ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Anh Thắng

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƢỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH
COLLAGENASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ĐÃ PHÂN LẬP
ĐƢỢC TỪ KHU VỰC QUẢNG TRƢỜNG BA ĐÌNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Anh Thắng

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI
TRƢỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH
COLLAGENASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM ĐÃ PHÂN LẬP
ĐƢỢC TỪ KHU VỰC QUẢNG TRƢỜNG BA ĐÌNH

Chuyên ngành

: Vi sinh vâ ̣t ho ̣c

Mã số

: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Lại Văn Hòa

PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - Năm 2014


LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới
TS. Lại Văn Hòa, PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, đã chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp, cũng như đã chỉ bảo cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý
báu trong cuộc sống.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô và các cán bộ trong bộ môn Vi
sinh vật học; các thầy cô, cán bộ trong Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học
Tự Nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong
suốt những năm học vừa qua.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ths. Phùng Công Thưởng và các đồng chí
thuộc Khoa Vi sinh vật & Môi trường, Viện 69 đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều
kiện rất lớn để tôi có thể hoàn thành đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã
luôn ở bên tôi, động viên và giúp đỡ tôi cả về mặt vật chất lẫn tinh thần trong suốt
thời gian vừa qua.


Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2014
Học viên

Hoàng Anh Thắng


MỤC LỤC
NỘI DUNG
ĐẶT VẤN ĐỀ
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang

1
3
4

1.1. Sơ lƣợc về cơ chất collagen

4

1.2. Sơ lƣợc về vi nấm và quá trình sản sinh các enzyme ngoại bào

9

1.3. Nghiên cứu về các yếu tố ảnh hƣởng tới sự phân hủy


12

collagen của vi nấm
1.3.1. Quá trình sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase vi nấm

12

1.3.2. Nghiên cứu về sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase

13

của vi nấm
1.3.3. Nghiên cứu về sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase,

15

protease của vi nấm trong công tác bảo quản lâu dài thi thể ƣớp
Chƣơng 2

1.4. Bộ sƣu tập vi nấm phân hủy các cơ chất sinh học tại Viện 69

16

ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU

18

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu


18

2.2. Vật liệu nghiên cứu

18

2.2.1. Dụng cụ, trang bị

18

2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy, cơ chất, hóa chất

18

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

18

2.3.1. Phƣơng pháp phục hồi, lựa chọn các chủng vi nấm

18

nghiên cứu
2.3.2. Phƣơng pháp kiểm tra mức độ thuần khiết các chủng vi

18

nấm sau phục hồi trên kính hiển vi quang học
2.3.3. Phƣơng pháp làm mẫu nấm nghiên cứu trên kính


20

hiển vi điện tử quét (SEM) JSM-5410LV
2.3.4. Tiến hành xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

21


collagenase theo phƣơng pháp của Laster Hankin, S.L.
Anagnistakis
2.3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu xác định một số điều kiện môi
trƣờng ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase

21

của các chủng vi nấm
2.3.5.1. Nghiên cứu xác định các giá trị pH ức chế khả năng

21

sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm
2.3.5.2. Nghiên cứu xác định các giá trị nhiệt độ môi trƣờng
ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của

22

các chủng vi nấm
2.3.5.3. Nghiên cứu xác định các giá trị hoạt độ nƣớc môi
trƣờng nuôi cấy ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính


22

collagenase của các chủng vi nấm
2.3.5.4. Nghiên cứu xác định các giá trị độ ẩm không khí ức
chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các

23

chủng vi nấm
2.3.5.5. Nghiên cứu xác định tổ hợp các điều kiện môi trƣờng
ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của

24

các chủng vi nấm
2.3.6. Phƣơng pháp thống kê, xử lý số liệu
Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

24
25

3.1. Kết quả phục hồi và lựa chọn các chủng nấm sợi nghiên cứu

25

3.2. Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị pH ức chế khả năng

42


sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm
3.2.1. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị pH8

42

3.2.2. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị pH8,5

43

3.2.3. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị pH9

44

3.2.4. Xác định mối tƣơng quan giữa điều kiện pH môi trƣờng
nuôi cấy với khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của

45


các chủng vi nấm nghiên cứu.
3.3. Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị nhiệt độ môi
trƣờng ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase

49

của các chủng vi nấm
3.3.1. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị nhiệt độ 140C

49


3.3.2. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị nhiệt độ 160C

50

3.3.3. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị nhiệt độ 180C

51

3.3.4. Xác định mối tƣơng quan giữa ba điều kiện nhiệt độ môi
trƣờng nuôi cấy với khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

52

collagenase của 15 chủng vi nấm
3.4. Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị hoạt độ nƣớc môi
trƣờng nuôi cấy ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

56

collagenase của các chủng vi nấm
3.4.1. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị hoạt độ nƣớc môi

56

trƣờng 0,6aw
3.4.2. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị hoạt độ nƣớc môi

