ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ NHƢ HOA
SỬ DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH
Salmonella typhi

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2011 - 2015

Thái Nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỖ NHƢ HOA
SỬ DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH
Salmonella typhi

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Lớp
Khoa
Khoá học
Giảng viên hƣớng dẫn

: Chính quy
: Công nghệ Sinh học
: K43 - CNSH
: CNSH - CNTP
: 2011 - 2015
: 1. TS. Nguyễn Văn Duy,
2. ThS. Trần Đình Quang

Thái Nguyên, năm 2015


i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS. Nguyễn Văn Duy, ThS. Trần Đình
Quang khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫn
trực tiếp đề tài, các thầy đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài này.

Tôi xin được cảm ơn anh Lã Văn Hiền cán bộ phòng thực hành Sinh
học phân tử và kỹ thuật di truyền khoa CNSH & CNTP cũng các bạn sinh
viên khoa CNSH & CNTP làm nghiên cứu tại phòng.
Tôi xin được cảm ơn TS. Nguyễn Đắc Trung bộ môn cơ sở Đại học Y
Dược Thái Nguyên, cô Phạm Thị Phương giảng viên khoa CNSH & CNTP đã
cung cấp chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn
các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã dạy
dỗ chúng tôi trong suốt thời gian qua, cảm ơn các cán bộ đang công tác tại
phòng thí nghiệm khoa CNSH & CNTP đã tạo môi trường thuận lợi cho tôi
học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ, thầy cô, bạn bè đã ủng hộ về mặt vật
chất cũng như tinh thần giúp tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Đỗ Như Hoa


ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ/thuật ngữ

Nghĩa đầy đủ của từ/thuật ngữ

viết tắt
μl

Microlit (1 μl = 10-3 ml)


CTAB

Cetyl Trimethylammonium Bromide

DNA

ELISA

Deoxyribonucleic acid - Một trong 2 loại nucleic
acid
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phương
pháp huỳnh quang miễn dịch liên kết enzyme)
Polymerase Chain Reaction: phản ứng tổng hợp

PCR

chuỗi polyme (Phản ứng khuếch đại DNA trong
ống nghiệm)

RADP

PFGE

MLPA

Random amplified polymorphic DNA (phân tích
tính đã hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên)
Pulsed-Field Gel Electrophoresis (Điện di trường
xung)
Multiplex ligation Dependent probe amplification

(khuếch đại phụ thuộc mẫu dò)


iii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Phân loại Salmonellavà vật chủ theo danh pháp Kauffmann - White ...... 7
Bảng 2.2. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella ............................................ 9
Bảng 3.1: Các cặp mồi được thiết kế .............................................................. 27
Bảng 4.1: Các thông số kỹ thuật của cặp mồi được thiết kế ........................... 32


iv
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 4.1. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số của các
mẫu Salmonella Typhi ............................................................................. 34
Hình 4.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại bởi cặp mồi
ViaBF-ViaBR và TF-TR ........................................................................ 33
Hình 4.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đơn sử dụng các cặp mồi
riêng rẽ .................................................................................................... 35
Hình 4.4. Kết quả diện di kiểm tra sản phẩm PCR đơn sử dụng các cặp mồi
riêng rẽ ở các điều kiện khác nhau .......................................................... 37
Hình 4.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR .. 39
Hình 4.6. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR ở các nồng độ
DNA khuôn khác nhau ............................................................................ 41
Hình 4.7. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR
với các chủng vi khuẩn kiểm định khác nhau ......................................... 43



v
MỤC LỤC
Phần 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .............................................................................. 2
1.3. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa của đề tài ................................................................................... 3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................ 3
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ....................................................................... 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
2.1 Tình hình nhiễm bệnh do Salmonella Typhi ........................................... 4
2.1.1 Trên thế giới ......................................................................................... 4
2.1.2 Tại Việt Nam ........................................................................................ 5
2.2. Đại cương về Salmonella Typhi ............................................................. 6
2.2.1. Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica
serotype Typhi ............................................................................................... 6
2.2.2. Đặc điểm cấu trúc................................................................................ 8
2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................................... 8
2.2.4 Khả năng biến dị di truyền ................................................................... 9
2.2.5 Tính chất nuôi cấy ................................................................................ 9
2.2.6 Sức đề kháng ...................................................................................... 10
2.2.7 Độc tố ................................................................................................ 10
2.2.8 Bệnh học sốt thương hàn do Salmonella Typhi. ................................ 10
2.3. Các phương pháp phát hiện nhanh Salmonella Typhi ......................... 12
2.3.1 Phát hiện Salmonella Typhi bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống .. 12
2.3.2 Phát hiện Salmonella bằng phương pháp Phage Typing ................... 14
2.3.3. Phương pháp phân tích tính đã hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu
nhiên (Random amplified polymorphic DNA - RAPD) ............................. 15



