1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lao là một trong những bệnh truyền nhiễm hàng đầu gây tỷ lệ tử vong
trên thế giới ngày nay. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO),
khoảng 1/3 dân số thế giới nhiễm lao. Mỗi năm, có thêm gần 9 triệu người
mắc lao mới và khoảng 1,3 triệu người tử vong do lao. Trong đ , 81

số

bệnh nhân thuộc về 22 nước c g nh n ng bệnh lao [133]. Trong khi đ , tỷ lệ
ph t hiện m c dù liên tục được cải thiện nhưng chỉ đạt 66

số bệnh nhân ước

tính [133], do c những hạn chế về công t c chẩn đo n, đ c biệt là lao kh ng
thuốc. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được ph t hiện và chữa trị
đang tiếp tục lây lan cho cộng đồng.
Theo thống kê của WHO, Việt Nam là một quốc gia c tỷ lệ bệnh lao
cao. Theo b o c o của Chương trình Chống lao Quốc gia (CTCLQG) năm
2013, tổng số người mắc lao là 190.000; trong đó, số người mắc lao mới
khoảng 130.000, số trường hợp tử vong do lao ước t nh là 17.000 người. Tình
hình kh ng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là một vấn đề đ ng lo
ngại. Tỷ lệ vi khuẩn lao kh ng đa thuốc ở bệnh nhân điều trị lại là 23 , ở
bệnh nhân lao mới là 4% [4].
Trong c c loại kh ng thuốc của vi khuẩn lao, kh ng rifampicin và
isoniazid - những thuốc chủ l c trong điều trị lao - được quan tâm nhất vì
thường dẫn đến thất bại trong điều trị và tử vong. Theo định nghĩa của WHO,
“lao kh ng đa thuốc” là trường hợp kh ng với t nhất đồng thời rifampicin và
isoniazid [135]. S đề kh ng với 2 thuốc chống lao dòng 1 này được cho là c
đột biến trên một số gen liên quan, đ c biệt là c c gen rpoB và katG. Các

nghiên cứu về t nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao cho thấy, rất hiếm c c chủng
kh ng rifampicin đơn thuần mà thường c

t nhất 90

c c chủng lao lâm sàng

kh ng rifampicin đồng thời cũng kh ng isoniazid [15], [62]. Như vậy, việc
ph t hiện c c chủng lao kh ng rifampicin cũng c nghĩa là x c định được lao
kh ng đa thuốc [92]. Các nghiên cứu về phân tử của vi khuẩn lao kh ng


2

rifampicin đã công bố cho thấy, t nh kh ng rifampicin liên quan đến đột biến
ở gen rpoB, còn kh ng isoniazid thường liên quan đến đột biến ở gen katG
[112], [140].
Chẩn đo n lao kh ng thuốc chủ yếu vẫn d a vào phương ph p kh ng
sinh đồ và phải mất khoảng 8 tuần mới cho kết quả. Chẩn đo n nhanh vi
khuẩn lao kh ng thuốc, đ c biệt là kh ng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân
tử là cần thiết trong công t c gi m s t và kiểm so t lao. C c kit thương mại
của nước ngoài chẩn đo n lao kh ng thuốc c gi thành cao và thường chỉ
nhằm vào c c điểm đột biến 526, 531 trên gen rpoB và 315 trên gen katG. Các
nghiên cứu về lao kh ng thuốc ở từng khu v c lại ph t hiện thêm c c điểm đột
biến ở vị tr kh c như 514, 533, 176 trên gen rpoB; đ c biệt tần số c c đột biến
thay đổi giữa c c cộng đồng người và vùng địa lý [15], [52], [65], [88], [110],
[140]. Đ c điểm phân tử của c c chủng kh ng thuốc phân lập được từ c c
vùng kh c nhau trên thế giới, nhất là từ c c quốc gia c tỷ lệ bệnh lao và tỷ lệ
lao kh ng thuốc cao s tạo điều kiện thuận lợi cho việc ph t triển c hiệu quả
hơn c c phương ph p phân tử để ph t hiện nhanh ch ng t nh kh ng thuốc phù

hợp với từng nước và từng khu v c. Việt Nam chưa c c c dữ kiện đầy đủ về
đ c điểm phân tử của vi khuẩn lao kh ng đa thuốc trong nước nên chưa c cơ
sở để p dụng nguyên bản kit chẩn đo n lao kh ng thuốc của nước ngoài.
Vì vậy chúng tôi th c hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen
rpoB, katG của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam” nhằm mục tiêu:
ố

ủ

ủ

ẩ
ủ

ẩ

ượ năm 2008-2009.

phân lậ
ư
ố ở Việ N

ẩ
.


3

Chƣơng 1
T N


QU N

1.1. Bệnh lao
Lao là căn bệnh truyền nhiễm xuất hiện từ lâu. C c nghiên cứu dấu t ch
ho thạch cho thấy, bệnh lao xuất hiện ở người khoảng 400 - 230 năm trước
Công nguyên. Đại dịch lao bùng ph t ở châu Âu ở thế kỷ XVII, lan sang châu
Mỹ và kéo dài cho đến tận thế kỷ XIX. Trong giai đoạn này, những mô tả về
giải phẫu, bệnh lý, t nh chất lây lan của căn bệnh này đã được công bố nhờ
những công trình nghiên cứu của

enjamin Martien (1720), Franciscus

Sylvius de la Boe (1769) và Jean-Antoine Villemin (1865). Tác nhân gây
bệnh lao, Mycobacterium tuberculosis, ch nh thức được x c định và mô tả
vào năm 1882. Đây là công trình nghiên cứu của Robert Koch (1843-1910).
Để ghi nhận công lao của ông, người ta còn gọi tr c khuẩn lao gây bệnh trên
người là tr c khuẩn Koch ( acille de Koch) [92].
Trong thế kỷ 20, bệnh lao đã giết chết khoảng 100 triệu người. Từ năm
1943, streptomycin, thuốc chống lao đầu tiên được phát hiện và được sử dụng
điều trị có hiệu quả. Sau đ hàng loạt thuốc chống lao kh c ra đời đã mở ra
một kỷ nguyên mới trong điều trị bệnh lao, cũng như đã cứu chữa cho hàng
triệu bệnh nhân lao khỏi căn bệnh nguy hiểm này [92]. Cùng với s phát triển
của đại dịch HIV/AIDS, dịch tễ lao toàn cầu đã bước sang một hướng phát
triển mới gây ra những thách thức vô cùng to lớn cho cuộc chiến chống lao
của loài người, đ là s tương t c giữa lao và đại dịch HIV/AIDS và s phát
triển của các chủng lao kháng thuốc [92], [131], [133].
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên th giới
Hiện nay, trên thế giới c khoảng 2,2 tỷ người nhiễm lao (chiếm 1/3 dân
số thế giới). Theo số liệu công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) [133],

ước t nh năm 2012 c thêm khoảng 8,6 triệu người mắc lao mới (trung bình


4

122 trường hợp trên 100 000 dân) và 1,3 triệu người tử vong do lao (trong đ ,
940 000 người HIV (-) và 330 000 người tử vong do lao/HIV (+)). Trong số
c c trường hợp tử vong, c 170 000 trường hợp mắc lao kh ng đa thuốc
[133].
Phân bố toàn cầu bệnh lao nghiêng về ph a c c nước c thu nhập thấp và
nh m nền kinh tế mới nổi. Hầu hết c c trường hợp xảy ra ở châu Á (58 ) và
châu Phi (27 ), một tỷ lệ nhỏ hơn ở ph a đông khu v c Địa trung Hải (8 ),
khu v c châu Âu (4 ). Khoảng 81

số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22

nước c g nh n ng bệnh lao cao [133]. Trong tổng số 8,6 triệu người mắc lao
mới trên toàn cầu năm 2012, c khoảng 13

sống chung với HIV. Tỷ lệ c c

trường hợp bệnh lao đồng nhiễm với HIV cao nhất trong c c quốc gia thuộc
khu v c châu Phi (82 ) [133].
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Theo b o c o của WHO năm 2012, Việt Nam đứng thứ 12/22 nước c
g nh n ng bệnh lao cao trên toàn cầu. Ở khu v c Tây - Th i ình Dương, Việt
nam đứng thứ ba sau Trung quốc và Philippin về số lượng bệnh nhân lao cũng
như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm [133]. Năm 2013, tỉ lệ mắc lao
mới c c thể là 144/100.000 dân; tỉ lệ hiện mắc lao c c thể là 209/100.000 dân;
tỉ lệ tử vong do lao là 19/100.000 dân [4].

