TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


Tiểu luận:

CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG
VI SINH VẬT
GVHD: Nguyễ n Minh Hả i

Lớp: L15_TP01
Nhóm 6:
Nguyễn Ngọc Diễm
Trương Minh Hiển
Phan Hồng Lý

1


MỤC LỤC
VAI TRÒ CỦA BẢO QUẢN VI SINH VẬT. ........................................................ 3
CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT. ............................. 4
Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:....................................................................... 4
a. Cấy truyền trên môi trường dịch thể:.......................................................................... 4
b. Cấy truyền trên môi trường thạch: ............................................................................. 5
c. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng ........................ 6
d. Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản: .......................................... 6
2. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp: ........... 8
a. Phương pháp đông khô: .............................................................................................. 8
b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying): .............................................. 12
3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu: .......................................................................... 14

III. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC
NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ....................................................................................... 16
1. Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn ............................ 16
1.1. Bảo quản vi khuẩn .............................................................................................. 16
1.2. Bảo quản xạ khuẩn:............................................................................................. 18
2. Bảo quản vi tảo ........................................................................................................ 19
3. Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi .................................................... 19
4. Phương pháp bảo quản nấm men:......................................................................... 24
III.
DỤNG CỤ VÀ TRANG BỊ TRONG BẢO QUẢN GIỐNG: ........................ 25
1. Ống và giá đựng giống ............................................................................................ 26
2. Bình và thùng bảo quản: ........................................................................................ 26
3. Chống đông.............................................................................................................. 28
I.
II.
1.

2


I.

VAI TRÒ CỦA BẢO QUẢN VI SINH VẬT.

Công tác bảo quản giống vi sinh vật có ý nghĩa rất lớn trong mọi phòng nghiên
cứu và trong công nghiệp vi sinh vật. Nó không chỉ đơn thuần giữ những chủng giống
trên một vài môi trường dinh dưỡng thông thường và định kỳ cấy chuyền, mà phải
làm thế nào để giống sống sót và giữ được những đặc tính ban đầu. Vì vậy công tác
này tương đối phức tạp và khó khăn.
Quá trình nuôi cấy đưa ra giống vi sinh vật có hoạt lực cao vào sản xuất cần qua

các bước như sau: phân lập, và tuyển chọn giống, nghiên cứu các đặc tính về hình
thái, sinh lý, hoá sinh, tuyển chọn các điều kiện nuôi cấy tối ưu. Bước đầu tiên cần
phải chú ý là việc giữ giống sau khi đã phân lập từ đất, nước hay một cơ chất nào đó.
Yêu cầu về mặt chọn giống: giống có hoạt lực cao và ổn định với hoạt lực này trong
qui trình thích hợp. Giống được chọn lần đầu cũng được giữ cho những lần tiếp theo.
Có thể cho rằng : công việc giữ giống liên quan đến công tác nghiên cứu và trong
mọi thời gian của các xí nghiệp dùng vi sinh vật.
Nếu không giữ được những đặc tính ban đầu của vi sinh vật thì mọi thành quả
thu được coi như vô ích. Vì lý do trên mà các nước trên thế giới đã chuẩn bị cho khâu
bảo quản giống mang tính tầm cỡ, thành lập các trung tâm, các bảo tàng giống vi sinh
vật, các viện nghiên cứu.
Nhiệm vụ của các bảo tàng vi sinh vật là: giữ được quần thể các tế bào giống
sống sót với tỉ lệ cao và các tế bào này giữ được đặc tính ban đầu để phục vụ cho
nghiên cứu và sản xuất. Nhưng cũng có những vi sinh vật không có khả năng sống
và duy trì những đặc tính ban đầu. Thông thường một chủng giữ lâu trên môi trường
dinh dưỡng và cấy chuyền nhiều lần có thể có những biến đổi. Như vậy cần phải
chọn lựa giống và phương pháp bảo quản thích hợp để cho các thế hệ con cháu của nó
không sinh ra các đột biến. Người ta chọn những khuẩn lạc riêng lẻ có những đặc điểm
đặc trưng. Chọn như vậy sẽ được những tế bào cùng loại, về nguyên tắc khó gặp
những thể đột biến, nhưng cũng có thể gặp phải sự xuất hiện hoặc tập trung thể đột
biến, nhưng cũng có thể gặp phải sự xuất hiện hoặc tập trung thể đột biến ở chủng ban
đầu.
Sau khi đã chọn được những chủng cần phải tiến hành bảo quản ngay. Ngày nay
có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. Phần nhiều những phương pháp
này giữ chủng giống ở trạng thái tiềm sinh và định kỳ cấy chuyền ở môi trường
thích hợp. Trong trạng thái tiềm sinh hầu như không xảy ra quá trình sống hoặc với
mức độ thấp. Bảo quản ở trạng thái này cho phép giữ được những tính chất quí
hiếm ban đầu. Sự lựa chọn những phương pháp bảo quản tuỳ thuộc vào khả năng của
3



từng phòng thí nghiệm.
CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT.

II.

