Mục lục
Nội dung
Mục lục ............................................................................................................................i
Danh sách hình .............................................................................................................. ii
Danh sách bảng ............................................................................................................. iii
Tóm tắt ......................................................................................................................... iiii
Danh mục các từ viết tắt ............................................................................................. iiiii
Chương 1 Giới thiệu .....................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................2
1.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 2
Chương 2 Lược khảo tài liệu ....................................................................................... 3
2.1 Giới thiệu cây Trầu bà chân rết ................................................................................ 3
21.1 Nguồn gốc và phân loại .......................................................................................... 3
2.1.2 Đặc điểm giống kiểng lá ........................................................................................ 3
2.1.3 Kỹ thuật trồng kiểng lá .......................................................................................... 3
2.2 Công nghệ nhân giống in vitro ................................................................................. 4
2.2.1 Giới thiệu lịch sử nuôi cấy mô .............................................................................. 4
2.2.2 Những ưu điểm và hạn chế của phương pháp nhân giống in vitro ....................... 5


2.2.2.1 Ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro ................................................. 5
2.2.2.2 Hạn chế của nhân giống in vitro ........................................................................5
2.2.3 Quy trình vi nhân giống ......................................................................................... 6
2.3 Thành phần môi trường ............................................................................................ 6
2.3.1 Khoáng đa lượng ...................................................................................................7
2.3.2 Khoáng vi lượng ....................................................................................................7
2.3.3 Cacbon và nguồn năng lượng ................................................................................ 7
2.3.4 Vitamin .................................................................................................................. 7
2.3.5 Các hợp chất hữu cơ không xác định ....................................................................8
2.3.6 Yếu tố làm đặc môi trường .................................................................................... 8

2.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ....................................................................8
2.4.1 Auxin ..................................................................................................................... 8
2.4.2 Cytokinin ............................................................................................................... 9
2.5 PH môi trường .......................................................................................................... 9
2.6 Một số vấn đề trong tạo mẫu in vitro .......................................................................9
2.6.1 Mẫu bị nhiễm .........................................................................................................9
2.6.2 Sự hóa nâu trong môi trường nuôi cấy ................................................................ 10
2.6.2.1 Các chất có thành phần phenol ........................................................................ 10
2.6.2.2 Phản ứng hóa nâu của mẫu cấy .......................................................................10
2.7 Những nghiên cứu liên quan về nhân giống cây Trầu bà chân rết ......................... 10


2.7.1 Tình hình nghiên cứu trong nước ........................................................................ 10
2.7.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................................ 11
Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu .............................................. 12
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu........................................................................... 12
3.2 Điều kiện phòng thí nghiệm ................................................................................... 12
3.3 Môi trường nuôi cấy ............................................................................................... 12
3.4 Vật liệu ................................................................................................................... 12
3.5 Phương pháp ........................................................................................................... 12
3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng thích hợp của HgCl2 0,1% để tạo nguồn
mẫu vô trùng ................................................................................................................. 13
3.5.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc
tái sinh chồi từ mầm ngủ của cây Trầu bà chân rết ...................................................... 15
3.5.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin và cytokinin thích hợp cho việc
tạo mô sẹo từ lát mỏng cuống lá non ............................................................................ 16
Chương 4 Kết quả và thảo luận ................................................................................ 18
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng thích hợp của HgCl2 0,1% để tạo nguồn
mẫu vô trùng ................................................................................................................. 18
4.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc

tái sinh chồi từ mầm ngủ của cây Trầu bà chân rết ...................................................... 20
4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin và cytokinin thích hợp cho việc
tạo mô sẹo từ lát mỏng cuống lá non ............................................................................ 26
Chương 5 Kết luận và kiến nghị ............................................................................... 31


5.1 Kết luận................................................................................................................... 31
5.2 Kiến nghị ................................................................................................................ 31
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 32
Phụ chương ................................................................................................................... 34

i


Tóm tắt
Trầu bà chân rết là một trong những giống kiểng lá được ưu chuộng hiện nay, tuy nhiên
nguồn cây giống không nhiều chủ yếu phải nhập nội từ các nước Thái Lan, Đài
Loan…Dẫn đến giá thành cây giống cao. Vì vấy đề tài “Nghiên cứu vật liệu khởi đầu in
vitro của cây trầu bà chân rết” đã được tiến hành nhằm tạo nguồn vật liệu ban đầu cho
các nghiên cứu tiếp theo, tạo ra số lượng lớn cây con cung cấp cho nhà vườn. Kết quả thí
nghiệm cho thấy:
Đối với cây Trầu bà chân rết thì hóa chất khử trùng HgCl 0,1% trong thời gian 10 phút là
thích hợp nhất đạt tỷ lệ mẫu vô trùng là đạt 44,2% đối với cuống lá non và 41,7% đối với
mầm ngủ.
Khi sử dụng thủy ngân ở thời gian 20 phút sẽ cho tỷ lệ mẫu chết cao trung bình trên 40%
Môi trường MS + 1mg/l BA + 1 mg/l TDZ thích hợp nhất cho việc tái sinh chồi từ mầm
ngủ và đạt chiều cao chồi là 1,2 cm, cho chồi to mập qua 56 NSKC.
Môi trường thích hợp nhất cho việc hình thành mô sẹo là môi trường MS + 1 mg/l NAA
+ 1 mg/l BA cho kết quả mô sẹo xanh, khối chặt đồng thời cũng cho kích thước mô sẹo
đạt 0,46 cm sau 56 NSKC.


