ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

MA THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI
CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN
TỪ AXIT FERULIC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

MA THỊ TRANG

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI
CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN
TỪ AXIT FERULIC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Dương Văn Cường

Thái Nguyên - 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Dương Văn Cường tại bộ môn Sinh học phân tử và công
nghệ gen, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên. Các số liệu, kết quả
trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào.
Mọi thông tin trích dẫn trong luận văn này được ghi rõ nguồn gốc
Thái Nguyên, ngày 14 tháng 5 năm 2016
Tác giả luận văn

Ma Thị Trang


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Dương
Văn Cường đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu,
thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học sự sống, các
thầy cô tại bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ gen đã tạo điều kiện giúp
đỡ tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo khoa Khoa học sự sống, trường Đại học
Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi
trong thời gian tôi học tập và hoàn thành khóa học này.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng

nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khan cùng tôi trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này.
Thái nguyên, ngày 14 tháng 10 năm 2016
Tác giả luận văn

Ma Thị Trang


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT................................................ vi
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. viii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề....................................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................... 3
4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................ 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................... 3
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
1.1. Giới thiệu về vanillin................................................................................... 4
1.1.1. Nguồn gốc ........................................................................................ 4
1.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa.................................................................. 5
1.1.3. Đặc tính sinh học .............................................................................. 6
1.1.4. Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống .............................. 8

1.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin ...................................................... 10
1.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật .......................... 10
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic trong vi sinh vật .... 10
1.3. Các phương pháp sản xuất vanillin ........................................................... 15
1.3.1. Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật .................................. 15
1.3.2. Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học ....................................... 16
1.3.3. Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học ................... 18
1.4. Tiềm năng ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong sản xuất
vanillin ............................................................................................ 21
1.4.1. Các gene mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic
.................................................................................................................. 21


iv

1.4.2.Vi khuẩn E. coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin.
.................................................................................................................. 23
1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin bằng ứng dụng công
nghệ ADN tái tổ hợp trong nước và ngoài nước........................... 26
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................. 26
1.5.2. Các nghiên cứu trong nước ............................................................ 29
Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 30
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 30
2.1.1 . Các chủng vi sinh vật .................................................................... 30
2.1.2. Các vector tách dòng và biểu hiện nền tảng ................................... 30
2.1.3. Mồi khuếch đại các gene gltA, fcs và ech. ............................... 35
2.1.4. Hóa chất.......................................................................................... 36
2.1.5. Thiết bị ........................................................................................... 37
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................. 37
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 38

2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 38
2.4.1. Quy trình tách dòng gene và thiết kế vector biểu hiện .................. 38
2.4.2. Nhân gene đích bằng PCR ............................................................. 41
2.4.3. Điện di trên gel agarose.................................................................. 42
2.4.4. Tách chiết ADN plasmid ................................................................ 43
2.4.5. Lập bản đồ giới hạn ........................................................................ 44
2.4.6. Thu nhận ADN từ gel agarose ....................................................... 45
2.4.7. Nối ADN bằng ADN ligase ........................................................... 46
2.4.8. Chuẩn bị tế bào khả biến ................................................................ 46
2.4.9. Biến nạp ADN vào E. coli khả biến ............................................... 47
2.4.10. Xác định trình tự nucleotide ......................................................... 47
2.4.11. Phân tích trình tự gene đã tách dòng ............................................ 48
2.4.12. Nuôi E. coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic ....................... 48
2.4.13. Lên men sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic ................ 49
2.4.14.Phân tích vanillin và axit ferulic bằng HPLC ............................... 50
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 51
3.1. Tách dòng và giải trình tự các gene mã hóa các enzyme xúc tác
con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic............................ 51


v

3.1.1. Tách dòng và giải trình tự gene gltA từ E. coli DH5α ................... 51
3.1.2. Tách dòng và giải trình tự gene ech từ Pseudomonas fluorescens
VTCC-B-668 ............................................................................................ 55
3.1.3. Tách dòng và giải trình tự gene fcs từ từ Amycolatopsis sp. HR104 . 60
3.2. Thiết kế vector biểu hiện chứa 3 gene gltA, ech, fcs trên nền
tảng vector pET22b+ ...................................................................... 65
3.2.1. Chuyển gene gltA từ pTZ-gltA sang pET22b+ tạo vector tái tổ hợp
pET22-G ................................................................................................... 65

