i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn
của GS.TS. Chu Hoàng Mậu và PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh. Các số liệu,
kết quả trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trong các tạp chí
khoa học công nghệ, phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, tháng 03 năm 2017
Tác giả luận án
Hoàng Thị Thao


ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Chu Hoàng Mậu,
PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hƣớng dẫn và chỉ bảo trong
suốt quá trình tôi nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ nghiên cứu
Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn
thành các thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo
dục sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện
luận án. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các cán bộ Bộ phận
đào tạo Sau đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Nông - Lâm Bắc
Giang, chân thành cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Nông học - Trƣờng Đại học
Nông Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học
tập và công tác.
Tôi rất biết ơn những ngƣời thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động
viên, khích lệ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày

tháng 03 năm 2017

TÁC GIẢ
Hoàng Thị Thao


iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT .........................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 3

4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................................ 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................5
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA MỌT HẠI ĐẬU XANH VÀ SỰ THIỆT HẠI DO MỌT
GÂY RA CHO ĐẬU XANH ............................................................................. 5
1.1.1. Cây đậu xanh .................................................................................................... 5
1.1.2. Mọt đậu xanh và ảnh hƣởng của mọt đến bảo quản hạt đậu xanh.................... 8
1.1.3. Đánh giá khả năng kháng mọt của đậu xanh .................................................. 13
1.2. DEFENSIN THỰC VẬT ................................................................................... 14
1.2.1. Các nhóm defensin thực vật............................................................................ 14
1.2.2. Cấu trúc của defensin thực vật ........................................................................ 16
1.2.3. Hoạt động ức chế của defensin thực vật ......................................................... 19
1.2.4. Một số nghiên cứu biểu hiện gen defensin thực vật ....................................... 23
1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN
DEFENSIN THỰC VẬT Ở MỘT SỐ LOÀI ĐẬU THUỘC CHI VIGNA ...... 26
1.3.1. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở một số loài đậu thuộc chi Vigna ................ 26
1.3.2. Hệ thống tái sinh in vitro và tạo cây đậu xanh chuyển gen ............................ 30


iv

1.3.3. Một số thành tựu chuyển gen defensin ở thực vật .......................................... 32
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................35
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................... 35
2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................................. 35
2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector ........................................................... 36
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................ 36
2.2.1. Hóa chất .......................................................................................................... 36
2.2.2. Các loại thiết bị máy móc ............................................................................... 36
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án................................................... 37

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................... 37
2.3.1. Phƣơng pháp đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu...... 37
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự nucleotide ................. 39
2.3.3. Thiết kế vector chuyển gen ............................................................................. 45
2.3.4. Phƣơng pháp tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens..................... 48
2.3.5. Nhóm phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen............................................... 53
2.3.6. Các phƣơng pháp phân tích, xử lý số liệu ...................................................... 56
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................57
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT VÀ PHÂN LẬP GEN VrPDF1
CỦA CÂY ĐẬU XANH .................................................................................. 57
3.1.1. Khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu ............................. 57
3.1.2. Khuếch đại và tách dòng gen VrPDF1 t giống đậu xanh T m TH và ĐX22 ... 61
3.1.3. Đặc điểm của gen VrPDF1 phân lập t hai giống đậu xanh T m TH và ĐX22 ... 62
3.1.4. Thảo luận về cấu trúc của protein defensin .................................................... 67
3.1.5. Sự đa dạng về trình tự nucleotide trong vùng mã hoá của gen VrPDF1 ở
cây đậu xanh .................................................................................................. 68
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN VrPDF1 VÀ PHÂN TÍCH HOẠT
ĐỘNG CỦA VECTOR CHUYỂN GEN TRÊN CÂY THUỐC LÁ ............... 71
3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện ở hạt thực vật mang gen VrPDF1 b ng kỹ thuật
Gateway ......................................................................................................... 71


v

3.2.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen in vitro mang gen VrPDF1 .............................. 74
3.2.3. Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 ở các dòng cây
thuốc lá chuyển gen b ng kỹ thuật PCR và Southern blot............................. 77
3.2.4. Phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trên cây thuốc lá
chuyển gen ở thế hệ T1 .................................................................................. 79
3.3. TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI

TỔ HỢP VrPDF1 Ở GIỐNG ĐẬU XANH ĐX22 .......................................... 84
3.3.1. Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen ....... 84
3.3.2. Xác định sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển VrPDF1 trong hệ gen
cây đậu xanh chuyển gen ............................................................................... 87
3.3.3. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển VrPDF1 trong các dòng cây đậu
xanh chuyển gen T1 ....................................................................................... 90
3.3.4. Kiểm tra hoạt động ức chế -amylase t ấu trùng mọt của protein tái tổ
hợp rVrPDF1 ở thế hệ T1 .............................................................................. 92
3.3.5. Thảo luận kết quả tăng cƣờng biểu hiện protein VrPDF1 ở cây đậu xanh
chuyển gen ..................................................................................................... 95
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................100
1. Kết luận ............................................................................................................... 100
2. Đề nghị ................................................................................................................ 100
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .....................101
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................102


v

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
µg

Microgam

AS

Acetylseringone

BAP


Benzylaminopurine

bp

Base pair

cs

Cặp bazơ nitơ
Cộng sự

CCM

Cocultivation medium

Môi trƣờng đồng nuôi cấy

cDNA

Complementary DNA

DNA bổ sung

CTAB

Hexadecyltrimethyl ammonium
bromide

Cys


Cysteine

DEPC

Diethyl pyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent
assay

Xét nghiệm ELISA

GM


Germination Medium

Môi trƣờng nảy mầm

Gus

β-Glucuronidase

HRP

Horseradish Peroxidase

IAA

Indole Acetic acid

IPTG

Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside

Kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

LB


Luria Bertani

Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản
nuôi cấy vi khuẩn

MS

Murashige và Skoog, 1962

Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản
nuôi cấy mô thực vật


vi

mRNA

Messenger ribonucleic acid

NAA

Naphthaleneacetic acid

NptII

Neomycyn phosphatranferaseII

Gen kháng kanamycine


OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

PDF1

Plant defensin type 1

Gen defensin 1 ở đậu xanh

RNA

Ribonucleic acid

RM

Rooting medium

Môi trƣờng tạo rễ

RT-PCR


Reverse transcription polymerase
chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase phiên
mã ngƣợc