iiii


Danh mục các từ viết tắt
2,4 D

2,4 Dichlopropennolxy acetic acid

BA

6 – Benzyl adenin

Ctv

Cộng tác viên

đ/c

Đối chứng

NSKC

Ngày sau khi cấy

MS

Musrashige và Skoog, 1962

NAA


Naphthalen acetic acid

TDZ

Thidiazuran

CĐHTT

Chất điều hòa tăng trưởng

NT

Nghiệm thức

iiiii


Danh sách hình
STT

Tên hình

Số trang

Hình 1

Cây Trầu bà chân rết

3


Hình 2

Chồi Trầu bà chân rết ở giai đoạn 56 NSKC ở nghiệm thức A1
(++)

25

Hình 3

Chồi Trầu bà chân rết ở giai đoạn 56 NSKC ở nghiệm thức A3
(+++)

25

Hình 4

Mô sẹo cây Trầu bà chân rết 42 NSKC ở nghiệm thức A0

30

Hình 5

Mô sẹo cây Trầu bà chân rết 42 NSKC ở nghiệm thức A0

30

ii



Danh sách bảng
Stt
Bảng 1
Bảng 2
Bảng 3
Bảng 4
Bảng 5

Tên bảng
Ký hiệu nghiệm thức khử trùng cuống lá non
Ký hiệu nghiệm thức khử trùng mầm ngủ
Môi trường tái sinh chồi và ký hiệu nghiệm thức
Môi trường tạo mô sẹo và ký hiệu nghiệm thức
Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến việc tạo nguồn mẫu vô trùng
đối với cuống lá non của cây Trầu bà chân rết

Số trang
13
13
15
16
18

Bảng 6

Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến việc tạo nguồn mẫu vô trùng
đối với mầm ngủ của cây Trầu bà chân rết

18


Bảng 7

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tái sinh
chồi từ mầm ngủ sau 14 ngày nuôi cấy (14 NSKC)

20

Bảng 8

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tái sinh
chồi từ mầm ngủ sau 28 ngày nuôi cấy (28 NSKC)

21

Bảng 9

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tái sinh
chồi từ mầm ngủ sau 42 ngày nuôi cấy (42 NSKC)

22

Bảng 10

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tái sinh
chồi từ mầm ngủ sau 56 ngày nuôi cấy (56 NSKC)

23

Bảng 11


Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tái sinh
chồi từ mầm ngủ sau 14 ngày nuôi cấy (14 NSKC)

26

Bảng 12

Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tái sinh
chồi từ mầm ngủ sau 56 ngày nuôi cấy (56 NSKC)

28

iii


Chương 1
Giới thiệu
1.1. Đặt vấn đề
Những năm gần đây, nghề trồng hoa kiểng tại thành phố Hồ Chí Minh cũng
như các tỉnh khác như Bến Tre, Đồng Tháp, Đà Lạt, Cần Thơ đang phát triển
mạnh, đặc biệt là phong trào trồng kiểng lá.
Mỗi loại kiểng lá có những nét đẹp, sự hấp dẫn và phong cách riêng không
giống như các loại bonsai, kiểng cổ thường dựa vào các hình thế cổ điển mà
tạo dáng theo. Chơi kiểng nội thất cũng không cần không gian rộng, chỉ cần
một khoảng không ở ban công, một góc nhỏ chỗ làm việc hay cạnh của sổ của
phòng ngủ là có thể đặt được những chậu cây xinh tươi. Có rất nhiều loại
kiểng lá được trồng phổ biến như Như ý, Thanh tâm, Bình lục… trong đó Trầu
bà chân rết là một trong những loại kiểng lá rất được ưa chuộng hiện nay. Với
những chiếc lá thuôn dài ở hai đầu, trên bề mặt lá có những đốm trắng xen kẽ,
hoặc đường sọc trắng giữa gân lá trong rất là đẹp mắt, chúng còn có một bộ rễ

mọc dài theo thân, dày nhìn giống như chân rết tạo cho nó một nét đẹp riêng
rất độc đáo.
Đặc biệt, Trầu bà chân rết là một đối tượng rất thích hợp để trồng trong nhà,
cơ quan, văn phòng... mà cây vẫn phát triển rất tốt. Ngoài ra, Trầu bà chân rết
còn được người chơi kiểng xem như một vật phong thuỷ, đặt trong nhà để hy
vọng nó sẽ đem lại nhiều may mắn, tiền tài và giúp ích nhiều cho sự nghiệp
của họ (Thế vinh, 2009).
Theo Dược sĩ Phan Đức Bình – Phó tổng biên tập tạp chí Thuốc & Sức khỏe,
việc chọn lựa và trưng bày các loại cây kiểng lá như là Trầu bà chân rết của
người chơi kiểng không chỉ là việc quan tâm đến tính thẩm mỹ tạo được một
không gian xanh, thoải mái mà nó còn có tác dụng thanh lọc không khí hấp
thụ nhiều chất gây ô nhiễm chuyển hóa thành dinh dưỡng nuôi cây (Phan Đức
Bình, 2011).
Tuy nhiên, hiện nay giống cây này trong nước hiện là một đối tượng kiểng lá
mới, nguồn giống không nhiều chủ yếu được nhập khẩu từ Thái Lan. Thêm
vào đó, cây Trầu bà chân rết chỉ nhân giống bằng phương pháp tách chiết chồi.
Trong khi cây lại phát triển chồi rất chậm, ít chồi dẫn đến hệ số nhân giống
chậm và rất thấp không đủ cung cấp cây giống cho thị trường. Cho nên giá
thành cây giống khá cao không đáp ứng được nhu cầu.

