ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

PHAN THỊ MY
Tên đề tài:
ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA TRONG KIỂM ĐỊNH THÀNH
PHẦN CHÍNH CỦA CÁC SẢN PHẨM THẢO DƢỢC TỪ GIẢO CỔ LAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011- 2015

Thái nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

PHAN THỊ MY
Tên đề tài:
ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÃ VẠCH DNA TRONG KIỂM ĐỊNH THÀNH
PHẦN CHÍNH CỦA CÁC SẢN PHẨM THẢO DƢỢC TỪ GIẢO CỔ LAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Lớp

: K43 - CNSH

Khóa học

: 2011- 2015


Giảng viên hƣớng dẫn

: 1.TS. Dƣơng Văn Cƣờng
2. PGS.TS Ngô Xuân Bình

Thái nguyên, năm 2015


i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành đƣợc khóa luận tốt
nghiệp này ngoài sự nỗ lực của cá nhân, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ,
chỉ bảo động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn:
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS. Dƣơng Văn
Cƣờng giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trƣờng
Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, ThS. Ma Thị Trang cán bộ tại Bộ môn Sinh học
Phân tử và Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên
ngƣời đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực hiện đề tài cũng nhƣ trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống – Đại Học
Thái Nguyên, ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
– Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ môn
Sinh học Phân tử và Công nghệ Gene – Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái
Nguyên đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè những
ngƣời đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ để tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá
trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, tháng 06 năm 2015

Sinh viên

Phan Thị My


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng công nghệ DNA mã vạch trên thế giới....... 18
Bảng 2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng công nghệ mã vạch DNA ở Việt Nam ... 20
Bảng 3.1. Danh sách các sản phẩm trà Giảo Cổ Lam túi lọc, trà Giảo Cổ Lam khô và thuốc
thảo dƣợc Giảo Cổ Lam dạng viên nén đang đƣợc thƣơng mại hóa trên thi trƣờng sử dụng
trong nghiên cứu....................................................................................................................... 23
Bảng 3.2. Hình ảnh các mẫu trà túi lọc, trà Giảo Cổ Lam khô và thuốc thảo dƣợc dạng viên
nén đƣợc thƣơng mại hóa trên thị trƣờng ............................................................................... 24
Bảng 3.3. Danh sách các sản phẩm trà thảo dƣợc Giảo Cổ Lam khô .................................. 26
Bảng 3.4. Hình ảnh các mẫu trà Giảo Cổ Lam khô............................................................... 26
Bảng 3.5. Thông tin trình tự của các cặp mồi ITS2 và rbcLa ............................................... 28
Bảng 3.6. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................................................... 29
Bảng 3.7. Thành phần dung dịch CTAB buffer sử dụng trong tách chiết DNA từ trà Giảo
Cổ Lam khô .............................................................................................................................. 30
Bảng 3.8. Thành phần dung dịch đệm CTAB sử dụng trong tách chiết DNA từ các mẫu trà
túi lọc......................................................................................................................................... 30
Bảng 3.9. Thành phần dung dịch chiết đồng nhất mẫu sử dụng trong tách chiết DNA từ
thuốc thảo dƣợc dạng viên nén ............................................................................................... 30
Bảng 3.10. Thành phần dung dịch CTAB buffer sử dụng trong tách chiết DNA từ thuốc
thảo dƣợc dạng viên nén .......................................................................................................... 31
Bảng 3.11. Thành phần dung dịch TE ( 10 : 0.1)................................................................... 31
Bảng 3.12. Thành phần phản ứng PCR .................................................................................. 36
Bảng 4.1. Các thông số thay đổi trong quy trình tách chiết DNA tổng số từ các mẫu trà

Giảo Cổ Lam khô..................................................................................................................... 40
Bảng 4.2 . Kết quả đo OD các mẫu trà Giảo Cổ Lam khô tách chiết theo quy trình sửa đổi
................................................................................................................................................... 42
Bảng 4.3. Các thông số thay đổi trong quy trình tách chiết DNA tổng số từ các mẫu trà túi
lọc .............................................................................................................................................. 43
Bảng 4.4. Kết quả đo OD của các mẫu trà túi lọc tách chiết theo quy trình sửa đổi ........ 44
Bảng 4.5. Tổng hợp kết quả của phản ứng khuếch đại trình tự DNA mã vạch................... 49
Bảng 4.6. Tỷ lệ tƣơng đồng giữa trình tự của các mẫu trà Giảo Cổ Lam với trình tự mã
vạch ........................................................................................................................................... 56


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh Giảo Cổ Lam mọc ngoài tự nhiên và quả Giảo Cổ Lam ....................... 2
Hình 3.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen rbcLa.......................... 36
Hình 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen ITS2............................ 37
Hình 4.1. Hình ảnh so sánh kết quả tách chiết DNA tổng số từ các mẫu trà Giảo Cổ Lam
khô tiến hành theo hai quy trình .............................................................................................. 41
Hình 4.2. Hình ảnh so sánh kết quả tách chiết DNA tổng số từ các mẫu trà túi lọc Giảo Cổ
Lam tiến hành theo quy trình trƣớc và sau khi sửa đổi.......................................................... 43
Hình 4.3. Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen rbcLa từ DNA các mẫu trà Giảo Cổ Lam khô
................................................................................................................................................... 45
Hình 4.4. Kết quả khuếch đại đoạn gen ITS2 từ các mẫu trà Giảo Cổ Lam khô................. 46
Hình 4.5. Kết quả khuếch đại đoạn gen rbcLa từ DNA khuôn tách ở các mẫu trà túi lọc . 47
Hình 4.6. Kết quả khuếch đại đoạn gen ITS2 từ mẫu trà túi lọc số 1 và 4 ........................... 48
Hình 4.7. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của các mẫu trà Giảo Cổ Lam khô và trà túi lọc
................................................................................................................................................... 50
Hình 4.8. Chất lƣợng tín hiệu giải trình tự theo giá trị Quality Valu (hình a-e thể hiện chất
lƣợng tín hiệu trình tự theo giá trị QV của các mẫu lần lƣợt là trà Giảo Cổ Lam túi lọc số 1,