vi
2.3.4 Phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA)..................................... 16
2.3.5 Phương pháp PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) - Điện di
trường xung ................................................................................................. 17
2.3.6. Phương pháp khuếch đại phụ thuộc mẫu dò (Multiplex ligation Dependent probe amplification - MLPA) ................................................... 18
2.4 Các chỉ thị phân tử phát hiện nhanh Salmonella Typhi ........................ 19
2.5. Tổng quan phương pháp multiplex PCR ............................................. 20
2.5.1 Khái niệm multiplex PCR .................................................................. 20
2.5.2 Ưu và nhược điểm của multiplex PCR .............................................. 22
2.5.3. Ứng dụng của multiplex PCR trong việc phát hiện các vi sinh vật
gây bệnh ...................................................................................................... 23
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ............................................................................................................ 26
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................ 26
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 26
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 26
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành .......................................................... 26
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 26
3.2.2. Thời gian tiến hành ........................................................................... 26
3.3. Hóa chất và thiết bị và vật liệu ............................................................. 26
3.3.1 Hóa chất.............................................................................................. 26
3.3.2 Thiết bị ............................................................................................... 27
3.3.3. Vật liệu .............................................................................................. 27
3.4. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 28
3.5. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 28
3.5.1.Lựa chọn các cặp mồi cho phản ứng multiplex PCR......................... 28


vii

3.5.2. Tách chiết DNA tổng số.................................................................... 28
3.5.4. Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh Salmonella
Typhi ............................................................................................................ 29
3.5.5. Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR ......... 30
3.5.6. Xác định độ đặc hiệu của phản ứngmultiplex PCR .......................... 31
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 32
4.1. Kết quả lựa chọn cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng multiplex PCR phát
hiện nhanh Salmonella Typhi ...................................................................... 32
4.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số của Salmonella Typhi ...................... 34
4.3. Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu trong phản ứng PCR đơn sử
dụng các cặp mồi riêng rẽ ........................................................................... 35
4.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu của phản ứng multiplex PCR .... 37
4.5. Xác định độ nhạy của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh
Salmonella Typhi ......................................................................................... 41
4.6. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh
Salmonella Typhi ......................................................................................... 42
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 44
5.1. Kết luận ................................................................................................ 44
5.2. Kiến nghị .............................................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 46
I. Tài liệu tiếng việt ..................................................................................... 46
II. Tài liệu tiếng anh .................................................................................... 48


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thương hàn là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây bằng đường tiêu

hóa, do trực khuẩn Salmonella Typhi gây nên. Biểu hiện lâm sàng là hội
chứng nhiễm khuẩn nhiễm độc toàn thân, kèm theo tổn thương bệnh lý đặc
hiệu tại đường tiêu hóa. Theo ước tính có 75% trường hợp ở người mắc phải
bệnh do Salmonella là do ăn phải những thức ăn bị nhiễm khuẩn bao gồm thịt
bò, thịt heo, thịt gia cầm và trứng. Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN: 7926-2008
Thịt và sản phẩm của thịt và TCVN 6040: 2007 Vi sinh vật trong thực phẩm
và thức ăn gia súc) yêu cầu lượng Salmonella trong 25 g thực phẩm là 0 [12]
Các bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm đã nổi lên như một vấn đề y tế
công cộng quan trọng ở nhiều nước trong thập kỷ qua.Salmonella Typhi gây
bệnh thương hàn của hơn 16 triệu người trên thế giới, và khoảng 600.000 ca
tử vong mỗi năm [27]. Để hiểu rõ hơn dịch tễ học toàn cầu của salmonellosis
và tỷ lệ các chương trình giám sát quốc gia cho Salmonellanhiễm trùng ở
người, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phối hợp với Trung tâm Kiểm Soát và
Ngừa Bệnh Hoa Kỳ (CDC), WHO phối hợp với Giám sát Thực Phẩm Gây
Bệnh, đã tiến hành một cuộc khảo sát toàn cầu các phòng thí nghiệm y tế
công cộng quốc gia để tìm hiểu về thực hiện liên quan đến Salmonella
serotyping và để xác định Salmonella thường được phân lập hầu hết type
huyết thanh từ con người vào năm 1990 - 1995 [31].
Hiện nay đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện vi
khuẩn Salmonella Typhi, phương pháp nuôi cấy truyền thống luôn luôn bao
gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra làm mất nhiều
thời gian từ 5 đến 7 ngày [12]. Những tiến bộ của các kỹ thuật sinh học phân
tử đã và đang cho phép phát triển những phương pháp kiểm tra rất nhạy và


