
Tm(product) = Melting temperature of the product: Nhiệt độ nóng chảy của

sản phẩm PCR.
◦ Nhiệt độ gắn mồi (Ta) tối ưu thấp hơn Tm khoảng 5oC.
Optimum Annealing Temperature (Ta Opt): Ta Opt = 0.3 * (Tm of primer) + 0.7 * (Tm
of product) - 14.9
Trong đó:
Tm of primer: Nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi-khuôn có độ ổn định kém hơn.
Tm of product: Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR.
 Độ bền đầu 3' của mồi:
◦ là giá trị ΔG lớn nhất của 5 Nu cuối của đầu 3'.
ΔG càng âm (năng lượng tự do càng thấp) đoạn trình tự càng bền, dễ tạo cấu trúc bậc 2.
ΔG đầu 3' ít âm sẽ làm giảm sự bắt cặp sai lầm (mismatch – bắt cặp không đặc hiệu).
Gía trị ΔG đầu 3' được chấp nhận -9 < ΔG < -4 Kcal/mole.
◦ GC Clamp: Sự hiện diện của thành phần base G-C trong 5 base cuối của đầu 3'
của mồi giúp tăng cường liên kết đặc hiệu ở đầu 3' bởi vì liên kết mạnh giữa
base G – C.
Số lượng G-C trong 5 Nu cuối đầu 3' không nên lớn hơn 3 vì nó sẽ dẫn đến khả năng bắt
cặp sai cao (mispriming).
 Khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp của mồi:
◦ Hairpins: Cấu trúc cặp tóc được hình thành bởi sự tương tác nội phân tử trong
mồi và nên tránh vì nó sẽ làm ảnh hưởng đến sự bắt cặp giữa mồi và khuôn.
▪ Định nghĩa ΔG:
ΔG = ΔH – TΔS
Năng lượng tự do Gibbs là tiêu chuẩn để đánh giá lượng sản phẩm có thể chiết suất từ
một quá trình hoạt động ở áp suất không đổi. Nó là thước đo của sự tự động của phản


ứng.
Độ bền của cấu trúc kẹp tóc thường được biểu diễn bằng giá trị ΔG của nó, là năng
lượng cần thiết để phá vỡ cấu trúc bậc 2.
Gía trị ΔG càng âm thể hiện sự bền vững của cấu trúc kẹp tóc mà ta không mong muốn.

Sự xuất hiện của cấu trúc cặp tóc ở đầu 3' là ảnh hưởng xấu nhất đến phản ứng.
Gía trị ΔG tối ưu ở đầu 3' là > -2 kcal/mol và ΔG của mồi > -3 kcal/mol.
◦ Self Dimer:
Tự dimer của 1 mồi được hình thành bởi các tương tác nội phân tử giữa hai mồi cùng
loại (same sense), tại vị trí mà trình tự bổ sung với chính nó (homologous). Nói chung
lượng mồi được sử dụng trong PCR lớn hơn nhiều so với lượng gen mục tiêu. Khi các
mồi hình thành dimer nội phân tử sẽ dễ hơn nhiều để lai với DNA mục tiêu, chúng làm
giảm năng suất sản phẩm.
Tự dimer ở đầu 3' tối ưu với giá trị ΔG khoảng -5 kcal/mol và tự dimer nội bộ với một
ΔG khoảng -6 kcal / mol nói chung được chấp nhận.
◦ Cross Dimer:
Dimer ngang của mồi được hình thành bởi tương tác nội phân tử giữa các mồi xuôi và
mồi ngược tại các vị trí trình tự bổ sung (homologous).

Tạo dimer ngang ở đầu 3' tối ưu với giá trị ΔG khoảng -5 kcal/mol và tạo dimer ngang
trong nội bộ với một ΔG khoảng -6 kcal / mol nói chung được chấp nhận.
2. Thiết kế mồi PCR
21
. . Giới thiệu chương trình Primer-BLAST
 Công cụ Primer-BLAST của NCBI là 1 chương trình sử dụng để thiết kế và kiểm
tra độ đặc hiệu của mồi.
Chương trình này là chương trình online miễn phí thiết kế dựa trên chương trình Primer3
kết hợp với BLAST, không phải chương trình chuyên dụng để thiết kế mồi nên thiết kế
mồi có thể không hiệu quả bằng các chương trình chuyên dụng... Nhưng NCBI có 1
CSDL toàn diện, đa dạng nên khả năng kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng BLAST rất
hiệu quả.