57


trƣờng 0,65aw
3.4.3. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị hoạt độ nƣớc môi

58

trƣờng 0,7aw
3.5. Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị độ ẩm không khí
ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của

60

các chủng vi nấm
3.5.1. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị độ ẩm môi trƣờng 60%

60

3.5.2. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị độ ẩm môi trƣờng 70%

61

3.5.3. Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị độ ẩm môi trƣờng 80%

62

3.5.4. Xác định mối tƣơng quan giữa ba điều kiện độ ẩm môi
trƣờng không khí với khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

63

collagenase của 15 chủng vi nấm

3.6. Kết quả nghiên cứu xác định tổ hợp các điều kiện môi

65


trƣờng ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase
của các chủng vi nấm
KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC ẢNH VI NẤM PHÂN HỦY CƠ CHẤT
PHỤ LỤC SỐ LIỆU NGHIÊN CỨU

68


MỤC LỤC HÌNH VÀ BẢNG
NỘI DUNG

Trang

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của hydroxyproline

7

Hình 1.2. Trình tự sắp xếp các acid amỉn trong phân tử Collagen

8

Hình 1.3. Nghiên cứu hoạt tính collagenase của 12 chủng Coccidioides


12

immitis trên thạch Czapek có 0,5% collagen gân bò type I
Hình 3.1. Aspergillus clavato - nanica Batista (T38)

27

Hình 3.2. Aspergillus silvaticus Fennell and Raper (T65)

28

Hình 3.3. Aspergillus asperescens Stolk (T116)

29

Hình 3.4. Aspergillus ustus Thom and Church (D45)

30

Hình 3.5. Acremonium ochraceum Gams (T104)

31

Hình 3.6. Cladosporium cladosporioides(Fres.) de Vries (T44)

32

Hình 3.7. Didymostilbe sp (D132)

33


Hình 3.8. Gloeosporium sp (D160)

34

Hình 3.9. Nectria inventa Pethybridge (D94)

35

Hình 3.10. Penicillium cyaneo - fulvum Biourge (T72)

36

Hình 3.11. Penicillium chrysogenum Thom (T142)

37

Hình 3.12. Penicillium casei Staub (D71)

38

Hình 3.13. Penicillium italicum Wehmer (D100)

39

Hình 3.14. Penicillium citrinum Thom (D148)

40

Hình 3.15. Scopulariopsis chartarum Morton and Smith (D162)


41

Bảng 1.1. Các loại collagen và các gen cấu trúc

5

Bảng 1.2. So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác

6

Bảng 1.3. Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide

9

Bảng 3.1. Danh sách 15 chủng vi nấm lựa chọn nghiên cứu

26

Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

42

collagenase 15 chủng vi nấm ở pH8
Bảng 3.3. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

43


collagenase 15 chủng vi nấm ở pH8,5

Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

44

collagenase 15 chủng vi nấm ở pH9
Bảng 3.5. Mối tương quan giữa pH ở vùng kiềm với khả năng sinh tổng hợp

45

và hoạt tính collagenase của 15 chủng vi nấm
Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

49

collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện 140C
Bảng 3.7. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

50

collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện 160C
Bảng 3.8. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

51

collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện 180C
Bảng 3.9. Mối tương quan giữa ba điều kiện nhiệt độ môi trường nuôi cấy

52

với khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của 15 chủng vi nấm

Bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

56

collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện hoạt độ nước môi trường 0,6aw
Bảng 3.11. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

57

collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện hoạt độ nước môi trường 0,65aw
Bảng 3.12. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

58

collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện hoạt độ nước môi trường 0,7aw
Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt

60

tính collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện độ ẩm môi trường 60%
Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt

61

tính collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện độ ẩm môi trường 70%
Bảng 3.15. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt

62

tính collagenase 15 chủng vi nấm ở điều kiện độ ẩm môi trường 80%

Bảng 3.16. Mối tương quan giữa ba điều kiện độ ẩm không khí môi trường
nuôi cấy với khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của 15 chủng

63

vi nấm
Bảng 3.17. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt

65


tính collagenase 15 chủng vi nấm ở ĐKTH
Bảng 3.18. Giá trị hệ số phân giải collagen của 15 chủng vi nấm ở các điều
kiện độc lập tương ứng với ĐKTH

66


CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Aw :

Activity water : Hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi cấy

RH :

Relative humidity: Độ ẩm tƣơng đối môi trƣờng không khí

IpH8:


Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện pH 8,0

IpH8,5:

Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện pH 8,5

IpH9:

Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện pH 9,0

Inđ14:

Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện nhiệt độ 140C

Inđ16:

Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện nhiệt độ 160C

Inđ18:

Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện nhiệt độ 180C

Ihd0,6:

Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi
cấy = 0,6

Ihd0,65: Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi
cấy = 0,65
Ihd0,7:


Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện hoạt độ nƣớc môi trƣờng nuôi
cấy = 0,7

Iđâ60:

Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện độ ẩm tƣơng đối môi trƣờng
không khí = 60%

Iđâ70:

Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện độ ẩm tƣơng đối môi trƣờng
không khí = 70%

Iđâ80:

Hệ số phân giải của vi nấm ở điều kiện độ ẩm tƣơng đối môi trƣờng
không khí = 80%

ĐKTH:

Tổ hợp các điều kiện môi trƣờng (hay Điều kiện tổ hợp)


ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi nấm trong tự nhiên rất phong phú đa dạng. Chúng có khả năng thích nghi
mạnh mẽ với điều kiện sống, có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện môi trƣờng
khắc nghiệt, nghèo chất dinh dƣỡng, có các chất ức chế, dƣới các điều kiện nhiệt độ,
độ ẩm, pH khác nhau. Có đƣợc khả năng đó là do vi nấm có khả năng thích nghi, từ
đó có thể sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào giúp chúng phân huỷ các cơ chất sinh

học, sử dụng để tồn tại, phát triển, sinh sản. Trong các cơ chất sinh học có collagen,
là một loại protein của động vật.
Collagen chiếm tới 25% lƣợng protein ở động vật có vú. Nó bao gồm 29 loại
khác nhau và là thành phần chủ yếu của mô liên kết ở động vật có vú, giúp cho các
cơ quan có đƣợc bộ khung của mình, đồng thời tạo độ bền đàn hồi cho mô, cơ quan
tổ chức. Collagen là thành phần cơ bản của da và cũng có ở các tổ chức nhƣ gân,
sụn, xƣơng [20].
Các nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính các enzyme phân huỷ
các cơ chất sinh học của vi nấm nói chung cũng nhƣ phân hủy collagen cho thấy,
tính chất này của chúng có thể thay đổi theo các điều kiện môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ,
độ ẩm, pH, hoạt độ nƣớc cơ chất,... [14-17].
Kết quả nghiên cứu tại Viện 69 cho thấy vẫn tồn tại loài vi nấm có khả năng
phát triển và gây hƣ hỏng một số vật liệu đã đƣợc xử lý bằng hóa chất bảo quản.
Nghiên cứu về độ bền vững của da ƣớp bảo quản dƣới tác động của các vi nấm có
khả năng sinh proteinase thấy rằng, khi thoát ly khỏi môi trƣờng bảo quản, các yếu
tố về nhiệt độ, độ ẩm, pH thay đổi, xuất hiện các loài vi nấm Aspergillus,
Penicillium, Cladosporum phát triển trên bề mặt da ƣớp, làm thay đổi màu sắc da
ƣớp, thậm chí phát triển sâu xuống lớp dƣới, gây hƣ hại cấu trúc da [12]. Các
nghiên cứu khác tại Viện 69 cũng cho thấy khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính các
enzyme phân hủy cơ chất sinh học phụ thuộc vào các điều kiện môi trƣờng nhƣ,
nhiệt độ, độ ẩm không khí, pH, hoạt độ nƣớc cơ chất [1,2,8,9,11].

1


Tuy nhiên, chƣa có những nghiên cứu có tính chất hệ thống về các điều kiện
môi trƣờng (nhiệt độ, độ ẩm môi trƣờng, pH, hoạt độ nƣớc cơ chất) có tác động ảnh
hƣởng ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase các chủng loài vi
nấm liên quan bảo quản thi thể ƣớp.
Trong thời gian qua, Viện 69 hiện đã lƣu giữ đƣợc nhiều chủng vi nấm có

khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính enzyme phân hủy cao cơ chất khác nhau, trong
đó có những chủng có khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase. Đây là
nguồn chủng vi nấm phục vụ cho các nghiên cứu về tác hại của vi sinh vật đối với
thi thể ƣớp bảo quản cũng nhƣ nghiên cứu tìm ra các biện pháp ngăn ngừa tác hại
của chúng.
Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với mục tiêu:
- Xác định đƣợc thông số các yếu tố pH, hoạt độ nƣớc cơ chất, nhiệt độ, độ ẩm
môi trƣờng gây ức chế quá trình sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của 15 chủng vi
nấm đã phân lập đƣợc trong môi trƣờng khu vực quảng trƣờng Ba Đình.