Số liệu ghi nhận của chương trình chống lao quốc gia hàng năm cho thấy,
tình hình bệnh lao ngày càng diễn biến phức tạp hơn, tỉ lệ ph t hiện ca bệnh
trên th c tế c thể thấp hơn con số ước t nh trước đây. Một số lượng đ ng kể
c c bệnh nhân lao chưa được chẩn đo n và điều trị là nguồn lây quan trọng
trong cộng đồng. Điều đ s tăng thêm s kh khăn đối với công t c chống lao
không những trong những năm tới mà c thể còn trong thời gian kh dài [2].
1. . Vi khuẩn lao
Vi khuẩn lao c tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis. Th c chất
t c nhân gây bệnh lao là một phức hợp gồm nhiều loài được gọi chung là


5

Mycobacterium tuberculosis complex (MT C). C c loài trong phức hợp này
là t c nhân gây nên bệnh lao trên c c vật chủ kh c nhau. Khả năng gây bệnh
của c c loài là kh c nhau, trong đ loài gây bệnh thường xuyên trên người là
Mycobacterium tuberculosis (MTB).
Đ

m hình th , cấu trúc

Vi khuẩn lao là tr c khuẩn mảnh, dài 2-4 µm, rộng 0,3-1,5 µm, đứng
riêng lẻ ho c xếp thành hình chữ N, Y, V ho c thành dãy phân nh nh như
cành cây. Tuy nhiên, cũng tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và thời gian nuôi
cấy mà vi khuẩn c k ch thước và hình dạng thay đổi, từ cầu tr c khuẩn đến
tr c khuẩn dài [12], [92].

Vi khuẩn lao trên kính hiển vi quang học

Hì


Hì

Vi khuẩn lao trên kính hiển vi điện tử

ả

ẩ

* Nguồn: theo Palomino J. C.(2007)[92]

Vi khuẩn lao kh bắt màu c c thuốc nhuộm thông thường. Thường
nhuộm theo phương ph p Ziehl - Neelsen, tr c khuẩn lao không bị cồn và
acid làm mất màu của carbonfuchsin, bắt màu đỏ [3], [12].
Mycobacterium tuberculosis c cấu trúc v ch tế bào phức tạp, hoàn hảo
mà t vi sinh vật c được. Nó không những đảm bảo cho s tồn tại của vi
khuẩn mà còn làm cho vi khuẩn bền vững đối với hiện tượng th c bào, khi
xâm nhập vào cơ thể vi khuẩn lao kh bị tiêu diệt. Vách c vai trò quan trọng
đối với khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn lao c tỷ lệ
lipit cao, chiếm tới hơn 60

trọng lượng khô của thành tế bào, trong đ axit


6

mycolic là thành phần lipit chủ yếu. Thành tế bào cũng được đ c trưng bởi s
liên kết giữa c c axit mycolic và c c chất lipid phức tạp, tạo nên độc t nh của
vi khuẩn lao, làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn giúp vi
khuẩn tồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị huỷ diệt bởi

đại th c bào và c c tế bào miễn dịch. Axit mycolic là c c chất béo nh nh
anpha duy nhất tìm thấy trong thành tế bào của Mycobacterium và
Corynebacterium. Chúng chiếm 50

trọng lượng khô của vỏ tế bào

Mycobacteria [92].
Đ

m nuôi cấy

Vi khuẩn lao ưa kh bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị kh . Vì
vậy, c c trường hợp lao phổi, thường tổn thương hay g p ở thuỳ trên của phổi.
Tuy nhiên, trong điều kiện thiếu oxy như trong c c nốt vôi ho , cục xơ ho ,
cục bã đậu rắn chắc vi khuẩn lao vẫn tồn tại ở trạng th i không hoạt động
trong kh nhiều năm [3], [12], [92].
Không nuôi được vi khuẩn lao ở môi trường thông thường, phải nuôi ở
môi trường đ c biệt, giàu chất dinh dưỡng, chứa trứng, khoai tây, citrat,
glycerol, asparagin, xanh malachit. Thường dùng môi trường đ c Löwenstein
được cải tiến bởi Jensen, ho c môi trường lỏng Sauton [3], [12], [92].
Vi khuẩn lao là vi khuẩn mọc chậm, thời gian một thế hệ của
Mycobacterium tuberculosis khoảng 18 giờ, phải 4-6 tuần sau mới hình thành
khuẩn lạc điển hình, dạng R [3], [92].

Hì

K

ẩ


ạ

ủ

ẩ

ô

* Nguồn: theo Lê Văn Phủng (2009)[9]

ườ

ô ấy


7

3 Đ

m phân t vi khuẩn lao

ộ gen hoàn chỉnh của Mycobacterium tuberculosis chủng H37Rv c
chiều dài 4.411.532 bp, bao gồm 3974 gen, trong đ c 3924 gen mã h a cho
protein và 50 gen mã h a cho c c RN

chức năng. Đây là genome có kích

thước rất lớn, chứa nhiều Guanine và Cystosine (G + C khoảng 65 ) và không
thay đổi hầu như trên toàn bộ genome [92].
Một trong những đ c t nh được quan tâm của Mycobacterium

tuberculosis là s c m t và phân bố của c c trình t chèn (insertion sequence IS), như IS6110 và IS1081, trong đ đ c biệt là đoạn IS6110. Tuy nhiên, một
số lượng đ ng kể c c chủng khuyết gen IS6110 đã được tìm thấy ở châu Á,
Ấn Độ và Việt Nam [40], [70], [87]. Gen 23S rDNA là đoạn gen mã h a cho
tiểu phần 23S của ribosome và c m t ở tất cả c c chủng lao gây bệnh. Vì thế,
c c gen này đang được quan tâm trong thiết kế kit chẩn đo n vi khuẩn lao.
1. . Vi khuẩn lao kháng thuốc
3

Tì

ì

ố

ủ

ẩ

ệ

y

Vi khuẩn lao kh ng thuốc đang là một trở ngại lớn đối với công t c
phòng chống lao toàn cầu. Năm 2008, tỷ lệ lao kh ng đa thuốc là 3,6 . Tỷ lệ
kh ng với c c thuốc chống lao dòng 1 trên toàn cầu là 59 . Tỷ lệ kh ng đa
thuốc trong số lao mới thay đổi từ 0
thứ ph t thay đổi từ 0

đến 28,3 . Trường hợp kh ng đa thuốc


đến 61,6 . Tại Uzbekistan tỷ lệ kh ng đa thuốc thứ

ph t lên đến 60,0 , zerbaijan là 55,8

[131].