rVrPDF1

Recombinant VrPDF1 protein

Protein defensin tái tổ hợp VrPDF1

ScFv

Single-chain variable fragment

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SEM

Shoot Elongation Medium

Môi trƣờng kéo dài chồi

SIM

Shoot Induction Medium


Môi trƣờng tạo đa chồi

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq DNA
polymerase

Thermus aquaticus DNA
polymerase

T-DNA

Transfer DNA

Đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực
vật

Ti-plasmid

Tumor inducing – plasmid

Plasmid gây khối u

T0, T1

Các thế hệ cây chuyển gen

T0


Cây chuyển gen tái sinh t chồi
trong ống nghiệm

T1

Hạt của cây chuyển gen T0 nảy
mầm thành cây T1

TMB

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

v/p

Vòng /phút

WT

Wild type

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalacto-pyranoside

Kiểu dại


vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số thực vật chuyển gen defensin ....................................................... 33
Bảng 2.1. Nguồn gốc các giống đậu xanh nghiên cứu ............................................. 35
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong nghiên cứu .............................. 39
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .................................................... 41
Bảng 2.4. Các thành phần bổ sung phản ứng tổng hợp cDNA................................. 41
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR nhân gen VrPDF1 ........................................ 42
Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng nhân gen VrPDF1 ........................................... 42
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ghép nối gen VrPDF1 vào vector tách dòng pBT ...... 43
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối gen VrPDF1 với vector pDON201SLHEP-HA.......................................................................................................... 46
Bảng 2.9. Thành phần phản ứng LR ......................................................................... 47
Bảng 2.10. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy in vitro cây đậu xanh .................. 51
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh qua
các thời gian nhiễm mọt.......................................................................... 59
Bảng 3.2. Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của gen VrPDF1 ........ 64
Bảng 3.3. Các vị trí amino acid sai khác giữa ba trình tự amino acid suy diễn
của gen VrPDF1 ..................................................................................... 65
Bảng 3.4. Thống kê một số trình tự gen PDF1 sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền....... 69
Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng và hệ số phân ly của các giống đậu xanh dựa trên
trình tự nucleotide của gen VrPDF1 ....................................................... 69
Bảng 3.6. Hệ số tƣơng đồng và hệ số phân ly của các giống đậu xanh dựa trên
trình tự amino acid suy diễn của gen VrPDF1 ....................................... 70
Bảng 3.7. Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso -VrPDF1 vào mô lá thuốc lá ...... 76
Bảng 3.8. Hoạt độ của -amylase t ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủ
với dịch chiết protein t hạt của các dòng cây thuốc lá chuyển gen
và t hạt cây không chuyển gen ............................................................. 82
Bảng 3.9. Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22 ...... 86
Bảng 3.10. Hoạt độ của -amylase t ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủ
với dịch chiết protein t hạt của các dòng đậu xanh chuyển gen T1

và t hạt cây không chuyển gen ............................................................. 93


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc tiền protein của hai lớp defensin thực vật ....................... 17
Hình 1.2. Cấu trúc không gian của protein defensin ở động vật, côn trùng và
thực vật. .................................................................................................. 18
Hình 1.3. Cấu trúc không gian của defensin thực vật (VrD2) ................................. 19
Hình 1.4. Mô hình cấu trúc defensin VrD1 ở cây đậu xanh..................................... 25
Hình 2.1. Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu ................................................... 35
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang gen kháng mọt VrPDF1 ............ 45
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tái sinh và chuyển gen ở cây đậu xanh ........................ 50
Hình 3.1. Biểu đồ so sánh khối lƣợng hao hụt giữa các giống đậu xanh sau
các thời điểm nhiễm mọt. ....................................................................... 57
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 của hai
giống đậu xanh T m TH và ĐX22.. ....................................................... 61
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân gen VrPDF1
t các dòng khuẩn lạc E. coli DH5 ...................................................... 62
Hình 3.4. Trình tự nucleotide gen VrPDF1 (cDNA) của hai giống đậu xanh
T m TH, ĐX22 và trình tự mang mã số AB020613 trên GenBank ...... 63
Hình 3.5. Trình tự amino acid suy diễn t gen VrPDF1 của hai giống đậu
xanh T m TH, ĐX22 và đoạn trình tự mang mã số AB020613 ............. 64
n 3. . Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen VrPDF1 phân lập t mRNA
và DNA của giống đậu xanh T m TH và ĐX22 .................................... 66
Hình 3.7. Sơ đồ các cầu nối disulfide giữa các cặp Cys trong vùng chức năng
của protein VrPDF1 ................................................................................ 68
Hình 3.8. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự nucleotide

của gen VrPDF1 của các giống đậu xanh............................................... 70
Hình 3.9. Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự amino
acid của gen VrPDF1.............................................................................. 71
Hình 3.10. Sơ đồ cấu trúc vector pDON201-SLHEP-VrPDF1 và kết quả điện
di sản phẩm colony-PCR kiểm tra vector pDON201-SLHEPVrPDF1. .................................................................................................. 72


ix
Hình 3.11. Sơ đồ một đoạn trong cấu trúc vector pBetaPhaso-VrPDF1;Kết
quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra vector chuyển gen
pBetaPhaso-VrPDF1............................................................................... 73
n 3.

. Sơ đồ tóm tắt quy trình chuyển cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 vào
mô lá thuốc lá giống K326 và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen. ........... 75

Hình 3.13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 t dòng
cây thuốc lá đƣợc chuyển gen ở thế hệ T0.. ........................................... 77
n 3.

. Kết quả phân tích cây thuốc lá chuyển gen b ng lai Southern .............. 78

Hình 3.15. Kết quả lai Western của protein hạt t

một số dòng thuốc lá

chuyển gen thế hệ T1. ............................................................................. 80
Hình 3.16. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng protein rVrPDF1 tái tổ hợp giữa các
dòng thuốc lá chuyển gen.. ..................................................................... 81
Hình 3.17. Biểu đồ so sánh kết quả thử nghiệm hoạt động ức chế của

rVrPDF1 đối với -amylase t ấu trùng mọt đậu xanh.. ........................ 83
Hình 3.18. Hình ảnh các giai đoạn biến nạp và tái sinh cây đậu xanh chuyển gen......... 85
Hình 3.19. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 t các
dòng cây đậu xanh đƣợc chuyển gen ở thế hệ T0 .................................. 88
Hình 3.20. Kết quả phân tích Southern blot của DNA tổng số các cây đậu xanh
chuyển gen VrPDF1 với đoạn dò nptII đƣợc đánh dấu b ng biotin. ....... 89
Hình 3.21. Kết quả phân tích Western blot t 3 dòng đậu xanh chuyển gen thế
hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen. ........................................... 92
Hình 3.22. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lƣợng protein tái tổ hợp
VrPDF1 của ba dòng đậu xanh chuyển gen và cây đối chứng
không chuyển gen. .................................................................................. 92
Hình 3.23. Hình ảnh phân tích định tính khả năng ức chế α-amylase ấu trùng
mọt đậu xanh của protein tái tổ hợp rVrDEF1 t hạt cây đậu xanh
chuyển gen ĐX22 thế hệ T1 và hạt cây đậu xanh ĐX22 đối chứng
không chuyển gen. ................................................................................. 94
Hình 3.24. Biểu đồ so sánh hiệu suất hoạt động -amylase và hiệu suất ức chế
-amylase của protein defensin trong hỗn hợp -amylase t