1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:
Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi
trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để
trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật
này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này được lặp
lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến
môi trường mới trước khi già và chết.
Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này
như: Staphylococi, Coliform... có thể sống được vài năm theo cách này. Cho dù
phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở
nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho
nghiên cứu.
 Ưu và nhược điểm của phương pháp:
Ưu điểm: Phương pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu.
Nhược điểm:
 Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.
 Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản.
 Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng
bảo quản.
 Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
 Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích
hợp.
 Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến
xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền.

a. Cấy truyền trên môi trường dịch thể:


Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men
(thông thường là môi trường YM Yeast extract – Maltose) trong lọ
McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút. Thường làm 2 lọ cho
mỗi chủng bảo quản.



Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được đưa vào môi trường bằng
thao tác vô trùng và giữ ở 25°C trong 72 giờ. Phải kiểm tra sự phát triển
4


của chủng bảo quản.


Sau đó các mẫu được giữ ở 4°C.

Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay đổi từ 2- 6
tháng.
b. Cấy truyền trên môi trường thạch:
Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở đây
môi trường được bổ sung thạch (1.6%). Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ ở
nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 4-8oC. Theo phương
pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền dịch thể, thông
thường giống được bảo quản từ 3-6 tháng.
Thời gian bảo quản có thể được kéo dài từ 2-3 năm nếu như các ống giống được
bảo quản trong dầu parafil đã thanh trùng và được đổ lên trên môi trường thạch sao

cho tạo một lớp dày khoảng 1cm.

Hình 1. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
Giống vi sinh vật được giữ trên môi trường thạch nghiêng (đối với các giống vi
sinh vật hiếu khí) hoặc trích sâu vào môi trường thạch (đối với vi sinh vật kỵ khí). Các
ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3- 5°C. Định kỳ để cấy truyền giống,
tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà định kỳ cấy truyền khác nhau, song giới hạn
tối đa là 3 tháng. Để công tác giữ giống được tốt, lâu hơn và đỡ bị tạp hơn, người ta
thường phủ lên môi truờng đã được cấy giống vi sinh vật một lớp dầu khoáng như
5


paraffin lỏng. Lớp paraffin này sẽ hạn chế được sự tiếp xúc của vi sinh vật đối với
oxy không khí (𝑂2 ) và hạn chế sự thoát hơi nước của môi trường thạch, do vậy giống
có thể bảo quản được lâu hơn và không bị nhiễm tạp, thoái hóa.
c. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng
Để khắc phục nhược điểm của phương pháp cấy chuyền nhiều lần cụ thể là hạn
chế sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian bảo quản, tránh cho lớp thạch môi
trường bị khô dần và giống có thể bị chết, thì phủ lên môi trường thạch có vi sinh vật
phát triển một lớp dầu khoáng parafin dày khoảng 10mm. Lớp parafin này sẽ hạn chế
sự tiếp xúc của vi sinh vật với oxygen không khí và hạn chế sự thoát hơi nước của
môi trường thạch nên nồng độ các chất hoà tan không bị thay đổi, do đó áp lực
thẩm thấu cũng không bị thay đổi nên không gây hại đến đời sống của vi sinh vật.
Những chủng đã được xử lý ở trên, sau đó được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50°C và có
thể bảo quản nhiều năm.
Cần phải giữ sao cho duy trì sự sống được tốt mà không tạo nên ưu thế sinh sản.
Đối với mỗi chủng phải thử và chọn phương pháp bảo quản thích hợp. Phương pháp
giữ giống với dầu khoáng tương đối thuận tiện và cho kết quả tốt. Giống bảo
quản dưới lớp dầu khoáng sau 12 tháng vẫn giữ được hình dáng bề ngoài bình
thường. Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi để giữ nhiều giống vi sinh vật

như: nấm men, nấm mốc,vi khuẩn, xạ khuẩn….
d. Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:
Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương
pháp này các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như
sau:
 Bảo quản giống vi sinh vật trong cát:
Dùng cát sông rửa sạch bằng nước nhiều lần (đến khi nước không đục), sấy khô,
sàng qua rây lỗ nhỏ để loại đất và rác bẩn. Có thể dùng acid clohyric đặc để oxy hoá
các chất hữu cơ (đun nóng 100°C và rửa lại bằng nước). Sấy khô ở 120°C trong 3 4 giờ. Chia cát khô vào ống nghiệm thuỷ tinh đã sấy thanh trùng ở 160-180°C
khoảng 2 giờ. Ta có thể kiểm tra độ vô trùng của cát bằng cách cho môi trường dịch
đường hoá và thịt- pepton vô trùng vào ống cát đã hấp thanh trùng. Sau đó cho vào tủ
ấm 28-30°C khoảng một tuần. Quan sát hàng ngày nếu thấy loại dịch này đục thì coi
như cát chưa vô trùng.
Đổ cát đã chuẩn bị vào các ống nghiệm giống đã thanh trùng sao cho cát không
6