2

nhanh sự hiện diện của các dòng vi khuẩn mà không cần đến giai đoạn nuôi
cấy tách dòng như: lai DNA, kỹ thuật PCR, ELISA, RADP... nhưng những
phương pháp này hầu hết có chi phí tốn kém, độ chính xác không cao và đòi hỏi

mật độ vi sinh vật gây bệnh đủ lớn.
Phương pháp multiplex PCR đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều
trong thực tế phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh. Theo Nguyễn Tuấn Anh đã
nghiên cứu „„xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện một số vi khuẩn gây
tiêu chảy cấp ở lợn“ đăng tải trên tạp chí sinh học 2014, kết quả thử nghiệm quy
trình bao gồm mẫu từ phân, mô lợn sơ sinh cho thấy tỉ lệ nhiễm Salmonella spp
là 4% [1]. Theo Nargess Safari Foroshani, 2013 “Đồng thời và nhanh chóng phát
hiện Salmonella Typhi, Bacillus anthracis và Yersinia pestis bằng cách sử dụng
mutiplex PCR“ cho kết quả có tính đặc hiệu và khẳng định tính chính xác caocủa
multiplex PCR và mồi trong đó là cặp mồi đặc hiệu của vi khuẩn Yersinia
pestis, Bacillus anthracis, và Salmonella Typhi.
Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên
cứu của Khoa CNSH & CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài: “Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện
nhanh Salmonella Typhi”
1.2. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Salmonella Typhi bằng kỹ
thuật multiplex PCR.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu
- Lựa chọn được các cặp mồi đặc hiệu cho Samonella Typhi.
- Tối ưu được phản ứng mutiplex PCR phát hiện nhanh Samonella
Typhi.
- Xác định được độ nhạy của kỹ thuật multiplex PCR phát hiện
SamonellaTyphi.


3

1.4. Ý nghĩa của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học

- Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Samonella Typhi bằng kỹ
thuật multiplex PCR.
- Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán
nhanh và đặc hiệu Salmonella Typhi.
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
- Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Samonella Typhi góp phần
giám sát sức khỏe cộng đồng thông qua phát hiện sớm vi khuẩn gây bệnh
nguy hiểm này từ các nguồn bệnh phẩm, thực phẩm.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tình hình nhiễm bệnh do Salmonella Typhi
2.1.1 Trên thế giới
Nhiễm khuẩn Salmonella và sốt thương hàn vẫn là một vấn đề y tế
công cộng quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các nước đang
phát triển.Ngộ độc do nhiễm vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện
cách đây hơn 100 năm, Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh cho
người và súc vật truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt (heo, bò, gia cầm…) và
các sản phẩm của thịt, trứng, và các sản phẩm của trứng. Mỗi năm,
Salmonella gây 93.800.000 nhiễm bệnh ở người và 155.000 ca tử vong trên
oàn thế giới.Sự phân bố của các phân loài Salmonella khác nhau thì khác
nhau giữa các nước và khu vực. Mặt khác, WHO ước tính 17 triệu trường hợp
sốt thương hàn hàng năm, Salmonella enterica serovarTyphi (S. Typhi) là sinh
vật chủ yếu phân lập trong nhiều thập kỷ qua [39]. Ở Đan Mạch 1995 có 2911
trường hợp bị nhiễm Salmonella, trong đó có 19% gây bệnh thương hàn do ăn
thức ăn là trứng và các sản phẩm của trứng bị nhiễm vi khuẩn này. Ở Mỹ
hàng năm có khoảng 4000 trường hợp bị bệnh do thực phẩm bị nhiễm

Salmonella[26].Ở Indonesia, tỷ lệ mắc bệnh thương hàn là 1487 nghìn người
mỗi năm.Năm 2001 nghiên cứu của Swanen Burg và cộng sự cho thấy 26%
thịt lợn nhiễm Salmonella. Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là các vi
khuẩn thương hàn, trong đó hàng đầu là Salmonella Typhi.
Ở Đông Nam Á và châu Phi, với ước tính hơn 20 triệu bệnh nhân và
hơn 200.000 trường hợp tử vong do sốt thương hàn và hơn 5 triệu bệnh do sốt
phó thương hàn vào năm 2000[29]
Ở Mỹ hàng năm ước tính có khoảng 1,4 triệu người nhiễm trùng
Salmonella không phải thương hàn đã đưa đến 168000 lượt khám, 15000 lượt