2


NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Phục hồi, lựa chọn 15 chủng vi nấm đại diện, có khả năng sinh
collagenase và hoạt tính enzyme tốt nhất từ bộ sƣu tập tại Viện 69.
2. Xác định các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phát triển, sinh tổng hợp và
hoạt tính collagenase của 15 chủng vi nấm ở các điều kiện:
- Độ pH môi trƣờng nuôi cấy: 8.0, 8.5, 9.0. (Hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1; độ
ẩm không khí = 99% ± 1%; nhiệt độ = 250C ± 20C).
- Nhiệt độ: 140C, 160C, 180C. (Hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1; pH = 7,0 ± 0,2; độ
ẩm không khí = 99% ± 1%).
- Hoạt độ nƣớc: 0,60aw; 0,65aw; 0,70aw. (pH = 7,0 ± 0,2; độ ẩm không khí
= 99% ± 1%; nhiệt độ = 250C ± 20C).
- Độ ẩm môi trƣờng không khí: 60%; 70%; 80%.(Hoạt độ nƣớc = 0,99 ± 0,1;
pH = 7,0 ± 0,2; nhiệt độ = 250C ± 20C).
3. Xác định tổ hợp điều kiện môi trƣờng (nhiệt độ =160C, RH = 70%, pH =
8,5, aw = 0,65) ảnh hƣởng đến khả năng phát triển, sinh tổng hợp và hoạt tính
collagenase của 15 chủng vi nấm.
4. Từ đó xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu gây ức chế quá trình phát triển,

sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm.

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về cơ chất collagen
3


Collagen là một nhóm protein chính trong ngƣời và động vật, chiếm khoảng
25% lƣợng protein của toàn bộ cơ thể. Collagen tập trung chủ yếu ở mô liên kết và
là thành phần chính của da, gân, xƣơng, dây chằng, sụn và răng. Collagen đảm nhận
tính co giãn của da, vì thế khi bị thoái hóa do quá trình lão hóa, do tác động bởi các
yếu tố lý, hóa, sinh học thì cơ thể xuất hiện các dấu hiệu trên da nhƣ tăng nếp nhăn,
nhão da, kém săn chắc,…[20].
Với da ngƣời, collagen có vai trò đặc biệt quan trọng. Collagen chiếm 75%
trọng lƣợng khô của da, là thành phần chính trong cấu trúc da. Collagen cùng với
elastin tạo nên cấu trúc bền vững và dẻo dai cho da, nhờ đó mà da ngƣời có thể đàn
hồi, săn chắc và giữ đƣợc hình dáng cơ thể. Theo lứa tuổi, hàm lƣợng cấu trúc
collagen bị thay đổi do khả năng tổng hợp của cơ thể giảm cùng với sự thoái hóa tự
nhiên của collagen trong da. Từ sau tuổi 25, mỗi năm collagen của cơ thể giảm đi
khoảng 1% về khối lƣợng và cấu trúc, độ dày, độ chặt chẽ giảm dần. Chính vì thế
mà da khô dần, nhăn nheo, các nếp nhăn mới xuất hiện, nếp nhăn cũ sâu thêm,
chùng xuống, hình dáng cơ thể thay đổi. Đó là hậu quả của sự lão hóa, thiếu hụt
collagen từ da. Cũng từ đây ngƣời ta đã nghiên cứu chế tạo các loại sản phẩm bổ
sung collagen cho cơ thể bằng các đƣờng uống và dùng ngoài [20].
Đã có nhiều nghiên cứu cơ bản, sâu về collagen ở mức độ tổng quát cũng
nhƣ ở cấp độ phân tử. Hiện nay ngƣời ta đã tìm ra 29 loại (type) colagen và cũng đã
xác định đƣợc các gen quy định từng loại collagen này (Bảng 1.1). Các collagen typ
I, II, III, IV chiếm tới hơn 90% tổng số collagen trong cơ thể. Collagen typ I có
trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xƣơng (thành phần chính của xƣơng).

Collagen typ II có trong sụn xƣơng, là thành phần chính của sụn. Collagen typ III có
trong cơ. Collagen typ IV là thành phần chính cấu tạo màng tế bào [20].
Collagen có kết cấu rất phức tạp. Phân tử collagen (hay Tropocollagen) là
một sợi dài khoảng 300 nm có đƣờng kính 1,5 nm, đƣợc tạo thành bởi ba chuỗi
polypeptit (chuỗi anpha), các chuỗi xoắn với nhau tạo nên cấu trúc xoắn của

4


collagen, các chuỗi polypeptit liên kết với nhau trong chuỗi bởi liên kết hydro. Các
chuỗi polypeptit đƣợc tổng hợp tƣơng tự nhƣ các protein khác [20].
Bảng 1.1: Các loại collagen và các gen cấu trúc của nó [20]
Loại collagen
(Type)

Gene quy định

Loại collagen

Gene quy

(Type)