rơi vào mặt thạch, không dính lên thành ống nghiệm. Úp mặt thạch, dùng que cấy
cào bào tử vào cát. Đổ cát có bào tử vào ống nghiệm vô trùng lắc đều. Chỉ bảo quản
những ống cát vào bào tử khô không bị ướt và vón cục, các ống cát giống đậy bằng
nút bông. Dùng parafin nóng chảy phết lên nút bông của ống nghiệm giúp cho ống
giống không bị ẩm ướt và giữ ở nhiệt độ phòng hay ở 4-6°C.
Phục hồi chủng bằng cách dùng que cấy lấy cát trong ống và cấy vào các ống
thạch nghiêng, sau đó chọn lựa và cấy chuyền tiếp theo. Phương pháp bảo quản này
chủ yếu áp dụng cho những nhóm vi sinh vật sinh bào tử như nấm mốc và xạ khuẩn.
 Bảo quản giống trong đất khô:
Nghiền đất và rây lấy những hạt bằng nhau. Chia đất nghiền vào các ống nghiệm
thêm 1-2 giọt nước,có thể thêm 1-2% 𝐶𝑎𝐶𝑂3 để trung hoà các loại đất chua hoặc cho
một ít than hoạt tính vào đáy ống để cho đất sau khi thanh trùng luôn khô. Đậy bông
và để các ống nghiệm có đất vào giỏ đem hấp thanh trùng hai lần ở 120°C một giờ

cách nhau một ngày. Kiểm tra độ vô trùng của môi trường giữ giống như đối với cát và
giữ giống trong đất như là ở cát. Ngoài ra ta có thể giữ giống trong hỗn hợp cát và
đất. Phương pháp này bảo quản thành công với giống Clostridium pasteurianum.
 Giữ giống trên hạt:
Có thể giữ bào tử nấm mốc, xạ khuẩn trên các hạt thực vật khác nhau. Ở Liên Xô
cũ thường bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh trên hạt kê: chọn hạt kê vàng đã
làm sạch, cho vào nước sôi khuấy trộn đều, giữ 30 phút cho các hạt thấm ẩm hoàn
toàn rồi lọc. Tãi kê ẩm ra trên mặt khay để xoa cồn, làm nguội và các hạt phải rời
nhau, rồi cho vào từng lọ (khoảng 15-16 g mỗi lọ thể tích 250ml). Các bình đậy nút
kín và thanh trùng ở 115°C khoảng 30-40 phút. Thử vô trùng giống các phương pháp
trên. Cấy vào mỗi bình 2 ml dịch huyền phù bào tử hay khuẩn ty dinh dưỡng. Lắc nhẹ
cho giống đều trên các hạt kê và nuôi ở nhiệt độ 24-28°C trong 8 ngày. Sau đó sấy
trong các thiết bị chân không đến khi độ ẩm kê có giống phát triển không quá 8%.
Kiểm tra giống và tráng parafin lên nút bông. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong tối và
khô.
 Bảo quản trên giấy:
Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng
giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp này là bảo quản được lượng
mẫu lớn.

7


 Bảo quản trên gelatin:
Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong
môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa petri. Phương pháp
này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm.
2. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp:
a. Phương pháp đông khô:
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng

thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được
làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng
mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu
là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối
tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy
nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào
động vật.

8


Hình 2. Đông khô vi sinh vật.

Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế
giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và
bảo quản được trong một thời gian dài.
Phương pháp lạnh đông giữ giống dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của
vi sinh vật bằng cách đưa chúng vào nhiệt độ lạnh sâu ở –25°C đến –70°C. Để đảm
bảo tế bào vi sinh vật không bị chết khi bị làm lạnh sâu ta cần trộn sinh khối của
giống cần bảo quản với dung dịch bảo vệ (hay còn gọi là dung dịch nhũ hoá) như
glycerin 15%, huyết thanh ngựa, dung dịch glucose hay lactose 10%. Việc làm tiến
hành từ từ lạnh được, khi độ lạnh đạt –20°C việc tiếp tục làm lạnh cần đạt tốc độ 12°C/ phút. Với phương pháp này cũng cấy chuyền và làm lại, nhưng thời gian giữa các
lần cấy chuyền kéo dài hơn so với phương pháp giữ giống trên thạch.
Nếu giữ ở t°=-15°C đến -20°C
: 6 tháng cấy chuyền và làm lại
một lần. Nếu giữ ở t°=-30°C
: 9 tháng cấy chuyền và làm lại
một lần.
Nếu giữ ở t°=40°C
: 1 năm cấy chuyền và làm lại một lần.