2, 4 và trà Giảo Cổ Lam khố số 3 và 6) .................................................................................. 52
Hình 4.9. Hình ảnh thể hiện các vùng bị nhiễu trong trình tự của mẫu trà Giảo Cổ Lam túi
lọc số 2 ...................................................................................................................................... 54
Hình 4.10. Hình ảnh thể hiện sự tạp nhiễm bởi DNA của các loài có quan hệ gần gũi trong
trình tự của mẫu trà Giảo cổ Lam khô số 6 ............................................................................ 54
Hình 4.11. Hình ảnh thể hiện sự tạp nhiễm bởi DNA của các loài khác nhau trong trình tự
của mẫu trà túi lọc số 4 ............................................................................................................ 55
Hình 4.12. Kết quả so sánh trình tự rbcLa của mẫu trà túi lọc số 1 với các trình tự công bố
trên ngân hàng gen ................................................................................................................... 57
Hình 4.13. Hình ảnh thể hiện mức độ thu hồi DNA từ các dạng chiết xuất của nguyên liệu
thảo dƣợc .................................................................................................................................. 59


iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BLAST

: Basic Local Alignment Search Tool

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

DMSO

: Dimethylsulfoxide

dNTP


: Deoxyribonucleotide Triphosphate

dATP

: DeoxyAdenine Triphosphate

dGTP

: DeoxyGuanine Triphosphate

dCTP

: DeoxyCytosine Triphosphate

dTTP

: DeoxyThymine Triphosphate

EDTA

: Etilendiamin tetraaxetic acit

Kb

: Kilo base – Kilo bazơ nitơ

NCBI

: Nation Cetrer for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về


Thông tin Công nghệ sinh học)
PCR

: Polymerase Chain Recation

ddNTP

: Dideoxynucleotide Triphosphate

ddATP

: DideoxyAdenine Triphosphate

ddGTP

: DideoxyGuanine Triphosphate

ddCTP

: Dideoxycytosine Triphosphate

ddTTP

: DideoxyThymine Triphosphate

cpDNA

: Chloroplast (DNA trong lục lạp)


mtDNA

: Mitochondrial (DNA trong ty thể)


v

MỤC LỤC

PHẦN 1........................................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục đích của đề tài ................................................................................................. 4
1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài.................................................. 4
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................. 5
2.1. Giới thiệu về công nghệ mã vạch DNA ................................................................ 5
2.2. Các tiêu chí để lựa chọn các trình tự để sử dụng làm DNA mã vạch và các điểm
cần lƣu ý khi tạo thƣ viện mã vạch ................................................................................ 6
2.3. Mã vạch DNA sử dụng trong xác định loài ở động vật và thực vật .................... 7
2.3.1. Mã vạch DNA ở động vật ....................................................................... 7
2.3.2. Mã vạch DNA ở thực vật ........................................................................ 8
2.4. Các sản phẩm thảo dƣợc và những nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe ngƣời tiêu
dùng ...............................................................................................................................10
2.5. Các phƣơng pháp chỉ thị sử dụng trong xác định nguyên liệu thảo dƣợc ........ 11
2.5.1. Phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tích giải phẫu học.......................... 11
2.5.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị hóa học ........................................... 12
2.5.3. Phƣơng pháp dựa vào chỉ thị DNA ....................................................... 13
2.6. Ƣu điểm của phƣơng pháp DNA mã vạch so với các phƣơng pháp khác trong
xác định nguyên liệu thảo dƣợc ...................................................................................16
2.7. Lựa chọn và sử dụng vùng DNA mã vạch trong xác định các thành phần

nguyên liệu thảo dƣợc ..................................................................................................16
2.8. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phƣơng pháp DNA mã vạch trong kiểm định,
đánh giá chất lƣợng các sản phẩm thảo dƣợc trong nƣớc và thế giới .......................17
2.8.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 17
2.8.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc.......................................................... 19


vi

PHẦN 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....... 22
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu........................................................................ 22
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 22
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 28
3.1.3. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 28
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ........................................................ 28
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 28
3.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 28
3.3. Thiết bị, hóa chất nghiên cứu ............................................................................... 28
3.3.1. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................... 28
3.3.2. Hóa chất nghiên cứu.............................................................................. 29
3.4. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 32
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................... 32
3.5.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 32
3.5.2. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose .................................................. 35
3.5.3. Phƣơng pháp PCR ................................................................................. 36
3.5.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR ................................................. 37
3.5.5. Phƣơng pháp xác định trình tự các nucleotide ...................................... 38
3.5.6. Phƣơng pháp so sánh trình tự gen đã tách đƣợc từ các sản phẩm với các
trình tự DNA mã vạch ..................................................................................... 39
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 40

4.1. Kết quả ................................................................................................................... 40
4.1.1. Kết quả tách chiết DNA từ các mẫu trà túi lọc, trà Giảo Cổ Lam khô và
thuốc thảo dƣợc dạng viên nén ....................................................................... 40
4.1.2. Kết quả PCR khuếch đại gen rbcLa và ITS2 ...................................... 445
4.1.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................... 49
4.1.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen rbcLa và ITS2 ....................................... 51
4.2. Thảo luận ............................................................................................................... 58


vii

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 62
5.1. Kết luận .................................................................................................................. 62
5.2. Kiến nghị................................................................................................................ 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 64


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Các cây thuốc thảo dƣợc đã đƣợc sử dụng từ rất lâu đời trong nền y học cổ
truyền. Hiện nay, thuốc thảo dƣợc vẫn đƣợc sử dụng nhiều trong việc chữa trị bệnh.
Với xu hƣớng của cuộc sống ngày càng hài hòa cùng thiên nhiên, việc sử dụng các
nguyên liệu thảo dƣợc để bảo vệ sức khỏe và điều trị bệnh ngày càng gia tăng. Hàng
ngàn loài thực vật và động vật có đặc tính dƣợc lý đƣợc dùng làm nguyên liệu thuốc
[28]. Việt Nam là một quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú. Theo thống
kê của Bộ y tế mỗi năm Việt Nam tiêu thụ khoảng 30 - 50 tấn nguyên liệu thảo dƣợc để
sử dụng trong y học cổ truyền và xuất khẩu ra nƣớc ngoài. Các loài cây thảo dƣợc có

thể dùng trực tiếp làm tác nhân điều trị hoặc làm nguyên liệu ban đầu cho quá trình
tổng hợp các loại thuốc. Hiện nay, ở Việt Nam mới chỉ khai thác sử dụng khoảng 200
loại cây dƣợc liệu [1], trong đó có một số loài đã đƣợc thƣơng mại hóa dƣới dạng các
sản phẩm thảo dƣợc nhƣ Sâm Ngọc Linh, trà Tam Thất Xạ Đen, trà Giảo Cổ Lam, trà
Nấm Linh Chi...Các sản phẩm thảo dƣợc ngày càng đa dạng với các hình thức mẫu
mã, nhãn hiệu khác nhau và có thể chứa duy nhất một thành phần hoặc là sự kết hợp
của nhiều thành phần. Việc liệt kê chính xác các thành phần của các sản phẩm thảo
dƣợc là rất quan trọng đối với ngƣời tiêu dùng, song các thành phần đó không thể
dễ dàng xác định bằng hình thức trực quan [32].
Giảo Cổ Lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Markino đƣợc sử dụng
rộng rãi nhƣ một loại cây thuốc dân gian và trà thảo dƣợc ở các nƣớc châu Á bao
gồm Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc [50]. Giảo Cổ Lam còn có
nhiều tên gọi khác, trong tiếng Trung gọi là "Jiao Gu Lan", trong tiếng anh đƣợc
gọi là Nhân Sâm Năm Lá, ở Việt Nam thƣờng gọi là Giảo Cổ Lam hoặc cây Bổ
Đắng. Trong cuốn "Compendium of Materia Media" của tác giả Li Shi – Zhen xuất
bản năm 1578 đã nói đến Giảo Cổ Lam đƣợc sử dụng trong điều trị nhiều loại bệnh


2

nhƣ đái ra máu, phù nề ở họng và cổ, khối u, các chấn thƣơng…Ngƣời ta cũng sử
dụng Giảo Cổ Lam để điều trị các bệnh cảm lạnh thông thƣờng và các bệnh truyền
nhiễm khác [38].