ấu

trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết t cây chuyển gen, cây
không chuyển gen ................................................................................... 99


1

MỞ ĐẦU
. Đặt vấn đề
Đậu xanh là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt,
đứng sau đậu tƣơng và lạc. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm. Hạt đậu

xanh v a cung cấp protein cho con ngƣời, v a có giá trị trong y học, và cũng là
cây có giá trị trong cải tạo đất bởi rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi khuẩn cố
định đạm sống cộng sinh. Việt Nam n m trong khu vực nhiệt đới, khí hậu thƣờng
nóng ẩm. Đây là điều kiện tốt để phát triển sản xuất nông nghiệp, tuy nhiên cũng
là yếu tố thuận lợi cho sâu hại phát sinh, phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới
năng suất và phẩm chất nông sản. Theo ƣớc tính, tổn thất sau thu hoạch khoảng t
10% - 30% sản lƣợng cây trồng nông nghiệp. Điều này có nghĩa là khoảng 10% 30% lƣợng lƣơng thực không bao giờ đƣợc sử dụng và cũng là tỷ lệ tổn thất của
công sức và tài chính đầu tƣ trong sản xuất nông nghiệp. Lƣợng nông sản bị hao
hụt này có thể ảnh hƣởng đến an ninh lƣơng thực của một phần dân số thế giới. Do
đó, việc đánh giá và hạn chế tổn thất sau thu hoạch là công tác rất có ý nghĩa trong
việc đảm bảo lƣơng thực, thực phẩm trong điều kiện hạn chế diện tích trồng trọt
và dân số đang gia tăng hiện nay.
Đối với nhóm nông sản là hạt thì một trong những nguyên nhân chính gây
tổn thất đến số lƣợng và chất lƣợng hạt là côn trùng mà chủ yếu là một số thuộc
Bộ cánh cứng (thƣờng gọi là mọt). Các loài mọt gây hại chủ yếu cho đậu đỗ là:
mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis (L.)), mọt đậu đỏ (Callosobruchus
maculatus F.), mọt đậu nành (Ancanthoscelides obtectus)…Trong đó, mọt đậu
xanh Callosobruchus chinensis (L.) thuộc họ Bruchid, bộ Coleoptera là loài gây
hại chủ yếu cho hạt đậu xanh. Ngoài ra, mọt đậu xanh còn gây hại trên các loại
đậu khác nhƣ: đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu đen … Mọt có thể gây thành dịch t
một số lƣợng nhỏ cá thể do khả năng sinh sản lớn và thời gian phát triển cá thể
ngắn. Sự tổn hại do mọt gây ra là rất lớn, do đó công tác phòng tr mọt đậu nói
chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cần đƣợc quan tâm nghiên
cứu. Trong công tác chọn tạo giống thì bên cạnh yếu tố năng suất cao và chất


2

lƣợng tốt thì khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh trong đó có khả năng
kháng mọt ở hạt là vấn đề cần thiết trong lĩnh vực chọn giống đậu đỗ nói chung

và chọn giống đậu xanh nói riêng.
Hiện nay, đã có một số nghiên cứu bƣớc đầu đánh giá về khả năng kháng
mọt, kháng nấm, kháng virus trên một số loại cây trồng trong đó có đậu xanh. Tuy
nhiên, những nghiên cứu ở đậu xanh mới tập trung đánh giá về mức độ thiệt hại mà
còn ít nghiên cứu về cơ chế phân tử của tính chống chịu sinh vật hại nói chung và
tính kháng mọt nói riêng. Theo các nghiên cứu đã công bố, đặc tính kháng mọt hại
hạt của cây trồng rất phức tạp và liên quan đến hoạt động của protein defensin.
Defensin thực vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trƣng bởi cấu trúc gấp cuộn ba
chiều qua 8 cầu nối disulfide của các cystein. Defensin thực vật hoạt động mạnh sẽ
tổng hợp protein ức chế, ảnh hƣởng đến kênh trao đổi ion, tác động đến hoạt động
của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật… Cơ chế gây độc của defensin
đối với mọt đậu xanh là sự cản trở hoạt động phân giải tinh bột của -amylase trong
ruột mọt và ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của mọt, ức chế sự sinh trƣởng phát triển
của mọt. Ngoài ra, defensin thực vật còn ức chế sự phát triển của một loạt các loại
nấm và một số loại virus gây hại cây lƣơng thực.
Defensin trong hạt đậu xanh có hàm lƣợng thấp và khác nhau giữa các giống, vì
thế để tăng hiệu quả ức chế α-amylase của ruột ấu trùng mọt, việc ứng dụng công nghệ
gen nh m tăng cƣờng biểu hiện, nâng cao hàm lƣợng defensin trong hạt đƣợc quan tâm
nghiên cứu. Xuất phát t những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài luận
án là: “Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
(i Phân tích đƣợc đặc điểm của gen defensin 1 (VrPDF1) phân lập t các giống đậu
xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt khác nhau.
(ii Biểu hiện đƣợc gen VrPDF1 trên cây thuốc lá chuyển gen.
(iii) Tạo đƣợc cây đậu xanh chuyển gen chứa gen VrPDF1 liên quan đến tính kháng
mọt Callosobruchus chinensis (L.).


3


3. Nội dung nghiên cứu
i) Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống đậu xanh trồng phổ
biến ở miền Bắc Việt Nam.
ii) Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen VrPDF1 phân lập t cây
đậu xanh. Phân tích đặc điểm trình tự nucleotide, trình tự amino acid suy diễn của
gen VrPDF1 phân lập t giống đậu xanh có khả năng kháng mọt tốt nhất và giống
đậu xanh kháng mọt kém nhất.
iii) Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1 và phân tích hoạt động
của vector chuyển gen trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1.
iv) Nghiên cứu chuyển cấu trúc chứa gen VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen.
Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong cây đậu xanh chuyển gen ở thế hệ
T1.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống t đánh
giá và phân nhóm các giống đậu xanh có khả năng kháng mọt khác nhau; phân lập,
tách dòng gen VrPDF1 đến thiết kế vector chuyển gen thực vật, tạo cây chuyển gen
và phân tích sự biểu hiện gen chuyển VrPDF1, cụ thể là:
1) Đã phân lập đƣợc gen VrPDF1 t DNA hệ gen của hai giống đậu xanh có khả năng
kháng mọt khác biệt nhau. Gen VrPDF1 có kích thƣớc 356 bp gồm 1 intron (128 bp)
xen giữa 2 exon (228 bp); cDNA VrPDF1 có 228 bp, mã hóa 75 amino acid.
2) Protein tái tổ hợp rVrPDF1 đƣợc biểu hiện trên cây thuốc lá chuyển gen và dịch
chiết chứa protein rVrPDF1 t dòng thuốc lá chuyển gen T1 có khả năng ức chế amylase của ruột ấu trùng mọt.
3 Tạo đƣợc cây đậu xanh của giống ĐX22 mang gen chuyển VrPDF1 ở thế hệ T1
và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rVrPDF1. Chứng minh đƣợc dịch chiết
chứa protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu hiện ức chế -amylase của ấu trùng mọt, hiệu
suất ức chế -amylase ở hai dòng chuyển gen DX1-3 và DX1-7 tăng 166,40 % và
178,19% so với cây không chuyển gen.