Vi khuẩn lao kh ng đa thuốc đang là một th ch thức lớn cho toàn cầu.
ớc t nh năm 2012 c 450.000 trường hợp lao kh ng đa thuốc trên toàn thế
giới [133], chiếm 3,6

trong tổng số mắc lao mới và 20,2

trong số lao t i

ph t. Trung Quốc, Ấn Độ, Liên bang Nga là những nước c tỷ lệ lao kh ng
thuốc và kh ng đa thuốc lớn nhất (chiếm trên 50

số trường hợp lao phổi

kh ng đa thuốc trên toàn cầu) [133]. Đối với c c trường hợp mắc lao kh ng đa
thuốc thì thường kh khăn hơn trong điều trị, liên quan đến tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử


8

vong cao, kéo dài thời gian điều trị và làm tăng nguy cơ lan truyền c c chủng
kh ng thuốc trong cộng đồng. Trong khi thuốc chống lao hàng đầu chỉ c 5
thuốc, thì thuốc chống lao loại hai thường c độc t nh cao và gi thành rất đắt.
Đối với lao kh ng đa thuốc mở rộng (XDR-T ) việc điều trị s kh khăn và
tốn kém hơn nhiều so với MDR-T và tỷ lệ thất bại cao hơn. Tỷ lệ XDR-TB

trong số MDR-T thay đổi từ 0 đến 30

ở c c quốc gia kh c nhau trên toàn

cầu [131]. Những người mắc bệnh lao với chủng vi khuẩn kh ng đa thuốc mở
rộng cần phải điều trị trên 2 năm so với từ 6 - 8 th ng trước đây và chi ph điều
trị cũng tăng lên gấp 100 lần.
ả

Số ườ

ợ MDR-TB ă

ố

ứ

)ở

008 (b

ồ

ự

ả
ớ

Khu vực


Số lƣợng

Châu Phi

69 000

Châu Mỹ

8 200

Đông Địa Trung Hải

24 000

Châu Âu

81000

Đông Nam Á

130 000

Tây Th i ình Dương

120 000

Tổng cộng

440 000
* Nguồn: theo WHO(2010) [131]


Tại Việt Nam, tình hình kh ng thuốc của vi khuẩn lao đang là một vấn đề
đ ng lo ngại. Tỷ lệ kh ng thuốc trong c c trường hợp lao mới là 32,7% và
thuộc loại cao trên thế giới [89]. Năm 2013, tỷ lệ lao kh ng đa thuốc ở bệnh
nhân điều trị lại là 23 , tỷ lệ kh ng đa thuốc trong bệnh nhân mới là 4%. Việt
Nam đứng thứ 14 trong số 27 nước c g nh n ng bệnh lao kh ng đa thuốc
trên toàn cầu [4].
3

ạ

ố

ủ

ẩ

T nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao được định nghĩa là “s giảm mức
mẫn cảm của Mycobacterium tuberculosis trong in vitro làm cho chúng c s


9

kh c biệt với c c chủng dại chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc kháng sinh”
Trong c c trường hợp lao kh ng thuốc cần phải phân biệt [10], [131], [133],
[135]:
- Lao kháng đơn thuốc (monoresistant TB) là những trường hợp vi
khuẩn lao chỉ kh ng với một thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid,
rifampicin, pyrazinamide, ethambutol ho c streptomycin.
- Lao kháng nhiều thuốc (polydrug resistant TB): là những trường hợp

vi khuẩn lao kh ng với nhiều hơn một thuốc chống lao dòng thứ nhất (nhưng
không phải kh ng đồng thời cả isoniazid và rifampicin).
- Lao kháng đa thuốc (MDR-T ): là vi khuẩn lao kh ng t nhất với cả
2 loại thuốc là isoniazid và rifampicin.
- Lao kháng đa thuốc mở rộng (XDR-T ): là s đề kh ng với isoniazid
và rifampicin cộng với fluoroquinolone và t nhất 1 trong số 3 thuốc chống
lao dòng thứ hai dùng đường tiêm (amikacin, kanamycin ho c capreomycin).
Kh ng thuốc tiên ph t là kh ng thuốc xảy ra ở một bệnh nhân mới được
chẩn đo n lao, trước đ chưa sử dụng một liệu ph p điều trị chống lao nào
ho c đã điều trị với thời gian dưới 1 th ng, còn kh ng thuốc thứ ph t là s
ph t triển của kh ng thuốc trong ho c sau liệu ph p điều trị bằng ho chất t
nhất là 1th ng. Kh ng thuốc t nhiên là t nh kh ng thuốc của c c chủng kiểu
dại với c c thuốc đ c hiệu. V dụ: tất cả c c chủng M. bovis kiểu dại đều c
t nh kh ng thuốc t nhiên với pyrazinamide, Mycobacterium tuberculosis có
t nh kh ng t nhiên với penicillin.
33 C

kháng thuốc của vi khuẩn lao

T nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao liên quan đến s ph t sinh c c đột
biến một c ch ngẫu nhiên ở c c gen nằm trong vùng nhân của tế bào vi khuẩn.
C c chủng vi khuẩn lao hoang dại không tiếp xúc với c c thuốc chống lao s
không bao giờ xuất hiện t nh kh ng thuốc ngoại trừ kh ng thuốc t nhiên của


10

các loài vi khuẩn với một số thuốc như M. bovis kháng pyrazinamide, M.
tuberculosis kháng penicillin,... [94], [140].


Hì

3 C

ố ở

ẩ

*Nguồn: Zhang Y. (2009) [140]

Trong qu trình nhân lên của tr c khuẩn lao, t nh kh ng thuốc được ph t
triển theo những trật t x c định. T nh kh ng thuốc do s ph t sinh ngẫu nhiên
c c đột biến liên quan này được gọi là t nh kh ng di truyền. Khi không c m t
của thuốc kh ng sinh, c c chủng vi khuẩn lao mẫn cảm thuốc ph t triển lấn t
c c chủng kh ng thuốc. S c m t của thuốc kh ng sinh trong điều trị đã cung
cấp một p l c chọn lọc cho c c chủng vi khuẩn lao. C c chủng mẫn cảm bị ức
chế sinh trưởng, thậm ch bị tiêu diệt, c c chủng kh ng thuốc trở thành ưu thế
hình thành t nh kh ng thuốc thu được, đ c biệt là trong c c bệnh nhân c chứa
một lượng lớn tr c khuẩn lao. S lây lan của c c chủng kh ng thuốc này sang
những người kh c làm cho những người này bị nhiễm vi khuẩn lao kh ng thuốc
ngay từ đầu (t nh kh ng thuốc sơ cấp) [94], [134], [140]. T nh kh ng nhiều loại


11

thuốc kh c nhau của vi khuẩn liên quan đến s c m t đồng thời c c đột biến
ở c c gen đ c hiệu. V dụ, t nh kh ng isoniazid của vi khuẩn lao c tần suất là
10-6 , s xuất hiện c c đột biến liên quan đến t nh kh ng rifampicin c tần suất
khoảng 10-8, và s xuất hiện đồng thời c c đột biến liên quan đến t nh kh ng
cả 2 loại thuốc này là kết quả của hai đột biến độc lập nên s c tần số rất

thấp. Tuy nhiên, trong một quần thể vi khuẩn chỉ kh ng isoniazid, c c đột biến
ngẫu nhiên ph t sinh c thể dẫn đến t nh kh ng rifampicin ở một vài c thể. Khi
bệnh nhân được điều trị bằng tổ hợp isoniazid và rifampicin, c c chủng kh ng
cả 2 loại thuốc này s được chọn lọc ph t triển ưu thế. Tương t như vậy, s
xuất hiện của c c đột biến c thể dẫn đến t nh kh ng tổ hợp c c loại thuốc
kh ng sinh kh c ở vi khuẩn lao. Nguyên nhân dẫn đến xuất hiện c c chủng vi
khuẩn lao kh ng thuốc c thể do việc điều trị không th ch hợp ho c không
đầy đủ (sử dụng liệu ph p đơn trị liệu đầy đủ, chỉ định ph c đồ điều trị không
đúng - liều qu thấp, thời gian điều trị ngắn, không phối hợp thuốc ho c phối
hợp qu

t, c thời gian không dùng thuốc - và quan trọng nhất là bệnh nhân

chưa được tiếp cận đầy đủ trong điều trị). S lan truyền c c chủng lao kh ng
thuốc từ bệnh nhân sang những người kh c càng làm cho vấn đề trở nên
nghiêm trọng. C c kiểu hình MDR/XDR-T

