VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GP5 CỦA VIRUS GÂY
HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN
(PRRS) TRÊN TẾ BÀO THUỐC LÁ VÀ HẠT ĐẬU TƯƠNG
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC


ii

HÀ NỘI – 2016


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, một phần đã
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả;
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày 19 tháng 8 năm 2016
Tác giả

ii

MỤC LỤC
Bảng 1.1. Một số vaccine PRRS thế hệ mới...................................................................12
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC
VẬT PHÒNG CHỐNG PRRS............................................................................................27
1.3.3.Tình hình nghiên cứu phát triển kháng nguyên tái tổ hợp trong thực vật phòng
chống PRRS..................................................................................................................31
Bảng 1.2. Các nghiên cứu biểu hiện gen của virus PRRS ở thực vật...............................32
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.......................................................................39
3.2.4. Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen biểu hiện GP5..................................97
3.2.4.2. Phân tích sự có mặt của gen chuyển ở các dòng đậu tương chuyển gen..........99
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ....................................................121
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..........................................................................................121
SUMMARY..................................................................................................................122


iii

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AS
BAP
B5
bp
BY2
CCM
cDNA
ADN
dNTP

EDTA
E. coli
ELISA
HRP
HSE
HSP
GA3
GFP
GM
gus
IAA
IBA
kb
kDa
LB
MS
NAA
nptII
NSP
OD
PCR
PPT
PRRSV
RM
Rpm
scFv

Acetosyrigone
6-benzyladenine purin
Môi trường cơ bản theo Gamborg (1968)

Base pair
Bright Yellow 2
Cocultivation medium (Môi trường đồng nuôi cấy)
Complementary DNA
Deoxyribonucleic acid
Deoxynucleoside triphosphate
Ethylene diamine tetraacetic acid
Escherichia coli
Enzyme-linked immunosorbent assay
Horseradish Peroxidase
Heat shock Element
Heat shock protein
Gibberellic acid
green fluorescent protein
Môi trường nảy mầm
Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase
Indole Acetic acid
Indole-3-butyric acid
Kilo base
Kilodalton
Luria and Bertani
Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
α-Naphthaleneacetic acid
Neomycin phosphotransferase gene
non-structural protein
Optical density
Polymerase Chain Reaction
Phosphinothricin
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus
Môi trường ra rễ

revolutions per minute, vòng/phút
Single-chain variable fragment


iv
SDS-PAGE
SDS
SIM
SEM
Taq
T-ADN
Ti- plasmid
T0, T1
T0
T1

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Sodium dodecylsulfat
Môi trường tạo chồi
Môi trường kéo dài chồi
Thermus Aquaticus
Vùng ADN plasmid chuyển vào thực vật
Plasmid tạo khối u
Các thế hệ cây chuyển gen
Cây chuyển gen tái sinh từ chồi
Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1

Vir
v/p
vvp

X-gluc
YEP
WT

Virulence Region
vòng/phút
volume per volume per minute, lít/phút
5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
Yeast extract peptone
Wild type


v
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số vaccine PRRS thế hệ mới...................................................................12
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC
VẬT PHÒNG CHỐNG PRRS............................................................................................27
1.3.3.Tình hình nghiên cứu phát triển kháng nguyên tái tổ hợp trong thực vật phòng
chống PRRS..................................................................................................................31
Bảng 1.2. Các nghiên cứu biểu hiện gen của virus PRRS ở thực vật...............................32
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.......................................................................39
3.2.4. Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen biểu hiện GP5..................................97
3.2.4.2. Phân tích sự có mặt của gen chuyển ở các dòng đậu tương chuyển gen..........99
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ....................................................121
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..........................................................................................121
SUMMARY..................................................................................................................122


vi

DANH MỤC HÌNH
Bảng 1.1. Một số vaccine PRRS thế hệ mới...................................................................12
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC
VẬT PHÒNG CHỐNG PRRS............................................................................................27
1.3.3.Tình hình nghiên cứu phát triển kháng nguyên tái tổ hợp trong thực vật phòng
chống PRRS..................................................................................................................31
Bảng 1.2. Các nghiên cứu biểu hiện gen của virus PRRS ở thực vật...............................32
2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.......................................................................39
3.2.4. Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen biểu hiện GP5..................................97
3.2.4.2. Phân tích sự có mặt của gen chuyển ở các dòng đậu tương chuyển gen..........99
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ....................................................121
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..........................................................................................121
SUMMARY..................................................................................................................122


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome, PRRS) hay còn được gọi là bệnh lợn tai xanh là một bệnh
truyền nhiễm nguy hiểm, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trên khắp
thế giới. Bệnh gây ra bởi virus PRRS. Ở Việt Nam, virus PRRS được phát hiện lần
đầu tiên, ở thể kinh điển, vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào phía Nam.
Virus thể độc lực cao được phát hiện vào đầu năm 2007 tại Hải Dương, sau lây lan
khắp cả nước, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi nước nhà.
Với những nỗ lực kết hợp các biên pháp phòng chống và tiêm phòng
vaccine, dịch bệnh lợn tai xanh tại Việt Nam đã giảm đi đáng kể. Tuy vậy, dịch
bệnh vẫn còn xảy ra lẻ tẻ, tiềm ẩn nguy cơ bùng phát dịch trong tương lai. Nhiều
loại vaccine thương mại hiện được sử dụng, chủ yếu là các vaccine truyền thống

như vô hoạt và nhược độc. Tuy nhiên, cho tới nay vẫn chưa có một vaccine phòng
chống bệnh PRRS thỏa mãn được các yêu cầu về hiệu lực và an toàn như mong đợi.
Bên cạnh đó, với đặc tính sinh miễn dịch khác lạ của virus PRRS so với các virus
gây bệnh toàn thân khác, việc nghiên cứu phát triển các vaccine mới, làm đa dạng
hóa các nguồn vaccine phòng chống bệnh là điều hết sức cần thiết.
Nhiều hướng nghiên cứu phát triển các loại vaccine thế hệ mới đã và đang
được tiến hành, trong đó dạng vaccine tiểu đơn vị biểu hiện trong hệ thống thực vật
là một hệ thống sản xuất mới có nhiều ưu điểm như dễ dàng tăng quy mô sản xuất
và thu sinh khối; có thể dùng qua đường miệng; vì thế tiện lợi và dễ sử dụng hơn so
với các vaccine thông thường.
Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp của virus
PRRS trên một số đối tượng thực vật như thuốc lá, chuối, khoai tây, đậu tương..
Song mức độ biểu hiện của các kháng nguyên tái tổ hợp này còn thấp chủ yếu dao
động từ 0,01-1%. Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án: “Nghiên
cứu biểu hiện gen GP5 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
(PRRS) trên tế bào thuốc lá và hạt đậu tương”.