Nếu giữ ở t°=-50°C đến -60°C
: 3 năm cấy chuyền và làm lại một
lần. Nếu giữ ở t°=-70°C
: 10 năm cấy chuyền và làm lại
một lần.
Phương pháp này rất đơn giản và tiện lợi, lại cho hiệu quả bảo quản khá cao.
9


Hiện nay nó là phương pháp sử dụng khá phổ biến để bảo quản giống vi sinh vật.
Phương pháp đông khô cũng giống vời phương pháp lạnh đông, tức là vi sinh
vật trong quá trình xử lý sẽ được đưa vào nhiệt độ thấp ở nhiệt độ –60°C đến –70°C
một cách từ từ với sự có mặt của chất bảo vệ: glutamate 3% hay lactose 1,2% +
pepton 1,2% hay saccharose 8% + sữa 5% + gelatin 1,5%…
Điều khác biệt với phương pháp lạnh đông là: đảm bảo an toàn hơn cho sự sống
của tế bào giống, người ta làm thăng hoa nước ở trong tế bào và môi trường có chất bảo
vệ trong thiết bị đông khô với áp suất 1.10-4 mmHg. Hỗn hợp tế bào giống và dung
dịch bảo vệ được chứa trong những ampul thuỷ tinh có =10mm hay =15mm được
hàn kín để đảm bảo độ khô và chân không cần thiết, nhưng ampul này được bảo
quản ở t°=4 - 6°C hay nhiệt độ phòng. Phương pháp này d0ược coi là tối ưu cho hiệu
suất bảo quản cao nhất vì có thể giữ giống vi sinh vật qua hàng chục năm vẫn có tỷ lệ
sống cao và không bị biến đổi về di truyền,
đồng thời chiếm diện tích bảo quản ít
nhất
Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại
NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh).
1 . Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống
thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi
trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng
rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm trong pha sinh trưởng log.

2. Chuẩn bị đệm mẫu:
Có thể dùng một trong hai loại đệm sau:
+ Đệm huyết thanh- inositol;
Meso-inositol:

5 gam

Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml
Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó phân 5ml vào
các
bình vô trùng.
+ Đệm inositol:
Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Mesoinositol: 5 gam
Nước cất: đủ 100 ml.
10


Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121
3. Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng
bảo quản. Thông thường có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 12 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần
đạt 1010 (đối với vi sinh vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi sinh
vật có bào tử. Hai đệm pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường
hợp enterobacteria thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn
dịch của vi khuẩn.
4. Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm
với dịch acid loãng (HCl 2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông,
ống được thanh trùng khô hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường.
5. Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa
cẩn thận bằng pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác
phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô.

6. Bước tiền đông khô: Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể
bị lạnh đông tạo đá. Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền
đông (như trình bày ở trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp
vào hệ thống đông khô và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành
khoảng 3 giờ.
7. Tạo chỗ thắt trên ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo
vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay
các cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động.
8. Hậu đông khô: Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ
ẩm cuối cùng đạt khoảng 1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2 giờ.
9. Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold)
cần có kinh nghiệm và cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực
hiện thao tác hàn ống đông khô.
10. Kiểm tra độ chân không của ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị là đèn
phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện
màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc
màu tím đậm.
11. Kiểm tra khả năng sống của mẫu: Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ
yếu để đánh giá chất lượng bảo quản. Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau
khi đông khô. Các bước kiểm tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để
11


đánh giá chất lượng của mẫu đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có
bào tử cao hơn vi sinh vật không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật
gram âm. Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng
qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy.
12. Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng.
b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying):
Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô

trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm
khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước.
Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống
trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần được quan
tâm khi thực hiện phương pháp này là:

-

Tuổi của vi sinh vật bảo quản.

-

Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật.

-

Tốc độ đông khô.

-

Nhiệt độ đông khô thấp nhất.

-

Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu.

Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông khô
đã trình bày ở trên và được thực hiện như sau:
 Chuẩn bị
1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng

170oC trong 3 giờ.
2, Môi trường L-drying chuẩn có thành phần như sau:
Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml.
Monosodium glutamat: 3 g
Adonitol: 1.5 g.
(Khử trùng ở 115°C/20 phút).
3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng
chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
 Cách tiến hành:
1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho
12


vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có
mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào
tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).
2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông
thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như
số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút
bông hay giấy bạc.
3, Đồng thời bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ
-75°C, lần lượt nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không
khi nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra, để đảm bảo độ chân không
cần thiết khi làm đông khô phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị cho
phép). Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55°C tiến hành quá trình làm
khô trong 3 giờ.
4, Hàn kín ampoule mẫu: Khi máy cô Dura-Dry đang chạy để đảm bảo độ chân
không cần thiết, lần lượt khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu
này tại vị trí ống bị thắt. Dùng ngọn lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía
và xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn lửa gas để cắt rời phần

trên (nối với manifold) và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của các
ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên.
 Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản:
-

Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo
cách đã được mô tả ở phần đông khô.

- Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và
quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá
khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học.
-


-

Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các mẫu sau đông khô trực
tiếp được giữ ở 37°C trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm
trong 2 tuần ở 37°C tương đương với bảo quản 10 năm ở 4°C.
Ưu và nhược điểm của phương pháp:
Ưu điểm
Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu.
Thời gian bảo quản lâu thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được
bảo quản từ 10-20 năm.
Tiết kiệm được công sức và sai sót nhãn mác và tạp nhiễm.
Nhược điểm
13


- Nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị.

- Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác
nhau.
- Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi
trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học.
3. Phương pháp bảo quản lạnh sâu:
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong
môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở
nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80°C).