Hình 1.1. Hình ảnh Giảo Cổ Lam mọc ngoài tự nhiên và quả Giảo Cổ Lam
( Nguồn ảnh : NaturalyPure.com)
Trong cây Giảo Cổ Lam có chứa nhiều hoạt chất quý bao gồm saponin,
flavonoid, chlorophyll, và carotenoids. Trong đó, saponin và flavonoid đƣợc cho là
chịu trách nhiệm chính cho tính chất của Giảo Cổ Lam. Hơn 165 saponin triterpene
dammarane đã đƣợc xác định từ Giảo Cổ Lam. Flavonoids, còn đƣợc gọi là vitamin

P. Saponin và flavonoids từ Giảo Cổ Lam có vai trò quan trọng trong phòng ngừa
và hỗ trợ điều trị ung thƣ, bao gồm ung thƣ gan, đại trực tràng, tuyến tiền liệt và
ung thƣ phổi, điều trị các bệnh bạch cầu, glioma, miệng, lƣỡi, thực quản [50], ngoài
ra Giảo Cổ Lam còn có tác dụng rất tích cực trong phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu
đƣờng [23]. Phần lớn các báo cáo chủ yếu tập trung vào hiệu quả của các saponin hơn
là các flavonoid [50]. Hiện nay, Giảo Cổ Lam đã đƣợc thƣơng mại hóa dƣới dạng trà
thảo dƣợc ở Hoa Kỳ và nhiều nƣớc Châu Á khác nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản và Việt
Nam [23, 50].
Các sản phẩm thảo dƣợc bày bán sẵn trên thị trƣờng có thể bị nhiễm, bị thay
thế bằng các loài cây khác hoặc có chứa các chất độn không đƣợc liệt kê trên nhãn
của sản phẩm do sự nhầm lẫn hoặc cố ý. Theo tổ chức y tế thế giới, sự pha trộn,


3

thay thế các nguyên liệu thảo dƣợc là một mối đe dọa lớn đến sự an toàn của ngƣời
tiêu dùng vì họ không thể tự kiểm định đƣợc chất lƣợng của các sản phẩm họ đang
dùng cho nên việc mua phải các loại sản phẩm không đảm bảo chất lƣợng là điều
khó tránh đƣợc [34]. Sự thay thế, pha trộn các nguyên liệu thảo dƣợc có thể làm
giảm tác dụng của thuốc, trong một số trƣờng hợp còn gây chết ngƣời nếu nguyên
liệu dùng để thay thế có chứa các chất độc hại. Do đó, việc xác định chính xác các
thành phần nguyên liệu làm thuốc là vô cùng quan trọng [49].
Các phƣơng pháp truyền thống dùng để nhận diện cây thuốc bao gồm các
phƣơng pháp cảm quan (xác định bằng các giác quan: Vị giác, thị giác, khứu giác,
xúc giác) và phƣơng pháp hóa học ví dụ nhƣ TLC, HPLC-UV, HPLC-MS [9, 49].
Mặc dù các phƣơng pháp xác định bằng cảm quan có ƣu điểm là đơn giản, song độ
chính xác lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của các thanh tra viên [45] hơn
nữa sự khác biệt giữa các loài có liên quan hoặc các sản phẩm chế biến đôi khi
không rõ ràng [28]. Phân tích hóa học có độ tin cậy cao hơn nhƣng kết quả có thể bị
ảnh hƣởng bởi các điều kiện sinh lý và sinh hóa của các loại thảo mộc. Các loài có

chứa các thành phần hóa học tƣơng đồng nên có thể nhầm lẫn . Vì vậy, để xác định
các thành phần của các sản phẩm thảo dƣợc là rất khó khăn, đặc biệt là đối với
những nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật đã đƣợc chế biến một phần hoặc ở
dạng nghiền thành mảnh nhỏ [36, 45, 49].
Với sự tiến bộ của kĩ thuật di truyền, DNA marker trở thành một phƣơng tiện
thuận lợi cho việc nhận dạng các loài ở cấp độ nghiên cứu phân tử. DNA là một đại
phân tử ổn định, không bị ảnh hƣởng bởi các yếu tố bên ngoài, độ tuổi, điều kiện
thu hoạch và đƣợc tìm thấy trong tất cả các mô của một cá thể, việc phân tích cũng
chỉ cần một lƣơng mẫu nhỏ. Vì vậy, việc lựa chọn nghiên cứu DNA ở các sinh vật
để xác định loài là một phƣơng pháp hiệu quả, điều này có ý nghĩa lớn trong việc
nghiên cứu DNA ở các mẫu khô hoặc đã qua sơ chế.
Các kỹ thuật mới dùng trong xác định các mẫu vật sinh học sử dụng các trình tự
DNA ngắn của hệ gen sinh vật gọi là mã vạch DNA. Năm 2003, mã vạch DNA đƣợc
đề xuất bởi Paul Hebert, đại học Guelph dùng nhƣ một đơn vị để phân loại loài [26,49].
Đây là một kỹ thuật sử dụng những vùng gen tiêu chuẩn để phân biệt các loài. So với


4

các phƣơng pháp truyền thống, kỹ thuật mã vạch DNA cho kết chính xác hơn rất
nhiều, mã vạch DNA cung cấp công cụ hữu ích và độc lập để bổ sung cho các phân
tích hóa học trong việc xác định và đảm bảo chất lƣợng dƣợc liệu [27].
Hiện nay, đã có nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới ứng dụng phƣơng pháp
mã vạch DNA để xác định thành phần trong các sản phẩm thảo dƣợc. Tuy nhiên, ở
Việt Nam các nghiên cứu về DNA mã vạch chủ yếu tập trung vào đánh giá đa dạng
di truyền, nhận diện ở một số loài. Các ứng dụng của DNA mã vạch trong lĩnh vực
dƣợc phẩm chƣa phát triển. Vì vậy, việc ứng dụng công nghệ sinh học đặc biệt là kỹ
thuật di truyền trong phân tích, đánh giá chất lƣợng các sản phẩm thảo dƣợc để có thể tìm
ra các loại sản phẩm kém chất lƣợng góp phần đảm bảo lợi ích cho ngƣời tiêu dùng là rất
cần thiết. Nắm bắt đƣợc tầm quan trọng và nhu cầu thực tế trên, tôi thực hiện để tài ―Ứng

dụng phương pháp mã vạch DNA trong kiểm định thành phần chính của các sản
phẩm thảo dược từ Giảo Cổ Lam‖.