5

điều trị nội trú và 580 ca tử vong. Chi phí ước tính cho mỗi ca nhiễm
Salmonellaở người dao động trong khoảng từ 40 đô la Mỹ đến 4,6 triệu đô la
Mỹ tương ứng với từ các ca đơn giản đến các ca phải nhập viện và tử vong.
Tổng chi phí liên quan đến Salmonella hàng năm ở Mỹ vào khoảng 3 tỷ đô la
[26].Ở Đan Mạch, ước tính chi phí hàng năm cho các bệnh về Salmonellado
ngộ độc thực phẩmlà khoảng 15,5 triệu đôla Mỹ (2001) tương đương với
khoảng 0,009% GDP. Một chương trình khống chế Salmonella đã thực hiện
vài năm ở Đan Mạch với chi phí hàng năm cho chương trình khoảng 14,1
triệu đola Mỹ, ước tính chương trình này đã tiết kiệm 25,5 triệu đôla chi phí
công cộng của Đan Mạch [24].
2.1.2 Tại Việt Nam
Hiện nay, tình trạng ngộ độc thực phẩm, bao gồm ngộ độc do nhiễm
khuẩn đang là vấn đề vô cùng nghiêm trọng ở Việt Nam, trong đó phải kể đến
các vụ ngộ độc do Salmonella gây nên. Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng
Salmonellacó trong các thực phẩm như thịt, gia cầm, trứng, các sản phẩm sữa,
hoa quả, rau và các sản phẩm thực phẩm khác, trong đó gia cầm được xem là
nguồn thực phẩm chính mang mầm bệnh. Thịt gà là một trong những thực

phẩm phổ biến của người Việt Nam, trong đó có tới 621,1 nghìn tấn thịt gia
cầm được sản xuất vào năm 2010[18].
Theo thống kê ở Việt Nam mỗi năm có hàng trăm vụ ngộ độc thực
phẩm, trong đó số vụ do nhiễm vi sinh vật chiếm 33 -49% và chủ yếu
Salmonella Typhi chiếm 70% các vụ ngộ độc [9]. Theo báo cáo của Bộ Y tế
về tình hình mắc bệnh thương hàn thì năm 2012 ghi nhận 617 trường hợp,
không có tử vong. So với cùng kì năm 2011(873 trường hợp mắc, không có tử
vong), số mắc giảm 29,3%. Số mắc giảm dần trong giai đoạn 2007 - 2011 từ
2148 ca xuống còn 873, tử vong duy trì 0 - 2 trường hợp/năm. Trung bình giai
đoạn 5 năm tỷ lệ mắc trên 100.000 dân là 1,806, tỷ lệ chết trên 100.000 dân là


6

0,001 [10]. Khu vực miền Nam chiếm đa số (>60%), tập trung tại các tỉnh An
Giang, Đồng Tháp, TP. Hồ Chí Minh, Kiên Giang. Trong năm 1999 số ca mắc
bệnh thương hàn tại các tỉnh miền Nam tăng khá cao như: Sóc Trăng
(205,57/100.000 dân), Đồng Tháp (108,78/100.000 dân), An Giang
(96,37/100.000 dân) [9,10]
2.2. Đại cƣơng về Salmonella Typhi
2.2.1. Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica
serotype Typhi
Salmonellathuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Họ vi
khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que, oxidase âm và có thể di
động được[15]. Có nhiều phương pháp khác nhau để định danhSalmonellatrong
đó Kaufmann - White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng
rộng dãi từ năm 2003 [4].Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết huyết thanh
với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng
nguyên H.
Kháng nguyên O có bản chất là một polysaccharide nằm ở ngoài cùng

của màng tế bào. Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểu
đơn vị, mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường. Những thay đổi trong
thành phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loại
kháng nguyên O khác nhau. Kháng nguyên O được chia thành các nhóm
kháng huyết thanh khác nhau quy ước bằng số như O9,O2, O4… ( Ban đầu
các nhóm O phổ biến được quy ước bằng chữ cái đến nay vẫn dùng ở một số
nơi). Ví dụ Salmonella Typhimuriumthuộc nhóm O4 hay còn gọi là nhóm B,
Salmonella Typhi thuộc nhóm O9 (nhóm D1), Salmonella paratyphi thuộc
nhóm O2 (nhóm A) [2].
Kháng nguyên H là thành phần tạo thành cấu trúc roi của vi khuẩn.
Kháng nguyên H có bản chất là proteinSalmonella là vi khuẩn đường ruột