1


Nhân giống bằng phương pháp in vitro là phương pháp nhân giống được ứng
dụng phổ biến và thông dụng nhất hiện nay. Áp dụng phương pháp này, sẽ
nhân giống cây nhanh với số lượng lớn và đồng đều về chất lượng mà không
bị ảnh hưởng bởi đặc tính sinh trưởng của cây hay tác động bên ngoài như thời
tiết và mùa vụ. Ngoài ra, nhân giống in vitro còn tạo được nguồn cây giống
sạch bệnh, giữ được những đặc tính tốt của cây mẹ. Từ đó có thể hạ được giá
thành sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng.

Chính vì vậy nên đề tài: “Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu in vitro của cây
Trầu bà chân rết” đã được tiến hành nhằm mục đích tìm hiểu rõ hơn về khả
năng tái sinh chồi từ mầm ngủ, tạo mô sẹo từ cuống lá non của cây Trầu bà
chân rết.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định thời gian khử trùng thích hợp để tạo nguồn mẫu in vitro cho cây
Trầu bà chân rết.
Nghiên cứu nồng độ auxin và cytokinin thích hợp cho việc tạo mô sẹo đối với
cuống lá non và tái sinh chồi từ mầm ngủ của cây Trầu bà chân rết.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát thời gian khử trùng thích hợp của HgCl2 0,1% để tạo nguồn mẫu vô
trùng in vitro đối với cuống lá non và mầm ngủ của cây Trầu bà chân rết.
Khảo sát ảnh hưởng của auxin và cytokinin thích hợp cho việc tái sinh chồi từ
mầm ngủ của cây Trầu bà chân rết.
Khảo sát ảnh hưởng của auxin và cytokinin thích hợp cho việc tạo mô sẹo từ
lát mỏng cuống lá non in vitro của cây Trầu bà chân rết.

2


Chương 2
Lược khảo tài liệu
2.1. Giới thiệu cây Trầu bà chân rết
2.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Họ
:
Araceae

Hình 1: Cây Trầu bà chân rết
2.1.2. Đặc điểm giống kiểng lá

Đây là loại cây thích hợp trồng cả trong nhà và ngoài vườn. Lá của nó trở nên
đậm hơn khi trồng trong bóng râm. Đây là cách điều tiết để lá tận dụng tốt
nguồn ánh sáng yếu để quang hợp. Lá lớn và mịn màng, cuống lá dài, thùy sâu
và thường rũ xuống. Ngoài ra, trên bề mặt lá có những đốm trắng xen kẽ, hoặc
đường sọc trắng giữa gân trong rất là đẹp mắt, chúng còn có một bộ rễ mọc dài
theo thân, dày nhìn giống như chân rết.
2.1.3. Kỹ thuật trồng kiểng lá
Cách trồng và chăm sóc: Cây có thể sống nơi ánh sáng trung bình, dưới trời
mát hoặc trồng ngoài vườn đều được. Vì vậy, nên đặt nó ở hành lang, gần cửa
sổ. Nếu muốn đặt nó trong phòng ít ánh sáng thì phải đem nó ra hứng nắng 1
tuần bên ngoài mỗi tháng. Cần duy trì độ ẩm cho đất, tuy nhiên không nên tưới
nước quá nhiều khi trồng cây trong điều kiện ánh sáng yếu. Thỉnh thoảng nên
để cho đất thật khô ráo rồi mới tưới. Bón phân NPK hoặc dung dịch phân pha
sẵn (Hiếu Giang, 2003).
Ánh sáng: Phần lớn cây cảnh nội thất không chịu nổi ánh nắng gắt chiếu trực
tiếp từ trưa đến chiều. Nắng như vậy sẽ làm cây bị cháy lá thậm chí chết do
3


mất nước đột ngột. Nên để cây ở cửa sổ hướng ra phía đông để hứng nắng
sáng hoặc có lưới che vào buổi trưa (Nguyễn Hành, 2013).
Nước và độ ẩm: Nguyên nhân hàng đầu làm cây trồng trong nhà bị chết là do
bị úng rễ vì tưới nước quá nhiều trong khi đất không kịp thoát hết nước. Vì
vậy cần chú ý chọn loại đất tơi xốp. Tùy từng loại cây mà tưới nước cho phù
hợp. Khi tưới nên tưới cho đến khi thấy nước chảy ra từ đáy chậu, làm như
vậy sẽ giúp “thanh lọc” đất cho cây, giúp rửa trôi lượng muối thừa từ phân
bón và giúp phần rễ cây dưới đáy chậu không bị héo khô (Nguyễn Hành,
2013).
Phân bón: Phần lớn dinh dưỡng giúp cây tồn tại được tổng hợp nhờ nguồn
năng lượng mặt trời. Các nguyên liệu thô ban đầu là nước, CO2 cùng các

