TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÔN VI SINH THỰC PHẨM

Đề tài:

PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH
VẬT
GVHD: NGUYỄN MINH HẢI
LỚP: L15-TP01
NHÓM 6:
Nguyễn Ngọc Diễm
Trương Minh Hiển
Phan Hồng Lý


I. Vai trò của bảo quản vi sinh vật
II. Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật
a. Cấy truyền trên môi trường dịch thể
b. Cấy truyền trên môi trường thạch
c. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng
2. Phương pháp làm mất nước trong môi trường ào quản
3. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp
4. Phương pháp bảo quản lạnh sâu
III. Dụng cụ trong bảo quản giống


I. VAI TRÒ CỦA BẢO QUẢN VI SINH VẬT.
 Công tác bảo quản giống vi sinh vật có ý nghĩa rất lớn trong mọi phòng nghiên
cứu và trong công nghiệp vi sinh vật. Nó không chỉ đơn thuần giữ những chủng

giống trên một vài môi trường dinh dưỡng thông thường và định kỳ cấy
chuyền, mà phải làm thế nào để giống sống sót và giữ được những đặc tính ban
đầu. Vì vậy công tác này tương đối phức tạp và khó khăn.
 Sau khi đã chọn được những chủng cần phải tiến hành bảo quản ngay. Ngày
nay có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. Phần nhiều những
phương pháp này giữ chủng giống ở trạng thái tiềm sinh và định kỳ cấy chuyền
ở môi trường thích hợp. Trong trạng thái tiềm sinh hầu như không xảy ra quá
trình sống hoặc với mức độ thấp. Bảo quản ở trạng thái này cho phép giữ được
những tính chất quí hiếm ban đầu. Sự lựa chọn những phương pháp bảo quản
tuỳ thuộc vào khả năng của từng phòng thí nghiệm.


II.CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI
SINH VẬT
1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật
 Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy
trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm
hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát
triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản
có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn
nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường
mới trước khi già và chết.
 Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo
quản này như: Staphylococi, Coliform... có thể sống được vài năm theo
cách này.


Ưu và nhược điểm của phương pháp
 Ưu điểm: Phương pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản
không lâu.

 Nhược điểm:
• Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.
• Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản.
• Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các
chủng bảo quản.
• Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
• Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không
thích hợp.
• Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do
đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.


a. Cấy truyền trên môi trường dịch thể:
 Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men
trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút. Thường làm 2 lọ
cho mỗi chủng bảo quản.
 Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được đưa vào môi trường bằng thao
tác vô trùng và giữ ở 25°C trong 72 giờ. Phải kiểm tra sự phát triển của chủng bảo
quản.

 Sau đó các mẫu được giữ ở 4°C.
 Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay đổi từ 26 tháng.
b. Cấy truyền trên môi trường thạch:

 Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở đây
môi trường được bổ sung thạch (1.6%). Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ
ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 4-8oC.
 Theo phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền
dịch thể, thông thường giống được bảo quản từ 3-6 tháng.



Hình 1. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
Giống vi sinh vật được giữ trên môi trường thạch nghiêng (đối với các giống vi sinh
vật hiếu khí) hoặc trích sâu vào môi trường thạch (đối với vi sinh vật kỵ khí).

Các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3- 5°C.
Để công tác giữ giống được tốt, lâu hơn và đỡ bị tạp hơn, người ta thường phủ lên
môi truờng đã được cấy giống vi sinh vật một lớp dầu khoáng như paraffin lỏng.


c. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng
 Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy truyền nhiều lần cụ thể là hạn chế
sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian bảo quản, tránh cho lớp thạch môi
trường bị khô dần và giống có thể bị chết, thì phủ lên môi trường thạch có vi sinh
vật phát triển một lớp dầu khoáng parafin dày khoảng 10mm.

 Lớp parafin này sẽ hạn chế sự tiếp xúc của vi sinh vật với oxygen không khí và
hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch nên nồng độ các chất hoà tan
không bị thay đổi.


2. Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:
Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men.

a. Bảo quản giống vi sinh vật trong cát:
Xử lý cát:
 Dùng cát sông rửa sạch bằng nước nhiều lần (đến khi nước không đục), sấy khô,
sàng qua rây lỗ nhỏ để loại đất và rác bẩn.
 Có thể dùng acid clohyric đặc để oxy hoá các chất hữu cơ (đun nóng 100°C và rửa
lại bằng nước).

 Sấy khô ở 120°C trong 3 - 4 giờ. Chia cát khô vào ống nghiệm thuỷ tinh đã sấy
thanh trùng ở 160-180°C khoảng 2 giờ.
 Kiểm tra độ vô trùng của cát bằng cách cho môi trường dịch đường hoá và thịtpepton vô trùng vào ống cát đã hấp thanh trùng
 Sau đó cho vào tủ ấm 28-30°C khoảng một tuần. Quan sát hàng ngày nếu thấy loại
dịch này đục thì coi như cát chưa vô trùng.


Cấy giống vào môi trường:
 Đổ cát đã chuẩn bị vào các ống nghiệm giống đã thanh trùng sao cho cát không
rơi vào mặt thạch, không dính lên thành ống nghiệm.
 Úp mặt thạch, dùng que cấy cào bào tử vào cát. Đổ cát có bào tử vào ống nghiệm
vô trùng lắc đều.

 Bảo quản những ống cát vào bào tử khô không bị ướt và vón cục, các ống cát
giống đậy bằng nút bông.
 Dùng parafin nóng chảy phết lên nút bông của ống nghiệm giúp cho ống giống
không bị ẩm ướt và giữ ở nhiệt độ phòng hay ở 4-6°C.
 Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống và cấy vào các ống
thạch nghiêng, sau đó chọn lựa và cấy truyền tiếp theo.


b. Bảo quản giống trong đất khô:
 Nghiền đất và rây lấy những hạt bằng nhau.
 Chia đất nghiền vào các ống nghiệm thêm 1-2 giọt nước,có thể thêm 1-2% 𝐶𝑎𝐶𝑂3
để trung hoà các loại đất chua hoặc cho một ít than hoạt tính vào đáy ống để cho
đất sau khi thanh trùng luôn khô.
 Đậy bông và để các ống nghiệm có đất vào giỏ đem hấp thanh trùng hai lần ở
120°C một giờ cách nhau một ngày.
c. Bảo quản trên giấy:
 Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng

giấy bạc và đựng trong hộp kín.
 Ưu thế của phương pháp này là bảo quản được lượng mẫu lớn.


d. Bảo quản trên gelatin:
 Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật
trong môi trường có gelatin.
 Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa petri. Phương pháp này có thể bảo
quản được vi khuẩn trong vài năm.
e. Giữ giống trên hạt:
 Có thể giữ bào tử nấm mốc, xạ khuẩn trên các hạt thực vật khác nhau.
 Thường bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh trên hạt kê: chọn hạt kê vàng
đã làm sạch, cho vào nước sôi khuấy trộn đều, giữ 30 phút cho các hạt thấm ẩm
hoàn toàn rồi lọc.
 Tãi kê ẩm ra trên mặt khay để xoa cồn, làm nguội và các hạt phải rời nhau, rồi
cho vào từng lọ.


 Các bình đậy nút kín và thanh trùng ở 115°C khoảng 30-40 phút.
 Cấy vào mỗi bình 2 ml dịch huyền phù bào tử hay khuẩn ty dinh dưỡng.

 Lắc nhẹ cho giống đều trên các hạt kê và nuôi ở nhiệt độ 24-28°C trong 8 ngày.
 Sau đó sấy trong các thiết bị chân không đến khi độ ẩm kê có giống phát triển
không quá 8%.
 Kiểm tra giống và tráng parafin lên nút bông.
 Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong tối và khô.
3. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp:
a. Phương pháp đông khô:
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái
lạnh sâu.



Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh
trong môi trường chân không.
Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định.

Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không.

Hình 2. Đông khô vi sinh vật.


Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật
trên thế giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc
tính của vi sinh vật và bảo quản được trong một thời gian dài.
Phương pháp lạnh đông giữ giống dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát
triển của vi sinh vật bằng cách đưa chúng vào nhiệt độ lạnh sâu ở –25°C
đến –70°C.
Để đảm bảo tế bào vi sinh vật không bị chết khi bị làm lạnh sâu ta cần
trộn sinh khối của giống cần bảo quản với dung dịch bảo vệ (hay còn gọi
là dung dịch nhũ hoá) như glycerin 15%



b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying):
 Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô
trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được
làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ
trước.

 Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng

sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông.
• Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là:
• Tuổi của vi sinh vật bảo quản.
• Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật.
• Tốc độ đông khô.
• Nhiệt độ đông khô thấp nhất.
• Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu.


Ưu và nhược điểm của phương pháp:
 Ưu điểm

• Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu.
•

Thời gian bảo quản lâu thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được
bảo quản từ 10-20 năm.

 Tiết kiệm được công sức và sai sót nhãn mác và tạp nhiễm.
 Nhược điểm
• Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị.

•

Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác
nhau.

•

Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi

trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học.


4. Phương pháp bảo quản lạnh sâu:
 Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi
trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt
độ lạnh sâu
(-196°C -> -80°C).

Hình 3. Bảo quản lạnh sâu


 Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu.
 Nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu
bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào
 Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ
lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide).
 Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như
nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.
 Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn
năng hơn cả.

Hình 4. Bảo quản trong nitơ lỏng


Cách tiến hành:

 Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích
hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.
 Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối

cùng 10% và mật độ tế bào
 Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp
 Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu
trong và ngoài tế bào

 Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng. Mẫu đưa vào
lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3C/phút
để đạt tới nhiệt độ -30C ban đầu.
 Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15C/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh
cần thiết (-100C đến -80C).
 Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng cách làm
tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37C trong 40-60 giây).


Ưu và nhược điểm của phương pháp:
Ưu điểm:
 Phương pháp có thể bảo quản tế bào trong thời gian rất lâu, tỉ lệ tế bào còn
sống cao.
Nhược điểm:
 Phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho
thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ...
 Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường
xuyên dùng đến.
 Phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc
tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô.


III.DỤNG CỤ VÀ TRANG BỊ TRONG BẢO QUẢN GIỐNG
1. Ống và giá đựng giống


 Vi sinh vật được bảo quản trong các ống nhựa PP chuyên dùng có khả năng chịu
được nhiệt độ thấp của nitơ lỏng nhưng cũng chịu được nhiệt độ tiệt trùng (Hình
5). Ống này được đặt trên các giá riêng rồi đặt vào các bình hay thùng chứa. Khi
đặt trong dụng cụ chứa, các giá này nên được đặt ở vùng chứa pha hơi của nitơ
(Hình 6 và Hình 7).

Hình 6. Ống đựng giống vi sinh vật


2. Bình và thùng bảo quản:
 Để duy trì nhiệt độ rất thấp ở bên trong, các trang bị này được cách nhiệt rất kỹ
lưỡng. Bên trong thường có các tấm để ngăn riêng pha lỏng của nitơ. Các nắp hay
cửa ra vào được thiết kế đặc biệt để nitơ không rò rỉ ra ngoài. Các trang bị này
cũng thường đặt trong phòng lạnh để tránh bị mất nhiệt (Hình 6 và Hình 7).

Hình 6 Bình bảo quản giống cỡ nhỏ


Hình 7 Thùng bảo quản giống cỡ lớn
Chất chống đông:
 Ở nhiệt độ rất thấp, nước trong vi sinh vật sẽ đông đặc và làm vi sinh vật bị
tổn thương, thậm chí bị tiêu diệt. Để ngăn ngừa điều này người ta phải sử
dụng các chất chống đông. Các chất này sẽ tạo liên kết với nước trong cơ thể
vi sinh vật và nước ở dạng liên kết không bị đông đặc dù ở nhiệt độ rất thấp.
 Các chất chống đông thường dùng là dimetyl sulfoxit (DMSO), glyxerol.
Trước khi bảo quản ta ngâm vi sinh vật trong dung dịch chống đông.