định

I

COL1A1 , COL1A2

XVI


COL16A1

II

COL2A1

XVII

COL17A1

III

COL3A1

XVIII

COL18A1

XIX

COL19A1

XX

COL20A1

XXI

COL21A1


XXII

COL22A1

XXIII

COL23A1

XXIV

COL24A1

IV

V

VI

COL4A1,

COL4A4

COL4A5,

COL4A6

COL4A2,

COL4A3


COL5A1,

COL5A2

COL5A3
COL6A1,

COL6A2

COL6A3

VII

COL7A1

VIII

COL8A1,

COL8A2

COL9A1,

COL9A2

IX

COL9A3


X

COL10A1

XXV

COL25A1

XI

COL11A1, COL11A2

XXVI

EMID2

XII

COL12A1

XXVII

COL27A1

XIII

COL13A1

XXVIII


COL28A1

XIV

COL14A1

XXIX

COL29A1

XV
COL15A1
XXVII
COL27A1
Thành phần protein trong collagen có gần đầy đủ các loại acid amin, bao gồm tất cả
20 loại acid amin (Schrieber và Gareis,2007). Thành phần acid amin có thể thay đổi
tùy theo nguồn gốc của collagen, nhƣng vẫn tồn tại một vài tính chất chung và duy
5


nhất cho tất cả collagen.
Trong thành phần collagen không chứa cystein và trytophan, nhƣng chứa
một lƣợng lớn glycine (Gly) chiếm khoảng 33% và proline (Pro) chiếm tỉ lệ 12% và
hydroxyproline (Hyp) chiếm tỉ lệ 22% (Theo Balian và Bowes 1977). Collagen là
một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngoài ra trong thành
phần collagen còn chứa khoáng chiếm tỉ lệ 1%.
Bảng 1.2. So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác [19]
(Số gốc/1000 gốc)
Collagen


Casein

Albumin

Glycine

363

30

19

Alanin

107

43

35

Valine

29

54

28

Leucine


28

60

32

Isoleucine

15

49

25

Serin

32

60

36

Threonine

19

41

16


Cystein

-

2

1

Methionine

5

17

16

Aspstic acid

47

63

32

Glutamic acid

77

153


52

Lycine

31

61

20

Proline và Hydroxyproline liên quan tới cấu trúc bậc 2 của collagen. Những amino
acid này giúp giới hạn sự quay của bộ khung polypeptide, do đó góp phần tạo nên
sự bền vững cho cấu trúc xoắn ốc bậc 3. Nhóm hydroxyl của hydroxylproline đóng
vai trò quan trọng trong sự bền vững cấu trúc xoắn ốc bậc 3 của collagen.
Polypeptide của collagen mà thiếu hydroxylproline sẽ tạo nên cấu trúc gấp khúc ở
nhiệt độ thấp và sẽ không bền vững ở nhiệt độ thân nhiệt.
Hydroxyproline là một acid amin đặc trƣng của collagen mà các loại protein
khác không có. Hydroxyproline đƣợc hình thành sau quá trình điều chỉnh proline
6


khi đƣợc kết hợp vào vị trí Y trong chuỗi Gly-X-Y. Hydroxyproline có công thức
phân tử là C 5 H 9 NO 3 , khác với proline, trong công thức cấu tạo của Hyp có gắn
nhóm OH nằm ở vị trí cacbon gamma, acid amin này có vai trò quan trọng trong sự
ổn định cấu trúc của collagen, là dẫn xuất của proline trong quá trình hình thành
chuỗi collagen có sự xúc tác của enzyme hydroxylase proline và sự có mặt của
Vitamin C để giúp bổ sung thêm Oxy, thiếu vitamin C sẽ làm chậm quá trình tổng
hợp hydroxyproline, ảnh hƣởng đến quá trình xây dựng cấu trúc protein gây ra
những rối loạn trong cơ thể.


Hình 1.1. Công thức cấu tạo của hydroxyproline
Phân tử collagen bao gồm 3 chuỗi xoắn lại với nhau tạo thành collagen
triple-helix tạo thành cấu trúc 3D- một mô hình lý tƣởng cho các liên kết hydro giữa
các chuỗi [27]. Mỗi chuỗi trong triple-helix quay theo chiều kim đồng hồ. Triplehelix dài xấp xỉ 300nm và chuỗi có khối lƣợng phân tử khoảng 105 kDa [25].
Triple-helix đƣợc ổn định bởi liên kết hydro nội giữa các chuỗi. Trong cấu trúc
phân tử collagen, do tƣơng tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có
những vùng kỵ nƣớc và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo
nƣớc làm trƣơng nở collagen. Sự biến tính collagen làm cho các cầu nối bị tách một
phần hoặc hoàn toàn gây nên sự tách rời các chuỗi do phá hủy các liên kết hydro,
chính điều này làm mất đi cấu trúc triple-helix. Mô hình “ Triple-helice” của
collagen dựa trên những nghiên cứu về hiện tƣợng nhiễu xạ sợi. Chuỗi nhiễu xạ sợi
thể hiện trên mức trung bình của toàn bộ phân tử collagen, và mô hình đặc trƣng thể
hiện đó là sự sắp xếp lặp đi lặp lại của các chuỗi polypeptid, thông thƣờng là GlyPro- Hyp.

7


Một đặc điểm đặc trƣng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino
acid trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này. Mỗi sợi collagen này
đƣợc cấu tạo từ ba chuỗi polypeptid nối với nhau giống nhƣ sợi dây thừng. Cấu trúc
của collagen tƣơng tự nhƣ hình xoắn ốc, mỗi một chuỗi polypeptid trong collagen
đƣợc cấu tạo từ các acid amin theo một trật tự, thông thƣờng là Gly - Pro - Y, hoặc
Gly - X - Hyp.