được gây ra bởi s t ch tụ liên

tiếp c c đột biến trong c c gen kh c nhau liên quan đến s đề kh ng của từng
thuốc riêng biệt [62], [140].
1.3.3.1. Kháng rifampicin
Rifampicin (R) được đưa vào sử dụng trong điều trị chống lao vào đầu
những năm 1970 và là một thuốc chống lao dòng 1 rất quan trọng trong điều
trị. Rifampicin là thuốc diệt khuẩn, với MICs nằm trong khoảng từ 0,05 đến
1µg/ml trên môi trường đ c ho c lỏng, nhưng MIC còn cao hơn khi th c hiện
trên môi trường chứa trứng (2,5-10µg/ml). Những chủng c MICs < 1 µg/ml
trong môi trường lỏng ho c MICs < 40µg/ml trên môi trường LöwensteinJensen (LJ) được coi là nhạy cảm với rifampicin. Rifampicin hoạt động chống



12

lại cả vi khuẩn lao dạng hoạt động và dạng không hoạt động với hoạt động
trao đổi chất thấp [140].
Cơ chế t c động của rifampicin liên quan đến ức chế enzyme RN
polymerase phụ thuộc DN , phần l i của enzyme này bao gồm 5 tiểu đơn vị
kh c nhau và được mã ho bởi c c gen rpoA, rpoB, rpoC, rpoD [62].
Rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RN

polymerase (rpoB), enzyme chịu

tr ch nhiệm cho sao chép và biểu hiện của c c gen ở mycobacteria, kết quả là
ức chế hoạt động sao chép của vi khuẩn. C c đột biến trên gen rpoB mã h a
tiểu phần β s dẫn tới đề kh ng rifampicin.
Kh ng đơn với isoniazid thường g p còn kh ng đơn với rifampicin rất
hiếm g p. Hầu như tất c c chủng kh ng rifampicin cũng kh ng với c c thuốc
kh c, đ c biệt là isoniazid. Do đ , đề kh ng với rifampicin c thể được sử
dụng như một dấu ấn thay thế cho kh ng đa thuốc [23], [98], [112].
1.3.3.2. Kháng isoniazid
Isoniazid (isoniazid) là thuốc chống lao dòng 1 được sử dụng rộng rãi
nhất, được coi là thuốc cơ bản trong điều trị lao và c c trường hợp nhiễm lao
tiềm ẩn. MT

nhạy cảm cao với isoniazid (MIC 0,02-0,2 µg/ml). Isoniazid

chỉ hoạt động chống lại vi khuẩn lao đang nhân lên mà không c t c dụng với
vi khuẩn lao không nhân lên ho c ở trong điều kiện k kh .
Gen katG mã ho cho enzyme catalase peroxidase là enzyme duy nhất chỉ
c ở MT c khả năng hoạt ho tiền isoniazid thành dạng hoạt động. Isoniazid
dạng hoạt động t c động lên qu trình tổng hợp acid mycolic bằng c ch ức chế

enonyl-ACP reductase phụ thuộc N DH, được mã ho bởi gen inhA.
Cơ sở phân tử của t nh kh ng với isoniazid phức tạp hơn và do s đa
dạng đột biến ở 5 gen kh c nhau của M. tuberculosis: katG mã hoá catalase
peroxidase, inhA mã hoá enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase, kasA mã
hoá cho b-ketoacyl ACP synthase, ahpC mã hoá cho alkylhydroperoxide
reductase và ndh mã ho cho N DH dehydrogenase. Trong đ , 2 cơ chế chủ


13

yếu gây ra đề kh ng với isoniazid là c c đột biến trên gen katG và vùng
promoter của gen inhA [112].
C c đột biến thường g p nhất trên gen katG được tìm thấy giữa codon
138 và 328 với vị tr thường g p nhất là 315. S thay thế Ser315Thr xảy ra ở
khoảng 30-95% chủng kháng isoniazid, s thay thế này ở gen katG được cho
là tr c tiếp dẫn tới t nh kh ng ở mức độ cao với isoniazid [60], [62], [83].
S

đề kh ng với isoniazid cũng c

thể xảy ra do đột biến ở vùng

promoter của operon mabA/inhA, gây ra s biểu hiện qu mức của inh . Đột
biến này thường liên quan đến s đề kh ng ở mức độ thấp (MICs = 0,2 1µg/ml) và t g p hơn so với c c đột biến trên gen katG [112], [115]. Đột biến
xảy ra trên gen kasA dẫn tới s đề kh ng yếu với isoniazid, tuy nhiên các đột
biến này cũng được tìm thấy trên c c chủng nhạy cảm với isoniazid [62].
Khoảng 10-25

c c chủng đề kh ng yếu với isoniazid không c đột biến


trên gen katG và inhA, c thể là một hay nhiều cơ chế đề kh ng mới. Ngoài
ra, c c đột biến điểm trên gen ndh đã được ph t hiện ở 9,5

chủng đề kh ng

isoniazid mà không ph t hiện được ở c c chủng nhạy cảm isoniazid [62]. M c
dù thế, gần 5-10

c c chủng M. tuberculosis kh ng isoniazid không c đột

biến nào được x c định trên c c gen này.
Kháng isoniazid là dạng kháng thuốc thường g p nhất, c thể là kh ng
đơn độc ho c kết hợp với thuốc kh c. C c chủng lao kh ng đơn với isoniazid
chưa gây kh khăn cho điều trị [140].
1. . Các phƣơng pháp chẩn đoán lao kháng thuốc
Ph t hiện sớm t nh kh ng thuốc ch nh là một trong những ưu tiên trong
chương trình kiểm so t bệnh lao. Nó cho phép bắt đầu điều trị th ch hợp ở
những bệnh nhân cũng như giám sát kh ng thuốc. Phát hiện kh ng thuốc bằng
phương ph p truyền thống đã được th c hiện d a trên ph t hiện s ph t triển
của M. tuberculosis với s c m t của các kháng sinh. Tuy nhiên, do các
nhược điểm của c c phương ph p này mà hầu hết là do mất nhiều thời gian để


14

c được kết quả; trong những năm gần đây, c c phương ph p mới đã được đề
xuất. Bao gồm cả hai phương ph p kiểu hình và kiểu gen.
Phương ph p kiểu hình d a trên cơ sở s sinh trưởng của vi khuẩn lao
trên môi trường chứa thuốc kh ng sinh. Phương ph p kiểu gen d a trên cơ sở
ph t hiện đột biến liên quan đến kh ng thuốc kh ng sinh bằng kỹ thuật sinh

học phân tử. Mỗi phương ph p đều c ưu và nhược điểm riêng nhưng cả hai
đều hỗ trợ nhau trong việc x c định vi khuẩn lao kh ng thuốc.
4