7

duy nhất có thể biểu hiện hai loại kháng nguyên H khác nhau được mã hóa
bởi hai gen khác nhau. Tuy nhiên hoạt động của hai gen được phối hợp sao
cho chỉ mộtkháng nguyên H được biểu hiện ở một thời điểm trong một tế
bào vi khuẩn. Hai kháng nguyên H này được sếp vào pha 1 và pha 2. Các
chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểu hiện một kiểu kháng nguyên duy nhất
do sự bất hoạt của gen mã hóa cho kháng nguyên pha 1 hoặc pha 2. Ngoài ra
một số typ huyết thanh “đơn pha” do tự nhiên như Salmonella enteriditis,
Salmonella Typhi.
Theo phương pháp định danh này, Salmonellađược chia thành hai loài:
Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vàoSalmonella
enterica phân loài V). Salmonella entericađược chia thành 6 phân loài quy định
bằng tên hoặc số La Mã, trong đó Salmonella Typhi thuộc phân loài I [5].
Bảng 2.1: Phân loại Salmonellavà vật chủ
theo danh pháp Kauffmann - White
Số lƣợng

Loài và phân loài
Salmonella

tuýp huyết
thanh

Vật chủ

trong mỗi
phân loài

S.enterica subsp.enterica (I)

1454

Động vật máu nóng

S.enterica subsp.salamae (II)

489

Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.arizonae (IIIa)

94

Động vật máu lạnh và môi trường

S.entericasubsp.diarizonae (IIIb)


324

Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.houtenae (IV)

70

Động vật máu lạnh và môi trường

S.bongori (V)

20

Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp.indica (VI)

12

Động vật máu lạnh và môi trường

Tổng cộng: 2463 tuýp huyết thanh


8

Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi (Salmonella Typhi)
là chủng vi khuẩn có tên tuýp huyết thanh (serotype) là Typhi thuộc giống

Salmonella, loài Salmonella enterica và phân loài enterica.
Salmonella Typhi còn được qui ước bằng công thức kháng nguyên: I
9,12(Vi):d:- để mô tả vi khuẩn này thuộc phân loài I có kháng nguyên O là 9,
12 và mang thêm kháng nguyên vỏ Vi, kháng nguyên H pha I là d và không
có kháng nguyên H pha 2.
Phần lớn (59%) tuýp huyết thanh của Salmonella thuộc S. enterica phân
loài I trong đó các nhóm kháng huyết thanh O phổ biến nhất là O2, O4, O9… gây
ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động vật máu nóng [36]
2.2.2. Đặc điểm cấu trúc
Salmonellacó chiều dài 2-4µm và đường kính 0.6µm, cấu trúc gồm 2
màng: màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein mỏng
nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào. Màng trong và màng ngoài đều là các
lớp lipoprotein, đóng vai tò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với tế
bào.Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và ra
khỏi tế bào chất [15].Các loại kháng nguyên [8]:
+ Kháng nguyên O: Hiện nay có 67 yếu tố kháng nguyên O. Xác định
yếu tố kháng ngyên giúp định nhóm và định typ.
+ Kháng nguyên H: Chỉ có ở Salmonellacó lông.
+ Kháng nguyên Vi ( Kháng nguyên K): Là kháng nguyên bề mặt bao
bên ngoài vách tế bào vi khuẩn, dưới dạng một màng mỏng không nhìn thấy ở
kính hiển vi thường. Kháng nguyên Vi chỉ có ở hai typ huyết thanh
Salmonella Typhi và SalmonellaparatyphiC
2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Salmonella Typhi là trực trùng gram âm không tạo bào tử, kị khí tùy ý, di
động được bằng các roi có vành lông rung, phát triển tốt nhất ở 37ºC [15].
Salmonella Typhi là vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người mà không gây bệnh


9


ở bất kì sinh vật nào khác. Nó có khả năng thay đổi để chống lại điều khiện
ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp vì vậy rất khó để loại bỏ tận gốc vi
khuẩn này khỏi chuỗi thức ăn.Salmonella Typhi có trể tồn tại ở thịt chưa được
nấu chin và xâm nhập qua hàng rào cản acid dạ dày để gây bệnh ở người [21].
Bảng 2.2. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella
Phản ứng sinh hóa