Hình 1.2. Trình tự sắp xếp các acid amin trong phân tử Collagen
Trong đó X, Y là những đơn vị aminoacid khác nhau, có thể là proline (Pro) và
hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chiều dài chuỗi. Glycine chiếm gần 1/3
trong tổng số các amino acid và nó đƣợc phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3
xuyên suốt trong phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự
lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau hình thành

nên một đƣờng xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi. Tổng cộng chỉ riêng
proline, hydroxyproline và glycine đã chiếm 1/2 chuỗi Collagen. Các acid amin còn
lại chiếm 1/2.
Bảng 1.3. Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide [19]

8


Triple helix

Tỷ lệ so với tổng bộ ba (%)

Gly - X - X

44

Gly - X - Y

20

Gly - Y - X

27

Gly - Y - Y
9
Collagen cũng chứa các đơn vị carbonhydrate, cả monosaccharide galactose
hoặc disaccharide glucosylgalactose, liên kết với phần dƣ hydroxylysine thông qua
nhóm hydroxyl chức năng của amino acid. Tỷ lệ của mono/disaccharide phụ thuộc
vào loại collagen và tình trạng sinh học. Chức năng của các đơn vị carbohydrate vẫn

chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ, nhƣng ảnh hƣởng của chúng trong việc gắn kết phần
bên phân tử collagen hình thành nên sợi và bán kính của sợi đang đƣợc nghiên cứu.
Ngoài ra, trong phân tử collagen có những vùng gồm khoảng 9-26 amino
acid tại các điểm đầu mút amino hay carboxyl của chuỗi. Các vùng này không sát
nhập với cấu trúc xoắn ốc và đƣợc gọi là telopeptide.
1.2. Sơ lƣợc về vi nấm và quá trình sản sinh các enzyme ngoại bào
Nấm (fungi) là một nhóm rất lớn, rất đa dạng trong sinh giới. Hiện nay, đã có
8.000 chi và 80.000 loài đƣợc mô tả và công nhận. Tuy nhiên, còn nhiều loài ở khắp
nơi trên thế giới chƣa đƣợc phát hiện. Theo ƣớc tính gần đây, con số này vào
khoảng 1,5 triệu loài [20].
Vi nấm có khả năng phát triển ở hầu hết các dạng sinh thái, có thể sử dụng hầu hết
các sản phẩm tự nhiên và các sản phẩm do con ngƣời làm ra. Chúng là sinh vật đầu
tiên và lý tƣởng sinh trƣởng ở vùng hoang dã, vì chúng có khả năng thay đổi mạnh
mẽ để thích nghi với điều kiện sống. Sự đa dạng của vi nấm không chỉ ở sự khác
biệt về hình thái mà còn ở các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chúng. Ví dụ, các loài
của chi Aureobasidium có thể sinh trƣởng ở nơi nhiệt độ thấp (vùng Antarctica) trên
các hòn đá ở nhiệt độ từ -100C đến -200C, có thể chống chịu ở nhiệt độ thấp từ 700C đến -800C. Nhƣng chi này cũng có những loài có thể sinh trƣởng ở vùng nhiệt
đới. Phần lớn các vi nấm là hiếu khí và sinh trƣởng ở hoạt độ nƣớc cao.

9


Nhƣng ngƣời ta đã phát hiện đƣợc vi nấm kỵ khí ở dạ cỏ của cừu và cũng đã
phát hiện đƣợc nhiều loài sinh trƣởng đƣợc ở các cơ chất có hoạt độ nƣớc thấp (aw
<0,85). Ngƣời ta có thể phân lập đƣợc nấm sống ký sinh, cộng sinh hoặc gây bệnh
cho tảo, rêu, các thực vật và các loài nấm khác (bao gồm cả địa y), các động vật
chân đốt, các động vật không xƣơng sống và có xƣơng sống. Các cơ chất nhƣ không
khí, đất, nƣớc, phân, thức ăn, các sản phẩm thực vật, dầu khí và các sản phẩm dƣợc
học cũng là nguồn phân lập đƣợc vi nấm [3,5].
Sở dĩ vi nấm có thể thích nghi mạnh mẽ, phát triển ở nhiều điều kiện môi