3.2.2. Chuyển gene ech từ pTZ-ech sang pET22-G tạo vector tái tổ hợp
pET22-GE ................................................................................................ 68
3.2.3. Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang pET22-GE tạo vector tái tổ hợp
pET22-GEF .............................................................................................. 71
3.3.1. Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang vector pRSET tạo vector pRSET-F .. 72
3.3.2. Chuyển cụm hai gene gltA và ech từ pET22-GE sang pRSET-F tạo
vector tái tổ hợp pRSET-GEF .................................................................. 73
3.4. Sinh tổng hợp vanillin từ axit fefulic sử dụng E. coli tái tổ hợp làm tế bào
chủ................................................................................................... 75
3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic đến sinh trưởng của E. coli .. 75
3.4.2. Xác định axit ferulic tồn dư và vanillin được tổng hợp bởi hệ thống
pET22........................................................................................................ 76
3.5. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên năng suất sinh tổng
hợp vanillin .................................................................................... 77
3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ................................................. 77
3.5.2. So sánh các môi trường LB, M9 và 2YT ....................................... 78
3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG................................. 79
3.6. So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin giữa hai hệ vector
pET22 và pRSET ........................................................................... 80
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 82
4.1. Kết luận ..................................................................................................... 82
4.2. Kiến nghị ................................................................................................... 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 83


vi

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
4-CL


: 4-hydroxycinnamate-CoA ligase

ATP

: Adenosine triphosphate

Bp

: Base pair

CCl4

: Carbon tetrachloride

CoA

: Coenzyme Acetoacetyl

ĐHQGHN

: Đại học quốc gia Hà Nội

ADN

: Deoxyribonucleic acid

ADN-PK

: ADN protein kinase


ADN-PK

: ADN protein kinase

dNTP

: Deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli

: Escherichia coli

EDTA

: Etilenduamin tetraacetic acid

HCLC

: 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase

IPTG

: Isopropy Thyogalactoside

Kb

: Kilo base

LB


: Lauria Broth

NCBI

: NationCenter for Biotechnology Information

PCR

: Polymerase Chain Reaction

SDS

: Sodium doecyl sulfat

TAE

: Tris acetate EDTA

TCA

: Tricarboxylic acid

VAO

: Vanillyl alcohol oxidase

X-gal

: 5-bromo-4chloro-3indoly-β-D-galactoside



vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanillin ......................................................... 5
Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm ................ 8
Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ
phẩm ................................................................................................. 9
Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên ............. 20
Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T ............................................ 32
Bảng 3.2: Các thành phần của vector pRSET – A ........................................... 33
Bảng 3.3: Các thành phần của vector pET22b (+) ........................................... 34
Bảng 3.4: Trình tự mồi khuếch đại gene .......................................................... 35
Bảng 3.5: Danh mục các thiết bị ...................................................................... 37
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR.............................................................. 41
Bảng 3.7: Thành phần phản ứng cắt enzyme ................................................... 45
Bảng 3.8: Thành phần phản ứng nối ............................................................... 46
Bảng 3.9: Chương trình chạy HPLC phân tích axit ferulic và vanillin ........... 50


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Sơ đồ phân bố vanilla trên thế giới .................................................... 4
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của vanillin và vanillin dạng bột ......................... 5
Hình 1.3: Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA dependent).............. 11
Hình 1.4: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent) ................. 12
Hình 1.5: Con đường Non-oxidation decarboxylataion................................... 13
Hình 1.6: Con đường CoA-Independent Deacetylation................................... 14
Hình 1.7: Con đường Side-Chain Reductive .................................................. 15