Hình 3. Bảo quản lạnh sâu
Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan
mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong
mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm
này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như
glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này
được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20°C, -30°C, -40°C, -70°C, 140°C và -196°C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30°C cho hiệu quả thấp do tế
bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này
có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ
khuẩn và virut.
Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp
vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác
nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật.
14


Hình 4. Bảo quản trong nitơ lỏng

- Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và
nhiệt độ
thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.

- Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước để đạt nồng độ
cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106.
Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp
hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị
rò rỉ). Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm
thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang
bình nitơ lỏng. Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường
tốc độ lạnh dao động 1-3°C/phút để đạt tới nhiệt độ -30°C ban đầu. Sau đó mẫu được
làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15°C/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (100°C đến -80°C). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương trình hoá
với tốc độ mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt
trong đá khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ 65°C.
- Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng
cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37°C trong 4060 giây). Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10
năm bảo quản.
 Ưu và nhược điểm của phương pháp:
15


Ưu điểm: Phương pháp có thể bảo quản tế bào trong thời gian rất lâu, tỉ lệ tế
bào còn sống cao.
Nhược điểm:
-

Phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho
thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ...

-

Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường
xuyên dùng đến.


-

Phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc
tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô.

III.

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN
CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ

1. Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn
1.1.
Bảo quản vi khuẩn
a. Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization)

Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng tại mọi bảo tàng vi sinh vật trên thế
giới. Phương pháp đông khô hạn chế được sự thay đổi các đặc tính của vi sinh vật và
bảo quản được trong một thời gian dài.
Phương pháp đông khô được trình bày ở đây là phương pháp được dùng tại
NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh).
* Nuôi vi khuẩn cho đông khô:
Vi khuẩn được cấy trên môi trường ống thạch nghiêng thích hợp. Tuy nhiên, cũng
có thể chuẩn bị dịch vi khuẩn trên môi trường dịch thể nhưng phải làm đậm đặc tế
bào bằng li tâm. Tuổi của tế bào cũng rất quan trọng do đó thường chọn tế bào nằm
trong pha sinh trưởng log.
* Chuẩn bị đệm mẫu:
Có thể dùng một trong hai loại đệm sau:
Đệm huyết thanh- inositol;
Meso-inositol: 5 gam

Huyết thanh ngựa (số 3): 100 ml
Thanh trùng bằng phương pháp lọc vi khuẩn, sau đó
phân 5ml vào các bình vô trùng.
+ Đệm inositol:
Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Meso-inositol: 5 gam
16


Nước cất: đủ 100 ml.
Phân 5 ml vào các bình và khử trùng tại nhiệt độ 121OC.
* Chuẩn bị dịch tế bào:
Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với chất lượng bảo quản. Thông thường
có thể thu sinh khối từ mỗi ống thạch nghiêng chỉ dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để
tạo dịch huyền phù tế bào. Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh
vật không có bào tử). Mật độ trên có thể giảm với các vi sinh vật có bào tử. Hai đệm
pha mẫu trên có thể dùng với mọi vi khuẩn nhưng trong trường hợp enterobacteria
thì không dùng đệm huyết thanh vì sẽ gây ra thay đổi đặc tính miễn dịch của vi
khuẩn.
* Chuẩn bị ống đông khô:
Ống đông khô được rửa sạch sau đó ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl
2%) và lại được rửa sạch, làm khô và chuẩn bị nút bông, ống được thanh trùng khô
hoặc khử trùng theo phương pháp thông thường.
* Chuẩn bị mẫu trước khi đông khô:
Lượng dịch huyền phù vi khuẩn được đưa cẩn thận bằng pipet pasteur
vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml. Chú ý mọi thao tác phải cẩn thận tránh dính
mẫu vào thành hay phía trên của ống đông khô.
* Bước tiền đông khô:
Mục tiêu của bước này là làm bay hơi hết nước có thể bị lạnh đông tạo đá.
Trước khi tiến hành đông khô mẫu được chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày ở
trên) sau đó bước tiền đông khô tiến hành khi mẫu được lắp vào hệ thống đông khô

và quá trình làm mất nước trong điều kiện lạnh được tiến hành khoảng 3 giờ.
* Tạo chỗ thắt trên ống đông khô:
Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt. Việc tạo vết thắt được thực
hiện với hệ thống đèn hàn. Tuy nhiên, hiện nay các cơ sở bảo quản vi sinh vật sử dụng
hệ thống hàn và tạo vết thắt trên thiết bị tự động.
* Hậu đông khô:
Trong bước này mẫu lại tiếp tục được làm khô cho đến độ ẩm cuối cùng đạt
khoảng 1%. Thời gian cho bước này có thể thay đổi từ 1-2 giờ.
* Hàn ống đông khô:
Việc hàn ống trực tiếp trên thiết bị đông khô (manifold) cần có kinh nghiệm và
cẩn thận. Trước hết phải tiến hành khoá van và sau đó mới thực hiện thao tác hàn ống
đông khô.
* Kiểm tra độ chân không của ống đông khô:
Người ta sử dụng thiết bị là đèn phát hiện mức độ chân không. Với các mẫu
đạt độ chân không cần thiết thì xuất hiện màu xanh tím nhạt. Đối với các mẫu
17