4


5. Ý ng ĩa k oa ọc và thực tiễn
5.1. Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen
VrPDF1 phân lập t các giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt khác
nhau. Sự tăng cƣờng biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF và biểu hiện khả năng ức
chế -amylase của ruột ấu trùng mọt của protein này t cây chuyển gen là những cơ
sở khoa học để khẳng định hiệu quả của việc ứng dụng công nghệ gen nh m nâng
cao khả năng kháng mọt của đậu xanh nói riêng và cây trồng thu hạt nói chung.
5.2. Về mặt thực tiễn
Các trình tự gen VrPDF1 phân lập đƣợc, cấu trúc vector chuyển gen thực vật
mang gen VrPDF1, các dòng cây chuyển gen ở T1, dịch chiết chứa rVrPDF1 có khả
năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt đã góp phần giải quyết những vấn đề
cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng kháng mọt
của cây đậu xanh, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại vào thực
tiễn chọn giống cây trồng thu hạt ở Việt Nam.


5

C ƣơng . TỔNG QUAN TÀI LIỆU

. . ĐẶC ĐIỂM CỦA MỌT HẠI ĐẬU XANH VÀ SỰ THIỆT HẠI DO MỌT
GÂY RA C O ĐẬU XANH

. . . Cây đậu xanh
Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck] thuộc ngành Magnoliophyta, lớp
Magnoliopsida, bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna. Chi Vigna là một trong những
chi lớn trong họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ: Vigna, Haydonia, Plactropic,
Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron, Sigmaidotrotopis. Đậu xanh bao gồm các

loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn đƣợc gọi là nhóm đậu châu Á, bao gồm
16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V. radiata, V. mungo, V. aconitifolia, V.
angularis, V. umbellata [11], [16]. Đậu xanh có bộ nhiễm sắc thể 2n = 22, là loại
cây ăn hạt, thân thảo. Đậu xanh có nguồn gốc t Ấn Độ, đƣợc phân bố rộng rãi ở
các nƣớc Đông và Nam Á, khu vực Đông Dƣơng. Dạng dại của V. radiata cũng
đƣợc tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dƣơng, Đông Phi [11].
Bên cạnh những cây lƣơng thực nhƣ lúa, ngô, lạc…thì đậu xanh cũng là loài
cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng
23 - 28%), ngoài ra còn có lipid khoảng 1,3%, glucid 56 - 60,2%, nƣớc và các chất
khoáng cùng nhiều loại vitamin. Các sản phẩm chế biến t đậu xanh không chỉ phù
hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nƣớc mà còn là mặt hàng xuất khẩu. Lá non và
ngọn của cây đậu xanh có thể đƣợc dùng để làm rau, muối dƣa. Thân, lá xanh có thể
dùng làm thức ăn cho vật nuôi [1], [2]. Ngoài ra đậu xanh còn có giá trị trong y học,
vỏ hạt đậu xanh có vị ngọt, tính mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải
bách độc [17]. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dƣỡng đất. Nhờ
hệ rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium có
khả năng cố định nitơ t khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lại lƣợng
đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch. Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở
nên tơi xốp và giàu dinh dƣỡng hơn [15].


6

Cây đậu xanh gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Hệ rễ đậu xanh
thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ chính thƣờng ăn sâu khoảng
20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới 70 - 100 cm. Rễ phụ thƣờng
gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm. Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa
vi khuẩn cổ định đạm Rhizobium. Trung bình mỗi vụ, 1 ha đậu xanh có thể bù lại
cho đất tƣơng ứng 85 - 107 kg nitơ làm cho đất tơi xốp hơn [12], [13].
Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng 40 70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng. Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có màu xanh

hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu sáng bao bọc [15]. Lá
cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách. Trên mỗi thân chính có 7 - 8
lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá đơn. Lá thật hoàn chỉnh gồm
có: lá kèm, cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt trên và dƣới của lá đều có lông bao phủ
[15]. Hoa đậu xanh là loại hoa lƣỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to, xếp xen
kẽ nhau ở trên cuống. Hoa đậu xanh thƣờng nở rải rác nên ngƣời ta chia hoa đậu
xanh thành 3 nhóm: Nhóm ra hoa không tập trung hoa nở liên tiếp trên 30 ngày,
nhóm ra hoa tập trung hoa nở kéo dài trong khoảng 16 ngày trở lại, nhóm 3 là nhóm
ra hoa trung gian hoa nở trong khoảng 16 - 30 ngày [15]. Quả đậu xanh thuộc loại
quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng dẹt với đƣờng kính 4 - 6 mm, dài 8 14 cm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2 gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có
một số hơi cong, khi còn non quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc
xám đen, đen. Mỗi cây có t 8 - 35 quả, mỗi quả có t 8 - 15 hạt [1], [12]. Hạt không
nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất dinh dƣỡng. Hạt gồm vỏ
hạt, rốn hạt 2 lá mầm và 1 mầm non. Mầm non là nơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn,
thân chính và lá kép đầu tiên. Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi... và
có nhiều màu sắc khác nhau nhƣ: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc,
vàng bóng n m ngăn cách nhau b ng những vách xốp của quả [1].
Hạt đậu xanh có giá trị dinh dƣỡng cao, trong hạt đậu xanh có chứa tƣơng
đối đầy đủ các chất dinh dƣỡng cần thiết cho con ngƣời và gia súc. Thành phần
hóa học của hạt đậu xanh thay đổi phụ thuộc vào giống, điều kiện khí hậu, điều