2
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu chung của luận án là nghiên cứu tăng cường biểu hiện kháng
nguyên GP5 của virus PRRS phân lập trên lợn nhiễm bệnh PRRS ở Việt Nam trong
tế bào thuốc lá BY-2 và hạt đậu tương. Các mục tiêu cụ thể cần đạt như sau:
1) Phát triển được hệ vector chuyển gen dựa trên virus thực vật cho phép
biểu hiện có điều khiển kháng nguyên GP5 trong dòng tế bào thuốc lá BY-2.
2) Thiết kế được vector chuyển gen sản xuất kháng nguyên GP5 chuyên biệt ở
hạt đậu tương.
3) Tạo được các dòng tế bào thuốc lá BY-2, cây thuốc lá và cây đậu tương
biến đổi gen biểu hiện kháng nguyên GP5.
4) Đánh giá sơ bộ tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp GP5 biểu hiện

trong thực vật sử dụng qua đường miệng trên động vật thí nghiệm.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1. Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên GP5 của virus PRRS trong
hệ thống tế bào thuốc lá BY-2 nuôi cấy huyền phù:
- Tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào thuốc lá BY-2 quy mô phòng thí nghiệm.
- Thiết kế vector biểu hiện ổn định GP5 dựa trên virus thực vật TMV dưới sự
điều khiển của promoter cảm ứng nhiệt HSP 18.2.
- Tạo dòng tế bào thuốc lá BY-2 chuyển gen biểu hiện GP5.
- Đánh giá sơ bộ tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp GP5 trên động vật
thí nghiệm.
Nội dung 2. Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên GP5 của virus PRRS đặc
hiệu trong hạt đậu tương.
- Đánh giá khả năng tái sinh đa chồi của một số giống đậu tương Việt Nam,
tạo nguyên liệu in vitro phục vụ chuyển gen.
- Thiết kế vector biểu hiện GP5 dưới sự điều khiển của promoter đặc hiệu ở
hạt β-phaseolin.
- Biển hiện gen GP5 trong cây mô hình.
- Tạo cây đậu tương chuyển gen mang gen GP5.


3
4. Đóng góp mới của luận án
- Luận án đã thiết kế thành công 2 hệ vector tăng cường biểu hiện gen GP5
trên tế bào thuốc lá BY-2 và hạt đậu tương là pHsp-TMV-LTB-GP5 và pDestphaso-LTB-GP5, mức độ biểu hiện của gen đích có thể đạt tới 3,4% hàm lượng
protein hoà tan tổng số;
- Protein tái tổ hợp GP5 thụ nhận được từ nghiên cứu của luận án đã có khả
năng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu ở lợn.
5. Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa lý luận
Đề tài bổ sung bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất các

protein có hoạt tính sinh học trong hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật bioreactor hoặc
trong cơ quan tích trữ của cây trồng. Ngoài những ưu điểm như an toàn và dễ dàng
tăng quy mô sản xuất, những cái tiến trong hệ thống vector biểu hiện như dựa trên
virus thực vật và promoter cảm ứng hay promoter đặc hiệu đã cho phép tăng năng
suất các protein có hoạt tính sinh học, một trong những điểm vẫn còn là hạn chế của
các hệ thống biểu hiện khác nhau trong thực vật.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài đã cung cấp quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào thuốc lá
BY-2 ở quy mô phòng thí nghiệm phục vụ cho nuôi cấy thu sinh khối tế bào
chuyển gen. Hệ thống này có thể ứng dụng cho việc sản xuất nhiều loại protein tái
tổ hợp khác nhau trong tế bào BY-2.
Đề tài đã phát triển được cấu trúc vector chuyển gen dựa trên virus thực vật
TMV, có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp ổn định ở mức cao 3,4 % protein hòa
tan tổng số dưới sự điều kiển của promoter cảm ứng nhiệt trong tế bào BY-2. Cấu
trúc vector này có thể ứng dụng để cải thiện mức độ biểu hiện các protein tái tổ hợp
ở tế bào thực vật khác nhau.
Các dòng tế bào thuốc lá BY-2 biểu hiện GP5 của virus PRRS của luận án có
thể được phát triển sản xuất ở quy mô lớn hơn ứng dụng cho cho các thử nghiệm
lâm sàng.
Vector chuyển gen, trong đó gen GP5 của virus PRRS được điều khiển biểu
hiện của promoter đặc hiệu ở hạt có thể dùng chuyển gen ở các đối tượng cây trồng
lấy hạt khác nhau ngoài đậu tương như lúa, ngô, lạc...


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN VÀ VIRUS PRRS


1.1.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine reproductive and
respiratory syndrome - PRRS) (còn gọi là bệnh lợn tai xanh) là một bệnh truyền
nhiễm nguy hiểm ở lợn (kể cả lợn rừng). Biểu hiện đặc trưng của lợn bệnh là bị các
rối loạn về sinh sản ở lợn nái như sảy thai, thai chết lưu, lợn sơ sinh chết yểu hoặc
viêm đường hô hấp rất nặng, tỉ lệ chết cao ở lợn con theo mẹ và lợn nái hậu.
Bệnh PRRS lần đầu tiên được phát hiện ở Hà Lan vào năm 1986, sau đó là ở
Mỹ năm 1987 rồi nhanh chóng lan rộng ra nhiều nước chăn nuôi lợn trên thế giới như
Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991), Pháp (1992)...
(Rossow KD, 1998). Lúc đầu, do chưa xác định được căn nguyên bệnh nên được gọi
là “bệnh bí hiểm ở lợn” (mistery swine disease – MSD). Sau khi lan rộng trên toàn
thế giới, bệnh được gọi bằng nhiều tên như hội chứng hô hấp và sinh sản của lợn
(Swine Infertility and Respiratory Syndrome – SIRS), hội chứng hô hấp và sảy thai ở
lợn (Porcine Endemic Abortion and Respiratory Syndrome – PEARS), hội chứng hô
hấp và sinh sản lợn (PRRS), bệnh tai xanh (Blue ears)... Năm 1991, lần đầu tiên
nguyên nhân gây bệnh “bí hiểm” đã được Wensvoort và cs thuộc Viện Thú y