Hình 1.8: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol (Kirk
& Othmer, 1983) ............................................................................ 17
Hình 1.9: Con đường phân hủy axit ferulic trong Pseudomonas
fluorescens BF13 (Calisti et al., 2008)........................................... 23
Hình 1.10: Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic (Yoon et al.,
2005) ............................................................................................... 24
Hình 1.11: Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA (Lee et
al., 2009) ......................................................................................... 25
Hình 2.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T .............................................. 30
Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc vector pRSET-A ...................................................... 32
Hình 2.3: Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+) .............................................. 33
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách dòng các gene gltA, ech, fcs từ E.coli
DH5 ,............................................................................................ 39
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện chứa các gene ................. 40
Hình 2.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ech ................ 41
Hình 2.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene fcs ................. 42
Hình 3.1: Sản phẩm PCR gene gltA (A), sản phẩm PCR sau khi tinh
sạch (B) và ADN plasmid các dòng khuẩn lạc màu trắng ............. 51
Hình 3.2: Plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gene gltA được cắt
bằng enzyme NcoI.......................................................................... 53
Hình 3.3: Kết quả xác định trình tự gene gltA ................................................. 54
Hình 3.4: Kết quả PCR khuếch đại gene ech ................................................... 55
Hình 3.5: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech........................... 56
Hình 3.6: (A) Thiết kế in silico vector pTZ-ech; (B) Kết quả cắt
kiểm tra vector tái tổ hợp đồng thời bằng SacI và EcoRI .............. 57


ix

Hình 3.7: Kết quả xác định trình tự gene ech .................................................. 59

Hình 3.8: Kết quả tách ADN tổng số từ Amycolatopsis sp. HR104
(DSM 9991)..................................................................................... 60
Hình 3.9: Sản phẩm PCR gene fcs (A), plasmid các dòng có khả
năng mang gene fcs (B), cắt plasmid tái tổ hợp bằng
EcoRI và BamHI (C)...................................................................... 61
Hình 3.10: Kết quả xác định và phân tích trình tự gene fcs............................. 64
Hình 3.11: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-G.............................. 66
Hình 3.12: Cắt plasmid dòng 1,7 bằng đồng thời 2 enzyme HindIII
và SacI ............................................................................................ 66
Hình 3.13: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gene gltA trong
pET22-G ......................................................................................... 67
Hình 3.14: Kết quả cắt pET22-G dòng 1,7 bằng enzyme NcoI ....................... 68
Hình 3.15: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pET22-GE ........................... 68
Hình 3.16: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng SacI và
EcoRI.............................................................................................. 69
Hình 3.17: Minh họa cơ sở kiểm tra chiều gắn gene ech trong
pET22-GE ...................................................................................... 70
Hình 3.18: Kết quả cắt các dòng plasmid đồng thời bằng EcoRI và
BamHI ............................................................................................ 71
Hình 3.19: Thiết kế vector tái tổ hợp pET22 mang 3 gene gltA, ech
và fcs .............................................................................................. 71
Hình 3.20: ADN plasmid của các khuẩn lạc trắng có khả năng mang
pRSET-F (A) và cắt plasmid bằng enzyme SacI và
BamHI (B) ...................................................................................... 72
Hình 3.21: Cấu trúc theo lý thuyết của vector pRSET-GEF (A), cắt
plasmid bằng các tổ hợp enzyme khác nhau (B) và
Marker 1kb được dùng làm thang chuẩn để xác định kích
thước các băng của sản phẩm cắt (C)............................................. 74
Hình 3.22: Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic ban đầu với sinh
trưởng của E. coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF ................. 75

Hình 3.23: Phân tích HPLC động học sự chuyển hóa axit ferulic
thành vanillin ở chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp
mang vector pET22-GEF. .............................................................. 76


x

Hình 3.24: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh
trưởng và sinh tổng hợp vanillin của chủng E. coli tái tổ
hợp. ................................................................................................. 77
Hình 3.25: So sánh khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin
của E. coli tái tổ hợp trên các môi trường LB, M9 và
2YT................................................................................................. 78
Hình 3.26: Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sinh tổng hợp
vanillin............................................................................................ 79
Hình 3.27: So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit
ferulic sử dụng các chủng E. coli tái tổ hợp mang
vector pET22-GEF và pRSET-GEF ............................................ 80


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan
trọng được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ
uống, nước hoa, dược phẩm, dinh dưỡng [66]. Mức độ tiêu thụ hàng năm trên
thế giới vào khoảng hơn 12000 tấn [44]. Vanillin còn thể hiện các đặc tính
chống khuẩn và chống oxy hóa [71], đồng thời đã có nghiên cứu chứng minh
vanillin có tác dụng chống đột biến và ung thư [71].