7

kiện canh tác, và vị trí của hạt ở trong quả. Các chất hữu cơ trong hạt đậu xanh
bao gồm protein, glucid, lipid, vitamin, enzyme, và một số chất màu. Trong 100
gam hạt đậu xanh có khoảng 23,4g protein, 53,1g glucid, 2,4g lipid. Các chất vô
cơ gồm nƣớc, muối khoáng [15], [17].
Protein chiếm hơn 90% các hợp chất chứa nitơ của hạt còn các chất phi
protein có hàm lƣợng không đáng kể. Protein đậu xanh có: protein hòa tan trong

nƣớc (chiếm 71 - 79 % protein tổng sô); protein hòa tan trong dung dịch muối (chiếm
5 - 10% protein tổng số); protein hòa tan trong dung dịch kiềm (chiếm 4 - 8% protein
tổng sô). Protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế nhƣ
leucine, isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, valine nhƣng hàm lƣợng
cysteine và methionine lại thấp [15], [17].
Glucid đậu xanh chứa chủ yếu là tinh bột và các thành phần khác với hàm
lƣợng rất thấp không đáng kể. Tinh bột đậu xanh bao gồm 2 cấu tử là amylose và
amylopectin. Trong đó amylose có hàm lƣợng tƣơng đối cao, chiếm khoảng 45 50%. Tinh bột đậu xanh đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm nhƣ chế
biến các sản phẩm miến đậu xanh, bột đậu xanh, cháo đậu xanh ăn liền...[15], [17].
Hàm lƣợng lipid trong đậu xanh rất thấp nhƣng có ảnh hƣởng rất lớn đến
chất lƣợng của hạt, bột và sản phẩm chế biến. Chất béo của hạt có giá trị tƣơng đối
cao vì trong thành phần của nó có 20 axit béo trong đó chứa nhiều axit béo chƣa no
không thay thế nhƣ axit linoleic [15].
Hạt đậu xanh chứa nhiều vitamin nhƣ vitamin A, B1, B2, B6, C, D,
PP…Hàm lƣợng vitamin trong các sản phẩm đƣợc chế biến t đậu xanh phụ thuộc
nhiều vào kỹ thuật và phƣơng tiện chế biến. Nghiên cứu cho thấy có sự mất mát
vitamin t 20 - 35% trong quá trình chế biến và 10 - 15% trong quá trình bảo quản
[15], [17].
Chất khoáng tập trung chủ yếu ở phần vỏ hạt gồm có Na, ca, Mg, P, Cu, Zn,
Fe, Mn…Ngoài ra, trong hạt đậu xanh còn chứa các enzyme nhƣ lipase, transferase,
hydrolase, lypoxygenase…[15], [17].


8

1.1.2. Mọt đậu xanh và ản

ƣởng của mọt đến bảo quản hạt đậu xanh

1.1.2.1. Đặc điểm của mọt gây hại đậu xanh

Mọt đậu xanh có tên khoa học là Callosobruchus chinensis Linne thuộc họ
mọt đậu (Bruchidae), bộ cánh cứng (Coleoptera). Mọt đậu xanh là loài đa thực, ăn
hại các loại đậu và các sản phẩm dƣợc liệu có nguồn gốc thực vật nhƣ: đậu xanh,
đậu t m, đậu đũa, đậu hà lan, đậu đen, hạt sen, đậu tƣơng.... Trong đó, đậu xanh và
hạt sen là bị thiệt hại nặng nhất. Loài mọt này có mặt khắp nơi trên thế giới, các
vùng trồng đậu xanh ở nƣớc ta đều có loại mọt này. Mọt đậu xanh thƣờng có mặt
ngoài đồng ruộng vào thời gian đậu xanh sắp thu hoạch [5], [39], [154], [157].
Về đặc điểm hình thái, mọt đậu xanh thuộc nhóm biến thái hoàn toàn, chu kỳ
sống của chúng gồm 4 pha phát dục là trứng, sâu non, nhộng và trƣởng thành [5], [39].
Mọt trƣởng thành: con đực dài trung bình 2,5 mm, rộng 1,64 mm, con cái dài
trung bình 3 mm, rộng 1,8 mm. Thân hình bầu dục ngắn, toàn thân màu đen nâu,
màu nâu đỏ hay trà nâu, có nhiều lông nhỏ màu đen nâu, màu vàng nâu hay màu
trắng xám. Ðầu nhỏ, quặp về phía trƣớc. Râu đầu có 11 đốt, râu con cái hình răng
cƣa, râu con đực hình răng lƣợc. Gốc râu, thân râu màu hồng nâu. Ðầu màu nâu tối,
phủ đầy chấm lõm và lông nhung màu vàng kim. Mép sau ngực trƣớc ở giữa có 2
khóm lông hình bầu dục dài màu xám trắng. Mắt lồi, ngực trƣớc có hình chóp cụt,
mặt lƣng lồi tròn, cánh không che hết phần bụng. Trên hai rãnh của đốt đùi chân sau
có 2 răng, răng ngoài tù, răng trong dài và thẳng [5], [39], [154].
Trứng có hình bầu dục, một đầu to, một đầu nhỏ, chiều dài t 0,4 - 0,6 mm
và chiều rộng 0,28 - 0,4 mm, màu vàng nhạt [5], [39].
Sâu non có 4 tuổi, màu sắc thay đổi tùy theo độ tuổi. Sâu non tuổi một có
chân rất nhỏ, tạm thời không phân đốt. Khi đẫy sức sâu non có chiều dài khoảng 3,5
mm, có màu trắng sữa, mập, có hình chữ C [5], [154].
Nhộng trần dài 3 - 3,5 mm, hình bầu dục to và mập, có nhiều lông nhỏ màu
vàng nhạt, đầu cong xuống [5], [39], [157].
Về đặc tính sinh vật học, trƣởng thành mọt đậu xanh đẻ trứng vào các hạt mà
quả đã bị khô nứt vỏ hoặc vỏ bị côn trùng ăn hại bỏ sót lại. Sau một thời gian ngắn