Biểu hiện

Maltose

+

Glucose

+

Lactose

-

H2 S

+/-

Gas

+

Lysine decarboxylase


+

Citrate

-

Ure

-

Nitrate

+

Indol

-

Voges Proskauer

-

Chú thích: (-) âm tính, (+) dương tính
2.2.4 Khả năng biến dị di truyền
Vi khuẩn Salmonela có khả năng biến dị khuẩn lạc từ dạng S sang dạng
R và ngược lại. Bởi vậy, chúng có thể biến đổi từ dạng gây bệnh sang không
gây bệnh nhất là khi nuôi cấy lâu ngày trong ống giống [20].
2.2.5 Tính chất nuôi cấy[17]
Là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, phát triển dễ dàng trên các môi trường

nuôi thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37ºC, có thể phát triển được từ 6 42ºC, pH thích hợp là 7,6 phát triển được ở pH từ 6 - 9.
- Trên môi trường lỏng
+ Sau 5 - 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đã làm đục nhẹ.
+ Sau 18 giờ nuôi cấy môi trường đục đều


10

- Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, thường
không màu hoặc xám.
- Trên môi trường phân lập có tính ức chế chọn lọc như SS, Istrati…
khuẩn lạc có màu cùng màu môi trường.
2.2.6 Sức đề kháng
Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50ºC trong 1 giờ, 70ºC trong 15 phút,
100ºC trong 5 phút. Chúng có thể sống sót trong môt trường thạch ở nhiệt độ 10ºC trong 115 ngày, sống từ 4-8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở
nhiệt độ 6 - 12ºC [6]
Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng
Salmonellatồn tại khoảng 2 - 3 tháng, trong nước tự nhiên chúng có thể sống
1 - 2 tháng. Ánh mặt trời chiếu thẳng có thể tiêu diệt vi khuẩn trong nước sau
5 giờ, trong nước đục sau 9 giờ. Salmonellabị tiêu diệt bởi clorua thủy ngân
1% trong 5 phút, formon 0,5%, acid fenic 3% trong 15 - 20 phút, cloramin
1%, phenol 5% [20].
2.2.7 Độc tố [17]
Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonellarất mạnh, tiêm cho chuột lang
hoặc chuột nhắt liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết. Ruột non xung
huyết, mảnh Payer phù nề, đôi khi hoại tử.Nội độc tố có vai trò quyết định
trong tính chất gây bệnh của Salmonella.
Ngoại độc tố: Ngoại tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi
cấy kỵ khí, ngoại độc tố có thể điều chế thành giải độc tố.
2.2.8 Bệnh học sốt thương hàn do Salmonella Typhi.

2.2.8.1 Nguồn lây bệnh và con đường truyền bệnh
Bệnh thương hàn là bệnh truyền nhiễm cấp tính của người do vi khuẩn
Salmonella Typhi gây ra, vi khuẩn này thường xâm nhập vào cơ thể bằng
đường miệng khi ăn thức ăn hay uống nước nhiễm bẩn. Nguồn nước sinh hoạt


11

bị ô nhiễm (thực phẩm không đảm bảo vệ sinh) là nguyên nhân chính gây ra
bệnh thương hàn [14].
Vi khuẩn thương hàn lây qua đường tiêu hóa. Đa số các trường hợp
mắc bệnh là do ăn uống thực phẩm, nước bị nhiễm khuẩn và không được nấu
chín. Những yếu tố nguy cơ phải kể đến nguồn nước nhiễm bẩn, kem, thực
phẩm và nước uống đường phố, rau quả được tưới bằng nước thải bẩn hoặc
được rửa bằng nước nhiễm khuẩn như nước sông, nước ao hồ, cống rãnh. Đo
lien quan đến những yếu tố điều kiện sống nên bệnh thường lưu hành ở những
nơi có mật độ dân số cao cùng với tập quán sinh hoạt kém vệ sinh[14].
2.2.8.2 Khả năng gây bệnh và triệu chứng lâm sàng
Salmonellatheo thức ăn, nước uống xâm nhập vào đường tiêu hóa sau
đó vào hệ thống bạch huyết rồi vào máu. Từ máu trực khuẩn thương hàn đến
các cơ quan bạch huyết ruột (như mảng payer).Chúng có thể gây hoại tử chảy
máu và thủng ruột.Từ hệ thống bạch huyết ruột, các trực khuẩn thương hàn lại
có thể xâm nhập vào máu rồi đến mọi cơ quan.Trong máu và hệ thống bạch
huyết, trực khuẩn thương hàn bị các tế bào đơn nhân to tiêu diệt làm giải
phóng các nội độc tố. Nội độc tố tác động lên hệ thần kinh gây sốt kéo dài,
liên tục, li bì, nhịp tim chậm (mạch và nhiệt độ phân ly) và huyết áp giảm.
Đây là dấu hiệu đặc trưng của bệnh thương hàn ở thời kì chưa có kháng sinh
đặc hiệu chữa thương hàn [6].
2.2.8.3 Biện pháp phòng bệnh sốt thương hàn
Bệnh chủ yếu lây qua đường ăn uống thức ăn hoặc nước bị nhiễm