trƣờng khắc nghiệt là bởi chúng có cấu tạo đơn giản với thành tế bào vững chắc
giúp cho chịu đựng và ổn định cấu trúc nội bào, đồng thời có đặc điểm sinh học
(chuyển hóa, sinh sản,...) đặc biệt, có thể thay đổi để sử dụng các cơ chất vô cơ hay
hữu cơ phục vụ cho sự phát triển, sinh sản của chúng. Vi nấm tiết ra các amylase,
protease, lipase, oxydase (enzyme oxy hoá), các acid amin, các enzyme pectin,
catalase, cellulase... Tổ hợp enzyme của vi nấm phong phú hơn so với các vi sinh
vật khác. Trong các vi nấm, ngƣời ta đã tìm thấy tất cả 6 lớp enzyme trong bảng
phân loại quốc tế hiện nay. Nhờ sự tác động của tổ hợp enzyme đó mà vi nấm có sự
biến đổi hoá học đa dạng trên những cơ chất phức tạp mà những vi sinh vật khác
không xâm nhập vào đƣợc. Để đáp ứng với tình trạng thiếu dinh dƣỡng, vi nấm có
thể có những biến đổi về hình thái để tăng bề mặt hấp thu các chất và tăng cƣờng
năng lực hấp thu chất dinh dƣỡng bằng cách khởi động các gen tiềm ẩn hoặc đóng
các gen gây tiêu hao năng lƣợng, tạo các hƣớng chuyển hóa mới. Sinh tổng hợp nên
các protease ngoại bào của các vi nấm trong đó có collagenase là một đặc điểm giúp
chúng có thể phân hủy các xác động vật trong chu trình phân hủy của tự nhiên, sử
dụng các protein làm nguồn carbon và năng lƣợng để sinh trƣởng phát triển. Các
protease sẽ thủy phân các protein và polypeptit thành acid amin; acid amin vận
chuyển vào tế bào và đƣợc phân giải [3,5].
Nhiều điều kiện tự nhiên nhƣ nhiệt độ, độ ẩm, hoạt độ nƣớc cơ chất, pH môi
trƣờng, nồng độ cơ chất, áp suất, nồng độ khí, muối, bức xạ,... có thể tác động tới
khả năng phát triển, thích nghi cũng nhƣ khả năng sinh enzyme phân hủy cơ chất
10


nói chung và collagen nói riêng. Dù có khả năng thích nghi cao nhƣng với vi nấm
hay với các vi sinh vật khác cũng chỉ có thể sinh trƣởng trong những điều kiện tới
hạn nhất định. Trong nghiên cứu của các tác giả C. Casals, I. Vinas, R. Torres, C.
Griera and J. Usall (2008) đã chỉ ra giới hạn về nhiệt độ, hoạt độ nƣớc của 3 loài vi
nấm nghiên cứu. Cả 3 loài Monilinia laxa, Monilinia fructicola và Monilinia
fructigena đều không thể phát triển ở nhiệt độ 380C và hoạt độ nƣớc cơ chất = 0,87

trong 30 ngày nuôi cấy. Ở nhiệt độ 00C, cả 3 loài đều phát triển đƣợc tại các hoạt độ
nƣớc 0,99; 0,97; 0,95 nhƣng lại không phát triển đƣợc ở hoạt độ nƣớc từ 0,90 trở
xuống. Ở cùng một điều kiện nhiệt độ và hoạt độ nƣớc, sự phát triển của 3 loài là
không giống nhau [15].
Để nghiên cứu xác định vi nấm có khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính
collagenase hay không, ngƣời ta sử dụng collagen làm cơ chất nuôi cấy (hình 1.3)
trên môi trƣờng đặc. Collagen có thể đƣợc sử dụng để thay thế một phần nguồn
cacbon (Sacarose) của môi trƣờng Czapek hoặc chỉ cần thêm vào môi trƣờng này.
Trƣờng hợp thay thế nguồn cacbon thì không cần phải sử dụng thuốc thử để phát
hiện vòng phân giải collagen và ngƣợc lại khi thêm vào thì phải sử dụng thuốc thử
clorua thủy ngân (HgCl2) [4].
Có tác giả nghiên cứu sâu về hóa sinh vi sinh vật đã thực hiện nuôi cấy trên
môi trƣờng lỏng có cơ chất collagen. Khi đó collagenase của vi nấm đƣợc phát hiện
trong dịch cấy và thu gom bằng các phƣơng pháp sinh hóa khác nhau [24,26].

11


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Lê Công Bằng và cộng sự (2005), Nghiên cứu xác định một số chỉ số y - sinh học
mô thi thể ướp và bảo quản phục vụ chiêm ngưỡng, Đề tài cấp bộ Mã số: KYBL 0401.
2. Vũ Văn Bình và cộng sự (2000), Nghiên cứu xác định một số biến đổi trên thi thể
ướp bảo quản lâu năm và các giải pháp phòng chống để phục vụ giữ gìn lâu dài thi
hài Chủ tịch Hồ Chí Minh, Đề tài độc lập cấp Nhà nƣớc mã số: KYĐL: 96 - 01.
3. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lƣơng (1982), Vi nấm, NXBKHKT.
4. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Chân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng,
Đoàn Xuân Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh
vật học Tập 3, NXBKHKT.
5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến (1996), Vi sinh vật, NXBGD.

6. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm ứng dụng trong công nghệ
sinh học, NXBKHKT.
7. Nguyễn Liên Hoa - Nguyễn Cao Vũ và cộng sự (2008), Nghiên cứu phân lập,
phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính enzyme gặp trong môi
trường khu vực Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh, Đề tài cấp Bộ mã số: KYBL 06-03.
8. Lại Văn Hoà và cộng sự (2003), Nghiên cứu một số giải pháp phòng chống
những biến đổi ở thi thể ướp bảo quản do tác động của những yếu tố môi trường
bất lợi để gìn giữ lâu dài thi hài Chủ tịch Hồ Chí Minh, Đề tài độc lập cấp Nhà nƣớc
mã số: 19 ĐL-2001.
9. Dƣơng Quang Kỳ và cộng sự (2002), Nghiên cứu tiêu chuẩn và các giải pháp
thích hợp để bảo đảm môi trường tinh khiết khu vực tiếp cận thi hài Bác, Đề tài cấp
Bộ Quốc Phòng.
10. Lƣơng Đức Phẩm, Hồ Sƣởng (1987), Vi sinh tổng hợp, NXBKHKT.
11. Nguyễn Gia Quyền, Doãn Huy Nghi (1990), Một số vấn đề về môi trường không khí
khu vực Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh, Đề tài cấp Nhà nƣớc mã số: 52D 05 -04.
12. Viện 69 (1997), Một số vấn đề về ướp bảo quản thi thể, Tập 3.


Tiếng Anh:
13. Andrea Astoreca et al. (2007), “Water activity and temperature effects on growth of
Aspergillus niger, A. awamori and A. carbonarius isolated from different substrates in
Argentina”, International Journal of Food Microbiology, pp. 119, 314-318.
14. Carolina A. Lima et al. (2010), “Production and Characterization of a
Collagenolytic Serine Proteinase by Penicillium aurantiogriseum URM 4622” A
Factorial Study, Biotechnology and Bioprocess Engineering 16, pp. 549-560.
15. Casals C. et al. (2008), “Effect of temperature and water activity on in vitro
germination of Monilinia spp”. Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072.
16. Chantal Barthomeuf, Henri Pourrat, and Aimee Pourrat (1992), “Collagenolytic
activity of a New Semi-Alkaline Protease from Aspergillus niger”, Journal of
Fermentation and Bioengineering Vol. 73, No. 3, pp. 233-236.

17. Dahot MU (1994), “Purification and some properties of alkaline protease from
Penicillium expansum”, J Islamic Acad Sci., 7:2, pp.100-105.
18. David M. Lupan and Pasipanodya Nziramasanga (1986), “Collagenolytic
Activity of Coccidioides immitis”, American Society for Microbiology, 51:1, 51, pp.
360-361.
19. Fratzl, P. (2008), “Collagen structure and Mechanics”, International Journal of
Food Microbiology, pp. 57-60.
20. Gelse K., Poschl E., Aigner T. (2003), “Collagens structure, function, and
biosynthesis”, Advanced Drug Delivery Reviews 55, pp. 1531-1546.
21. Horner K. J. and 0. D. Anagnostopoul (1973), “Combined Effects of Water
Activity, pH and Temperature on the Growth and Spoilage Potential of Fungi”, J.
appl. Bact. pp. 427-436.
22. John W. R. (1967), “Extracellular Collagenase from Trichophyton schoenleinii,
Jan”, Journal of bacteriology, No. 1, Vol. 95, pp. 43-46.
23. Joydeep Mukherjee et at. (2009), “Purification and Characterization of a
Collagenolytic Enzyme from a Pathogen of the Great Barrier Reef Sponge,
Rhopaloeides odorabile, PLoS ONE”, Issue 9. Vol. 4.


24. Pitt J. I. and Chistian J. H. B. (1968), “Water Relations of Xerophilic Fungi
Isolated from Prunes”, Applied Microbiology, Dec. 1968, pp. 1853-1858.
25. Solveig Tosi et at. (2001), “Collagenase production in an Antarctic strain of
Arthobotrys tortor Jarowaja”, Mycopathologia 153: pp. 157-162.
26. Sukhosyrova E. A. et at. (2003) “Characteristics of Collagenolytic Enzymes
Secreted by Deuteromycete Fungi Aspergillus flavus, Bulletin of Experimental
Biology and Medicine”, Vol. 135, No. 5.
27. Susan Schenck et at. (1980), “Collagenase Production by Nematode Trapping
Fungi, Appl. Environ. Microbiol.”, 40: 3, pp. 567-570.
28. Ying Ji et at. (2007), “Effect of water activity and temperature on growth of
Penicillium citreoviride and Penicillium citrinum on MiGao (rice cake)”, Can. J.

Microbiol. Vol, pp. 53.
29. Zhao Minglian, Mo Minghe, Zhang Keqin (2004), “Characterization of a neutral
serine protease and its full-length cDNA from the nematode-trapping fungus
Arthrobotrys oligospora”, Mycologia, 96(1), pp. 16-22.