Vanillin được sản xuất chủ yếu từ nguồn tách chiết vỏ quả của loài lan
Vanilla planifolia và tổng hợp nhân tạo từ eugeneol, lignin…Trong đó,
vanillin được tách chiết từ thực vật chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường, còn lại
là tổng hợp hóa học. Giá trị kinh tế của vanillin tự nhiên từ Vanilla
planifolia có giá lên tới 4000 đôla một kilogam, trái lại vanillin nhân tạo
chỉ vào khoảng 15 đôla trên một kilogram [84]. Tuy nhiên, vanillin nhân
tạo không được đánh giá tương đương như vanillin tự nhiên theo quy định
của Mỹ và Châu Âu do thiếu hẳn các hương vị thuần khiết của vanillin tự
nhiên và quá trình tổng hợp gây ảnh hưởng xấu tới môi trường [51].
Sự khác biệt lớn giữa giá trị của vanillin tự nhiên với vanillin tổng hợp
đã kích thích mối quan tâm của ngành công nghiệp hương liệu để sản xuất ra
vanillin tự nhiên, bảo vệ môi trường và hiệu quả kinh tế bằng các con đường
sinh tổng hợp thông qua các chuyển hóa sinh học nhờ vi sinh vật từ các nguồn
cơ chất như axit ferulic, eugeneol, isogeneol, lignin,…
Trong các nguồn cơ chất trên, axit ferulic được nghiên nhiều về các con
đường chuyển hóa để tạo ra vanillin có thể được ghi nhãn tự nhiên. Axit
ferulic có nhiều trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm nên có thể thu từ
các phế phụ phẩm nông nghiệp. Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy axit
ferulic để tạo ra vanillin như Amycolatopsis sp. strain HR167 [6], Delftia
acidovorans [63], Pseudomonas putida [62], Streptomyces setonii [73],


2

Pseudomonas fluorescens [53],…Vanillin mặc dù được tổng hợp từ các vi
sinh vật trên song nó bị phân hủy thành các hợp chất khác, do vậy làm giảm
nồng độ vanillin tạo ra. Đồng thời quá trình lên men một số xạ khuẩn thường
gặp khó khăn bởi dịch nuôi cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi
nấm và bào tử.
Với những khó khăn trên, hướng nghiên cứu tiếp theo là tổng hợp

vanillin trong các vi khuẩn không mang gene sinh tổng hợp cũng như không
có con đường phân hủy vanillin bằng kĩ thuật ADN tái tổ hợp. Trong số đó, E.
coli được xem là một vật chủ tiềm năng bởi các lý do sau:
- Vanillin tạo ra bằng con đường này được chấp nhận là vanillin tự nhiên.
- Axit ferulic chiếm tỉ lệ cao trong mô thực vật, do đó là nguồn cơ chất
phổ biến, rẻ tiền tận dụng từ phụ phẩm nông nghiệp.
- Ở các loại vật chủ khác, vanillin sau khi tạo thành nhanh chóng bị
chuyển hóa thành các sản phẩm khác, hoặc là bị chính vật chủ tái sử dụng như
một nguồn cacbon. E. coli là vật chủ không mang các con đường chuyển hóa
này, do đó sản xuất vanillin nhờ E. coli không bị yếu điểm này.
- E. coli là loài vi khuẩn lành tính, đặc điểm di truyền cũng như quy trình
lên men đã được nghiên cứu kĩ.
Từ các luận điểm trên, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này với
mục tiêu sử dụng kĩ thuật di truyền để tạo ra chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp
chứa các gene của con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic. Chủng E.
coli này sẽ có khả năng sản xuất ra vanillin tự nhiên từ axit ferulic.
2. Mục tiêu của đề tài
Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp mang các gen mã hóa cho
enzyme sinh tổng hợp axit ferulic thành vanillin.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Tách dòng gene gltA, ech và fcs
Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện mang các gen gltA, ech, fcs