 Khuôn của phản ứng PCR:
Ta có gen MT-ND1 nằm từ vị trí 3,307 đến 4,262 trên DNA ty thể (956 bp)

( Gen MT-ND1 mã
hóa cho 1 protein ND1(NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1) có kích thước 36
kDa gồm 318 amino acid.
MT-ND1 là 1 trong 7 tiểu đơn vị mã hóa của DNA ty thể mã hóa cho enzym NADH
dehydrogenase (ubiquinone).
Protein ND1 là một tiểu đơn vị của NADH dehydrogenase (ubiquinone), nằm ở màng
trong ty thể và là phức hợp lớn nhất trong năm phức hợp của chuỗi vận chuyển điện tử.
Các biến thể của gen MT-ND1 có liên quan đến Hội chứng MELAS (bệnh não, cơ, tăng
axit lactic giả tai biến mạch máu não từng thời kỳ - Mitochondrial encephalomyopathy,
lactic acidosis, and stroke-like episodes), Hội chứng Leigh (viêm não tuỷ hoại tử bán
cấp - Leigh's syndrome – LS), Teo thị Leber (Leber’s hereditary optic neuropathy –
LHON) và tăng chỉ số BMI ở người lớn.
( />

2.2. Thiết kế mồi bằng Primer-BLAST
 PCR Template: Khuôn của phản ứng PCR.
◦ Nhập trình tự khuôn của phản ứng PCR. Có thể nhập mã số nhận dạng của
trình tự, GI hoặc nhập trình tự dưới dạng dữ liệu FASTA.
Ta có thể tải file trình tự lên.


Độ dài trình tự khuôn không quá 50kb.
◦ Giới hạn: xác định vị trí của mồi xuôi và mồi ngược, phụ thuộc vào vị trí đoạn
gen mà ta muốn nhân lên.
 Primer Parameters: Các thông số của mồi.
◦ Nếu kiểm tra độ đặc hiệu của mồi đã biết ta nhập cặp mồi vào khung theo
chiều trình tự từ đầu 5' → đầu 3'.
◦ Kích thước sản phẩm PCR: Nếu không có yêu cầu ta để mặc định từ 70 –
1000.
Kích thước sản phẩm PCR thường nhỏ hơn 1000 bp, không vượt quá 3kb. Đối với

qPCR, chiều dài gen đích là khoảng 100 bp và đối với PCR chuẩn là gần 500 bp.
Chiều dài sản phẩm PCR = Vị trí cuối của mồi ngược – Vị trí đầu của mồi xuôi + 1.
Product length = (Position of antisense primer - Position of sense primer) + 1.
◦ Số lượng các mồi trả về
◦ Nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi: GTNN - GT tối ưu – GTLN – Độ chênh lệch
tối đa Tm giữa 2 mồi.
Tm của mồi thường có giá trị từ 52 – 56 oC.
Độ chênh lệch Tm giữa 2 mồi càng nhỏ càng tốt, và không vượt quá 5 oC.
Mặc định của chương trình từ 57 – 63 là hơi cao. Ta có thể điều chỉnh cho phù hợp.
 Exon/intron selection: Lựa chọn exon/intron.
◦ Exon junction span: Trùm qua vị trí nối giữa các exon.
▪ No preference: Nếu ta không cần quan tâm đến trình tự exon và intron
trong khuôn.
▪ Primer must span an exon-exon junction: Mồi phải trùm qua 1 vị trí nối
giữa các exon.
Trong trường hợp ta cần phải nhân lên DNAc, để chắc chắn chỉ nhân lên các đoạn exon
ta phải đặt thông số của mồi bám qua vị trí nối của 2 exon.
▪ Primer may not span an exon-exon junction: Mồi có thể không bám vào vị
trí nối giữa các exon.
Mồi bám vào exon hay intron đều được.
◦ Exon junction match: Phù hợp với vị trí nối giữa các exon: Khi ta cần mồi bám
vào vị trí nối giữa 2 exon.
Số lượng base tối thiểu bám vào exon bên 5' - Số lượng base tối thiểu bám vào exon bên
3'.
◦ Intron inclusion: Bao gồm cả intron.
Với tùy chọn này, chương trình sẽ cố gắng tìm các cặp mồi được phân cách bởi ít nhất
một intron trên ADN hệ gen tương ứng, sử dụng so sánh mRNA-genomic DNA của
NCBI. Điều này làm cho dễ dàng phân biệt giữa sản phẩm khuếch đại từ mRNA và
DNA genomic, các sản phẩm nhân lên từ DNA là dài hơn do sự hiện diện của một
intron.

◦ Giới hạn độ dài intron: GTNN – GTLN.