nguyên tố như N, P, L (đạm, lân, kali) và các nguyên tố vi lượng khác như
đồng, canxi… Các chất này được cây hấp thụ qua rễ (Hiếu Giang, 2003).
Sâu bệnh: Nếu cây bị sâu bệnh nên thử dùng thuốc xịt diệt muỗi, nếu thấy vẫn
không hiệu quả thì mang cây ra ngoài và dùng thuốc trừ sâu. Nên lựa chọn
những loại thuốc trừ sâu có nguồn gốc rõ ràng và có nguồn gốc tự nhiên.
Khắc phục tình trạng cây bị héo úa: Nếu phát hiện lá cây dần ngã sang màu
vàng và không còn màu xanh và bóng bẫy thì cần tìm ra nguyên nhân và thực
hiện các biện pháp giúp cây hồi phục. Khi cây đã chuyển sang trạng thái héo
úa, lá rụng đồng loạt thì khó có thể cứu cây (Hiếu Giang, 2003).
Những nguyên nhân thường gặp làm cây héo úa và rụng lá là:
- Cây bị úng: Hãy lấy một mẫu đất quanh rễ để kiểm tra, nếu thấy đất ướt
sũng và có rễ chết thì đúng là cây bị úng. Tiến hành thoát nước cho
đất, tốt nhất nên thay đất mới. Mang cây ra nơi thoáng mát, không có
quá nhiều gió và tránh ánh nắng trực tiếp (Hiếu Giang, 2003).
- Cây bị thừa chất dinh dưỡng: Mang cây ra nơi có nhiều ánh nắng
(nhưng tránh ánh nắng trực tiếp), tưới cho cây thật nhiều nước để rửa
trôi bớt phân bón đi (Hiếu Giang, 2003).
- Cây bị thiếu nước: Có những loại cây ưa nước nên ít tưới nước cho cây
tất nhiên sẽ làm cây khô và héo úa (Hiếu Giang, 2003).
2.2. Công nghệ nhân giống in vitro
2.2.1. Giới thiệu lịch sử nuôi cấy mô
Có thể nói G. Haberlandt, nhà sinh lý học Đức là cha đẻ của ngành nuôi cấy
mô thực vật, kể từ năm 1902, đã khai thác hiện tượng toàn năng của tế bào
thực vật. Đó là khả năng của tế bào cho ra một cây hoàn chỉnh trong điều kiện
nuôi cấy thích hợp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).

4


Đến năm 1922, Kotte và Robins lặp lại thí nghiệm của Haberlandt trên vật liệu

là đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002).
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của
việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua (Dương Công Kiên, 2002).
Năm 1941, Overbeck ở Mỹ đã chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của
nước dừa trong nuôi cấy phôi họ cà (Datura).
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự
nhân chồi.
Năm 1962, Musrashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu
một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô (Dương Công Kiên, 2002).
2.2.2. Những ưu điểm và hạn chế của phương pháp nhân giống in vitro
2.2.2.1. Ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro
Theo Bùi Bá Bổng (1995), việc nhân giống cây bằng phương pháp nuôi cấy
mô có các ưu điểm sau:
- Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ.
- So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, hom), nhân giống
bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng lớn cây con từ một
cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn.
- Tạo ra cây con sạch bệnh nhờ có thể áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu
một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh.
- Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết và điều kiện
ngoại cảnh.
- Một số giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất.
- Việc trao đổi giống được dễ dàng hơn.
Với những ưu điểm trên, nuôi cấy mô thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong
sản xuất nông, lâm nghiệp. Đây thực sự là cuộc cách mạng trong ngành trồng
trọt. Nuôi cấy mô đã có những đóng góp to lớn trong việc phục tráng, nhân
giống cây trồng, góp phần vào sự phát triển của ngành khoa học nông, lâm
nghiệp (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
2.2.2.2. Hạn chế của nhân giống in vitro

- Tính bất định về di truyền trong một số hệ thống nuôi cấy.
- Tạo ra những cây không hoàn toàn giống như mong muốn: mọc um tùm (do
còn khả năng trẻ hóa trong quá trình nuôi cấy).
- Một số loài thân gỗ rất khó cảm ứng ra rễ.
- Việc chuyển cây từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm là công đoạn khó khăn vì
cây lúc này dễ bị nhiễm nấm bệnh.
5


- Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyền mô sẹo và huyền
phù tế bào được lặp lại nhiều lần.
- Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
2.2.3. Quy trình vi nhân giống
Công nghệ nhân giống ở mức độ tế bào (micropropagation) bao gồm nội dung
sản xuất từ một phần cây rất nhỏ và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt. Công
nghệ vi nhân giống của những cây trồng đặc biệt có khả năng áp dụng có hiệu
quả về kinh tế (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).
Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmermen (1991) chia thành 4 giai đoạn
khác nhau, mỗi giai đoạn có một chức năng riêng. Sự thành công của công
việc vi nhân giống tùy thuộc vào tất cả các giai đoạn.
In vivo
Giai đoạn 0 : Sự chuẩn bị cây mẹ
In vitro
Giai đoạn 1 : Bắt đầu tiệt trùng
Giai đoạn 2 : Nhân
Giai đoạn 3a : Kéo dài
Giai đoạn 3b : Tạo rễ và tiền thuần dưỡng
In vivo
Giai đoạn 4 : Thuần dưỡng (Nguyễn Thị Mỹ Duyên, 2007)

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), cây mẹ cần phải sạch
bệnh và đang ở trong giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống sẽ
đạt hiệu quả cao.
2.3. Thành phần môi trường
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường
nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Tất cả các môi trường cấy đều bao gồm 5 thành phần:
- Khoáng đa lượng
- Khoáng vi lượng
- Vitamin
- Đường là nguồn cung cấp carbon
- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định
(amino acid, EDTA…) và một số chất có thành phần không xác định như
nước dừa và dịch chiết nấm men…(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,
2002).

6


2.3.1. Khoáng đa lượng
Theo Lê Văn Hòa và ctv (1999), khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh
hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc.
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây
trồng trong điều kiện tự nhiên (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là Nitrogen, Phosphorus, Botasium,
Calcium, Magnesium, sắt (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
2.3.2. Khoáng vi lượng
Khoáng vi lượng là những nguyên tố được sử dụng với nồng độ và liều lượng

thấp hơn 30 ppm như Fe, B, Mn, I, Mo,Cu, Zn, Ni, Co…(Lê Trần Bình và ctv,
1997).
Chúng tham gia vào enzyme trong những hoạt động thuộc quá trình chuyển
hóa cơ bản và có vai trò không thể thay thế ở nhiều trường hợp (Đặng Phương
Trâm, 2005).
2.3.3. Carbon và nguồn năng lượng
Trong môi trường nuôi cấy, nguồn carbon giúp mô tế bào thực vật tổng hợp
nên các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải do quá
trình quang hợp cung cấp mà chính là carbon bổ sung vào môi trường dưới
dạng đường. Hai dạng đường thường được sử dụng trong cấy mô là glucose và
sucrose (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Lượng đường sucrore thường dùng từ 2 - 3% (20 – 30 mg/l) (Bùi Bá Bổng,
1995).
2.3.4. Vitamin
Theo Lê Trần Bình và ctv (1997), vitamin là những chất có hoạt tính sinh lí
cao và thực hiện chức năng sinh hóa khác nhau. Một số tham gia vào thành
phần enzyme, một số là sản phẩm trung gian của sự trao đổi chất.
Dạng và nồng độ sử dụng:
- Myo inositol 100 mg/l
- Pyridoxine (vitamin B6) 0,5 mg/l
- Nicotinic acid 0,5 mg/l
- Thiamine (vitamin B1) 0,4 mg/l
- Glycine 0,2 mg/l
Myo - inositol thường được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin. Mặc dù
đây là một carbohydrate chứ không phải là vitamin, nó cũng được chứng minh
kích thích sự tăng trưởng của tế bào đa số loài thực vật (Nguyễn Đức Lượng
và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

7



2.3.5. Các hợp chất hữu cơ không xác định
Nước dừa (CM, coconut milk): Trong nước dừa có rất nhiều muối khoáng,
acid amin, sinh tố, kích thích tố tăng trưởng rất cần thiết cho sự phát triển của
lan (Nguyễn Công Nghiệp, 1988). Hàm lượng sử dụng của nước dừa là 10 - 20
% (v/v) (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005).
Than hoạt tính: Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy thì sẽ có
lợi ích và có tác dụng khử độc.
Ảnh hưởng của than hoạt tính nói chung có ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp
chất cản, hút các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy
hoặc làm đen môi trường.
Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,5
- 3% (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
2.3.6. Yếu tố làm đặc môi trường
Agar là chất thường được sử dụng nhất để tạo môi trường đặc hay môi trường
bán lỏng để nuôi cấy mô thực vật. Độ cứng của agar được quyết định bởi nồng
độ agar sử dụng và độ pH của môi trường nuôi cấy. Agar không phản ứng với
các chất trong môi trường nuôi cấy và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Agar được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật là 0,5 - 10 g/l (Vũ
Văn Vụ, 2005).
2.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Các chất điều hòa tăng trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường
nuôi cấy. Auxin và cytokinin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích
thích sự phát sinh hình thái và tỉ lệ hormone sử dụng để kích thích tạo chồi hay
tạo rễ không giống nhau. Tùy theo giống, loài thực vật mà nhu cầu về dạng và
nồng độ auxin và cytokinin khác nhau trong sự phát sinh hình thái (Vũ Văn
Vụ và ctv, 2005).
2.4.1. Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng thường xuyên nhất

trong nuôi cấy mô thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh
dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích tăng trưởng mô sẹo, huyền phù
tế bào, phát sinh phôi soma và điều hòa phát sinh hình thái khi được sử dụng
phối hợp với cytokinin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, auxin giúp thúc đẩy sự sinh
trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường quá trình sinh tổng hợp và trao đổi
chất, kích thích hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính (Vũ
Văn Vụ và ctv, 2005).
8