ư

x

nh ki u hình

1.4.1.1. Phương pháp truyền thống
Có ba phương ph p kiểu hình truyền thống được th c hịên trên môi
trường đ c: phương ph p tỷ lệ, phương ph p tỷ lệ nồng độ ức chế tối thiểu và
phương ph p nồng độ tới hạn [92]. Trong đ , phương ph p tỷ lệ (proportion
method) là phương ph p được sử dụng rộng rãi nhất. Với phương pháp này,
chủng vi khuẩn lao với c c nồng độ như nhau được nuôi cấy trên môi trường
c chứa kh ng sinh và môi trường đối chứng không chứa kh ng sinh. Kết quả
được kiểm tra lần đầu sau 28 ngày ủ ở 37°C. Sau 42 ngày nuôi cấy, đếm lại số
khuẩn lạc để đ nh gi xem chủng c nhạy cảm với loại thuốc kh ng sinh nào
hay không. Đếm số khuẩn lạc trên c c môi trường này và so s nh. Nếu tỷ lệ
giữa số khuẩn lạc ph t triển trên môi trường chứa chất kh ng sinh so với số
khuẩn lạc ph t triển trên môi trường kiểm chứng lớn hơn 1

thì chủng đ

được kết luận là kh ng thuốc [38], [94]. M c dù c những hạn chế nhất định
về thời gian nhưng phương ph p này vẫn luôn được coi là tiêu chuẩn vàng để
x c định t nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao [63].
1.4.1.2. Các phương pháp nuôi cấy cải tiến
Phương ph p nuôi cấy truyền thống trên môi trường thạch tốn thời gian do

tốc độ sinh trưởng chậm của c c chủng vi khuẩn. Vì vậy, một số hệ thống nuôi
cấy cải tiến đã ra đời c thể rút ngắn thời gian chẩn đo n xuống còn 1-2 tuần.
Đ là phương ph p sử dụng hệ thống nuôi cấy

CTEC và MGIT [92].


15

Phương ph p này đã được Cục Quản lý Th c phẩm và Dược Phẩm (FDA) của
Mỹ phê duyệt để x c định s nhạy cảm với các thuốc chống lao dòng 1 [92].
Phương ph p nuôi cấy cải tiến thuận tiện, nhanh, tin cậy để th c hiện c c thử
nghiệm x c định độ nhạy cảm kh ng sinh tr c tiếp và gi n tiếp ở c c nước
đang ph t triển, đ c biệt sử dụng kh thành công như một phương ph p ph t
hiện tr c tiếp từ c c bệnh phẩm lâm sàng bị nhiễm (đờm). Tuy nhiên do chi phí
cao trong đầu tư thiết bị và kh khăn trong xử lý chất thải ph ng xạ nên việc p
dụng các phương ph p này trong chẩn đo n lâm sàng còn hạn chế [46], [92].
1.4.1.3. Một số phương pháp kiểu hình khác
Một số phương ph p kiểu hình kh c được thiết kế nhằm rút ngắn thời
gian chẩn đo n, đơn giản h a trong th c hiện và đọc kết quả như phương
ph p sử dụng phage đ c hiệu, phương ph p đo màu, phương ph p khử nitrate
hay thử nghiệm x c định độ nhạy cảm kh ng sinh trong môi trường lỏng với
k nh hiển vi đảo ngược (The microscopic observation broth-drug
susceptibility - MODS) [78], [86], [92], [93], [123]. MODS là phương ph p
nhanh, rẻ tiền để ph t hiện lao kh ng thuốc, đ c biệt c vai trò trong chẩn
đo n và loại trừ nhanh lao kh ng thuốc trên bệnh nhân lao đồng nhiễm HIV,
th ch hợp với c c nước đang ph t triển [94], [123]. Thử nghiệm này được
WHO khuyến c o sử dụng trong sàng lọc nhanh c c bệnh nhân nghi ngờ lao
kh ng đa thuốc [130].
Tuy nhiên vấn đề nguy cơ về an toàn sinh học và cần c c c nghiên cứu

đ nh gi so s nh với c c phương ph p chẩn đo n hiện c , đ nh gi độ chính
xác của các thử nghiệm này trong chẩn đo n vi khuẩn lao kháng thuốc, đ c
biệt là tr c tiếp từ mẫu bệnh phẩm đờm …[94], [106], [123].
1. . . Phƣơng pháp xác định kiểu gen
C c phương ph p x c định kiểu gen d a trên cơ sở x c định đột biến ở c c
gen c liên quan kh ng thuốc tương ứng thay vì tìm kiếm kiểu hình kháng thuốc
và bao gồm 2 bước cơ bản: sử dụng kỹ thuật PCR để khuyếch đại các đoạn gen


16

ở genom của các chủng đề kh ng; và bước thứ hai là đ nh gi sản phẩm khuyếch
đại để x c định c c đột biến đ c hiệu liên quan đến tính kháng thuốc.
1.4.2.1. Phương pháp giải trình tự DNA
Giải trình t gen (DN

sequencing) là phương ph p x c định vị tr sắp

xếp của nucleotid trong phân tử DN . Hiện nay người ta thường sử dụng hai
phương ph p giải trình t đ là phương ph p dideoxynucleotid và giải trình t
bằng m y t động.
Giải trình t đã trở thành phương ph p x c định kiểu gen được sử dụng
rộng rãi nhất để ph t hiện t nh kh ng thuốc của MT , n th c s ch nh x c và
tin cậy. Kể từ khi phương ph p giải trình t DN

không những ph t hiện mà

còn x c định được c c đột biến đ c hiệu, phương ph p này đã trở thành tiêu
chuẩn vàng để chẩn đo n lao kh ng thuốc. Phương ph p giải trình t cũng
phân biệt giữa c c đột biến dẫn đến thay đổi axit amin và c c đột biến im l ng

[94]. Phương ph p giải trình t đã được sử dụng rộng rãi để x c định c c đột
biến đ c trưng trên gen rpoB ở c c chủng kh ng rifampicin và để ph t hiện
c c đột biến chịu tr ch nhiệm kh ng c c thuốc kh c như isoniazid,
streptomycin, và ciprofloxacin. Đ c biệt với c c chủng kh ng đa thuốc,
phương ph p giải trình t được coi là rất hữu ch và chuẩn x c trong việc ph t
hiện c c đột biến [15], [34], [62], [92]. Phương ph p giải trình t ph t hiện
đột biến kh ng rifampicin và isoniazid cung cấp kết quả kh ng định từ đ c
thể p dụng sớm ph c đồ điều trị thay thế ở những bệnh nhân MDR [34].
Tuy nhiên, việc sử dụng phương ph p giải trình t để ph t hiện ch nh
x c c c đột biến mất nhiều công sức và đòi hỏi chuyên gia c trình độ chuyên
môn cao và trang thiết bị đắt tiền. Phần lớn c c phương ph p ph t hiện đột
biến sử dụng thiết th c ở c c nước nghèo với g nh n ng bệnh lao cao không
sử dụng phương ph p giải trình t DN .