 Primer Pair Specificity Checking Parameters: Các thông số kiểm tra độ đặc hiệu
của mồi.
Dùng để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi.
◦ Specificity check: Kích hoạt tính năng tìm kiếm các cặp mồi đặc hiệu cho mẫu
PCR được dự đoán.
◦ Search mode: Chế độ tìm kiếm:
▪ Automatic: Tự động.
▪ User guided: Chỉ dẫn của người dùng.
▪ No user guidance: Không có hướng dẫn sử dụng.
◦ Database: CSDL.
▪ Refseq mRNA: Trình tự chuẩn mRNA.
▪ Refseq representative genomes: Trình tự chuẩn genome đại diện.
▪ nr.
▪ Refseq RNA (refseq_rna): Trình tự chuẩn RNA.
▪ Genome (reference assembly from selected organisms): Trình tự chuẩn
ghép từ genome của các loài sinh vật được chọn.
▪ Custom: Mặc định.
▪ Genome (chromosomes from all organisms): Genome (từ tất cả các sinh
vật).
◦ Exclusion: Loại trừ
▪ Exclude predicted Refseq transcripts (accession with XM, XR prefix): Loại
trừ các bản sao của các trình tự chuẩn được dự đoán.
▪ Exclude uncultured/environmental sample sequences: Loại trừ các trình tự
mẫu môi trường.
◦ Organism: Tên loài sinh vật
◦ Entrez query: Truy vấn Entrez.
để giới hạn cơ sở dữ liệu tìm kiếm cho mồi đặc hiệu.

◦ Primer specificity stringency: Tính chính xác độ đặc hiệu của mồi.
Mồi phải có ít nhất: 2 tổng số lần bắt cặp không đặc hiệu đến các mục tiêu ngoài ý
muốn,
trong đó ít nhất: 2 bắt cặp không đặc hiệu trong: 5 base cuối của đầu 3'.
Bỏ qua các mục tiêu có: 6 hoặc nhiều hơn các bắt cặp không đặc hiệu đến mồi.
◦ Max target size: Kích cỡ mục tiêu lớn nhất.
◦ Splice variant handling: Chỉnh lý biến thể nối.
Cho phép mồi để khuếch đại các biến thể nối mRNA ( yêu cầu trình tự mRNA chuẩn
như khuôn đầu vào PCR).


 Các thông số nâng cao:
◦ Các thông số kiểm tra độ đặc hiệu của mồi:
▪ Số lượng tối đa của các trình tự mục tiêu BLAST.
▪ Giá trị mong đợi (E) BLAST.
Dự kiến số lượng cơ hội phù hợp trong một mô hình ngẫu nhiên.


Giá trị E cao kiểm tra độ đặc hiệu chính xác hơn. Gía trị E thấp hơn rút ngắn thời gian
tìm kiếm.
▪ Word size BLAST.
▪ Số lượng cặp mồi tối đa để sàng lọc.
▪ Số lượng mục tiêu tối đa để hiển thị (cho thiết kế mồi mới)
▪ Số lượng mục tiêu tối đa để hiển thị (cho mồi được thiết kế sẵn)
▪ Số lượng mục tiêu tối đa trên 1 trình tự: Số lượng tối đa của mục tiêu PCR
(trình tự được khuếch đại) để được tìm thấy trên bất kỳ trình tự đơn trong
cơ sở dữ liệu tìm kiếm.
◦ Các thông số mồi:
▪ Tm sản phẩm PCR: GTNN – GT tối ưu – GTLN.
▪ Chiều dài mồi: GTNN – GT tối ưu – GTLN.

▪ Thành phần G-C của mồi (Tỷ lệ %): GTNN – GTLN.
▪ GC clamp.
▪ Max Poly-X: (Runs) Độ dài tối đa cho phép của 1 dãy lặp lại 1 Nu.
Gía trị tối đa bằng 4.
▪ Max 3' Stability: Độ ổn định của đầu 3'.
▪ Max GC in primer 3' end: Số lượng G-C tối đa ở đầu 3'.
▪ Secondary Structure Alignment Methods: Phương pháp so sánh cấu trúc thứ
cấp.
- Use Thermodynamic Oligo Alignment: Sử dụng so sánh nhiệt động học oligo.
- Use Thermodynamic Template Alignment (warning: search may be very slow with this
option on): Sử dụng so sánh nhiệt động học mẫu (Phương pháp tìm kiếm chậm).
Tùy chọn “Use Thermodynamic Oligo Alignment” chỉ dẫn Primer3 để sử dụng mô hình
so sánh nhiệt động học (thay thế cho so sánh cấu trúc bậc 2 truyền thống) để tính xu
hướng của các oligo tạo thành cấu trúc cặp tóc và dimer. Trong khi tùy chọn "Use
Thermodynamic Template Alignment" chỉ dẫn Primer3 để sử dụng mô hình so sánh
nhiệt động học để tính xu hướng của các oligo bám vào các vị trí không mong muốn
trong trình tự khuôn.
▪ TH: Max Template Mispriming: (For thermodynamic alignment model
only): Tỷ lệ gắn mồi không đặc hiệu tối đa: của 1 mồi (Prime) và cặp mồi
(Pair).
▪ TH: Max Self Complementarity: (For thermodynamic alignment model
only): Tỷ lệ tự bổ sung tối đa: ở bất kỳ vị trí nào của mồi (Any) và ở đầu 3'
của mồi (3').
▪ TH: Max Pair Complementarity: (For thermodynamic alignment model
only): Tỷ lệ bổ sung tối đa giữa 2 mồi: ở bất kỳ vị trí nào trên mồi (Any) và
ở đầu 3' của mồi (3').
▪ TH: Max Primer Hairpin: (For thermodynamic alignment model only): Tỷ
lệ hình thành cấu trúc kẹp tóc tối đa ở mồi.