Các chất thường dùng nhất trong nuôi cấy mô là 2,4-D, NAA, IBA, và IAA ở
nồng độ 0,1 - 5,0 mg/l. NAA và IBA thường dùng để cho ra rễ và dùng phối
hợp với cytokinin trong sự nhân chồi. 2,4-D rất hữu hiệu trong tạo mô sẹo
(callus) (Bùi Bá Bổng, 1995).
2.4.2. Cytokinin
Các cytokinin rất thú vị trong lĩnh vực nuôi cấy mô in vitro, chúng cho phép
có một sự tiến bộ lớn trong nhân giống vô tính. Thực vậy, cytokinin thể hiện
các tính chất trong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào
và định hướng tế bào trong con đường phân hóa (Dương Công Kiên, 2002).
Cytokinin có tác dụng quan trọng trong nuôi cấy mô do ảnh hưởng rõ rệt của
nó lên sự phát sinh chồi và nhân chồi, giữ tuổi thọ cho mô cấy cũng như sự
kích thích phân chia tế bào và định hướng phân hóa tế bào. Có biểu hiện ức
chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo. Có thể dùng phối hợp với auxin
trong trường hợp tạo chồi (Đặng Phương Trâm, 2005).
Các loại cytokinin thường được sử dụng trong cấy mô như: kinetin, zeatin,
BAP, TDZ, ZiP…Nồng độ sử dụng dao động từ 0,1 - 2 mg/l. Trong các loại
cytokinin thì nói trên thì kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn
cả (Vũ Văn Vụ, 2005).
2.5. pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình hấp thu các chất dinh
dưỡng từ môi trường vào tế bào. Do đó, phải chỉnh độ pH của môi trường về
một giá trị ổn định cho việc nuôi cấy từng loài cây khác nhau (Vũ Văn Vụ,
2007).
pH quyết định sự hòa tan của khoáng, ảnh hưởng sự hấp thu khoáng trong môi
trường, ảnh hưởng trên sự tạo gel của agar khi hấp khử trùng. Trong nuôi cấy
mô thực vật cũng như ngoài tự nhiên, cây cấy mô có yêu cầu pH theo mức độ
khác nhau nhưng nói chung nằm trong khoảng pH từ 5,5 – 5,8 ngoại trừ một
số cây đặc biệt cần có pH kiềm hay acid (Dương Công Kiên, 2003).
2.6. Một số vấn đề trong tạo mẫu in vitro
2.6.1. Mẫu bị nhiễm
Mẫu cấy, các mảnh mô thực vật, dùng để nuôi cấy thường là nguồn nhiễm
chính. Có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa
các lớp vảy chồi, mầm chồi…(Dương Công Kiên, 2003)
Mẫu cấy thường bị nhiễm nấm hoặc nhiễm khuẩn. Nếu do nấm, thường thấy
sự phát triển của khuẩn ty có cấu trúc sợi, màu trắng hoặc hơi xám. Nếu sợi
khuẩn ty màu xanh, là do nấm Penicillium. Nếu sợi thể hiện các dạng hạt đen
nhỏ (dạng quả), có thể là do nấm Rhizopus nigricans, nấm này sinh sôi rất
9


nhanh và cần diệt chúng bằng autoclave càng sớm càng tốt. Nếu do vi khuẩn,
sẽ xuất hiện một màng có dạng sữa, phát triển bên trong môi trường và ở bề
mặt. Màng này đôi lúc có màu (hồng, vàng,…) (Dương Công Kiên, 2002).
Vi khuẩn và vi nấm trong môi trường nuôi cấy sẽ làm hạn chế sự phát triển
của mô cấy và tạp nhiễm như vậy là điều tối kỵ trong vi nhân giống, phải loại
bỏ mẫu tạp nhiễm. Muốn hạn chế tạp nhiễm, khuyến cáo phải thực hiện các
bước trong quy trình thanh trùng một cách đầy đủ và thận trọng (Bùi Chí Bửu
và Nguyễn Thị Lang, 2007).
2.6.2. Sự hóa nâu mẫu trong môi trường cấy mô