9


thì trứng nở thành sâu non, sâu non ăn phần thịt của hạt và làm cho hạt rỗng, phân
thải ra trong quá trình này làm cho hạt bị biến đổi thành màu vàng nâu hoặc nâu
đen. Sâu non khi đẫy sức hóa nhộng, vũ hóa ngay trong hạt, trƣởng thành sau vũ hóa
một ngày chui ra t một lỗ tròn ở vỏ hạt. Con đực chui ra đƣợc hơn nửa giờ bắt đầu
giao phối, sau giao phối khoảng hơn 5 giờ con cái bắt đầu đẻ trứng. Mọt có thể đẻ
trứng trên quả ở ngoài đồng hay trên hạt ở trong kho, có thể đẻ liên tục 2 - 3 quả trên
cùng 1 hạt. Thời gian các pha phát dục của mọt là: giai đoạn trứng t 4 - 15 ngày,
trung bình 6 ngày. Giai đoạn sâu non t 13 - 34 ngày. Giai đoạn nhộng t 3 - 18 ngày.
Thời gian sống của mọt trƣởng thành phụ thuộc vào các yếu tố sinh thái, đặc biệt là
yếu tố nhiệt độ và độ ẩm. Trung bình trƣởng thành sống đƣợc t 36 đến 39 ngày
trong điều kiện mùa đông và 6 đến 7 ngày trong điều kiện mùa hè. Mọt phát dục thích
hợp nhất ở 22oC - 29,5oC và độ ẩm 88 - 100 % [150] . Mọt không có khả năng đẻ
trứng khi nhiệt độ dƣới 10oC, và trên 37oC [150]. Vòng đời của mọt đậu xanh phụ
thuộc vào các yếu tố nhƣ độ nhiệt, độ ẩm và thức ăn, thời gian t 18 - 60 ngày.
Trong điều kiện hoàn toàn thích hợp, một con cái có thể đẻ t 80 - 100 trứng. Nếu
điều kiện không thích hợp, thì vòng đời của mọt có thể kéo dài đến 196 ngày. Tập
tính của mọt đậu xanh đã đƣợc nghiên cứu chi tiết về tập tính giao phối của con đực
[79], nghiên cứu về vai trò của con đực đối với khả năng sinh sản của con cái [39].
Mỗi năm mọt đậu xanh thƣờng có t 4 - 5 lứa, có thể có t 8 - 11 lứa (nếu trong điều
kiện thích hợp).
Về đặc điểm sinh thái học
Theo Chavan và cs (1997), mọt trƣởng thành có đời sống ngắn, khoảng 12
ngày trong điều kiện thích hợp. [42]. Vòng đời khoảng 22 đến 25 ngày trong điều
kiện thích hợp. Nhiệt độ thích hợp cho mọt đậu xanh đẻ trứng là ở 23oC. Trứng dính
chặt vào vỏ của hạt ký chủ, những giống có vỏ hạt nhẵn phù hợp cho sự đẻ trứng
hơn những giống có vỏ hạt ráp [42], [103]. Sau khi đẻ 5 - 6 ngày thì trứng bắt đầu
nở [63]. Theo Borikar và cs (1996), Yongxue và cs (1998b) mọt đậu xanh đƣợc
nuôi dễ dàng trong phòng thí nghiệm và sự phát triển của nó bị ảnh hƣởng lớn bởi
nhiệt độ và độ ẩm [34], [150].



10

Ấu trùng phát triển hoàn toàn trong một hạt, tạo thành hang khi phát triển.
Nhiệt độ tối thích cho mọt đậu xanh phát triển là 37oC và độ ẩm 90%. Thời gian
phát triển tối thiểu là 22 - 23 ngày. Sự xâm nhiễm thƣờng xảy ra trên đồng
ruộng, trứng đƣợc đẻ trên vỏ quả khi chín [95], [117]. Khi quả khô khả năng xâm
nhiễm của mọt giảm [39].
Nghiên cứu về sự cạnh tranh giữa loài C. chinensis và C. maculatus, Koichi
fujii (1967) cho thấy, trong điều kiện nhiệt độ 30oC và độ ẩm 70% bổ sung thêm
thức ăn ở các khoảng thời gian khác nhau thì không thấy có kết quả về của sự cạnh
tranh giữa hai loài [73]. Cũng ở điều kiện trên, khi sử dụng hai nguồn thức ăn khác
nhau là đậu khô (hàm lƣợng nƣớc là 11% và đậu thƣờng (hàm lƣợng nƣớc khoảng
15%) thì cũng không thấy có sự khác nhau về kết quả cạnh tranh thức ăn. Nhƣng ở
điều kiện nhiệt độ 32oC và độ ẩm 64% thì thấy có kết quả của sự cạnh tranh, do sự
khác nhau về tỷ lệ phát triển và số lƣợng trứng giữa hai loài.
1.1.2.2. Tác hại của mọt trong quá trình bảo quản đậu xanh
Sau khi thu hoạch, hạt đậu xanh cần đƣợc bảo quản để sử dụng làm lƣơng
thực, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nhiều mục đích khác nhau, mà thiệt hại do
côn trùng gây ra trong qúa trình bảo quản hạt có thể lên tới 5 - 10% (ở khu vực ôn
đới) và 20 - 30% (ở khu vực nhiệt đới) [5], [96]. Đặc biệt, với đặc điểm khí hậu
nƣớc ta nóng ẩm quanh năm, có nhiều loại mọt hại đậu xanh trong kho bảo quản
nhƣng mọt đậu xanh loài C. Chinensis là đối tƣợng gây hại nghiêm trọng nhất,
chúng có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh và có sức sinh sản
nhanh. Sự xâm nhiễm có thể bắt đầu t ngoài đồng trƣớc khi thu hoạch, sau đó theo
vào trong kho bảo quản. Sự lây nhiễm có thể làm giảm đáng kể về khối lƣợng, chất
lƣợng và hàm lƣợng protein của hạt [154]. Ngoài ra nó còn gây hại nghiêm trọng
đối với các loại đậu đỗ khác, nhƣ: đậu tƣơng, đậu hà lan, đậu đũa và đậu năng, đậu
đỏ, đậu đen... Ngoài ra, mọt đậu xanh còn gây hại trên hạt bông, lúa miến và ngô

[29]. Cả mọt trƣởng thành và sâu non đều gây hại. Khối lƣợng hạt bị hao hụt do mọt
có thể lên đến 55 - 60% [52] và hao hụt về hàm lƣợng protein là 45,50 - 66,30%
[73]. Một sâu non có thể gây hại vài hạt đậu [63]. Trong trƣờng hợp bị nhiễm mọt,


11

hạt bị mất khả năng nảy mầm và không sử dụng đƣợc. Khi bị xâm nhiễm nặng, thiệt
hại có thể lên đến 100% và chỉ còn lại phần vỏ hạt. Nghiên cứu sự thiệt hại về chất
lƣợng của hạt đậu xanh kết quả cho thấy sự thiệt hại có thể lên tới 90%. Tỷ lệ thiệt
hại hạt đậu xanh trong quá trình bảo quản do C. chinensis ở Pakistan gây ra là
12,18% [56].
1.1.2.3. Một số biện pháp phòng trừ mọt hại đậu xanh
Sau khi thu hoạch hạt đậu xanh đƣợc bảo quản chủ yếu ở dạng hạt khô và
hạt khô dễ bị tấn công bởi mọt, gây ra thiệt hại lớn. Hiện nay ngƣời ta có thể sử
dụng nhiều biện pháp khác nhau để phòng tr

mọt đậu xanh. Nhƣng có hai

phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất đó là phƣơng pháp hóa học và phƣơng
pháp vật lý [33].
Phòng trừ bằng hóa học
Có thể xử lý hạt b ng xông hơi methyl bromide hoặc phosphine, mặc dù sự
đăng ký sử dụng sản phẩm này ở nhiều khu vực có thể bị hạn chế hoặc bị cấm
[118]. Philips (1994) cho r ng, biện pháp hóa học có hiệu quả rất cao đối với mọt
đậu, có thể đạt 90 - 99% với các loại thuốc hóa học thuộc nhóm lân hữu cơ và
pyrethroid. Các hoá chất pyrethrin là những hợp chất hữu cơ thiên nhiên mà có chứa
hoạt tính diệt côn trùng mạnh [109].
Việc sử dụng b a bãi thuốc hóa học tr côn trùng dẫn đến một số vấn đề nhƣ
tăng tính kháng thuốc của côn trùng, các tàn dƣ độc hại trên hạt, gây ô nhiễm môi