khuẩn nên biện pháp quan tọng hang đầu là tạo điều kiện vệ sinh an toàn
thực phẩm, cải thiện hệ thống xử lý nước thải và nguồn cung cấp nước. Ở
các nước phát triển, bệnh chủ yếu xảy ra ở các khác du lịch trở về từ các
nước có dịch nên khách du lịch khi đến những vùng này cần chú ý đến vấn
đề an toàn thực phẩm.


12

Do Salmonella Typhi chỉ gây bệnh ở người nên guồn gốc lây lan bệnh
luôn liên quan đến những người mắc sốt thương hàn hoặc mang mầm bệnh
mãn tính. Những người chế biến thực phẩm mang mần bệnh mãn tính có thể
là nguyên nhân của những đợt dịch sốt thương hàn nghiêm trọng. Những
người mang Salmonella Typhi mãn tính có thể làm lan tràn bệnh dịch nếu họ
gây nhiễm nguồn cung cấp nước. Vì vậy, việc kiểm soát và chữa bệnh cho
người mang Salmonella Typhi mãn tính là hết sức quan trọng trong công tác
phòng chống dịch.
2.2.8.4 Biện pháp điều trị sốt thương hàn
- Phòng bệnh
+ Phòng bệnh không đặc hiệu: Cách ly bệnh nhân, xử lý chất thải đường
tiêu hóa. Ăn chin uống sôi, rửa tay trước khi ăn và sau khi đi ngoài.
+ Phòng bệnh đặc hiệu: Vaccin tiêm chứa kháng nguyên Vi của vi
khuẩn phòng thương hàn tiêm 1 liều 25µg có giá trị bảo vệ 70% trong vòng 1
năm. Hiện đang nghiên cứu vaccin uống từ khuẩn sống giảm độc [2]
- Điều trị
Hiện nay vi khuẩn thương hàn kháng lại một số kháng sinh nên làm
kháng sinh đồ để chọn kháng sinh điều trị là cần thiết. Nếu không có điều
kiện làm kháng sinh đồ thì kháng sinh kinh điển điều trị thương hàn là
Chloramphenicol ampicillin [19].
2.3. Các phƣơng pháp phát hiện nhanhSalmonella Typhi

2.3.1 Phát hiện Salmonella Typhi bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống
Bao gồm có 4 giai đoạn:
Giai đoạn tiền tăng sinh (pre-ernichment): Đây là khâu quan trọng
không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm
không phải là mẫu bệnh phẩm. người ta thường sử dụng môi trường tiền
tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc


13

hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều sinh
vật hiện diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo
quản thực phẩm[22].
Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment): Giai đoạn này
làm tăng mật độ Salmonella so với các vi khuẩn khác bằng cách ức chế hoặc
ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi cho
việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập.
Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonellathường được dung là
Rappapor Vasilialis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT),
Selenete Cystein Broth (SC)… Thông thường môi trường TT được dùng để
phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các
mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại
thực phẩm khác[42].
Giai đoạn phân lập (isolation): Đây là bước tách biệt Salmonella
trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng. Một số môi trường phân lập
như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar (BSA),
Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen Entric
Agar (HEP). Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái
khuẩn lạc của Salmonellatrên từng môi trường khác nhau.
Trên các môi trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu

khuẩn lạc đặc trưng khác nhau. Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng,
tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonellacó khả
năng sinh H2S, trừ Salmonella Typhi thì khuẩn lạc trong suốt và không có
tâm đen[5]
Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa: Đây là bước xác nhận các
dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonellatrên môi trường phân lập bằng các thử
nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng. Các biểu hiện sinh hóa của