không đạt tiêu chuẩn thì không có tín hiệu hoặc màu tím đậm.
* Kiểm tra khả năng sống của mẫu:
Đếm số lượng tế bào là phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo
quản. Việc đếm được thực hiện trước khi và ngay sau khi đông khô. Các bước kiểm
tra tiếp theo có thể được thực hiện sau 1 hoặc 5 năm để đánh giá chất lượng của mẫu
đông khô. Nói chung khả năng sống của vi sinh vật có bào tử cao hơn vi sinh vật
không có bào tử và loại gram dương cao hơn vi sinh vật gram âm. Tuy nhiên, với vi
sinh vật kỵ khí thì yêu cầu phải được tiến hành theo đúng qui trình, tránh vi sinh vật
tiếp xúc với oxy.
* Bảo quản mẫu:
Mẫu thông thường được bảo quản tại 4OC hay nhiệt độ phòng.
b. Phương pháp giữ trong lạnh sâu

- Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu:

Tế bào được nuôi cấy trên môi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc
đầu pha log.
- Pha dịch tế bào với glycerol hoặc DMSO đã thanh trùng trước
để đạt nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106.
- Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường
hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống
bị rò rỉ).
Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm
thấu trong và ngoài tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang
bình nitơ lỏng.
Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh
dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh
tiếp với tốc độ cao hơn 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100OC đến
-80 OC). Hiện nay, đã có các thiết bị làm lạnh sâu được chương trình hoá với tốc độ
mong muốn. Tuy nhiên, cũng có thể đơn giản hơn là mẫu ban đầu được đặt trong đá
khô sau đó lại đưa vào tủ lạnh sâu và đặt thời gian vài giờ để đạt nhiệt độ -65OC.
- Hoạt hoá mẫu: mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng
cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37 OC trong
40-60 giây). Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10
năm bảo quản.
c. Một số phương pháp bảo quản khác: Bảo quản trên gelatin và silicagel.
1.2. Bảo quản xạ khuẩn:
Xạ khuẩn mang cả đặc tính của vi khuẩn và nấm sợi (có sợi và bào tử) do đó cần
có những phương pháp bảo quản thích hợp.
Thông thường xạ khuẩn cũng được bảo quản theo các cách thông thường như cấy
18



truyền, đông khô và lạnh sâu như với vi khuẩn ở trên. Tuy nhiên, có phương pháp
kinh tế mà vẫn đảm bảo chất lượng chủng bảo quản mà chúng tôi trình bày ở đây,
đó là phương pháp bảo quản trong đất.
Các bước tiến hành bảo quản trong đất:
Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô tại 150 OC trong 6 giờ để làm chết các vi
sinh vật có bào tử và trứng giun nếu có. Đất sau khi thanh trùng được nghiền nhỏ
qua lưới có kích thước 30 mesh. Đất sau khi nghiền được đưa vào ống nghiệm chuẩn
bị nút bông và thanh trùng trong 60 phút. Trước khi tiến hành bảo quản phải kiểm
tra nhiễm sự khuẩn trong đất bằng cách cấy vòng que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào
môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn và giữ ở 24 OC, 28 OC và 37 OC, kiểm tra
sau 2-4 ngày.
- Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn. Nước cất vô trùng được dùng để tạo
dịch huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng. Lấy 1 ml
dịch huyền phù cho vào mỗi ống nghiệm và để khô tại nhiệt độ phòng (24OC) trong
thời gian 1 tháng. Đập nhẹ vào thành ống cho các hạt tách đều ra và bảo quản mẫu tại
4OC.
- Hoạt hoá mẫu đơn giản bằng cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường
(thạch hoặc dịch thể) và để ở nhiệt độ thích hợp.
2. Bảo quản vi tảo
Vi tảo thông thường được bảo quản theo 3 phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu và
đông khô. Các phương pháp đã được trình bày chi tiết trong phần vi khuẩn. Một số
điểm cần chú ý khi bảo quản vi tảo là ở chỗ: Nên dùng tế bào già ở pha cân bằng,
phương pháp lạnh sâu cho kết quả tốt hơn phương pháp đông khô.
3. Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi
a. Phương pháp cấy truyền:
Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng
nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến
mức độ cực đại, sau đó là quá trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ được bảo
quản theo các cách khác nhau:
- Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7 OC).

- Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp
dầu parafin có tỷ trọng tương đối
- Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp
dầu parafin có tỷ trọng tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt độ 121 OC
trong 15 phút. Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo quản là 15-20
OC.
19


- Bảo quản trong nước, nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch đĩa. Sau khi

sợi phát triển cực đại thì cắt thành từng miếng nhỏ kích thước khoảng 6 mm2 và
cho vào lọ nước đã thanh trùng. Bảo quản tại nhiệt độ phòng.
b. Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel:
 Chuẩn bị:
- Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) thanh trùng ở
nhiệt độ 170 oC trong 3 giờ.
- Silicagel: Loại trong suốt, không có màu, kích thước và số lượng hạt
silicagel đưa vào không quá 1/3 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt độ 170 °C trong 3
giờ.
- Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút).
- Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng
chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
 Cách tiến hành:
- Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm
chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối
với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống
thạch bào tử khác nhau).
- Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel. Chú ý silicagel
hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong

chậu nước đá. Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt silicagel
trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt silicagel đều dính dịch bào tử nấm
sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi
trường và nhiệt độ thích hợp...
- Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau
đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn
giấy parafil giữ trong 4OC.
 Kiểm tra độ sống sót sau khi bảo quản:
-Mẫu silicagel ở 4 °C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt

thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi
trường. Để ở nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp.
c. -Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô

(freez-drying):
 Chuẩn bị:
- Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170OC

trong 3 giờ.
- Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút).
- Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng
20


chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
 Cách tiến hành:
- Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm
chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối
với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống
thạch bào tử khác nhau).

- Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml), thông
thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như
mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút
bông hay giấy bạc.
- Giữ ở -80°C trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời bật máy DuraStop, khi nhiệt độ đạt -40OC, đưa mẫu vào tủ đông khô của Dura-Stop, bật máy
Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt độ DuraStop lên -5OC, để qua đêm.
- Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25°C, khi đạt nhiệt độ cần thiết, tắt

máy hút chân không nhưng không tắt Dura-Dry.
- Tắt Dura-Stop, lần lượt nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy DuraDry, tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC.
Chú ý: Trong trường hợp chỉ dùng Dura-Dry có thể được thực hiện như sau:
- Tiến hành các bước 1,2,3,4 như trên.
- Mẫu được để tiền đông khô ở -80°C trong 3 giờ. Bật máy Dura- Dry, khi đạt
nhiệt độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống
manifold tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC.
 Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô:
- Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột
ngột bằng cồn đốt
- Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa
9,8 ml nước cất vô trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù
sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất. Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau
(mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và nghiêng cho dịch chảy đều
dọc theo một hướng như hình vẽ:

21


Hình 5. PP kiểm tra độ sống sót của vi sinh vật sau đông khô
- Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ
thích hợp.

- Cách đánh giá:
Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc. Khá:
50 – 100 khuẩn
lạc. Trung bình: 10-50 khuẩn lạc. Kém: < 10
khuẩn lạc.
Không mọc.
Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên, có một số nấm
sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc
đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt. Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn lạc mọc
chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong đĩa petri. Các mẫu có số lượng khuẩn
lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi đông khô như thay đổi
môi trường sinh bào tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử
nấm sợi.
d. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp:
Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông khô
đã trình bày ở trên và được thực hiện như sau:
 Chuẩn bị:
- Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử
trùng 170oC trong 3 giờ.
- Môi trường L-drying chuẩn có thành phần như sau: Đệm phosphat:
0.1M : 100 ml.
Monosodium glutamat: 3 g Adonitol: 1.5 g.
(Khử trùng ở 115oC/20 phút).
- Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng
chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày).
 Cách tiến hành:
- Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho
vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có
mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào
22



tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau).
- Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông
thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số
mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông
hay giấy bạc.
- Đồng thời bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt
độ -75oC, lần lượt nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân
không khi nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra, để đảm bảo độ chân
không cần thiết khi làm đông khô phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị
cho phép). Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành quá trình
làm khô trong 3 giờ.
- Hàn kín ampoule mẫu:
-Khi máy cô Dura-Dry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt khoá
van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu này tại vị trí ống bị thắt.
Dùng ngọn lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía và xoay đều cho thuỷ
tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn lửa gas để cắt rời phần trên (nối với manifold)
và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của các ampoule mẫu tiếp theo và
hàn lần lượt như trên.
 Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản:
- Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo cách
đã được mô tả ở phần đông khô.
- Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và
quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả năng
tạp nhiễm và đặc tính sinh học.
- Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các mẫu sau đông khô trực
tiếp được giữ ở 37oC trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở
37oC tương đương với bảo quản 10 năm ở 4oC.
e. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80 oC và nitơ lỏng (-196

oC):
 Chuẩn bị:
- Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml trong ống nghiệm) khử trùng ở 121 oC

trong 15 phút. Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sạch trong sonic cleaner, khử trùng ở 170
oC trong 3 giờ.
- Chuẩn bị mẫu nấm sợi trên môi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn
 Cách tiến hành:
- Dùng pipet pasteur hút khoảng 0,3 ml glycerol đã thanh trùng
vào ống nhựa
đựng mẫu. Sau đó dùng dao vô trùng cắt lấy 1 miếng nhỏ môi trường chứa cả sợi và
bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa. Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu,
đậy nút và bao băng parafil sau đó dán nhãn.
23