2.6.2.1. Các chất có thành phần phenol
Các chất ức chế có thành phần phenol là các chất ức chế sự chuyển hóa hoặc
là chất đối kháng của các chất tăng trưởng. Các chất này tham dự vào hiện
tượng ngủ của các chồi non hoặc các mầm giống, ít nhất là sự làm chậm, kế
đến là sự làm ngừng tăng trưởng (Dương Công Kiên, 2002).
2.6.2.2. Phản ứng hóa nâu của mẫu cấy
Trong nuôi cấy mô, các phenol như cinnamic, coumarin, salisilic acid…đôi
lúc phóng thích ra môi trường cấy và gây hiện tượng oxy hóa, chất này đã gây
ra sự hóa nâu cho môi trường và thường dẫn đến chết các mô thực vật. Chính
vì vậy mà trong một vài sự nuôi cấy, người ta sử dụng trong môi trường các
chất chống oxy hóa hoặc là các chất hấp thu để khử độc môi trường (Dương
Công Kiên, 2002).
2.7. Những nghiên cứu liên quan về nhân giống cây Trầu bà chân rết.
2.7.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2009, Nguyễn Văn Hiếu đã có nghiên cứu “ứng dụng hệ thống TIS trong
việc nhân giống cây kiểng lá Thanh tâm (Spathiphyllum sensation). Các thí
nghiệm của ông được tiến hành bằng việc khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích và
tần suất ngập chìm. Giống kiểng lá Spathiphyllum sensation được nuôi với mật
độ 8g, thể tích nuôi cấy 250 ml và tần suất ngập chìm được thiết lập là ngập 3
phút sau mỗi 6 giờ. Bên cạnh đó, còn đánh giá khả năng sinh trưởng của đối
tượng nuôi cấy trên hệ thống TIS với mẫu đối chứng được nuôi cấy trên môi
trường thạch trong cùng điều kiện.
Năm 2011, Nguyễn Văn Phong đã tiến hành nghiên cứu kỹ thuật nuôi trồng
kiểng lá trong môi trường thủy canh. Ông đã tiến hành thí nghiệm bằng cách
ngâm toàn bộ rễ của những cây kiểng lá được nghiên cứu vào môi trường
nước có chứa các chất dinh dưỡng nhằm thay thế cho việc bón phân cũng như
tưới nước cho cây. Hiện tại, ông đã nghiên cứu thành công trên một số đối
10



tượng như: Thanh tâm, Lẽ bạn, Thuyền trưởng vàng, Nhẫn bạc, Trầu bà Chân
rít, Trúc nhật đốm vàng, Tay phật, Kim phát tài...
2.7.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Năm 1999, Zhu Genfa ctv đã tiến hành đề tài nuôi cấy mô và nhân nhanh các
giống Dieffenbachia (kiểng lá) như là D. maculata , D. seguine cho kết quả
cho thấy ở nồng độ 3 - 5 mg/l BA là thuận lợi cho sự phát triển chồi. Còn trên
môi trường MS1/2 với nồng độ 0.5 mg/l NAA cho sự phát triển rễ tốt nhất.

11


Chương 3
Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Nuôi cấy mô thuộc bộ môn Công nghệ
sinh học khoa Nông nghiệp và Tài nguyên thiên nhiên trường Đại học An
Giang.
Thời gian thực hiện: tháng 12 năm 2012 đến tháng 05 năm 2013.
3.2. Điều kiện phòng thí nghiệm
Phòng nuôi cấy mô có trang bị máy điều hòa nhiệt độ, đèn neon.
- Trang thiết bị và dụng cụ:
+ Nồi hấp thanh trùng
+ Cân phân tích
+ Máy đo pH
+ Tủ sấy
+ Tủ lạnh
+ Bếp điện từ
- Dụng cụ thủy tinh và các vật dụng khác:
+ Chai lọ, beaker, ống đong, đũa thủy tinh, đĩa petri…
+ Dao, kéo, kẹp cấy, giấy, bông gòn, đèn cồn, nước cất…

3.3. Môi trường nuôi cấy
Tất cả các nghiệm thức đều sử dụng môi trường nuôi cấy cơ bản là MS
(Musrashige và Skoog, 1962) gồm khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, Fe EDTA, chất hữu cơ Myo - inisitol 0,1 mg/l, đường 30 mg/l, agar 8 mg/l, than
hoạt tính 0,5 mg/l. pH = 5,7 - 5,8. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA
(6 - Benzyl adenin), NAA (Naphtylacetic acide), TDZ được bổ sung vào môi
trường với nhiều nồng độ và tỷ lệ khác nhau tùy vào mục đích thí nghiệm.
3.4. Vật liệu
Mẫu cấy được dùng thí nghiệm là cây Trầu bà chân rết đựơc mua ở Thị xã Sa
đét, Tỉnh Đồng Tháp và đem về thuần dưỡng tại vườn lan của Khoa NN &
TNTN trường Đại học An Giang.
3.5. Phương pháp
3.5.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng thích hợp của HgCl2 0,1%
để tạo nguồn mẫu vô trùng đối với cuống lá non và mầm ngủ của cây Trầu bà
chân rết.

12


3.5.1.1. Mục tiêu
Xác định thời gian khử trùng thích hợp đối với hóa chất khử trùng là HgCl2
0,1% để tạo nguồn mẫu in-vitro đối với cây Trầu bà chân rết.
3.5.1.2. Vật liệu
Cuống lá non và đoạn thân dài từ 3 – 4 cm chứa mầm ngủ của cây Trầu bà
chân rết.
3.5.1.3.Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy mô theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 2 nhân tố thí nghiệm là thời gian và nguồn mẫu (6 nghiệm thức, mỗi
nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo)
Bảng 1: Ký hiệu nghiệm thức khử trùng đối với cuống lá non
Nghiệm thức


Thời gian

A1

10

A2

15

A3

20

Bảng 2: Ký hiệu nghiệm thức khử trùng đối với mầm ngủ
Nghiệm thức

Thời gian

B1

10

B2

15

B3


20

Cách tiến hành
Cắt tỉa mẫu sau đó để mẫu dưới vòi nước máy 15 phút.
Ngâm mẫu trong nước xà phòng 5 phút rồi làm sạch xà phòng dưới vòi nước
chảy 15 phút.