17

1.4.2.2. Các phương pháp kiểu gen khác
Nhiều phương ph p sinh học phân tử kh c nhau đã được thiết kế và sử
dụng trong x c định t nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao, đ c biệt c vai trò
quan trọng ở c c khu v c c tỷ lệ lưu hành lao kh ng thuốc và kh ng đa thuốc
cao, phục vụ công t c chẩn đo n và kiểm so t tình hình bệnh nhân mắc bệnh
lao kh ng thuốc, đ c biệt lao kh ng đa thuốc [92], [94], [123].
Real-time PCR là phương ph p c độ đ c hiệu cao và c thể phân biệt
c c đột biến điểm xảy ra ở mỗi nucleotid [92], [94], [102], với ưu điểm lớn
nhất là thời gian th nghiệm được rút ngắn, do c c phản ứng được th c hiện
và số liệu được đ nh gi trong một hệ thống khép k n, do đ giảm thiểu tối đa
s nhiễm mẫu [94], [123].
Line probe assays (LPAs) là phương ph p ưu điểm trong việc ph t hiện
nhanh t nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao, đ c biệt là kh ng rifampicin (c thể

đơn độc ho c kết hợp với isoniazid). LPAs tập trung vào ph t hiện nhanh vi
khuẩn lao kh ng rifampicin (đơn độc ho c kết hợp isoniazid) đã được WHO
khuyến c o sử dụng ở c c phòng xét nghiệm cấp quốc gia từ năm 2008 [129].
GeneXpert (Real-time PCR) dùng để phát hiện nhanh s hiện diện của tác
nhân gây bệnh có trong bệnh phẩm với độ nhạy, độ đ c hiệu, độ chính xác cao.
Đây là kỹ thuật đơn giản không phải thao tác bằng tay, dễ th c hiện và cho kết
quả trong vòng 2 giờ. Toàn bộ quá trình xử lý, phát hiện và phân tích kết quả
được th c hiện trong 1 hệ thống khép kín, gọi là hệ thống GeneXpert (The
GeneXpert® System – Cepheid, USA). Đây là 1 bước tiến đ ng kể trong lĩnh
v c chẩn đo n, giúp ph t hiện sớm và giảm gánh n ng bệnh tật cho bệnh nhân
và giảm tải cho các bệnh viện tuyến trên. Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng đòi hỏi
trang bị m y m c ban đầu và chi ph xét nghiệm cao nên cũng không thể th c
hiện được ở c c tuyến y tế nếu không có tài trợ.
C c phương ph p sinh học phân tử kh c như PCR-RFLP, PCR đ c hiệu
alen cũng đã được thiết kế và p dụng trong chẩn đo n lao kh ng đa thuốc


18

d a trên c c đột biến thường g p chịu tr ch nhiệm kh ng rifampicin và
isoniazid [62]. Tuy nhiên, các kỹ thuật này thường kh

p dụng cho ph t hiện

đồng thời t nh kh ng nhiều loại thuốc kh ng sinh và việc sử dụng phương
ph p này trong sàng lọc đột biến liên quan đến t nh kh ng thuốc của vi khuẩn
lao còn hạn chế [62], [84].
1.5. Nghiên cứu giá trị chẩn đoán của các phƣơng pháp sinh học phân tử
trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng đa thuốc
Việc nghiên cứu ph t hiện c c đột biến trên gen rpoB và katG liên quan

kháng rifampicin, isoniazid và kh ng đa thuốc ở c c chủng vi khuẩn lao trên
thế giới cũng như ở Việt Nam thường được gắn liền với việc đ nh gi c c
phương ph p sinh học phân tử kh c nhau trong chẩn đo n vi khuẩn lao kh ng
rifampicin, isoniazid và kh ng đa thuốc. Nhiều nghiên cứu cũng tập trung vào
đ nh gi c c kỹ thuật chẩn đo n lao kh ng thuốc và kh ng đa thuốc bằng kỹ
thuật sinh học phân tử so với phương ph p kh ng sinh đồ truyền thống phương ph p luôn được coi là tiêu chuẩn vàng để x c định t nh kh ng thuốc
của vi khuẩn [63].
1.5.1. Trên th giới
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đ nh gi c c phương ph p sinh học
phân tử kh c nhau trong chẩn đo n lao kh ng thuốc và kh ng đa thuốc ở c c
khu v c kh c nhau trên thế giới với tỷ lệ mắc lao kháng thuốc và kháng đa
thuốc kh c nhau [15], [24], [32], [42], [52], [54], [63], [94].
Việc l a chọn kỹ thuật sinh học phân tử nào cho ph t hiện đột biến kh ng
đa thuốc ở vi khuẩn lao th c s là một th ch thức. Nhưng từ khi kỹ thuật giải
trình t ra đời đã được coi là tiêu chuẩn vàng cho việc x c định c c đột biến
kh ng thuốc. Vì vậy, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã lấy kỹ thuật giải trình t
làm cơ sở để ph t triển, thiết kế cũng như đ nh gi c c kỹ thuật phân tử x c
định nhanh t nh kh ng thuốc của vi khuẩn lao như LP s, realtime PCR,... [63].


19

Nghiên cứu của Cho tại Hàn Quốc năm 2009 cho thấy: So với kiểu hình
truyền thống, độ nhạy và độ đ c hiệu của phương ph p giải trình t là 83,0
và 96,6

cho ph t hiện t nh kh ng isoniazid (trong đ ph t hiện đột biến ở

codon 315 là 56,6 ); độ nhạy và độ đ c hiệu là 93,3


và 100

cho ph t hiện

t nh kháng rifampicin khi ph t hiện c c đột biến trong vùng RRDR của gen
rpoB. Độ nhạy khi ph t hiện đột biến ở cả 3 codon thường g p là 82,1
độ đ c hiệu là 100

với

[42]. T c giả Sharma và cộng s th c hiện kỹ thuật giải

trình t đoạn gen rpoB chứa vùng RRDR ở 35 chủng vi khuẩn lao kh ng đa
thuốc đã ph t hiện 100

chủng c xuất hiện đột biến [109].

Trong nghiên cứu của Huang W. L. và cộng s ; với kỹ thuật giải trình t
thì độ nhạy, độ đăc hiệu và độ ch nh x c cho ph t hiện kh ng rifampicin
tương ứng là 97,9 , 100 , và 98,2%; trong ph t hiện kh ng isoniazid là
93,4%, 100%, và 94,1 . T c giả cũng thấy rằng, để ph t hiện lao kh ng đa
thuốc độ nhạy, độ đăc hiệu và độ ch nh x c của kỹ thuật giải trình t là
91,3 , 100 , và 92,3 .

ằng kỹ thuật giải trình t , tất cả c c chủng lao

kh ng rifampicin đều mang đột biến trong vùng RRDR của gen rpoB, từ
codon 507 đến codon 533 [54].
Phương ph p LP s (với nhiều kit thương mại) là phương ph p phân tử
c nhiều ưu điểm trong việc ph t hiện nhanh t nh kh ng thuốc của vi khuẩn

lao. Năm 2008, WHO đã t n thành việc dùng xét nghiệm LPAs để sàng lọc
lao kh ng đa thuốc, và xét nghiệm MT DRplus đã được giới thiệu cho th c
hành thường quy tại nhiều nước [94], [129]. Xét nghiệm GenoType®
MTBDR (Hain lifescience, Nehren, Germany) c thể ph t hiện c c đột biến
quan trọng nhất c liên quan đến s đề kh ng rifampin và isoniazid trong
vùng RRDR của gen rpoB và đột biến ở codon 315 của gen katG [52]. Vì thế
nhiều nghiên cứu trên thế giới tập trung vào đ nh gi hiệu quả của phương
ph p này trong chẩn đo n lao kh ng thuốc và lao kh ng đa thuốc. Xét nghiệm
này đã được đ nh gi bởi nhiều phòng xét nghiệm ở c c nước kh c nhau, có


20

độ nhạy cảm và độ đ c hiệu cao, tin cậy để ph t hiện nhanh t nh kh ng
rifampicin và isoniazid (bảng 1.3). C c nghiên cứu cũng chứng minh rằng xét
nghiệm th c hiện tốt khi dùng tr c tiếp cho mẫu đờm