trƣờng và tăng chi phí. Do đó, hiện nay ngƣời ta quan tâm nhiều đến việc sử dụng
các chất có hoạt chất sinh học đƣợc chiết xuất t thực vật. Việc trộn hạt với dầu
thực vật, tro hoặc lá có mùi thơm cũng có hiệu quả trong việc hạn chế tác hại của
mọt đậu xanh [73]. Một số các loài cây, sản phẩm chiết xuất t cây có tác dụng hạn
chế tác hại của mọt đậu xanh và các loài dịch hại thuộc họ Bruchidea khác nhƣ: cây
keo Ả Rập (Acacia nilotica), cây thủy xƣơng bồ (Acorus calamus), Cây cỏ xƣớc
(Achyranthus aspera), cây gội nƣớc (Amoora rohituka), Cây cốt khí muồng (Cassia
occidentalis), cây bạch đàn trắng lá nhỏ (Eucalyptus tereticornis), cây hoa ngũ sắc
(Lantana camara), cây lanh (Linum usitatissinum),...[39].


12

Hóa chất có nguồn gốc thực vật đƣợc biết đến phổ biến nhất là azadirachtin,
chất này đƣợc dùng riêng ở dạng thuốc thảo mộc hoặc ở dạng hỗn hợp nhƣ một
thành phần của lá hoặc dạng chiết xuất của cây xoan ấn độ (Azadirachta indica).
Azadirachtin có tác dụng hạn chế sự đẻ trứng và tiêu diệt sâu non và mọt trƣởng
thành. Dầu của cây xoan Ấn độ và chất chiết xuất khác có thể sử dụng trực tiếp để
bảo quản hạt đậu xanh [155].
Trong bảo quản hạt đậu xanh, Farid Asif Shaheem (2006 đã nghiên cứu hiệu
quả sử dụng bột ớt, bột oliu và bột lá chè xanh trong phòng chống sự xâm nhiễm và
phá hủy hạt của mọt Callosobruchus chinensis. Kết quả cho thấy bột ớt, bột oliu,
bột lá chè có tác dụng chống mọt và trong cùng một khối lƣợng hạt đậu xanh bảo
quản, cùng thời gian và cùng liều lƣợng bột xử lý thì hiệu quả chống mọt có sự khác
nhau giữa bột ớt, bột liu và bột đậu xanh [56].
Phòng trừ bằng biện pháp vật lý
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự phát triển của mọt. Việc xử lý
nhiệt đã đƣợc quan tâm nhiều trong những năm gần đây trong việc làm sạch hàng
hóa bảo quản và xu hƣớng này đang tiếp tục đƣợc áp dụng rộng rãi để diệt tr dịch
hại [85], [86]. Việc sử dụng nhiệt độ cao là một biện pháp đƣợc sử dụng phổ biến để

phòng tr dịch hại trong bảo quản hạt. Hầu hết các dịch hại trong bảo quản bị chết ở
nhiệt độ trên 40oC [61]. Tuy nhiên, nhiệt độ thấp cũng đƣợc sử dụng trong phòng tr
mọt hại. Evans (1987) công bố r ng xử lý nhiệt độ thấp, kết hợp với làm khô bảo vệ
hạt khỏi sự tấn công và gây hại của dịch hại hơn là việc xử lý diệt tr [55]. Việc tăng
nhiệt độ làm tăng tỷ lệ trao đổi chất, theo đó làm giảm trọng lƣợng sản phẩm bảo
quản nhanh hơn. Ở nhiệt độ thấp khả năng đẻ trứng giảm và khả năng phát triển của
côn trùng chậm điều này kéo dài thời gian trƣớc khi quần thể tăng đến ngƣỡng gây
hại kinh tế [73].
Sử dụng năng lƣợng điện tử ở mức nhẹ để phòng tr mọt, thí nghiệm này đƣợc
tiến hành ở phòng thí nghiệm đối với mọt ở các giai đoạn khác nhau. Mọt ở 0, 2, 4,
6, 8, 10, 12, 14, 16 và 18 ngày tuổi xử lý ở mức 170 kv trong vòng 20 phút, kết quả
cho thấy sự mẫn cảm đối với bức xạ điện tử giảm khi tuổi của mọt tăng, giai đoạn


13

trứng dễ nhiễm bức xạ điện tử cao nhƣng ngƣợc lại giai đoạn 18 ngày tuổi thì mọt
trƣởng thành vẫn hoàn toàn phát triển đƣợc. Do vậy, để đạt đƣợc tỷ lệ chết ở giai
đoạn trƣởng thành 80% phải xử lý ở mức năng lƣợng cao hơn (200 kv . Đối với mọt
trƣởng thành sống sót còn lại thì ảnh hƣởng tới sức đẻ trứng, thời gian sống. Đây là
một biện pháp rất hiệu quả và an toàn vì nó không ảnh hƣởng tới khả năng nảy mầm
của hạt đậu [157].
Đối với bất kỳ một loại sâu bệnh nào việc nghiên cứu để tìm ra giống có khả
năng chống chịu là khâu không thể thiếu trong công tác quản lý dịch hại tổng hợp,
vì vậy các nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm 5 giống đậu xanh: Parbat, Paidar91, Pb-2000, CM-2000, bittler-98 thì thấy khả năng kháng mọt của các giống là rất
khác nhau thể hiện ở số lƣợng trứng, tỷ lệ hao hụt khối lƣợng, số lƣợng mọt trƣởng
thành, số lƣợng lỗ đục. Kết quả thí nghiệm cho thấy giống Parbat là giống bị nhiễm
nặng, còn giống Bittle-98 có khả năng kháng mọt cao [158].
1.1.3. Đánh giá khả năng k áng mọt của đậu xanh
Có rất nhiều phƣơng pháp để đánh giá khả năng kháng mọt đục hạt đậu xanh.