Trung ương - Lelystad - Hà Lan phân lập được trên tế bào đại thực bào phế
nang của lợn, là một loại virus ARN và đặt tên là virus Lelystad-LV . Năm
1992, Collins và cộng sự cũng báo cáo về việc phân lập được virus gây bệnh
với tên gọi là VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ. Hội nghị quốc tế
về bệnh này được tổ chức cũng vào năm 1992, tại St. Paul, Minnesota đã thống nhất
tên bệnh là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, được tổ chức Thú y thế giới
(OIE) công nhận. Từ đây, virus gây bệnh được gọi phổ biến trên thế giới là virus
PRRS (Rossow KD, 1998).
Tại Trung Quốc, PRRS xuất hiện từ những năm 1995, gây chết hàng loạt con


5
lợn. Năm 2006, PRRS lại hoành hành tại đây trong vòng 3 tháng, làm trên 2 triệu lợn

mắc bệnh, 400 nghìn con chết, ước tính tỉ lệ chết 20%. Bệnh được xác định do virus
PRRS thể độc lực cao gây ra với triệu chứng sốt cao, lợn chết ở mọi lứa tuổi, tốc độ
lây lan nhanh, chỉ sau 3- 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao.
Năm 2007 dịch lại bùng phát ở đây, xảy ra ở 26/33 tỉnh với 310000 con mắc, chết
hơn 81000 con. Các kết quả nghiên cứu đã phân lập từ mẫu bệnh phẩm của lợn bị
bệnh được cả virus thể kinh điển và thể độc lực cao của dòng Bắc Mỹ. Đến nay, bệnh
vẫn diễn biến phức tạp. Ở Philippines PRRS xuất hiện từ năm 2006, trong năm 2007
có 18 ổ dịch, 13542 con mắc, làm chết 1743 con và sau đó lan rộng, gây ốm và chết
hàng loạt lợn nái và lợn con theo mẹ .Tại Thái Lan, PRRS xuất hiện vào năm 1989 và
có mặt các chủng thuộc cả dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ (Tô Long Thành, 2008;
Cục Thú y, 2008).
Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục
trên thế giới đều có dịch bệnh PRRS lưu hành (trừ châu Úc và Newzeland)
và đã gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi. Ở Mỹ, hàng năm
bệnh PRRS gây tổn thất hàng trăm triệu đô la, ước tính năm 2011 thiệt hại lên đến
664 triệu USD (Holtkamp D, 2012). Cho đến nay chưa có nước nào trên thế giới
khẳng định là đã thanh toán được bệnh.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên, ở thể kinh điển, vào năm 1997
trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh
dương tính với PRRS. Kết quả điều tra những năm sau đó ở một số địa bàn thuộc
thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có
kháng thể virus PRRS (596/2308 mẫu) và 5/15 trại (chiếm 33%) có lưu hành huyết
thanh bệnh lợn tai xanh. Tuy nhiên, từ năm 1997 đến trước tháng 3 năm 2007 chưa
phát hiện các ổ dịch lâm sàng nào. Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tại Việt Nam
bắt đầu từ ngày 12/3/2007 khi hàng loạt đàn lợn tại Hải Dương có những biểu hiện
ốm khác thường sau đó lây lan ra các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ, Trung Bộ và Nam Bộ
gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi lợn (Tô Long Thành, 2008). Việc xảy ra
các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh phía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở Trung
Quốc. Kết quả phân tích cấu trúc gen của virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam cho



6
thấy, virus PRRS tại Việt Nam thuộc thể độc lực cao, chủng Bắc Mỹ. Cấu trúc gen
vùng NSP2 được phát hiện có sự thiếu hụt không liên tiếp về axit amin tại các vị trí
481 và từ 532 - 560. Tất cả các mẫu virus PRRS của Việt Nam đều có mức tương
đồng cao so với virus PRRS chủng độc lực cao của Trung Quốc (99,0-99,7%). Nếu
như cả năm 2007, toàn quốc có 18 tỉnh, thành phố có dịch với 70 577 con lợn mắc
bệnh thì đến năm 2010, dịch đã lan trên 49 tỉnh thành với 833 641 con lợn mắc
bệnh, trong đó chết và tiêu hủy 457 708 con (Cục Thú y, 2010). Dịch có xu hướng
giảm năm 2011 nhưng lại tiếp tục gia tăng vào năm 2012. Từ tháng 7/2013 đến
tháng 09/2015, cả nước đã kiểm soát thành công dịch tai xanh. Tuy nhiên, từ đầu
tháng 10/2015 đến nay cả nước đã xuất hiện 19 ổ dịch tai xanh tại 11 huyện của 06
tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Long An, Tiền Giang, Sóc Trăng và Cần Thơ. Tổng số lợn
mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 1 228 con (Phòng Dịch tễ, Cục Thú y, 2016). Nhìn
chung, bệnh vẫn còn diễn biến phức tạp bởi đặc tính sinh miễn dịch khác lạ của
virus PRRS và việc vẫn còn tồn tại virus trong những đàn lợn lành bệnh lâm sàng
cho thấy nguy cơ lớn từ bệnh này vẫn còn tiếp tục trong thời gian tới.
1.1.2. Virus PRRS
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái và phân loại
Virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) là virus
ARN sợi đơn, dương. có vỏ bao bọc, thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ
Nidovirales (Ansari IH, 2006).
Dựa trên đặc điểm sinh học và phân tích kiểu gen, virus PRRS được chia làm
hai nhóm lớn, nhóm I gồm các virus có nguồn gốc ở châu Âu (đại diện tương ứng là
chủng Lelystad - LV), nhóm II gồm các virus có nguồn gốc Bắc Mỹ (đại diện tương
ứng là chủng VR2332) với nhiều phân nhóm đã được xác định. Mặc dù, hai nhóm
xuất hiện gần như đồng thời và gây ra các dấu hiệu lâm sàng gần giống nhau song
mức độ tương đồng về cấu trúc chuỗi nucleotide của hai nhóm chỉ vào khoảng 5060% (Fang Y, 2007). Hiện nay, cả hai nhóm virus này vẫn lưu hành rộng khắp trên
toàn cầu. Báo cáo về mặt di truyền cho thấy, virus PRRS rất đa dạng và biến đổi hàng
năm. Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi

nucleotide khá cao, đến 20%, đặc biệt là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ. Chủng