13


Chia làm 2 keo, 1 keo chứa mầm ngủ và 1 keo chứa cuống lá non, đậy nắp.
Sau đó, đem vào thao tác trong tủ cấy.
Thao tác khử mẫu trong tủ cấy

Cắt tỉa phần mô bị hư do tiếp xúc với hóa chất. Cắt lát mỏng khoảng 1mm đối
với cuống lá non, cắt đoạn thân mang mầm ngủ dài khoảng 2 – 3cm. Sau đó
cấy 4 mẫu trên 1 keo đối với cuống lá non, một mẫu trên 1 keo đối với mầm
ngủ. Cấy tất cả vào môi trường đã chuẩn bị sẵn.
Đặt mẫu sao cho mầm ngủ hướng lên và lát mỏng cuống lá non tiếp xúc với
môi trường.
3.5.1.4 Chỉ tiêu theo dõi
Tổng số mẫu nhiễm
-

Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)=

x 100
Tổng số mẫu đưa vào

Tổng số mẫu chết

-

Tỉ lệ mẫu chết ( %) =

x 100
Tổng số mẫu đưa vào

•

Tỉ lệ mẫu sống vô trùng (%) = 100% - Tỉ lệ mẫu nhiễm – Tỉ lệ mẫu
chết
14




Quan sát mẫu trong 14 ngày.

Thống kê và xử lý bằng phần mềm SAS 9.3.1.
3.5.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin và cytokinin thích
hợp cho việc tái sinh chồi từ mầm ngủ của cây Trầu bà chân rết.
3.5.2.1. Mục tiêu
Xác định nồng độ auxin và cytokinin thích hợp cho việc tái sinh chồi từ mầm
ngủ của cây Trầu bà chân rết.
3.5.2.2. Vật liệu
Mẫu mầm ngủ vô trùng từ thí nghiệm 1
3.5.2.3. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy mô theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1
keo. Cấy 1 mẫu trên 1 keo.

Bảng 2: Môi trường tái sinh chồi và ký hiệu nghiệm thức

Nghiệm thức

BA

NAA

TDZ

(mg/l)

(mg/l)

(mg/l)

C0 (đ/c)

0

0

0

C1

1

0


1

C2

1

0

0

C3

1

0,5

0

C4

2

0,5

0

C5

2


1

0

Cách tiến hành
Mẫu mầm ngủ được gấp ra khỏi keo, cắt tỉa và cấy vào môi trường đã chuẩn bị
sẵn.
3.5.2.4. Chỉ tiêu theo dõi
Chiều cao của chồi (mm): tính từ mặt môi trường đến đỉnh chồi.
15


Đặc điểm hình thái: (Chất lượng chồi).
-

Tốt (chồi mập): +++

-

Trung bình (chồi to trung bình): ++

-

Kém (chồi nhỏ): +



Thời gian lấy chỉ tiêu: 14, 28, 42, 56 ngày sau khi cấy (NSKC).




Thống kê và xử lí số liệu bằng phần mềm SAS 9.3.1.

3.5.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin và cytokinin thích
hợp cho việc tạo mô sẹo từ lát mỏng cuống lá non của cây Trầu bà chân rết.
3.5.3.1. Mục tiêu
Xác định nồng độ auxin và cytokinin thích hợp cho việc tạo mô sẹo từ nuôi
cấy lát mỏng cuống lá non của cây Trầu bà chân rết.
3.5.3.2. Vật liệu
Cuống lá non vô trùng từ thí nghiệm 1
3.5.3.3. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí trong phòng nuôi cấy mô theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1
keo. Cấy 4 mẫu trên 1 keo.
Bảng 3: Môi trường tạo mô sẹo và ký hiệu nghiệm thức
Nghiệm thức

2,4 D

BA

NAA

(mg/l)

(mg/l)

(mg/l)

D0 (đ/c)


0

0

0

D1

0,5

0

0

D2

0,5

1

0

D3

0,5

0

0,5


D4

1

0

0

D5

0

1

1

16


Cách tiến hành
Lát mỏng cuống lá non vô trùng được tạo thành từ thí nghiệm 1 sẽ được cắt tỉa
và cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4D
từ 0 - 1 mg/l, BA 0 -1 mg/l và NAA từ 0 – 1 mg/l.
3.5.3.4. Chỉ tiêu theo dõi
-

Kích thước mô sẹo được hình thành.

-


Hình thái, màu sắc của mô sẹo.

Thời gian lấy chỉ tiêu: 14, 28, 42, 56 ngày sau khi cấy.
Thống kê và xử lí số liệu bằng phần mềm SAS 9.3.1.

17