Mẫu trước tiên phải để ở 5oC (tạo điều kiện cho glycerol đi vào tế bào), sau đó
được làm lạnh sâu tử 25oC xuống -55oC với tốc độ - 1oC/phút. Trong trường hợp
không có thiết bị làm lạnh thì có thể để - 20oC trong 3 giờ, sau đó chuyển sang -80oC
hay nitơ lỏng (-196oC).
Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết các nấm
sợi sinh bào tử và tế bào có vách ngăn. Nhưng phương pháp này tỏ ra không thích
hợp với các nấm sợi không sinh bào tử và không có vách ngăn. Trong trường hợp
này cần nuôi cấy nấm sợi trên môi trường thích hợp để tạo bào tử. Nếu không khắc
phục được thì phải tiến hành nuôi trên môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối và giữ
trong glycerol 10% như trên.
 Đánh giá khả năng sống của mẫu bảo quản:
- Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80oC hoặc nitơ lỏng - 196oC) trong
bể ổn nhiệt 37oC trong 2 phút.
- Dùng que cấy lấy các miếng môi trường thạch đặt vào 3 vị trí khác nhau trên

môi trường thạch đĩa thích hợp. Để ở nhiệt độ thích hợp và xem khả năng mọc sau
thời gian thích hợp (2-4 ngày). Chú ý khi lấy mẫu cần lấy cả sợi nấm để đưa vào môi
trường thạch đĩa.
 Một số điều chú ý đối với bảo quản nấm sợi:
- Ảnh hưởng của ánh sáng với quá trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp
thì sự thành công của phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử. Ánh
sáng là một tác nhân quan trọng đối với quá trình hình thành bào tử của nấm sợi, ánh
sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích quá trình hình thành bào tử, ánh sáng
gần vùng cực tím (3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc và kích thước khuẩn
lạc.
- Thành phần môi trường: Nói chung các môi trường có thành phần dinh
dưỡng nghèo thì thường cho lượng bào tử lớn.
- Tránh nhiễm tạp các con mạt (mite), các chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt
phá hoại. Đầu tiên chúng ăn chủng giống và làm hỏng, sau đó gây tạp nhiễm do
mang bào tử và vi khuẩn trên cơ thể từ ống này sang ống khác. Vì lý do trên mà cần
có biện pháp hạn chế mạt, thông thường các chủng giống phải được bảo quản ở nơi
sạch, nhiệt độ 4-8oC.
4. Phương pháp bảo quản nấm men:
Tương tự như nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men. Chúng tôi
chỉ đề cập đến các phương pháp thông dụng nhất đang được sử dụng tại các bộ sưu
tập nấm men lớn trên thế giới.
a. Phương pháp cấy truyền:
Cấy truyền là phương pháp đơn giản, nhanh và rẻ tiền cũng như thông dụng nhất,
tuy nhiên những hạn chế của phương pháp này là dễ tạp nhiễm cũng như những thay
đổi các đặc điểm sinh học, tính trạng di truyền sẽ là bất lợi khi bảo quản theo phương
pháp này.

24



 Cấy truyền trên môi trường dịch thể:
- Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men
(thông thường là môi trường YM Yeast extract – Maltose) trong lọ McCartney khử
trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản.
- Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được đưa vào môi trường bằng
thao tác vô trùng và giữ ở 25oC trong 72 giờ. Phải kiểm tra sự phát triển của chủng
bảo quản.
- Sau đó các mẫu được giữ ở 4oC.
- Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng

thường thay đổi từ 2- 6 tháng.
 Cấy truyền trên môi trường thạch:
Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở
đây môi trường được bổ sung thạch (1.6%). Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ
ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 4-8oC. Theo
phương pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền dịch thể,
thông thường giống được bảo quản từ 3-6 tháng.
Thời gian bảo quản có thể được kéo dài từ 2-3 năm nếu như các ống giống được
bảo quản trong dầu parafin đã thanh trùng và được đổ lên trên môi trường thạch sao
cho tạo một lớp dày khoảng 1cm.
b. Phương pháp bảo quản trong lạnh sâu và đông khô (xem phần các phương
pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn và xạ khuẩn).
IV. DỤNG CỤ VÀ TRANG BỊ TRONG BẢO QUẢN GIỐNG:
Trong các cơ sở lên men, giống thường được bảo quản trong thời gian dài, đặc biệt là
các chủng phải mua từ bên ngoài. Dù sử dụng phương pháp bảo quản nào, bằng phương
tiện gì, ta phải duy trì được hoạt tính vi sinh vật. Phương pháp bảo quản nên đơn giản,
có chi phí hợp lý.
Có hai phương pháp bảo quản giống chính là sử dụng nitơ lỏng và sấy thăng hoa (còn
gọi là đông khô). Tuy nhiên sấy thăng hoa chủ yếu áp dụng cho cơ sở sản xuất giống do
công nghệ và thiết bị phức tạp và đắt. Trong phần này ta đề cập đến phương pháp sử

dụng nitơ lỏng.
Do nhiệt độ sôi của nitơ rất thấp, - 196 ºC, nên các vật liệu dùng để sử dụng trong
bảo quản phải có khả năng chịu được nhiệt độ thấp này trong khoảng thời gian dài mà
tính chất không thay đổi.

25