7
virus gây bệnh tai xanh ở Trung Quốc và các nước châu Á trong đó có Việt Nam
trong những năm gần đây được cho là thuộc nhóm Bắc Mỹ và đã biến chủng thành
chủng PRRSV độc lực cao (Lê Thanh Hòa, 2009; Shi M, 2010). Virus PRRS được
đánh giá là loài có tốc độ tiến hóa nhất trong số các virus sợi ARN (Hanada K, 2005).
Virion của virus PRRS có dạng hình cầu hoặc trứng với đường kính vào
khoảng 50-74 nm, bên trong là lõi nucleocapsid có đường kính khoảng 40 nm được
bao bọc bởi một lớp vỏ lipid kép. Bề mặt ngoài virus trơn với chỉ một vài điểm lồi
ra là các phức hợp protein vỏ gắn trên vỏ bọc lipid. Thành phần protein chính của
vỏ virus là GP5 và M. Các protein vỏ GP2, GP3, GP4, E chiếm tỉ lệ ít hơn. Bên trong
là nucleocapsid tạo bởi nucleocapsid protein (protein N) bao bọc ARN genome của
virus. Protein N chiếm khoảng 20-40% protein của hạt virus (Dokland T, 2010).

Hình 1.1. Cấu trúc và hình thái hạt virus PRRS
A. Hạt virus PRRS dưới kính hiển vi điện tử (Nguồn: Spilman MS, 2009)
B. Sơ đồ hóa cấu trúc virion của virus PRRS ( Nguồn :)

1.1.2.2. Cấu trúc hệ gen và protein của virus
Hệ gen của virus PRRS là một phân tử ARN đơn, dương, kích thước khoảng
13-15 kb gồm đầu mũ 5', đuôi polyA ở đầu 3' cùng 9 khung đọc mở (ORF - open
reading frame) 1a, 1b, 2a, 2b và 3-7 mã hóa cho khoảng 20 protein (Britton P &,
Cavanagh D, 2008). Khi phân tích hệ gen PRRS người ta thấy rằng các ORF gối
vào nhau từ 1-253 bp. Ví dụ: ORF4 và ORF5 lồng vào nhau bởi 1 bp, ORF3 và
ORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp. Như vậy, các gen sau sử dụng một phần cuối
chuỗi nucleotide của gen trước làm promoter hoạt động (Meng XJ, 2000).



8
ORF1a và ORF1b mã hóa cho các protein chức năng như Serine protease,
helicase, polymerase. Bảy khung đọc mở ORF2a, 2b, 3-7 mã hóa cho các protein
cấu trúc GP3, E, GP3, GP4, GP5, M và N (Fang Y & Snijder EJ, 2010).
Các phân tử glycoprotein nhỏ GP2, GP3, GP4 và protein E tương tác với nhau
để tạo thành một cấu trúc heterotetrameric phức tạp trong các tế bào bị nhiễm. Việc
hình thành phức hợp này là cần thiết trong việc truyền nhiễm của virion (Das PB,
2011; Wissink E, 2005). GP2 được mã hóa bởi ORF2a, có kích thước khoảng 29-30
kilodalton (kDa), mang trình tự tín hiệu N-terminal và cấu trúc neo màng ở đầu C.
GP2 có chứa 2 điểm N-glycosyl hóa (Meulenberg JIM, 1995). Ở nhóm Bắc Mỹ, vị
trí N-glycosyl hóa nằm ở các vị trí N178 và N184. Vị trí glycosyl hóa có vai trò
quan trong trong việc truyền nhiễm của virus, ít nhất một trong hai vị trí là điểm
tương tác với receptor CD163 (Das PB, 2011).
Protein E có kích thước nhỏ khoảng 10 kDa, có mặt ở tất cả các
Arteriviruses. Protein E chứa một miền kị nước ở trung tâm. Protein E chứa vị trí
N-terminal N-myristoylation và vị trí casein kinase II phosphoryl hóa tiềm năng
Các bằng chứng thực nghiệm cho thấy protein E hình thành homo-oligomers bởi
tương tác không cộng hóa trị trong vỏ virus hoạt động như một kênh vận chuyển
ion (Lee C & Yoo D, 2006).
Glycoprotein GP3 có kích thước dao động 45-50 kDa, là một trong những
protein biến đổi nhất của virus PRRS, mức độ tương đồng acid amin giữa 2 nhóm
châu Âu và Bắc Mỹ chỉ vào khoảng 54-60%. GP3 là protein glycosyl hóa cao, chứa
bảy vị trí N-oligosaccharides liên kết. Các khu vực biến đổi nhất của GP3 nằm ở 35
axit amin đầu tiên, điểm biến đổi cao nhất được cho là trình tự peptide tín hiệu dẫn
tới ER với mức độ tương đồng chỉ đạt 29% giữa 2 nhóm châu Âu và Bắc Mỹ
(Mardassi H, 1995).
Glycoprotein GP4 có trọng lượng phân tử vào khoảng 31-35 kDa. GP4 chứa tín
hiệu peptide dẫn tới ER. GP4 có chứa epitope có khả năng kích thích kháng thể trung
hòa yếu bào. GP4 có vai trò trong quá trình tái bản của virus, có khả năng sử dụng hoặc
thay đổi cấu trúc của tế bào chủ để vận chuyển virus hoặc thành phần tế bào đến bề mặt

tế bào (Welch S, 2004).