3

Nội dung 3: Đưa vector biểu hiện vào tế bào chủ, cảm ứng biểu hiện các
gen đích
Nội dung 4: Phân tích sản phẩm vanillin được tạo thành
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo được chủng E.coli có khả năng sản
xuất ra vanillin từ axit ferulic là nền tảng để thực hiện nhiều nghiên cứu
ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp để tạo ra sản phẩm thực tiễn. Giúp bổ
sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các đối tượng tiếp theo. Là nguồn
tài liệu tham khảo hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo về công nghệ ADN
tái tổ hợp.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là tiền đề để sản xuất vanillin từ vi sinh
vật giúp cung cấp cho thị trường lượng vanillin tự nhiên với giá cả phù hợp
với túi tiền người tiêu dùng.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về vanillin
1.1.1. Nguồn gốc
Vanillin là hỗn hợp chất thơm tự nhiên phổ biến trên thế giới được tách chiết
từ vỏ quả loài lan Vanilla planifolia. Trong số hơn 250 thành phần chất hóa học
khác nhau được tách chiết từ vỏ quả, vanillin chiếm thành phần chủ yếu.
Lịch sử về nguồn gốc vanillin bắt đầu từ sự khám phá ra loài lan Vanilla
planifolia ở Mesoamerica suốt những năm 1930. Người Aztecs (Mexico) được coi
là cái nôi đầu tiên trong việc sử dụng vanilla cho đồ uống của họ. Sau đó, người
Tây Ban Nha xâm chiếm và mang nó về Châu Âu, song mọi cố gắng để có thể
trồng được cây Vanilla planifolia đều thất bại do không có sự thụ phấn tự nhiên.
Cho đến khi nhà thực vật học Charles Morren phát hiện ra bí mật của sự miễn
cưỡng sinh sản ở những vùng đất ngoài Mexico, điều này đã dẫn tới khám phá ra
sự thụ phấn nhân tạo cho hoa cuả vanilla [71].

Ngày nay, vanilla được trồng phổ biến ở một số quốc gia như Indonesia,
Trung Quốc, Madagascar, Mexico,…

Hình 1.1: Sơ đồ phân bố vanilla trên thế giới


5

1.1.2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa
Vanillin có dạng bột kết tinh màu trắng với mùi thơm mạnh, dễ chịu. Về mặt
hóa học, vanillin là một phenolic aldehyde (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde),
có công thức phân tử là C8H8O3, bao gồm các nhóm aldehyte, ete, phenol [18].

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của vanillin và vanillin dạng bột
(Converti et al., 2010)
Các đặc tính lí hóa của vanillin được thể hiện dưới bảng sau:
Bảng 1.1: Các đặc tính hóa lí của vanillin
(Ravendra, Sharma, & Prem Shanker, 2012)
Đặc tính

Dữ liệu

Trọng lượng phân tử

152.15

Nhiệt độ nóng chảy

80-810C


Nhiệt độ sôi

2850C

Độ hòa tan

1g/100ml

Tỉ trọng hơi (không khí=1)
Áp suất hơi
Hằng số phân li

5.2
2.2 x 10-3 mmHg ở 250C
pKa1= 7.40, pKa2= 11.4(250C)


6

1.1.3. Đặc tính sinh học
Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những đặc tính của vanillin như
chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, chống bệnh hồng cầu lưỡi
liềm,… [71].
1.1.3.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Vanillin và dẫn xuất thể hiện mức độ khác nhau về hoạt tính kháng
nấm bao gồm các loại nấm men, nấm mốc gây hư hại thực phẩm [23].
Vanillin còn ức chế sự sinh trưởng của nấm men và nấm mốc trong nước hoa
quả ép, thạch hoa quả [45] và trong bảo quản xoài chế biến tươi và chống lại
một số nấm men gây bệnh quan trong trong y học như Candida albicans,
Cryptococcus neoformans [16], [56].

Vanillin đóng vai trò như một tác nhân kháng khuẩn chống lại
Escherichia coli, Lactobacillusp lantarum, Listeria innocua. Schiff bases
(thuốc nhuộm fuchsin) có nguồn gốc từ vanillin được đánh giá là một chất
kháng khuẩn chống lại một số chủng Gram dương và gram âm như
Pseudomonas pseudoalcaligenes, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii,
Enterobacter aero-genes, Staphylococcus subfava, Bacillus megaterium
[76]. Tuy nhiên cần có hướng nghiên cứu xác định nồng độ nhỏ nhất mà ở

đó vanillin hoạt động như một chất kháng vi sinh vật cũng như chất bảo
quản tự nhiên.
1.1.3.2. Hoạt tính kháng oxy hóa
Vanillin đã được công nhận với khả năng chống oxy hóa cũng như
hoạt tính phân hủy các gốc tự do. Vanillin có khả năng chống lại các tổn
thương ở não dưới sự cảm ứng của carbon tetrachloride (CCl 4) tác nhân
gây oxy hóa ở chuột [47], bảo vệ lớp màng ty thể gan khỏi quá trình oxy
hóa được cảm ứng bởi sự nhạy cảm ánh sáng trên ty thể gan chuột [35]. Sự
có mặt của vanillin với lượng nhỏ trong thực phẩm cũng giúp chống lại oxy
hóa, ức chế sự tự oxy hóa ở sữa béo.