▪ Max Template Mispriming: (For old secondary structure alignment model
only): Tỷ lệ gắn mồi không đặc hiệu tối đa: của 1 mồi (Prime) và cặp mồi
(Pair).
▪ Max Self Complementarity: (For old secondary structure alignment model
only): Tỷ lệ tự bổ sung tối đa: ở bất kỳ vị trí nào của mồi (Any) và ở đầu 3'
của mồi (3').
▪ Max Pair Complementarity: (For old secondary structure alignment model
only): Tỷ lệ bổ sung tối đa giữa 2 mồi: ở bất kỳ vị trí nào trên mồi (Any) và
ở đầu 3' của mồi (3').
▪ Excluded regions: Vùng loại trừ.
▪ Overlap junctions: Vị trí bám chồng lên là số lượng tối thiểu của các
nucleotide mà bên trái hoặc bên phải mồi phải có ở bên 5' hoặc 3'của các vị
trí nối: ở đầu 5' (5' side overlaps) và ở đầu 3' (3' side overlaps).
▪ Concentration of monovalent cations: Nồng độ của các cation hóa trị 1.
▪ Concentration of divalent cations: Nồng độ của các cation hóa trị 2.
▪ Concentration of dNTPs: Nồng độ của các dNTP.
▪ Salt correction formula: Công thức chuẩn muối.
- Schildkraut and Lifson 1965.
- SantaLucia 1998.
- Owczarzy et. 2004.
Tùy chọn để xác định công thức chuẩn muối cho tính nhiệt độ nóng chảy.
▪ Table of thermodynamic parameters: Bảng các thông số nhiệt động học.
- Breslauer et al. 1986.
- SantaLucia 1998.
Tùy chọn bảng các thông số nhiệt động học (Nearest-Neighbor thermodynamic
parameters) và phương pháp tính nhiệt độ nóng chảy Tm.
▪ Annealing Oligo Concentration: Nồng độ oligo ủ.
▪ SNP handling: Xử lý SNP.
Với tùy chọn này, chương trình sẽ tự động lấy thông tin SNP chứa trong mẫu (sử dụng
GenBank accession hoặc GI như mẫu được yêu cầu) và tránh chọn mồi trong vùng SNP.

▪ Repeat filter: Bộ lọc lặp lại.
Tránh vùng lặp lại cho lựa chọn mồi bằng cách lọc với cơ sở dữ liệu lặp lại.
▪ Low complexity filter: Bộ lọc phức tạp thấp.
Tránh vùng có độ phức tạp thấp cho lựa chọn mồi.


◦ Internal hybridization oligo parameters: Các thông số oligo lai nội bộ.
▪ Hybridization oligo: Chọn oligo lai nội bộ.
▪ Hyb Oligo Size: Kích thước oligo lai: GTNN – GT tối ưu – GTLN.
▪ Hyb Oligo Tm: Tm của oligo lai: GTNN – GT tối ưu – GTLN.
▪ Hyb Oligo GC%: Tỷ lệ % G-C oligo lai: GTNN – GT tối ưu – GTLN.
→ Get Primers.


→ Ta có kết quả thiết kế mồi của khuôn ND1:
Kết quả đầu ra của chương trình đưa ra các thông tin:
◦ Khuôn đầu vào của PCR.
◦ Giới hạn đoạn trình tự khuếch đại.
◦ Độ đặc hiệu của mồi.
◦ Các thông số chi tiết.
 Đồ họa của các cặp mồi.
 Chi tiết các cặp mồi.


3. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng BLAST.
Ta nhập trình tự khuôn và trình tự cặp mồi cần kiểm tra độ đặc hiệu, hiệu chỉnh các
thông số cần thiết → Get Primers.


→ Kết quả đầu ra:


 So sánh với kết quả nhân PCR:
( />

Ta thấy các thông số của mồi thỏa mãn khuếch đại đặc hiệu vùng gen ND1, mặc dù có
thể hình thành các sản phẩm thứ cấp nhưng các sản phẩm đó vẫn có thể phân biệt với
sản phẩm mong muốn bằng điện di.