9
Glycoprotein GP5 có trọng lượng phân tử từ 24-25 kDa là protein liên kết vỏ
bọc kết hợp glycogen. Đây là protein biến đổi nhất của virus PRRS, mức độ tương
đồng acid amin giữa hai nhóm châu Âu và Bắc Mỹ chỉ khoảng 50-55% (Mardassi
H, 1995). Các kháng thể trung hòa chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên
bề mặt của protein GP5, do vậy virus có thể bị trung hòa. Những epitope trung hòa
này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá. Có ba vị trí epitope kích thích tế bào
lympho B đã được xác định, một epitope trung hòa chính nằm ở giữa của
ectodomain GP5 (aa 36-52), một epitope không trung hòa (epitope A) và một
epitope trung hòa (epitope B) trong ectodomain của GP5 (Ostrowski M, 2002).
Protein màng (membrane protein) (M, ORF6): Có khối lượng phân tử khoảng 1819 kDa, không được glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và
có tính bảo tồn cao nhất với mức độ tương đồng acid amin giữa hai nhóm châu Âu và
Bắc Mỹ đạt đến 78-81% (Mardassi H, 1995). Protein M có cấu trúc tương tự như cấu
trúc protein M của các virus thuộc nhóm Coronavirus. Protein M hình thành cầu nối
disunfit với glycoprotein 5 (GP5) cấu thành một phần virus và được tìm thấy trong tế
bào nhiễm nhưng cầu nối sunfit này không cấu thành nên hạt virus (Meulenberg JJM,
1997).
Nucleocapsid protein (N, ORF7) có khối lượng phân tử khoảng 14-15 kDa,
đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên cao. Protein N chiếm khoảng 2040% protein của hạt virus. Nó không được glycosyl hóa, mặc dù chứa những vị trí
glycosyl hóa tiềm tàng. Hiện nay, protein N được dùng như là một kháng nguyên để
phát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn.
Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, có tất cả 6 ARN thông tin (mARN)
được tổng hợp, tất cả 6 ARN thông tin đều chứa trình tự sắp xếp chung nhận được
từ đầu 5' của hệ gen ARN trong gen và tất cả chúng đều có gắn thêm đuôi 3' polyA.
1.1.3. Vaccine phòng PRRS
Áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, vệ sinh thú y kết hợp với sử dụng
vaccine thích hợp và đúng cách là phương pháp phòng bệnh hữu hiệu và kinh tế

nhất. Hiện nay, trên thế giới đã có hơn 20 loại vaccine thương mại phòng bệnh lợn


10
tai xanh. Các vaccine được chế từ các chủng virus dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ
dưới dạng vaccine truyền thống là vaccine sống - nhược độc (modified-live virus
vaccine -MLV) và vaccine vô hoạt (killed vaccine - KV).
1.1.3.1. Vaccine truyền thống
Hầu hết các vaccine sống - nhược độc (MLV) thương mại được sản xuất
trên các dòng tế bào động vật và được cấy chuyển nhiều lần dưới áp lực
chọn lọc cho tới khi chủng vaccine bị mất độc lực. Hầu hết các dòng tế
bào động vật sử dụng bắt nguồn từ dòng tế bào thận khỉ MA-104, là
những dòng tế bào liên tục đáp ứng cho sự nhân lên của virus PRRS.
Tuy nhiên, các dòng tế bào khác, ví dụ như, MARC-Complimentary cells
(Welch S, 2004), các tế bào PK, FK, và BHK biểu hiện CD163, PK-15 với
CD163, tế bào SJPL, bạch cầu đơn nhân lợn và ZMAC cũng được phát triển
và sử dụng để nuôi cấy và phân lập virus PRRS cho việc sản xuất vaccine
(Renukaradhya GJ, 2015).
Các vaccine nhược độc hiện được cấp phép lưu hành rộng rãi trên thế giới và
tùy vào dịch bệnh trong từng nước để sử dụng vaccine được chế từ các chủng virus
dòng châu Âu (như Porcilis PRRS (từ DV; Merck), Amervac-PRRS (từ VP046;
Hipra), Pyrsvac-183 (từ All-183; Syva)) hay dòng Bắc Mỹ (như Ingelvac PRRS
MLV; ReproCyc PRRS-PLE (cả hai đều của VR-2332; Boehringer Ingelheim),
Ingel-vac PRRS ATP (từ JA-142; Boehringer Ingelheim), JXA1-R (chủng JXA1-

R, thể độc lực cao của Trung Quốc) hoặc cả hai dòng này. Mới đây, Việt Nam lần
đầu tiên đã sản xuất thành công vaccine nhược độc phòng bệnh lợn tai xanh từ
chủng virus PRRS Hanvet1.VN gây bệnh ở Việt Nam.
Các vaccine nhược độc tạo ra mức bảo vệ tốt đối với các chủng tương đồng
nhưng vẫn tồn tại một số quan ngại như phản ứng bảo vệ tương đối chậm, thường

là 3 - 4 tuần sau khi tiêm chủng; chỉ có khả năng bảo vệ tốt đối với các chủng tương
đồng; việc tiêm vaccine có thể ảnh hưởng tới hiệu quả bảo vệ của các vaccine khác
ở lợn (Renukaradhya GJ, 2015). Trong đó, một trở ngại lớn đối với vaccine nhược
độc là khả năng phát triển trở lại độc tính do đột biến gen của virus vaccine hay do


11
quá trình tái tổ hợp gen. Virus trong vaccine có khả năng vượt qua nhau thai vào
giai đoạn cuối của thai kỳ có thể gây chết lưu hoặc chết non. Lợn con sinh ra từ
những lợn nái được tiêm chủng có thể bị nhiễm virus PRRS và có khả năng lây
truyền cho những con lợn khác. Một điểm nữa là phản ứng bảo vệ xuất hiện chậm,
khoảng 4 tuần sau khi tiêm chủng, vì thế trong thời gian này có khả năng lây lan
virus cho những con lợn chưa bị nhiễm khác.
Các vaccine vô hoạt PRRS hiện được cấp phép sử dụng ở châu Âu và nhiều
nước trên thế giới ngoại trừ Mỹ. Các vaccine vô hoạt có thể được chế từ hai chủng
châu Âu và Bắc Mỹ. Một số vaccine thương mại phổ biến như Ingelvac PRRS KV
(nguồn gốc từ P120; Boehringer Ingelheim), Suipravac-PRRS (từ 5710; Hipra),
Progressis (từ chủng độc quyền; Merial), Suivac PRRS-ine (từ VD-E1 và VD-E2;
Dyntec), Suivac PRRS-IN (từ VD-E1, VD-E2 và VD-A1; Dyntec).
Vaacine vô hoạt PRRS có hiệu quả bảo vệ kém hơn vaccine nhược độc. Việc
sử dụng vaccine vô hoạt thường được ứng dụng như là một vaccine trị liệu trong
các trại lợn dương tính với virus PRRS (Renukaradhya GJ, 2015).
1.1.3.2. Vaccine thế hệ mới
Mặc dù, nhiều loại vaccine phòng bệnh lợn tai xanh đã được phát triển và
thương mại hóa bao gồm vaccine nhược độc và vô hoạt. Tuy nhiên, cho tới nay, vẫn
chưa có một vaccine phòng chống PRRS thỏa mãn được các yêu cầu về hiệu lực và
an toàn như mong đợi vì vaccine nhược độc tuy bảo vệ tốt với các chủng tương
đồng nhưng lại có nguy cơ trở lại độc tính, giá thành vaccine cao, đòi hỏi nghiêm
ngặt trong khâu bảo quản và vận chuyển...Vì vậy, việc tiếp tục tìm kiếm phát triển
các vaccine phòng bệnh PRRS mới hướng tới như vaccine không chứa mầm bệnh