7

1.1.3.3. Hoạt tính chống ung thư và đột biến
Vanillin đã được nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư và đột biến.
Vanillin ức chế đột biến ở locus CD59 trên NST 11 ở người được cảm
ứng bởi hydrogene peroxide, N-methyl-N-nitrosoguanidine và mitomycin
C [27]. Vanillin ức chế con đường Non-homologous ADN end- joining
(NHEJ) gây ra sự đứt gãy trên mạch kép ADN bởi ức chế hoạt tính của
ADN-PK (ADN protein kinase) , làm giảm số lượng khối u ruột cảm ứng
bởi nhiều tác nhân trong mô hình chuột [7].

1.1.3.4. Hoạt tính hạ lipid trong máu
Vanillin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tình trạng bệnh lí
như siêu mỡ trong máu. Hoạt tính dược lí của vanillin như một tác nhân
hạ lipid trong máu khi nồng độ vượt quá phạm vi cho phép trong điều trị
bệnh tiểu đường (type 2), rối loạn tim mạch, béo phì. Trước đó đã có
nghiên cứu vanillin làm giảm lượng triglycerin trong huyết tương,
triglycerin liên kết với lipoprotein và triglycerin trong gan trên đối tượng
chuột [72].
1.1.3.5. Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm
Vanillin trong các thí nghiệm in vitro đã chứng minh khả năng
chống tạo hồng cầu lưỡi liềm bởi tác động của nhóm aldehyde với
hemoglobin trong tế bào hồng cầu [5] . Tuy nhiên vanillin được hấp thụ
theo đường uống không có tác động trị liệu bởi vì nó có sự phân hủy
nhanh chóng trong dịch tiêu hóa. Để khắc phục vấn đề này, chế phẩm
vanillin MX- 1520 đã được tổng hợp. Lợi ích sinh học của loại thuốc
này chống tạo thành hồng cầu lưỡi liềm mạnh gấp 5 lần so với vanillin
tự nhiên [89] .
1.1.3.6. Các hoạt tính khác
Các loại dầu dễ bay hơi tách chiết từ nghệ, cỏ xả, húng quế kết
hợp với 5% vanillin có tác dụng hiệu quả chống lại các loài muỗi [74] .


8

1.1.4. Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống
Vanillin được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất
nước hoa, mỹ phẩm và dược phẩm [71].
Trong công nghiệp thực phẩm, vanillin là một phụ gia rất thông dụng,
đặc biệt trong sản xuất kem đá lạnh (ice cream). Ngoài sử dụng trong sản xuất
kem, vanillin còn được dùng rất nhiều để làm tăng hương vị và tạo mùi thơm

cho bánh, kẹo, cho các loại đồ uống.
Hương thơm đặc trưng của vanillin được sử dụng trong lĩnh vực mỹ
phẩm như tạo mùi cho nước hoa, kem, sữa dưỡng ẩm, nước hoa xịt phòng, xà
phòng ,….
Bảng 1.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm
Sản phẩm

Mức độ sử dụng (ppm)
Bình thường

Tối đa

Đồ nướng

74.5

106.0

Ngũ cốc

353.0

353.0

Chất béo, tinh dầu

96.0

100.0


Nước sốt ngọt

358.0

363.0

Bánh pudding

47.7

117.0

Đồ ăn nhẹ

200.0

200.0

Đồ uống loại I

39.4

97.4

Các sản phẩm sữa

221.0

314.0


Đồ uống loại II

26.7

55.2

Bơ sữa đông lạnh

1.5

2.7

Các sản phẩm sữa

247.0

408.0

Kẹo mềm

30.1

47.1
Nguồn: CAS N°: 121-33-5


9

Bảng 1.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm
Sản phẩm


Hàm lượng

Trạng thái
vật lí

TLTK

Đồ uống không cồn
Kem
Kẹo
Đồ nướng
Nước ngọt
Chocolate
Kẹo Bonbons
Chocolate sữa
Đường cô
Mứt kẹo
Đường vanillin