Liu và cs năm 2016 đã nghiên cứu về khả năng kháng mọt đục hạt ở đậu xanh b ng
phƣơng pháp so sánh hệ gen của các giống đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczeck).
Kết quả so sánh hệ gen của các dòng bố mẹ kháng và nhạy cảm với mọt thế hệ con
cháu của chúng đã xác định đƣợc 91 gen biểu hiện khác nhau và phân loại thành 17
gen chính và 74 gen khác liên quan tính kháng mọt; một số lƣợng lớn gen này n m
trên một vùng của nhiễm sắc thể số 5 [82]. Sibakwe và cs (2015) đã đánh giá các
mức độ kháng mọt Acanthoscelides obtectus và mọt Zabrotes subfasciatus của một
vài giống đậu ở quy mô phòng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra r ng mức
độ kháng của 7 giống đậu xanh với hai loài mọt Acanthoscelides obtectus và
Zabrotes subfasciatus có sự khác nhau rõ rệt trong thời gian lƣu trữ t 15 ngày đến
120 ngày [116].
Năm 2014, Duraimunrugan và cs đã sử dụng phƣơng pháp sàng lọc khả năng
kháng mọt đậu xanh của các kiểu gen đậu xanh và đậu đen nh m tìm hiểu sự ảnh
hƣởng của đặc điểm hình thái, sinh lý của hạt tới khả năng kháng mọt. Sử dụng 335


14

giống đậu xanh và 140 giống đậu đen thuộc chi Vigna đem kiểm tra ngẫu nhiên, kết
quả thu đƣợc 8 giống đậu xanh và 9 giống đậu đen đƣợc xác nhận có tính kháng
mọt trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tám giống đậu xanh và chín giống đậu đen
có chỉ số mẫn cảm thấp với mọt trong sàng lọc ở phép kiểm tra “lựa chọn tự do”
đƣợc chọn để xác nhận thêm tính kháng trong phép kiểm tra “không lựa chọn” [51].
Theo Hà Quang Hùng (2005) và Tomooka và cs (1992) khả năng kháng mọt
của các giống đậu xanh đƣợc đánh giá b ng phƣơng pháp lây nhiễm mọt nhân tạo.
Sử dụng 3 cặp mọt đậu xanh ban đầu thả vào hộp nhựa có nắp gắn lƣới ngăn côn
trùng đựng 100g hạt đậu xanh và theo dõi các chỉ tiêu nhƣ khối lƣợng hạt hao hụt,
hệ số gia tăng quần thể, tỷ lệ nhiễm mọt ở các thời điểm sau 15 ngày, sau 30 ngày,
sau 45 ngày và sau 60 ngày nhiễm mọt và xác định chỉ số mẫm cảm với mọt của các
giống đậu xanh. Thí nghiệm chia làm 2 lô theo dõi, lô thí nghiệm (thả mọt) nhắc lại

3 lần và lô đối chứng (không thả mọt) [8], [138].
Nhƣ vậy, mọt đậu xanh có thể gây thành dịch t một số lƣợng nhỏ cá thể do
mọt có khả năng sinh sản nhanh và thời gian phát triển cá thể ngắn. Cả mọt trƣởng
thành và sâu non đều gây hại. Hiện nay ngƣời ta đã sử dụng nhiều biện pháp khác
nhau để bảo quản hạt đậu xanh nhƣng không mang lại hiệu quả, mà lại tốn nhiều
thời gian công sức. Vì thế, hƣớng giải quyết hiệu quả là chọn tạo những giống đậu
xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt.
1.2. DEFENSIN THỰC VẬT

1.2.1. Các nhóm defensin thực vật
Defensin là những phân tử protein nhỏ, giàu cystein đƣợc tìm thấy ở cả động
vật có xƣơng sống, động vật không xƣơng sống và thực vật [58]. Về mặt chức năng,
chúng là những peptide bảo vệ. Defensin có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và
kháng nhiều loại virus.
Defensin thực vật đầu tiên đƣợc phân lập t lúa mỳ (Triticum aestivum) [44],
[74], và lúa mạch (Hordeum vulgare) [89]. Cho tới nay, ngƣời ta đã xác định đƣợc
có hơn 80 loại defensin thực vật. Nhóm defensin thực vật khá đa dạng tƣơng ứng
với vị trí khác nhau của các amino acid cũng nhƣ nhóm 8 gốc cystein trong tất cả


15

các loại defensin thực vật [131], [136]. Sự khác biệt trong cấu trúc bậc một dẫn đến
sự khác nhau về hoạt tính sinh học đối với các loại defensin này.
Sự phân nhóm defensin đƣợc đề xuất dựa trên nguồn gốc phát sinh và phân
tích 139 trình tự gen mã hóa defensin đƣợc chia thành 18 nhóm có chức năng khác
nhau, nhƣ tính kháng nấm, kháng khuẩn, ức chế - amylase, ức chế trypsin, ức chế
tổng hợp protein, chặn kênh trao đổi ion Na+, chịu kẽm,…[92], [99].
Defensin nhóm 1 là các chất ức chế tổng hợp protein, ức chế hoạt động của
α-amylase và chặn kênh natri, có độ tƣơng đồng trên 90% và tạo thành một nhóm

riêng biệt. Các thành viên khác của nhóm 1 thể hiện hoạt tính kháng nấm và kháng
khuẩn [120], [130]. Tuy nhiên, tồn tại hay không tồn tại sự ức chế tổng hợp protein,
ức chế các enzyme có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn còn chƣa đƣợc biết đến
Chỉ một thành viên trong nhóm này đƣợc nghiên cứu hoạt tính kháng nấm là
MtDef4. Defesin này ức chế sự sinh trƣởng của Fusarium graminearum mà không
làm tăng sự phân nhánh sợi nấm.
Defensin thuộc nhóm 2 gồm hai loại defensin phân lập t cây ớt (Capsium)
và một trong số này đƣợc xác nhận là có mặt trong suốt quá trình chín của quả.
Nhóm 3 gồm các defensin tách t cây vân sam (Spruce) và cây bạch quả (Gingko
biloba), một trong số đó có hoạt tính kháng nấm in vitro [53]. Defensin thuộc nhóm
4 có hoạt tính ức chế α-amylase và chặn kênh trao đổi ion Na+. Hai loại defensin
của củ cải đƣờng là thành viên của nhóm 5, có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của
nấm sợi nhƣng không có tác dụng với vi khuẩn và đƣợc biểu hiện ở lá. Một
defensin t cây Arabidopsis là thành viên duy nhất của nhóm 6 đến nay còn chƣa
đƣợc nghiên cứu kỹ. Defensin thực vật nhóm 7 chỉ gồm các defensin t cây họ cà
(Solanaceous , đều có hoạt tính kháng nấm và chỉ biểu hiện ở hoa. Defensin thực
vật nhóm 8 bao gồm một peptide kháng nấm biểu hiện ở nhị hoa của cây cải bắp
Brassica campestri (BsD1). Hầu hết các defensin đƣợc nghiên cứu kĩ đến nay là các
defensin kháng nấm của nhóm 9, nhóm này có thể đƣợc chia thành 3 nhánh, trong
đó có defensin liên quan đến tính trạng hình thái, gây ra sự tăng phân nhánh sợi nấm
và sự phồng ở những sợi nấm; trong khi defensin của nhánh còn lại không liên quan