1.2. Mục đích của đề tài
- Tách chiết thu DNA tổng số từ các mẫu trà Giảo Cổ Lam khô, mẫu trà túi lọc
Giảo Cổ Lam và thuốc thảo dƣợc dạng viên nén .
- Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại thành công vùng gen rbcLa và ITS2 từ
DNA thu ở các mẫu trên.
- Giải trình tự các sản phẩm PCR, từ các dữ liệu trình tự thu đƣợc sẽ dùng để
đánh giá chất lƣợng các mẫu trà và thuốc thảo dƣợc.

1.3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học: Ứng dụng phƣơng pháp mã vạch DNA để kiểm định
thành phần chính trong các sản phẩm trà thảo dƣợc làm cơ sở cho đánh giá chất
lƣợng của các sản phẩm thảo dƣợc khác.
- Ý nghĩa thực tiễn: Xác định, đánh giá đƣợc chất lƣợng của các sản phẩm trà
thảo dƣợc, giúp ngƣời tiêu dùng có những lựa chọn hợp lí nhất.


5

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về công nghệ mã vạch DNA
Sự đa dạng loài là nền tảng cho tất cả các nghiên cứu sinh học, nhƣng nó
cũng là một thách thức lớn, vấn đề phân loại và xác định các loài là một nhiệm vụ
không dễ dàng. Trong thực tế, mới chỉ xác định đƣợc khoảng 1,7 triệu loài trong
hàng chục triệu loài sinh vật có trên trái đất [31]. Trong đó, có rất nhiều loài đƣợc
xác định căn cứ vào nhận dạng các đặc điểm và chẩn đoán hình thái. Tuy nhiên,
phƣơng pháp xác định đựa vào hình thái bên ngoài của sinh vật có rất nhiều hạn

chế. Đầu tiên là sự mềm dẻo về kiểu hình và biến dị di truyền ở các loài sinh vật
nên nhiều khi sẽ cho kết quả không chính xác. Thứ hai, quan sát đặc điểm hình thái
của các loài có quan hệ gần gũi, đặc điểm bên ngoài giống nhau dễ dẫn tới nhầm
lẫn. Các đặc điểm hình thái thƣờng thay đổi theo từng giai đoạn phát triển, từng môi
trƣờng và điều kiện sống dẫn đến khó xác định đƣợc loài. Cuối cùng, việc nhận diện
và định danh loài yêu cầu chuyên môn cao trong lĩnh vực phân loại học [38, 53].
Hơn nữa, trứng và các loài sinh vật khi còn non không thể phân biệt dựa vào các
đặc điểm nhƣ cá thể trƣởng thành. Đối với thực vật, một mẫu vật có thể dễ dàng xác
định từ đặc điểm của hoa, trong khi rễ và các bộ phận thực vật khác không thể phân
biệt. Qua các nghiên cứu cho thấy số lƣợng các loài bị tuyệt chủng hàng năm đang
tăng cao. Điều này có nghĩa rằng có rất nhiều loài thực vật và động vật bị mất mỗi
năm, rất nhiều loài trong số này chƣa đƣợc xác định. Từ thực trạng trên cho thấy
cần phải tạo ra một danh mục đa dạng sinh học cho các loài trƣớc khi chúng bị tuyệt
chủng để phục cho các nghiên cứu đa dạng sinh học [25].
Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph, Canada là ngƣời
sáng lập ra phƣơng pháp DNA mã vạch, đây là một phƣơng pháp dùng để nhận diện
các loài [24]. Ông đề xuất sử dụng một trình tự ngắn của một gen đƣợc gọi là
Cytochrome c oxidase 1 (CO1) có chiều dài khoảng 650 bp, đây là một trình tự DNA


6

có chứa trong tất cả các loài động vật, tuy nhiên các trình tự này có thể sử dụng để
phân biệt các loài động vật. Đoạn gen CO1 đƣợc tìm thấy trong ty thể. Hệ gen ty thể
của động vật là một mục tiêu tốt để phân tích hơn bộ gen nhân vì thiếu các đoạn
intron và việc phát sinh loài thƣờng tập trung vào các gen trong ty thể, 13 gen mã hóa
cho protein trong ty thể động vật là những vùng gen có nhiều tiềm năng để dùng làm
mã vạch DNA bởi vì sự thêm và mất các trình tự dẫn đến một sự thay đổi trong
khung đọc rất hiếm xảy ra, trong đó CO1 có đủ các yếu tố quan trọng để có thể sử
dụng làm DNA mã vạch [38, 57]. Lợi thế của việc sử dụng đoạn CO1 trong xác định

loài là đoạn gen này đủ ngắn để đƣợc giải trình tự một cách nhanh chóng và rẻ tiền
nhƣng cũng đủ dài để xác định đƣợc các biến thể giữa các loài [58].
Có năm bƣớc chính liên quan đến xác định loài bằng trình tự đoạn DNA mã
vạch. Đầu tiên, một mẫu vật phải đƣợc thu gom và xác định bởi các nhà phân loại.
Sau đó, một mẫu mô đƣợc lấy từ mẫu và tiến hành tách chiết thu DNA tổng số, sau
đó trình tự DNA đích đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR và đƣợc giải trình tự để
tạo ra một mã vạch. Cuối cùng, các mã vạch đƣợc nhập vào hệ thống dữ liệu Barcode
cuộc sống (BOLD). Nó là một hệ thống trực tuyến để giúp các nhà nghiên cứu thu
thập, quản lý và phân tích mã vạch DNA. Mỗi mục đƣợc tổ chức trong BOLD có
thông tin nhƣ tên phân loại, hình ảnh của loài, GPS tọa độ nơi mà loài đó đã đƣợc tìm
thấy và trình tự mã vạch. Thông tin này có thể truy cập thông qua BOLD cho bất cứ
ai trên thế giới và có nhiều ứng dụng bao gồm cả giám sát môi trƣờng, an toàn thực
phẩm và y học. Ví dụ, DNA mã vạch sẽ đƣợc sử dụng để xác định các ấu trùng
của loài xâm hại, phát hiện ra các loài mới [46], xác định các loài gây ra một
vết cắn, chích hoặc ngộ độc, xác minh thực vật hay thành phần động vật trong thực
phẩm [57].

2.2. Các tiêu chí để lựa chọn các trình tự để sử dụng làm DNA mã
vạch và các điểm cần lƣu ý khi tạo thƣ viện mã vạch
Có một số tiêu chí để lựa chọn một trình tự có thể đƣợc sử dụng nhƣ một mã
vạch DNA. Các trình tự đƣợc sử dụng làm mã vạch phải có trong tất cả các loài của
một đơn vị phân loại lớn, đảm bảo đủ ngắn khoảng 400-800 bp để có thể phân lập


7

đƣợc từ các mẫu vật đã bị hƣ hỏng, suy giảm về chất lƣợng cũng nhƣ có thể khuếch
đại một cách dễ dàng mà không tốn kém. Trình tự của mã vạch DNA giữa các loài
cần có sự giống nhau đến 70% song cũng phải chứa khoảng 30% trình tự khác nhau
để có thể xác định, thậm chí có thể phân biệt đƣợc các loài có liên quan chặt

chẽ một cách dễ dàng. Hai bên của các trình tự này là các vùng bảo tồn tiến hóa
tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng các cặp mồi chung để khuếch đại đoạn
gen mã vạch [46].