0.0063%
0.095%
0.02%
(Furia &
Bellanca, 1975)
0.022%
Hoà tan
0.033-2.0%
hoặc rắc lên
0.097%

bề mặt
Lên tới 0.05%
Lên tới 0.03%
Lên tới 0.015%
ACF
ChemieFarmaNV
Lên tới 0.055%
2%
Bột
Bình thường: 0.2%
Nước hoa
Tối đa: 0.8%
Bìnhthường:0.005%
Kem, sữa dưỡng ẩm
Hòa tan
Opdyke, 1977
Tối đa: 0.03%
Bình thường:0.01%
Xà bông
Tối đa: 0.1%
Nguồn: CAS N°: 121-33-5
Vanillin còn được sử dụng trong tổng hợp thuốc một số loại thuốc như:
Aldomet (thuốc chống tăng huyết áp), L-dopa (điều trị di chứng của bệnh
Parkinson) và Trimethoprim (điều trị chứng viêm đường hô hấp cấp và một số
biến dạng của bệnh hoa liễu) [18], [24].
Vanillin còn là một chất khử mùi hữu hiệu để che giấu mùi khó chịu của
nhiều loại mặt hàng như đồ may mặc, sản phẩm cao su, giấy và chất dẻo,…Thông
thường chỉ cần đến một lượng nhỏ, vì mùi của vanillin có thể cảm nhận được ngay
ở độ pha loãng khoảng 0,0000002 mg trong 1 m3 không khí [2]. Ngoài ra, vanillin
còn được sử dụng ngăn chặn tạo bọt trong sự bôi trơn nhiều loại dầu, làm sáng

trong lớp phủ kẽm bồn tắm, hỗ trợ sự oxi hóa tinh dầu hạt lanh, hấp dẫn côn trùng,
ngăn chặn xỉn màu răng gây ra bởi khói thuốc lá, hòa tan vitamin B1 và xúc tác
phản ứng trùng hợp methyl methacrylate [39].


10

1.2. Các con đường sinh tổng hợp vanillin
1.2.1. Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật
Quả vanilla được thu hoạch khoảng từ 6 đến 8 tháng sau quá trình
thụ phấn và ở giai đoạn này chúng chưa bộc lộ ra hương vanilla [79].
Mùi hương chỉ được giải phóng ra trong quá trình lên men, được
gọi là “curing”. Khi glucoside, glucovanillin, các ß-glucoside liên quan
bị thủy phân bởi enzyme ß-D-glucosidase sẽ giải phóng ra vanillin tự
do và các chất liên quan [57].
Mặc dù vanillin là một trong số những chất hóa học được nghiên
cứu nhiều song những con đường sinh tổng hợp chúng trong thực vật
vẫn c̣ n gây nhiều tranh luận, bởi v́ chưa có nghiên cứu chính xác nào
xác định và nêu ra đặc trưng của tất cả các bước trong con đường được
đề xuất. Có một giả thiết nói rằng vanillin là sản phẩm của con đường
acid shikimic. Ở con đường này, phenylalanine hoặc tyrosine trải qua
khử amin hóa tới C 6 – C 3 phenylpropanoid, tiếp đó đóng vai trò như
một cơ chất cho vanillin [30].
1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic trong vi sinh vật
Một số vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đã được nghiên cứu để
xác định các gene mã hóa các enzyme xúc tác phản ứng tổng hợp vanillin từ các
cơ chất khác nhau như lignin, eugeneol, isoeugeneol, axit ferulic, glucose,…Trong
đó đáng chú ý nhiều là các chuyển hóa sinh học từ axit ferulic.
Axit ferulic (acid 4-hydroxy-3-methoxycinnamic) là một thành phần phổ
biến trong thực vật được tạo ra từ sự trao đổi chất phenylpropanoid, kết hợp

với acid dihydroferulic tạo nên tính vững chắc của thành tế bào bằng liên kết
chéo giữa lignin và polysacchatide [58].
Axit ferulic là thành phần phenolic chủ yếu được tìm thấy trong thành tế
bào của thực vật hai lá mầm, nên nó có thể được thu từ các nguồn phế phẩm
nông nghiệp như vỏ ngu, cám ngu, củ cải đường, thành tế bào nội nhũ gạo,