F dương t nh [51],

[73], [94], [120], [123]. Độ ch nh x c của thử nghiệm trong ph t hiện kh ng
rifampicin c thể so s nh gần ngang bằng với kỹ thuật kh ng sinh đồ truyền
thống, nhưng thử nghiệm này c độ ch nh x c thấp hơn trong ph t hiện kh ng
isoniazid [54].
ả

.Đ
ẩ

ệ


ả ủ

ư

L A
z

Kháng rifampicin
Se
Sp
Ac
(%) (%) (%)
99
100

Kháng isoniazid
Se
Sp
Ac
(%) (%) (%)
88,4 100

Kh ng đa thuốc
Se
Sp
Ac
(%) (%) (%)

Huang W. L. (2009)


95,4

100

81,8

100

78,5

Bwanga (2009)

99

99

96

100

95-

92-

72-

95-

Kalokhe (2013)


100

100

92

100

Aurin (2014)

99,5

98,8

Tác giả
Hilleman (2005)

96

83,8

Tài liệu
tham khảo
[52]

100

80,9

[54]

[32]

[63]

99,3

[24]

e: độ nh y, p: độ đ c hi u, c: độ ch nh ác

Xpert MT /RIF được dùng để phát hiện vi khuẩn lao và vi khuẩn lao
kháng rifampicin - một trong hai loại thuốc kháng lao chủ l c đang sử dụng
trong ph c đồ điều trị lao của WHO. Năm 2010, WHO đã khuyến cáo triển
khai sử dụng Xpert MTB/RIF trong chẩn đo n sớm lao và lao kh ng đa thuốc,
ưu tiên p dụng cho nhóm bệnh nhân nghi ngờ mắc lao kh ng đa thuốc và
người nhiễm HIV có triệu chứng nghi ngờ mắc lao [94], [132]. Với c c bệnh
nhân đồng nhiễm HIV, thường làm giảm độ nhạy của phương ph p nhuộm
soi, nhưng không ảnh hưởng đ ng kể đến Xpert MT /RIF. Kỹ thuật này để
ph t hiện đề kh ng với rifampicin đạt độ nhạy 98

- 99,5% và độ đ c hiệu

100% khi so s nh với phương ph p kiểu hình truyền thống [24], [39], [132].
Độ ch nh x c của phương ph p là 98,8

và 98,9

khi so s nh với phương



21

ph p LP s [24]. Một nghiên cứu tổng thể của Kalokhe cho thấy, độ nhạy và
độ đ c hiệu là 86-100
và 100

và 95-100

cho ph t hiện kh ng rifampicin; 76-94

cho ph t hiện kh ng isoniazid [63]. C c nghiên cứu cũng cho thấy

đối với c c trường hợp lao ngoài phổi, kỹ thuật GeneXpert MT /RIF c thể
đạt độ nhạy hơn 80

và độ đ c hiệu c

thể đạt tới 100 . GeneXpert

MT /RIF cho ph t hiện kh ng rifampicin đạt độ nhạy 94,4 , đ c hiệu 98 ,
gi trị d b o dương t nh 99,5

[91].

Gần đây nhất, nghiên cứu của Luz và cộng s đ nh gi phương ph p
LPAs cho thấy độ nhạy, độ đ c hiệu, gi trị d b o dương t nh, gi trị d b o
âm t nh so với phương ph p kiểu hình truyền thống lần lượt là 80 , 100 ,
100
64


và 63

trong ph t hiện đột biến trên gen rpoB; 72

100 , 100

và

trong ph t hiện đột biến trên gen katG. Độ nhạy, độ đ c hiệu, gi trị d

b o dương t nh, gi trị d b o âm t nh so với phương ph p giải trình t gen
lần lượt là 97,7 , 100 , 100
rpoB; 87,5 , 95,4

, 95,5

và 95,7
và 87,2

trong ph t hiện đột biến trên gen
trong ph t hiện đột biến trên gen

katG. Chỉ số kappa đ nh gi độ phù hợp chẩn đo n giữa kỹ thuật này với kỹ
thuật giải trình t rất tốt từ 0.825 đến 0.966 [79].
C c nghiên cứu của c c t c giả trên thế giới đều đ nh gi c c kỹ thuật
sinh học phân tử c gi trị cao trong việc ph t hiện nhanh t nh kh ng thuốc,
đ c biệt kh ng đa thuốc của vi khuẩn lao với độ nhạy và độ đ c hiệu cao, từ
đ giúp cho b c sĩ lâm sàng c thể tối ưu h a điều trị ban đầu cho bệnh nhân
[15], [63], [66], [73].
1.5


Tạ

ệ N

Đã c một số nghiên cứu trong nước đ nh gi c c kỹ thuật sinh học phân
tử trong chẩn đo n vi khuẩn lao kh ng thuốc và kh ng đa thuốc trong những
năm gần đây. C c nghiên cứu trong nước đều c chung nhận xét rằng, c c kỹ
thuật sinh học phân tử ph t triển s là công cụ hỗ trợ hữu hiệu cho việc xây
d ng chế độ điều trị phù hợp với bệnh nhân lao, đ c biệt bệnh nhân lao kh ng


22

đa thuốc, trong khi c c phương ph p kiểu hình truyền thống vốn mất rất nhiều
thời gian; g p phần hạn chế s lây lan c c chủng vi khuẩn kh ng thuốc, đ c
biệt kh ng đa thuốc trong cộng đồng.
T c giả Caw và cộng s sử dụng kỹ thuật giải trình t gen cho thấy độ
nhạy khi ph t hiện c c đột biến trong vùng RRDR của gen rpoB là 95

với

độ đ c hiệu 100 , độ nhạy ph t hiện kh ng isoniazid với đột biến 315 trên
gen katG là 78 , nếu thêm đột biến -15C → T trên gen inhA, độ nhạy lên đến
89

với độ đ c hiệu 100

[36].


Nguyễn Thị Mai Huyền và cộng s đã đ nh gi độ nhạy cảm và độ đ c
hịêu của xét nghiệm MTBDRplus tại Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, bằng c ch
sử dụng c c chủng vi khuẩn lao đã biết trước c c kiểu hình kh ng thuốc đại
diện cho miền Nam Việt Nam [56]. Xét nghiệm x c định đúng 93,2% kháng
rifampin, 91,2% kháng isoniazid, và 89
100

kh ng đa thuốc, và c độ đ c hiệu

cho mỗi trường hợp. Như thế, độ nhạy của xét nghiệm này hơi thấp hơn

c c nghiên cứu kh c trong khi đ độ đ c hịêu thì tương đương c c b o cáo
khác [24], [54]. Vì xét nghiệm sinh học phân tử c thể c kết quả trong vòng
1 ngày, nên việc p dụng xét nghiệm này rất c lợi ở những nơi c tỉ lệ đề
kh ng thuốc cao trong c c trường hợp lao như Việt Nam, để điều chỉnh kịp
thời những ph c đồ điều trị không th ch hợp. Với độ đ c hiệu 100

của xét

nghiệm sinh học phân tử để ph t hiện lao kh ng đa thuốc, nếu xét nghiệm này
được dùng thường quy để chẩn đo n nhanh lao kh ng đa thuốc thì c c bệnh
nhân c thể được điều trị th ch hợp hoàn toàn với ph c đồ 4 (điều trị lao
kh ng đa thuốc) [56].
Năm 2010, t c giả Nguyễn Văn Duy và cộng s đã tiến hành thiết kế và
đ nh gi kỹ thuật DN

array trong ph t hiện nhanh vi khuẩn lao bằng c ch

ph t hiện c c đột biến thường g p trên gen rpoB (codon 531, 526, 516), codon
315 trên gen katG và đột biến -15C → T thuộc vùng khởi động của gen inhA.