2.3. Mã vạch DNA sử dụng trong xác định loài ở động vật và thực vật
2.3.1. Mã vạch DNA ở động vật
Sự đa dạng của thế giới động vật đặt ra một thách thách lớn trong việc phân
loại và định danh các loài. Một hệ thống phân loại cho thế giới động vật sẽ có thể
bao gồm ít nhất hàng triệu loài khác nhau [38]. Phân loại hiện đại có nguồn gốc từ
giữa thế kỷ 18, đã mô tả đƣợc khoảng 1,7 triệu loài. Các nhóm động vật lớn hơn
thƣờng đƣợc mô tả đầu tiên, trong khi nhiều sinh vật nhỏ hơn vẫn chƣa đƣợc biết
đến. Tuy nhiên, ngay cả các loài động vật lớn hơn vẫn có những nghi ngờ về nhận
dạng giữa các loài. Hệ sinh vật của trái đất có thể chứa từ 10 đến 100 triệu loài sinh
vật nhân chuẩn. Vì vậy, để định danh loài thông qua các đặc điểm hình thái thì con
số trên là quá lớn, bên cạnh đó cũng có một số lĩnh vực khác liên quan đến việc xác
định loài nhƣ: Đấu tranh chống buôn bán các loài nguy cấp đang trong nguy cơ
tuyệt chủng, giám sát thủy sản, xác định và kiểm soát sự lây lan của các loài vật gây
hại hoặc bệnh, xác định dòng tuyệt chủng [53]. Với sự đa dạng sinh học cao nhƣ
vậy thì việc tìm ra một công nghệ cho việc phân loại là vô cùng quan trọng.
Năm 2003, Paul Hebert đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) nhƣ là
một cách để xác định loài, mã vạch DNA là một chuỗi nucleotide ngắn lấy từ một
phần thích hợp của hệ gen đƣợc sử dụng để xác định ở mức độ loài [1, 49]. Ông đề
xuất xây dựng một hệ thống phân loại cho động vật dựa trên sự đa dạng trong chuỗi
Cytochrome c oxidase tiểu đơn vị 1 (COI) [38]. Gen Cytochrome c oxidase tiểu đơn
vị 1 trong ty thể cung cấp một số lợi thế so với DNA trong nhân: Có thể nhân lên


8

nhanh chóng, thiếu các đoạn intron và có số lƣợng bản sao cao. Những đặc điểm đó

rất quan trọng đối với sự khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và sử
dụng nhƣ là một marker phân tử [29]. Lƣu ý rằng trình tự gen CO1 chỉ dùng để xác
định các động vật có xƣơng sống và côn trùng, nó không thể dùng cho tất cả các
nhóm động vât, chẳng hạn đối với bọt biển và san hô thì vùng gen này rất bảo thủ
[12, 21], nhƣng lại có sự biến đổi quá cao ở các loài lƣỡng cƣ và giáp xác [17, 46],
trong khi ở các loài nhƣ giun tròn, sán lá và tardigrades (loài gấu nƣớc) thì vùng
gen này có sự sắp xếp lại lớn nên sẽ làm ngăn cản việc sử dụng các cặp mồi phổ
biến trong phản ứng PCR [7]. Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen khác trong ty
thể nhƣ Cytb (cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng đƣợc dùng nhƣ ADN
mã vạch trong nhận dạng ở động vật [1].
2.3.2. Mã vạch DNA ở thực vật
Hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Chúng bao gồm thực vật có hạt
(hạt trần và hạt kín) cùng với rêu, dƣơng xỉ và các loài có quan hệ gần với dƣơng xỉ.
Tổng số loài khác nhau rất nhiều giữa công bố của các tác giả, nhƣng một ƣớc tính
gần đây đã cho thấy rằng hiện có khoảng 380.000 loài thực vật trên cạn, gồm
khoảng 352.000 loài thực vật hạt kín, 1.300 loài thực vật hạt trần, 13.000 loài rêu và
dƣơng xỉ. Với một số lƣợng loài lớn nhƣ vậy thì vấn đề về phân loại và định danh sẽ
không dẽ dàng và sẽ tốn nhiều thời gian, việc định danh loài dựa vào các đặc điểm
hình thái bên ngoài cho độ tin cậy không cao, trong khi số lƣợng loài luôn luôn biến
động, số loài tuyệt chủng ngày càng tăng mà có thể chúng còn chƣa đƣợc biết đến.
Vì vậy, cần có một biện pháp thích hợp để giả quyết vấn đề này [6, 31].
Sự ra đời của một công nghệ gọi là "mã vạch DNA" là một công cụ hữu ích
để giải quyết vấn đề trên. Đoạn gen đƣợc dùng làm mã vạch có thể tìm thấy ở tất cả
các sinh vật (hoặc ít nhất là trong tất cả các thành viên của một nhóm loài), các trình
tự nucleotide sẽ giống nhau hoặc rất giống nhau ở các cá thể trong cùng một loài,
nhƣng khác nhau giữa các loài. Vì vậy, khu vực này có thể đƣợc sử dụng cho nhận
dạng các loài bằng cách so sánh trình tự của nó trong sinh vật thử nghiệm với trình tự
từ tài liệu tham khảo đặc biệt từ cơ sở dữ liệu [46]. Mã vạch DNA đã đƣợc sử dụng



9

một cách hiệu quả ở động vật, tảo và nấm, nhƣng vẫn còn có những cuộc tranh luận
về việc sử dụng các vùng DNA chuẩn để áp dụng cho thực vật. Mã vạch DNA dựa
trên trình tự Cytochromecoxidase 1 (cox1) của ty thể đang đƣợc sử dụng trong việc
xác định và phát hiện các loài động vật [41] chẳng hạn nhƣ lƣỡng cƣ [47], chim [20],
cá [53], nhện [18], nấm [44] và tảo đỏ [42] một cách hiệu quả với mức độ phân biệt
loài là trên 90% [41]. Việc áp dụng hệ thống mã vạch này đối với thực vật trên cạn
gặp nhiều khó khăn, thách thức. Do đó, cần nghiên cứu bộ gen trong lục lạp và bộ
gen nhân để tìm kiếm vùng mã vạch phù hợp cho thực vật [6, 50]. Tỷ lệ những sự
thay thế trong bộ gen của thực vật là thấp hơn đáng kể so với những quan sát trong ty
thể động vật. Từ đó cho thấy rằng cần phải có một số lƣợng lớn dữ liệu trình tự từ
nhiều locus cho mã vạch ở thực vật [35]. Không có vùng DNA phổ biến nào phù hợp
cho tất cả các loài thực vật và đáp ứng tất cả các tiêu chí cần thiết đã đƣợc tìm thấy.
Năm 2005, nhóm công tác cây trồng (PWG - Plant Working Group) đã đƣa
ra 5 vùng gen nằm trong lạp thể có tiềm năng để sử dụng làm mã vạch cho thực vật,
bao gồm vùng matK (mã hóa cho maturase và có vị trí trong gen trnK), vùng rpoB
(tiểu đơn vị RNA polymerase), rpoC1(tiểu đơn vị RNA polymerase), accD (tiểu
đơn vị của acetyl CoA carboxylase) và UBBAXH (trƣớc đây đƣợc biết đến nhƣ
ycf5 gen mã hóa protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp Cytochrome c). Năm
2007, trong một nghiên cứu tiếp theo đã đề xuất thêm hai vùng gen nằm trong DNA
plastid đó là hai locus rbcL và matK dùng để xác định các cây hạt trần, hạt kín, dƣơng
xỉ, bút tháp và rêu. Hiệu suất xác định loài của sự kết hợp hai locus này đạt 72%. Ngoài
ra các vùng khác nhƣ psbA-trnH thuộc plastid và trình tự ITS thuộc DNA ribosome hạt
nhân cũng đƣợc thử nghiệm nhƣ mã vạch bổ sung [16].
DNA trong tất cả các tế bào của một cá thể là nhƣ nhau, do đó việc xác định
loài có thể tiến hành bằng cách sử dụng bất cứ phần mô tế bào nào của sinh vật đó
tại bất kỳ giai đoạn phát triển. DNA có thể đƣợc bảo quản trong một thời gian dài
sau khi sinh vật chết đi, DNA có thể đƣợc phân lập từ tiêu bản hoặc từ các mẫu
đƣợc bảo quản trong kho lƣu trữ. Ngoài xác định loài khả năng trên của phân tử