virus, có khả năng bảo vệ tốt cũng như khắc phục được các hạn chế mà các vaccine
hiện hành là cần thiết. Nhiều hướng nghiên cứu phát triển vaccine đã và đang tiếp
tục như cải tiến công nghệ trong sản xuất vaccine truyền thống như bổ sung tá chất,
phương pháp vô hoạt, sử dụng các hạt nano... Hay phát triển các vaccine mới như
vaccine ADN, vector tái tổ hợp biểu hiện protein của virus, vaccine thực vật.


12
Bảng 1.1. Một số vaccine PRRS thế hệ mới
(Nguồn: Wasin Charerntantanakul, 2012)
Vaccine

ORF/GP

Miễn dịch

Bảo vệ

Kháng thể CMI

Tham khảo

Chủng
tương
đồng

Chủng
không
tương đồng
Barfoed, 2004


Vaccine ADN

ORF1-7

+

+

+

ND

Peptide tổng hợp

GP5

-

-

ND

-

Adenovirus vector

GP3,4,5

+


ND

ND

PRV vector vaccine

GP5,M

+

+

+

ND

Poxvirus vector

GP3,5,M

+

+

+

ND

TGEV vector


GP5,M

+

ND

+

ND

Alphavirus

GP5,M

+

+

+

+

Mogler, 2009

Bacterial vector

GP5,M

+


-

+

ND

Bastos, 2004

Biểu hiện ở côn trùng ORF 3,5,7

+

ND

+

ND

Plana Duran, 1997

Vaccine thực vật

+

+

ND

ND


Chen & Liu, 2011
Chia, 2010

GP5

Rompato, 2006
Charerntantanakul
2006
Cai, 2010
Zhou, 2010
Jiang, 2007
Qiu, 2005
Shen, 2007
Zheng, 2007
Cruz, 2010

Ghi chú: (+): có; (-): không; ND: không xác định.

Protein cấu trúc của virus, đặc biệt là GP3, GP5 và M là đích để phát triển
vaccine tái tổ hợp. Plana Duran và cs (1997) sử dụng baculovirus để biểu hiện ORF
2-7 riêng rẽ, tuy nhiên chỉ có các ORF 2,3,5 và 7 là biểu hiện được. Trong đó, sản
phẩm của gen ORF 3 và ORF 5 (GP3 và GP5) được xác định là ứng cử chính để
phát triển vaccine vì tạo được mức độ bảo hộ tương đối cao là 68,4% và 50% khi
đánh giá trên lợn con khỏe mạnh và lợn ở thời kỳ cai sữa. Trong khi đó, protein N
không có khả năng bảo vệ. Chuột được tiêm chủng với adenoviruses (rAd) mang
GP3 hoặc GP5 đã bị đột biến mất axit amin từ 2-64 tạo ra kháng thể trung hòa đặc
hiệu với PRRSV (Jiang Y, 2007). Virus Pseudorabies tái tổ hợp biểu hiện protein
GP5 tạo ra bảo hộ tốt hơn vaccine bất hoạt có trên thị trường.



13
Để tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên của virus
PRRS, các vector tái tổ hợp biểu hiện các protein của virus được gắn với các protein
khác nhau hoặc cùng biểu hiện nhiều protein của virus cùng một lúc. Chuột tiêm
GP5 và M biểu hiện từ vector replication-defective adenovirus có hàm lượng kháng
thể trung hòa cao hơn đáng kể so với chuột chỉ được tiêm vector biểu hiện GP5
hoặc M riêng rẽ (Jiang W, 2006). Fowlpox virus tái tổ hợp đồng biểu hiện GP5 và
GP3 cũng cho làm chuột được tiêm giảm sốt và số lượng virus trong các tế bào phổi
thấp hơn so với đối chứng (Shen G, 2007). Tổ hợp GP3-GP5 hoặc GP3-GP4-GP5
cũng đồng thời tăng cường miễn dịch thể và tế bào (Jiang W, 2008). Tuy nhiên, hạn
chế về thời gian và mức độ miễn dịch, khả năng bảo vệ hiện là những hạn chế của
vaccine tiểu đơn vị biểu hiện ở baculovirus.
Vaccine ADN chống lại PRRSV là một dạng được quan tâm nghiên cứu xem
như là một vaccine an toàn hơn. Li và cs (2009) đã sử dụng gen mã hóa cho protein
GP5 và sử dụng S. typhimurium nhược độc như là hệ thống mang vaccine ADN
chứa ORF 5 qua đường miệng. Kết quả cho thấy lượng kháng thể trung hòa trong
huyết thanh của chuột tương đương như trong chuột được tiêm với plasmid ADN
mang ORF 5. Vaccine ADN dựa trên GP5 bị đột biến ở đầu N-glycosylation hoặc
đồng biểu hiện với các protein chức năng khác cũng cho thấy làm tăng miễn dịch
của các vaccine ADN (Li G, 2009). Chia và cs (2010) sử dụng gen mã hóa GP5 và
M đồng thời kết hợp với đoạn axit amin mã hóa cho glycine-proline-glycine-proline
(GPGP) nhằm tạo mối liên kết giúp ổn định cấu trúc bậc ba. Với ba cấu trúc:
plasmid ADN mã hóa đồng thời protein GP5/M không có GPGP liên kết (pcADN56), plasmid ADN mã hóa GP5/M được gắn kết bởi một mối liên kết GPGP
(pcADN-5L6), và plasmid ADN mã hóa M /GP5 protein phản ứng tổng hợp liên
hợp bởi một GPGP là mối liên kết (pcADN-6L5) sử dụng như một vaccine ADN.
Kết quả cho thấy, cả ba cấu trúc đều có khả năng kích thích sinh ra kháng thể. Sau
khi thử thách với virus PRRS, lợn được tiêm chủng với cấu trúc pcADN-5L6 và
pcADN-6L5 có virus trong máu ở mức độ thấp hơn và thời gian ngắn hơn và lượng
virus trong mô cũng thấp hơn so với lợn được tiêm chủng với pcADN-56. Điều này