11

lúa mỳ, lúa mạch. Axit ferulic còn là cơ chất ít độc tính nhất với vi sinh vật
trong số các cơ chất được nghiên cứu. Vì vậy, có thể coi đây là cơ chất thích
hợp cho sản xuất vanillin sinh học [50].
Các nhà nghiên cứu đã đưa ra 5 con đường chuyển hóa axit ferulic thành
vanillin, đó là con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent), βoxidative deacetylation (CoA-dependent), Non-oxidative decarboxylation,
CoA-Independent Deacetylation, Side-Chain Reductive .
1.2.2.1. Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
Các gene mã hóa enzyme cần cho con đường Non-β-oxidative deacetylation
đã được xác định và xác nhận hoạt tính của chúng [25].

Hình 1.3: Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)
Con đường này có ba bước xúc tác với sự tham gia của hai enzyme: 4hydroxycinnamate-CoA ligase (4-CL) hay feruloyl-CoA synthetase, mã hóa bởi
gene fcsvà 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase (HCHL) hay enoyl-CoA
hydratase/aldolas được mã hóa bởi gene ech. Đầu tiên, enzyme HCHL chuyển axit
ferulic thành feruloyl-ScoA, sau đó 4-CL xúc tác thủy phân feruloyl-ScoA thành
một chất trung gian tạm thời 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-hydroxypropionylScoA và tách chuỗi bên theo kiểu retro-aldol thành vanillin và acetyl-ScoA. Một


12


gene khác liên kết với gene fcs và gene ech mã hóa enzyme vanillin-xidoreductase
gây oxi hóa vanillin thành sản phẩm khác [25].
Các gene và enzyme tham gia vào các phản ứng tương ứng đã được xác
định ở các chủng Pseudomonas fluorescens AN103 [25], Pseudomonas sp.
HR199 [59], Streptomyces setonii [51], Amycolatopsis sp.HR167 [6], Delftia
acidovorans [63], and Pseudomonas putida KT2440 [62]. Sự nhận biết về đặc
trưng của các gene mã hóa cho các enzyme đưa ra cơ hội mới cho điều hướng trao
đổi chất và cấu trúc các chủng tái tổ hợp.
1.2.2.2. Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
Con đường β-oxidation deacetylation được đề xuất cho P. Putida [88]
và Rhodotorula rubra [32].

Hình 1.4: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)
(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)
Bước đầu là sự hình thành feruloyl-ScoA từ axit ferulic được xúc tác
bởi enzyme 4-CL. Bước thứ hai enzyme HCHL xúc tác phản ứng cộng nước
để tạo thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-ketopropionyl-ScoA và trải qua
quá trình lưu phân (thyolytic)thành vanillyl-ScoA và acetyl-ScoA. Tiếp theo,
vanillyl-ScoA cộng nước (hydrate) và loại CoASH hình thành vanillin, bước
này được xúc tác bởi enzyme b-ketoacyl-CoA-thiolase (aat).


13

1.2.2.3. Con đường non-oxidative decarboxylation
Đầu tiên là sự tham gia của enzyme decarboxylase xúc tác phản ứng
đồng phân hóa axit ferulic thành một chất quinoid trung gian và sau đó loại
gốc cacboxyl tạo thành 4-vinylguaiacol [33].

Hình 1.5: Con đường Non-oxidation decarboxylataion

(Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)
Các chất trung gian của các phản ứng xuôi dòng tiếp theo giữa 4 vinylguanicol và vanillin chưa được xác định. Đặc trưng của mỗi loại
enzyme decarboxylase phụ thuộc vào từng vi sinh vật [13] . Trong số đó
ở nấm men Brettanomyces anomalus, enzyme được sản xuất ở mức độ
thấp và được cảm ứng nhờ sự bổ sung của cơ chất [22] .
Rhodotorulaglutinis và Rhodotorularubra đã được báo cáo về cơ
chế trao đổi chất axit ferulic qua quá trình loại nhóm cacboxyl [32] .
1.2.2.4. Con đường CoA-Independent Deacetylation
Trong suốt con đường này, liên kết đôi dạng trans của axit ferulic
cộng nước tạo thành một chất trung gian tạm thời là acid 4-hydroxy-3methoxy-b-hydroxypropionic.