DNA còn có tầm quan trọng đặc biệt cho nghiên cứu khoa học và các mục đích thực
tế khác nhƣ bảo vệ môi trƣờng, đánh giá đa dạng sinh học, nghiên cứu sinh học, các


10

biện pháp kiểm dịch, khoa học pháp y và giám định chất lƣợng các nguyên liệu sản
phẩm [4, 46].
Ở động vật, nấm và tảo tỷ lệ xác định loài thành công là 90% thì ở thực vật
Tỷ lệ thành công trung bình là 70%. Hơn nữa tỷ lệ phân biệt khác nhau rất nhiều
giữa các dòng giống cây trồng [41]. Ví dụ, khoảng 90% các loài asterella (một loài
rêu) có thể đƣợc phân biệt bằng đoạn gen rbcL, trong khi đối với thực vật hạt kín thì
chỉ đạt 70% [42] và chỉ có 32% các loài thực vật hạt trần đã phân biệt thành công bởi
sự kết hợp của một số khu vực DNA trong lục lạp [22].
Qua các nghiên cứu về các locus ở trong hệ gen lục lạp và hệ gen nhân dẫn
đến kết luận rằng không có locus đơn mã vạch ở thực vật tồn tại và chỉ có mã vạch
đa locus là điều kiện tiên quyết cho mã vạch DNA ở thực vật [50]. Lựa chọn cả hai
vùng mã vạch là rbcL và matK cùng với hai khu vực bổ sung là ITS (hoặc ITS2) và
trnH –psbA đã đƣợc chứng minh là phù hợp để sử dụng cho phân biệt các loài thực
vật một cách hiệu quả hiệu quả [15].

2.4. Các sản phẩm thảo dƣợc và những nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe
ngƣời tiêu dùng
Các loại thảo dƣợc truyền thống đang đƣợc sử dụng rất rộng rãi trên toàn thế
giới. Hiện có khoảng 80% dân số thế giới sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thảo
dƣợc để chăm sóc, bảo vệ sức khỏe. Sự gia tăng nhu cầu đối với các sản phẩm thảo
dƣợc đã đặt ra một vấn đề về chất lƣợng, tính hiệu quả và sự an toàn của các nguyên
liệu thảo dƣợc [40]. Để giảm chi phí giá thành sản xuất và tăng lợi nhuận đã có rất
nhiều hiện tƣợng làm giả, thay thế nguyên liệu làm thuốc bằng các loại nguyên liệu
rẻ tiền, bổ sung thêm các chất độn không đƣợc lệt kê trên nhãn mác. Đây là một mối

đe dọa lớn đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng.
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này. Trong một nghiên cứu
về một sản phẩm thảo dƣợc có tên là ―Wort St Johns‖ (chiết xuất từ cây Hypericum
perforatum) đã cho thấy có sự thay thế bằng cây Senna alexandrina (thuộc cây họ
đậu), kết quả chỉ tìm thấy mã vạch của cây Senna alexandrina chứ không hề có mã
vạch củ cây Hypericum perforatum. Nếu sử dụng trong một thời gian dài thì độc


11

tính của cây Senna alexandrina có thể gây ra những tác dụng nhƣ tiêu chảy mãn
tính, đại tràng, tổn thƣơng gan, đau bụng [35].
Trong một nghiên cứu khác về các sản phẩm trà thảo dƣợc và chè (Camellia
sinensis) thì một phần lớn các sản phẩm có chứa một hoặc nhiều mã vạch của các
loại nguyên liệu không đƣợc ghi trên nhãn, trong đó có 21/60 (35%) sản phẩm là trà
thảo dƣợc, 3/70 (4%) sản phẩm là chè [32]. Liuwei Dihuang Wan (LDW) là một
loại thuốc kết hợp bởi 6 loại thảo dƣợc truyền thống bao gồm: Rehmannia
glutinosa, Cornus officinalis, Paeonia suffruticosa, Dioscorea opposite, Poria
Cocos và Alisma ori entails. Tất cả các nguyên lệu này đƣợc nghiền thành bột, phối
trộn với nhau cùng với mật ong hoặc nƣớc và làm thành viên thuốc. Qua sự phân
tích dữ liệu mã vạch ITS2 thu đƣợc từ các mẫu LDW thì phát hiện có từ 3-4 loại
thảo mộc đƣợc phát hiện có trong loại thuốc này là đúng với thành phần của nó,
trong khi đã phát hiện thấy có sự xuất hiện của 5 loài khác gây ô nhiễm bao gồm:
Persicaria odorata, Rumex, Vigna, Saposhnikovia và Taraxacum. Sự tạp nhiễm
những loài này vào các mẫu thuốc có thể gây ra những tác dụng phụ không mong
muốn [11]. Ngoài ra còn rất nhiều trƣờng hợp gây ngộ độc đo dùng thuốc thảo dƣợc
gây ra bởi sự thay thế, nhầm lẫn trong việc sử dụng nguyên liệu. Ví dụ sự xác định
nhầm lẫn loài Gelsemium elegans (cây lá ngón) là loài Mussaenda pubescens (cây
bƣớm bạc) là một thành phần có chứa trong một loại trà thảo mộc ở Trung Quốc đã
gây ra hai vụ ngộ độc tại Hồng Kông. Sự pha trộn một chất chống viêm từ độc tố

của loài Aristolochia fangchi (một loại thuộc bộ Hồ tiêu) và Stephania tetrandra
(Hán phòng kỷ) đã dẫn đến hơn 100 trƣờng hợp suy thận và ung thƣ biểu mô đƣờng
tiết niệu [28].