Kết quả cho thấy độ nhạy và độ đ c hiệu của kỹ thuật lần lượt là 93,6

và


23

100

đối với kh ng rifampicin; 87,4

và 100

đối với kh ng isoniazid so

với phương ph p kiểu hình truyền thống; độ nhạy và độ đ c hiệu đạt 100

so

với kết quả thu được bằng kỹ thuật giải trình t gen [5].
Đậu Quang Thọ và cộng s nghiên cứu trên c c chủng lao phân lập tại
miền Nam bằng kỹ thuật M S-PCR và Genotype MT DR assay cho thấy:
Với kỹ thuật Genotype MT DR assay, độ nhạy và độ đ c hiệu cho kh ng
rifampicin là 93,3

và 100 ; gi trị d b o dương t nh là 100

và gi trị d

b o âm t nh là 87,7 . Độ nhạy và độ đ c hiệu cho kh ng isoniazid là 82,6

và 100 ; gi trị d b o dương t nh là 100
48,9 . Trong nghiên cứu của t c giả c 66

và gi trị d b o âm t nh là
số chủng là kh ng đa thuốc với

gi trị d b o dương t nh và gi trị d b o âm t nh lần lượt là 100

và 70,3 .

Với kỹ thuật M S-PCR; độ nhạy và độ đ c hiệu cho kh ng rifampicin là
83,7

và 100 ; gi trị d b o dương t nh và gi trị d b o âm t nh lần lượt là

100

và 74,6 . T c giả cũng nhận thấy, 2 kỹ thuật này không đạt độ nhạy

100

cho ph t hiện t nh kh ng thuốc (kh ng đa thuốc), nhưng cả hai đều c

độ đ c hiệu 100

do đ rất hữu ch cho việc x c định nhanh t nh kh ng

rifampicin cũng như là kh ng đa thuốc [118].
Nghiên cứu của Shah năm 2009 tại Việt Nam khi đ nh gi kỹ thuật
LPAs trong ph t hiện lao kh ng rifampicin cho thấy độ phù hợp chẩn đo n

của LPAs với phương ph p kiểu hình truyền thống là 0,94 với độ nhạy 90
và độ đ c hiệu 100

[108].

Đề kh ng đồng thời isoniazid và streptomycin, không phải kh ng đa
thuốc, c mối liên quan mạnh m với nguy cơ gia tăng thất bại trong điều trị
ho c t i ph t và với kh ng đa thuốc mắc phải. Khoảng 25

chủng lao phân

lập tại TP Hồ Ch Minh là kh ng isoniazid tiên ph t và 15

kh ng tiên ph t

đồng thời với cả 2 thuốc là isoniazid và streptomycin. Vì thế t c giả Caw và
cộng s nghiên cứu ph t triển 1 test PCR-RFLP đơn giản, nhanh cho việc
sàng lọc kh ng isoniazid từ c c mẫu nuôi cấy dương t nh. Kết quả cho thấy kỹ


24

thuật c độ nhạy 80

và độ đ c hiệu 100 ; gi trị d b o dương t nh và gi

trị d b o âm t nh lần lượt là 100% và 86%. Test này cũng c chi ph thấp
(dưới 1,5USD/mẫu) và phù hợp cho ph t hiện nhanh t nh kh ng isoniazid ở
c c khu v c c


tỷ lệ đột biến katG315 cao trong c c chủng lao kh ng

isoniazid [37].
C c test sinh học phân tử không đạt được độ ch nh x c 100

cho đến

khi tất cả c c đột biến liên quan được mô tả. Một kết quả nhạy của xét nghiệm
sinh học phân tử do đ cũng chưa thể loại trừ kh ng rifampicin. Kỹ thuật
kh ng sinh đồ truyền thống nên được th c hiện đồng thời trên bệnh nhân; tuy
nhiên, ở khu v c c tỷ lệ mắc lao cao thì không khả thi, mà cần ưu tiên với
c c trường hợp nghi ngờ lao kh ng thuốc (kh ng đa thuốc) cao, như bệnh
nhân HIV (+), c c trường hợp tiếp xúc với lao kh ng đa thuốc và c c trường
hợp lao t i ph t, lao điều trị lại. Với c c trường hợp này, nếu kết quả sinh học
phân tử trả lời nhạy thuốc thì cần x c định bằng kỹ thuật kh ng sinh đồ truyền
thống ho c phương ph p kiểu hình kh c. Tuy nhiên, với độ đ c hiệu cao
(100 ), kỹ thuật sinh học phân tử cho phép ph t hiện sớm c c trường hợp lao
kh ng đa thuốc, giúp làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, tử vong và làm giảm nguy cơ
lan truyền c c chủng kh ng đa thuốc trong cộng đồng khi kết hợp với c c
chương trình điều trị kh ng đa thuốc hiệu quả.
1.6. Gen rpoB v katG liên quan đ n kháng thuốc ở vi khuẩn lao
1.6.1. Gen rpoB
Rifampicin ức chế tổng hợp RN

bằng c ch liên kết với c c RN

polymerase phụ thuộc vào DN , một enzyme quan trọng chịu tr ch nhiệm
phiên mã DN thành RN trong tổng hợp protein.
RN


polymerase (RN P) là một enzyme quan trọng trong qu trình

phiên mã và biểu hiện gen trong tất cả c c sinh vật sống [28]. Ở vi khuẩn, đại
diện là E. coli, RNA polymerase hoàn chỉnh (holoenzyme) là một protein lớn
c nhiều tiểu đơn vị, gồm hai phần ch nh là yếu tố sigma (σ) và lõi enzyme.


25

Yếu tố sigma giúp cho RN polymerase nhận biết và b m ch t vào promoter
để c thể bắt đầu phiên mã tại vị tr ch nh x c, và lõi enzyme đ ng vai trò
ch nh trong tổng hợp sợi RN . Phần l i enzyme c trọng lượng 400 kDa bao
gồm năm tiểu đơn vị; trong đ c 2 tiểu đơn vị α (α1 và α2), 1 tiểu đơn vị β,
1 tiểu đơn vị β', và 1 tiểu đơn vị ω tạo cấu trúc như càng cua với c c vùng cấu
trúc đ ng vai trò then chốt trong qu trình phiên mã (hình 1.4). Tiểu đơn vị
α1 và α2 đ ng vai trò là nền tảng để c c tiểu đơn vị β, β' b m vào và từ đ
th c hiện vai trò trong qu trình phiên mã. Tiểu đơn vị β' bám vào khuôn
DN

và tiểu đơn vị β giúp hình thành c c liên kết phosphodiester. Gen mã

ho cho c c tiểu đơn vị α, β, β' và σ là rpoA, rpoB, rpoC, rpoD. Gen rpoB mã
ho cho tiểu phần β của RNA polymerase, là đ ch t c động của kh ng sinh
rifampicin. Rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RN

polymerase (rpoB),

enzyme chịu tr ch nhiệm cho sao chép và biểu hiện của c c gen ở
mycobacteria, kết quả là ức chế hoạt động sao chép của vi khuẩn [17], [21],
[33], [140].


Hình 1.4 Cấ

ú

ủ RNA

y

* Nguồn: theo Alifano P. (2015) [21]

Gen rpoB c chiều dài 3534bp, với tỷ lệ G + C trên toàn bộ gen là 64,2 .
Như vậy khung đọc mở này mã ho cho protein với 1178 acid amin [81].