14
cho thấy mối liên kết GPGP giúp cải thiện cấu tạo tự nhiên của protein virus PRRS
và vì thế có khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch.
Trong những năm gần đây, sử dụng thực vật là hệ thống biểu hiện để sản xuất
vaccine tiểu đơn vị được đánh giá là có nhiều lợi thế như có thể sử dụng trực tiếp qua
đường miệng, rẻ tiền, dễ dàng trong sản xuất và mở rộng sản xuất, an toàn hơn so với
các hệ thống truyền thống... Sử dụng thực vật biểu hiện các kháng nguyên như GP5, M
của virus PRRS nhằm tạo vaccine cũng đã tạo được đáp ứng miễn dịch trên động vật
mô hình (Hu J, 2012; Chan HT, 2013). Tiến hành lây nhiễm virus nhận thấy sự giảm
đáng kể lượng virus trong máu và mô so với lợn đối chứng (Chan HT, 2013). Có thể
thấy, sản xuất và sử dụng protein của virus biểu hiện trong hệ thống thực vật là một
trong những phương thức hiệu quả để phát triển vaccine PRRS thế hệ mới (Hu J,
2012). Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của các kháng nguyên của virus PRRS nói riêng
và các protein tái tổ hợp ở thực vật nói chung còn thấp được đánh giá là một trở ngại
lớn nhằm hướng tới việc phát triển và thương mại hóa các sản phẩm này.
1.2. CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN VÀ GIẢI PHÁP TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU
HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở THỰC VẬT
1.2.1. Các hệ thống biểu hiện thực vật
Nhiều loại thực vật khác nhau đã được khai thác để sản suất protein tái tổ hợp,
bao gồm các kháng nguyên làm vaccine (Mason HS, 2002; Fischer R, 2004). Cho
đến hiện nay, đã có nhiều hệ thống thực vật được sử dụng để sản xuất protein tái tổ
hợp. Nguồn nguyên liệu trong thực vật để biển hiện protein có thể chia thành các
nhóm như cây lấy lá, quả, rễ, hạt và hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật... Tuy nhiên,
không có một hệ thống nào là tối ưu nhất để sản xuất tất cả các sản phẩm tái tổ hợp
mà phụ thuộc vào bản chất của các protein tái tổ hợp cần được tổng hợp và mục
đích sử dụng. Vì thế, khi nghiên cứu cần quan tâm tới các yếu tố như loại protein tái
tổ hợp cần sản xuất, năng suất, sinh khối, khả năng mở rộng sản xuất… Mỗi hệ
thống biểu hiện đều có những ưu điểm và hạn chế nhất định. Có thể chỉ ra các ưu

nhược điểm chính ở một số hệ thống biểu hiện nổi bật được sử dụng trong hướng
nghiên cứu làm vaccine thực vật sau.


15
1.2.1.1. Cây trồng cho lá
Những nghiên cứu thăm dò để tạo ra các cây chuyển gen ổn định biểu hiện
protein tái tổ hợp thường được tiến hành trên các cây mô hình như Arabidopsis
thaliana và thuốc lá. Quy trình chuyển gen ở Arabidopsis đã được thiết lập và có
thể dễ dàng tiến hành. Tuy nhiên, Arabidopsis khó có thể trở thành hệ thống sản
xuất thương mại vì có sinh khối thấp (Fischer R, 2004). Trong khí đó, thuốc lá sản
xuất sinh khối khá cao và không phải là cây thực phẩm, vì thế không có nguy cơ
chiếm chỗ của các cây cung cấp thực phẩm cho người và động vật (Fischer R,
2004). Tuy nhiên, việc trồng cây thuốc lá chuyển gen ngoài tự nhiên lại đòi hỏi
phải tuân theo pháp luật hiện hành về an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi
gen vì thế thời gian có được sẽ kéo dài. Ngoài ra, cây thuốc lá chuyển gen lại
không thể sử dụng trực tiếp mà phải chế biến vì lá thuốc lá chứa hàm lượng
nicotine cao và các alkaloid độc phải loại bỏ trước khi sử dụng qua đường miệng.
Vì thế, việc sử dụng các dòng tế bào thuốc lá nuôi cấy huyền phù, có hàm lượng
alkaloid thấp có thể giảm thiểu các chất có thể gây độc và an toàn hơn trong việc
sản xuất protein tái tổ hợp. Ngoài thuốc lá, các cây trồng cho lá khác như cỏ
alfalfa, cỏ ba lá và rau diếp cũng đã được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp
(Fischer R, 2004). Lá của các cây này có thể ăn trưc tiếp không cần qua đun nấu
nên rất có lợi trong việc phát triển vaccine cho vật nuôi (Fischer R, 2004). Ngoài
ra, các loại lá này còn chứa hàm lượng protein cao và có năng suất sinh khối trên
một đợn vị diện tích lớn. Cỏ alfalfa có thể được thu hoạch 9 lần/năm. Kiểu biến
đổi sau dịch mã trong cỏ alfalfa khá đồng nhất (Fischer R, 2004). Quá trình Nglycosyl hóa ổn định là một trong những tiêu chí quan trọng cho việc sản xuất
protein làm thuốc vì chức năng sinh học của protein bị ảnh hưởng bởi cấu trúc
glycan gắn tại đầu N. Trong khi đó, N-glycosyl hóa trong cây thuốc lá lại không
đồng nhất (Bardor M, 2003).