2.5. Các phƣơng pháp chỉ thị sử dụng trong xác định nguyên liệu thảo
dƣợc
2.5.1. Phương pháp dựa trên chỉ thị phân tích giải phẫu học
Các tế bào hoặc mô lấy từ các mẫu nguyên liệu thảo dƣợc rồi quan sát dƣới
kình hiển vi có thể thấy đƣợc các đặc điểm, thành phần của mẫu mô tế bào đó. Dựa


12

vào đặc điểm của các thành phần nhƣ các mạch dẫn, lớp biểu bì, các loại sợi…để
xác định loài. Phân tích giải phẫu có thể không cung cấp một phƣơng tiện rõ ràng
xác thực để xác định loài, đặc biệt là từ các loài có liên quan, có đặc điểm tƣơng tự.
Đây là một phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém. Tuy nhiên, các
yếu tố nhƣ môi trƣờng, địa lý, giai đọan tăng trƣởng và các điều kiện bảo quản
của các loại thảo mộc có thể ảnh hƣởng đến cấu trúc bên trong của tế bào. Vì vậy sử
dụng phƣơng pháp giải phẫu học để xác thực các nguyên liệu thảo dƣợc sẽ cho kết
quả có độ chính xác không cao, đặc biệt các nguyên liệu đã qua chế biến [36].
2.5.2. Các phương pháp dựa trên chỉ thị hóa học
Các phƣơng pháp nhƣ sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography -TLC)
và sắc kí lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography- HPLC) đƣợc sử
dụng trong xác định các thành phần nguyên liệu thảo dƣợc [36]. Protein và các hoạt
chất trao đổi khác là sản phẩm của quá trình biểu hiện gen của sinh vật. Nghiên cứu
các khác biệt trong thành phần của các sản phẩm này có thể giúp xác định những sự
khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể và các loài khác nhau. Điện di protein là
một phƣơng pháp hữu hiệu để phân biệt, nhận diện giữa các loài bởi mỗi protein là
sản phẩm của một gen, do đó sự đa hình các protein cũng phản ánh gián tiếp sự đa

hình trong kiểu gen của các loài [3]. Song các phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là
các nguyên liệu thảo dƣợc có thể bị ảnh hƣởng bởi điều kiện sinh lý, thời gian thu
hoạch và điều kiện bảo quản. Hơn nữa, rất khó để phân biệt các loài liên quan chặt
chẽ vì các loài trong số đó có thể chứa các thành phần hóa học tƣơng tự [36]. Đối
với các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi thì sản phẩm biểu hiện gen (protein,
enzyme…) không cho sự đa hình rõ ràng. Sự đa hình của các chỉ thị hóa sinh
không độc lập với điều kiện môi trƣờng (do quá trình biểu hiện gen thay đổi ở
các điều kiện sinh trƣởng khác nhau) và số lƣợng chỉ thị đa hình không phong
phú [3].


13

2.5.3. Phương pháp dựa vào chỉ thị DNA
Các chỉ thị DNA có thể phân chia theo nhiều tiêu chí khác nhau, dựa trên cơ
sở kỹ thuật hay tính chất di truyền của chỉ thị. Dựa trên cơ sở kỹ thuật có thể phân
chia thành các nhóm sau:
- Nhóm chỉ thị DNA dựa trên phản ứng PCR
- Nhóm chỉ thị DNA dựa trên cơ sở lai DNA
- Nhóm chỉ thị DNA dựa trên trình tự DNA
2.5.3.1. Các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR
+ Phản ứng PCR dựa trên các cặp mồi ngẫu nhiên (PCR by Arbitrarily
Chosen Primers – ACP PCR)
Năm 1990, hai phƣơng pháp đa hình DNA khuếch đại ngẫu nhiên (Random
Amplified Polymorphic DNA - RAPD) và PCR các cặp mồi tùy ý (ArbitrarilyPrimed PCR – AP PCR) đã đƣợc phát triển. Để khuếch đại một đoạn DNA khuôn,
phƣơng pháp RAPD sử dụng tập hợp đoạn mồi dài khoảng10 nucleotide và
phƣơng pháp AP-PCR sử dụng cặp mồi dài khoảng 20 nucleotide. Các phƣơng
pháp này sử dụng các đoạn oligonucleotide để làm mồi xuôi và mồi ngƣợc một
cách tùy tiện có trình tự ngẫu nhiên. Vì các đoạn mồi này ngắn nên thƣờng gắn
với DNA khuôn tại nhiều vị trí khác nhau. Tập hợp các sản phẩm khuếch đại thu

đƣợc sẽ chứa các đoạn DNA chỉ khuếch đại từ một số mẫu DNA hệ gen mà không
từ các mẫu khác. Nghĩa là sự có mặt hay vắng mặt của các đoạn khuếch đại sẽ tạo
nên tính đa hình của các loài. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là không cần biết trƣớc
trình tự gen của loài cần nghiên cứu, lƣợng DNA cho nghiên cứu cần ít, thời gian
thực hiện ngắn, đơn giản, chi phí thấp. Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD có một số
nhƣợc điểm là do đoạn mồi sử dụng có kích thƣớc ngắn và không thể bắt cặp tuyệt
đối với khuôn nên khả năng xuất hiện đa hình thấp, kết quả phân tích không ổn
định, thƣờng có sự sai khác giữa các lần nghiên cứu. Bên cạnh đó, RAPD là chỉ
thị trội nên không thể phát hiện đƣợc các cá thể dị hợp tử [36].


14

+ Phương pháp đa hình lặp lại liên tiếp đoạn đơn giản (Simple Sequence
Length Polymorphism - SSLP)
Trong hệ gen sinh vật bậc cao, ngoài các trình tự mã hóa protein còn có các
yếu tố DNA lặp lại, phân bố trên nhiễm sắc thể và có kích thƣớc khác nhau. Tùy
vào sự phân bố DNA trên hệ gen, các yếu tố DNA lặp lại đƣợc chia làm hai nhóm
là trình tự DNA lặp lại rải rác và trình tự DNA lặp lại nối tiếp có kích thƣớc khác
nhau (VNTR – Variable Number of Tandem Repeat). Các VNTR cũng đƣợc chia
làm 3 nhóm bao gồm: DNA vệ tinh, Minisatellite và các vi vệ tinh. DNA vi vệ
tinh còn gọi là đoạn lặp trình tự đơn giản (SSR- Simple Senquence Repeats). SSR
có mức độ đặc hiệu cao cho nên sản phẩm nhân gen của phản ứng PCR-SSR đặc
hiệu và ổn định, nhờ tính bảo thủ của vùng trình tự sƣờn mà mồi của SSR có thể
sử dụng chéo giữa các loài khác nhau. Ngoài ra, chỉ thị SSR là di truyền đồng trội
và mức độ đa hình cao nên có thể sử dụng để phát hiện các cá thể đồng hợp tử và
dị hợp tử ở các locus đó, phƣơng pháp SSR còn có thể thực hiện nhanh chóng, đơn
giản. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là cần kết hợp các cặp mồi
chính xác tƣơng ứng với hai đầu của đoạn DNA chứa trình tự lặp lại [3].
2.5.3.2. Các chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA

+ Phương pháp đa hình chiều dài đoạn DNA được cắt bởi enzyme giới hạn
(Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP)
Trong hệ gen của các sinh vật thƣờng xảy ra các quá trình làm thay đổi trình
tự DNA nhƣ các đột biến điểm, đột biến thêm bớt đoạn DNA hay sắp xếp lại các
đoạn trên nhiễm sắc thể. Những biến đổi này có thể làm tăng, giảm, dịch chuyển
các vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn. Khi enzyme giới hạn cắt DNA hệ
gen, những thay đổi cuả vị trí nhận biết sẽ tạo ra các mảnh DNA có kích thƣớc
khác nhau. RPLP dựa trên sự phân cắt DNA hệ gen bằng các enzyme cắt giới hạn,
các sản phẩm cắt có thể phát hiện bằng quá trình lai Southern Blot với các mẫu dò
có đánh dấu đồng vị phóng xạ sau khi điện di trên gel agrose. Đây là công cụ
nghiên cứu đa dạng di truyền đƣợc sử dụng phổ biến những năm 80 của thế kỷ 20


15

cho kết quả có độ tin cậy cao. Tuy nhiên, phƣơng pháp này đòi hỏi chuyên viên có
tay nghề cao, mất nhiều thời gian, độc hại và phức tạp nên ngày nay ít đƣợc sử
dụng. Hiện nay, phƣơng pháp này đã đƣợc cải tiến và đƣợc gọi là PCR-RFLP hay
còn gọi là CAPS. Chỉ thị CAPS đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp, có thể phân
biệt đƣợc cá thể dị hợp tử. Tuy nhiên, mức độ đa hình phát hiện bởi chỉ thị này
phụ thuộc vào các vị trí giới hạn cũng nhƣ các enzyme giới hạn sử dụng để phân
cắt sản phẩm PCR [3].
+ Phương pháp đa hình các đoạn cắt khuệch đại (Amplified Fragment
Length Polymorphism - AFLP)
Đây là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng đồng thời hai
enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen tạo ra đầu cắt so le, sau đó gắn với các adapter
oligonucleotide có trình tự đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nhận biết của enzyme cắt
giới hạn các đoạn cắt đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR. Sự khác nhau trong
chiều dài của các sản phẩm PCR tạo nên sự đa hình. Phƣơng pháp AFLP có ƣu
điêm là nhanh chóng, đòi hỏi lƣợng DNA ban đầu ít, không cần biết trƣớc trình tự

đích, các cặp mồi sử dụng không cần đặc hiệu cho loài (các cặp mồi có thể dùng
cho hầu hết các loài) và có thể áp dụng với các hệ gen có kích thƣớc lớn. Tuy nhiên,
phƣơng pháp này gặp khó khăn trong xác định phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp
2.5.3.2. Các chỉ thị dựa trên cơ sở trình tự DNA mã vạch
Đoạn gen đƣợc dùng làm mã vạch có thể tìm thấy ở tất cả các sinh vật (hoặc
ít nhất là trong tất cả các thành viên của một nhóm loài), các trình tự nucleotide sẽ
giống nhau hoặc rất giống nhau ở các cá thể trong cùng một loài, nhƣng khác nhau
giữa các loài. Vì vậy, khu vực này có thể đƣợc sử dụng cho nhận dạng các loài bằng
cách so sánh trình tự của nó trong sinh vật thử nghiệm với trình tự từ tài liệu tham
khảo từ cơ sở dữ liệu. Các vùng gen đƣợc sử dụng để làm DNA mã vạch ở thực vật
bao gồm các trình tự DNA trong lạp thể và DNA trong nhân. Hiện nay, các chỉ thị
dựa trên trình tự DNA là một phƣơng pháp xác định các nguyên liệu thuốc thảo
dƣợc một cách hiệu quả [46].


16

2.6. Ƣu điểm của phƣơng pháp DNA mã vạch so với các phƣơng pháp
khác trong xác định nguyên liệu thảo dƣợc
Các nguyên liệu thảo dƣợc có thể đƣợc xác định bằng hai phƣơng pháp
bao gồm phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp hiện đại. Tuy nhiên,
phƣơng pháp sinh học phân tử dựa vào vùng DNA mã vạch thể hiện nhiều đặc
điểm ƣu việt vƣợt trội.
Các phƣơng pháp truyền thống nhận diện nguyên liệu thuốc bao gồm các
phƣơng pháp cảm quan (xác định bằng các giác quan: Vị giác, thị giác, khứu giác,
xúc giác), phƣơng pháp xác định dựa vào hình dạng, màu sắc, kết cấu. Phƣơng pháp
dựa vào các thƣ nghiệm hóa học (ví dụ nhƣ TLC,HPLC-UV, HPLC-MS). Tuy
nhiên, đây không phải là phƣơng pháp có thể xác định các loài một cách dễ dàng
đặc biệt là trong các sản phẩm đã qua chế biến. Các sản phẩm đã trải qua chế biến
công nghiệp, chịu tác động của các yếu tố nhiệt độ, lực cơ học, các chất phụ gia nhƣ

trà, các loại thuốc thảo dƣợc dạng viên, dạng lỏng thì không thể dùng phƣơng pháp
dựa vào các đặc điểm hình thái, kết cấu để nhận diện vì các nguyên liệu thảo dƣợc
đã bị nghiền thành các mảnh nhỏ hoặc chế thành dạng lỏng, ngoài ra các thành phần
hóa học có chứa trong các mẫu có thể bị ảnh hƣởng do tác động của các yếu tố nhƣ
điều kiện lƣu trữ và bảo quản. Các loài có chứa các thành phần hóa học tƣơng đồng
nên có thể bị nhầm lẫn do đó việc áp dụng các phƣơng pháp hóa học để xác định sẽ
cho độ chính xác không cao [1, 28]. DNA là một đại phân tử ổn định, ít bị ản hƣởng
bởi các yêu tố bên ngoài, có thể tìm thấy ở tất cả các mô trên sinh vật [53]. Công
nghệ mã vạch DNA có khả năng nhận diện loài từ một mẫu rất nhỏ, từ mọi cơ quan
bộ phận của một cá thể kể cả các mẫu từ một cá thể còn non, từ các mẫu đã bị hƣ
hỏng hoặc ngay cả đã trải qua quá trình chế biến và phƣơng pháp này có độ chính
xác tin cậy cao [61].

2.7. Lựa chọn và sử dụng vùng DNA mã vạch trong xác định các thành
phần nguyên liệu thảo dƣợc
Bốn vùng mã vạch tiêu chuẩn (rbcL, matK, trnH - psbA và ITS) đã đƣợc tập
trung chủ yếu trong các lĩnh vực về đa dạng sinh học, bảo tồn và cũng đƣợc sử dụng