1.2.1.2. Cây trồng lấy quả và củ
Rau quả và củ như cà chua và khoai tây cũng là một trong những đối tượng để
biểu hiện protein tái tổ hợp. Khoai tây thường xuyên được sử dụng vì quy trình


16
chuyển gen đã được chuẩn hóa. Củ tách từ cây chuyển gen biểu hiện S1
glycoprotein của virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IBV) đã cho thấy có
khả năng bảo vệ gà khỏi mắc các triệu chứng lâm sàng của bệnh và diệt được virus
trong thí nghiệm công cường độc (Zhou JY, 2003). Bên cạnh đó, việc sản xuất củ
khoai tây có thể dễ dàng cung cấp vật liệu cho thử nghiệm (Mason HS, 2002).
Protein tái tổ hợp trong củ được dự trữ trong thời gian dài trong điều kiện bình
thường (Fischer R, 2004). Nguy cơ trôi gen thấp vì khoai tây có thể được nhân
nhanh in vitro. Ngoài ra, quá trình chế biến khoai tây ở mức công nghiệp là có sẵn
nên chi phí sau thu hoach được giảm đi đáng kể. Tuy nhiên, khoai tây có hàm lượng
protein thấp (Mason HS, 2002) và có vị không ngon khi được ăn sống. Vị của khoai
tây được cải thiện sau khi đun nấu nhưng cấu trúc của protein tái tổ hợp lại bị mất
dẫn đến giảm khả năng đáp ứng miễn dịch nếu được dùng để sản xuất kháng
nguyên làm vaccine (Gunn S, 2012). Cà chua được coi là hệ thống biểu hiện tốt hơn
(Mason HS, 2002) vì cà chua có vị ngon và có thể ăn sống không cần chế biến.
Kháng nguyên biểu hiện trong quả không bị mất cấu trúc do nhiệt. Glycoprotein của
virus gây bệnh dại là kháng nguyên đầu tiên được biểu hiện trong cà chua
(McGarvey PB, 1995). Tiếp theo, các protein vỏ VP2 và VP6 của virus gây bệnh
tiêu chảy biểu hiện trong cà chua đã thể hiện khả năng miễn dịch trong chuột được
tiêm qua màng bụng (Saldaña S, 2006). Đặc tính chứa hàm lượng vitamin A cao
vốn có của cà chua có thể đồng thời trợ giúp nâng cao đáp ứng miễn dịch của kháng
nguyên tái tổ hợp (Gunn S, 2012). Quy trình trồng và chế biến ở quy mô công
nghiệp của cà chua cũng sẵn có giống như khoai tây. Tuy nhiên, cà chua cũng có
hàm lượng protein thấp và phải bảo quản lạnh sau thu hoạch để tránh bị hỏng (Gunn
S, 2012). Mặc dù kỹ thuật đông khô lạnh hiện nay có thể bảo quản quả nhưng sẽ

tăng chi phí.
1.2.1.3. Cây trồng lấy hạt
Hạt là một hệ thống biểu hiện khác để tổng hợp và dự trữ protein và kháng
nguyên tái tổ hợp và được xem là một hệ thống có nhiều ưu điểm. So với các thực vật


17
dễ bị hỏng như cây cho lá và quả thì hạt có thể cất giữ protein tái tổ hợp đã được sản
xuất trong thời gian dài (Lau O & Sun S, 2009). Hạt thường có hàm lượng nước thấp
khoảng 10% sinh khối, trong khi hàm lượng này của lá là hơn 90% (Boothe J, 2010).
Bên cạnh đó, hạt có hàm lượng protein tương đối cao từ 10% đến 40% trọng lượng
tươi, trong khi ở trong lá lại hầu hết là thấp hơn 5% (Boothe J, 2010). Vì thế, hạt là nơi
có thể thúc đẩy việc việc tích tụ và dự trữ ổn định của protein. Thêm vào đó hoạt tính
của các enzyme phân hủy protein trong hạt thấp, vì thế nguy cơ mất hoạt tính của
protein tái tổ hợp do phân hủy nội bào được giảm đi đáng kể (Fischer R, 2004). Nhiều
nghiên cứu cho thấy rằng kháng thể và kháng nguyên biểu hiện trong hạt có hoạt tính
ổn định trong nhiều năm ở nhiệt độ phòng (Stöger E, 2000). Vì thế, hạt là hệ thống biểu
hiện phù hợp cho tiêu thụ trực tiếp và đặc biệt thích hợp để phát triển vaccine cho vật
nuôi và các động vật khác. Việc trồng, sản xuất, thu hoạch, cất giữ, phân phối và chế
biến hạt ở quy mô công nghiệp đã được thiết lập cho hầu hết các cây trồng phổ biến
(Lau O & Sun S, 2009). Trong đó, nổi bật ở cây họ ngũ cốc (ngô, lúa...) và cây họ đậu.
Đậu Hà lan và đậu tương là hai hệ thống thông dụng nhất để nghiên cứu việc
phát triển trang trại phân tử trong thực vật (Lau O & Sun S, 2009) vì có thể tích tụ
hàm lượng protein cao trong hạt. Hạt đậu tương đã được sử dụng để biểu hiện tiểu
đơn vị B của độc tố đường ruột không bền nhiệt (LTB) của E. coli (Moravec T,
2007). Sau khi cho ăn, các hạt chuyển gen này đã tạo ra được cả miễn dịch dịch thể
và miễn dịch hệ thống ở chuột và giúp chuột chống chịu một phần khi tiến hành
công cường độc. Một trong những ưu thế của cây họ đậu so với cây ngũ cốc là hàm
lượng protein của hạt cao hơn chiếm đến 40% protein tổng số, trong khi ở ngũ cốc
chỉ vào khoảng 8 đến 13% (Stoger E, 2005). Tuy nhiên, quá trình chuyển gen ở cây

họ đậu được cho lá khá khó khăn. Ngoài ra, năng suất hạt không cao và chi phí sản
xuất cao hơn so với lúa và ngô. Nhưng đậu Hà Lan và đậu tương đều là cây tự thụ
phấn nên nguy cơ trôi gen là rất thấp.
Một trong những nhược điểm chung của hệ thống biểu hiện trong hạt là thời
gian sản xuất hạt kéo dài (Boothe J, 2010). Việc đánh giá khả năng biểu hiện của
protein chỉ được tiến hành khi hạt được hình thành. Bên cạnh đó, việc trong các cây