14

Salmonellanhư sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase
(+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), manitol (+), sorbitol (+). Nếu các
biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các thử
nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá.Vi khuẩn sau
khi hồi phục được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa nhằm
xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella[21].
- Ưu điểm:
+ Chính xác, là phương pháp tiêu chuẩn được áp dụng rộng rãi
+ Chi phí thấp
- Nhược điểm:
+ Tốn nhiều thời gian và công sức lao động cho các công việc: chuẩn bị
môi trường, dụng cụ, thực hiện quy trình… Với thời gian này đã không đáp
ứng yêu cầu cho kết quả nhanh trong việc phục vụ các chương trình giám sát
chất lượng thực phẩm trên dây truyền sản xuất như hiện nay hoặc gây thiệt
hại cho các nhà quản lý doanh nghiệp vì các chi phí lưu kho để chờ kết quả
phân tích [13]
2.3.2 Phát hiện Salmonella bằng phương pháp Phage Typing
Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại phage chỉ ly giải một
chủng vi khuẩn mà không thể ly giải một chủng vi khuẩn khác trong cùng một

loài. Do đó các chủng của một loài vi khuẩn có thể được phân biệt dựa trên tính
nhạy khác nhau của chúng với một hỗn hợp nhiều loại phage khác nhau [26].
- Ưu điểm:
+ Có giá thành rẻ.
+ Không tốn công lao động.
- Nhược điểm:
+ Nặng về mặt kỹ thuật và chỉ được thực hiện ở một số phòng thí
nghiệm đạt chuẩn.


15

+ Hiệu quả phân biệt của phương pháp còn hạn chế.
+ Nhiều chủng Salmonella Typhi không thể xác định được kiểu Vi do
chúng kháng với hoạt động của các Vi-phage hoặc phản ứng chéo với nhiều
loại Vi-phage khác nhau [32].
Trong nhiều năm qua phương pháp Phage typing đã được nghiên cứu
và sử dụng để phát hiện Salmonella. Điển hình như Rabsch W( 2007) đã mô
tả phương pháp Phage typing nhằm phát hiện Salmonella Typhimurium.
2.3.3. Phương pháp phân tích tính đã hình các đoạn DNA khuếch đại ngẫu
nhiên (Random amplified polymorphic DNA - RAPD)
Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuếch đại ngẫu nhiên, kỹ
thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và McClelland. Được sử
dụng lần đầu tiên bởi Williams và cộng sự (1990) để kiểm tra mẫu DNA của
con người chưa rõ danh tính [25]. Random amplified polymorphic DNA (tính
đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là phương pháp phân biệt dựa trên
sự khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA trên nhiễm sắc thể. Dùng nghiên cứu
sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau [22]
Sinh vật cùng loài sẽ có kiểu gen hoàn toàn giống nhau, khuếch đại các
đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để

chạy PCR. Sinh vật khác nhau ít nhiều sẽ khác nhau về kiểu gen thì một số mồi
ngẫu nhiên nào đó các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước khác nhau.
+ Ưu điểm:
+ Phát hiện nhanh tính đa dạng di truyền
+ Thao tác đơn giản không đòi hỏi kỹ thuật cao
+ Tương đối rẻ tiền hơn so với các phương pháp RFLP, SSR
+ Không dùng đồng vị phóng xạ nên tránh được độc hại cho người thao tác.
+ Thường được áp dụng để phân loại Salmonella Typhi và cho hiệu quả
phân biệt khá cao [4]


16

- Nhược điểm:
+ Có sự xuất hiện các băng tính trội điều đó sẽ không phân biệt được cá
thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử
+ Tính lặp lại không cao do mồi là ngẫu nhiên và phụ thuộc vào điều
kiện phản ứng PCR, trở ngại trong việc giải thích các băng có cùng tốc độ di
chuyển Việc sử dụng mồi, các loại enzyme polymerase khác nhau, quy trình
chuẩn bị DNA khác nhau hay thực hiện ở các phòng thí nghiệm khác nhau
đều có thể ảnh hưởng đến kết quả [4].
Các công trình nghiên cứu trên thế giới ứng dụng kỹ thuật RADP đã
được công bố như Quintaes B. R., Leal N. C., Reis E. M. F. đã tối ưu hóa
phản ứng RADP đặc trưng cho Salmonella Typhi, để đảm bảo khả năng phân
biệt của kỹ thuật này các nhà khoa học đã sử dụng nồng độ khác nhau của
DNA khuôn, mồi, MgCl2 và Taq để kiểm tra 8 chủng Salmonella Typhi được
phân lập ở các khu vựa khác nhau Brazil.
2.3.4 Phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA)
Nguyên tắc: phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung

là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữ kháng nguyên và kháng thể, trong đó
kháng thể được gắn vào một enzyme [11].
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng
nguyên kháng thể và chất tạo màu thực hiện qua hai bước:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải
phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm
thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
Kỹ thuật ELISA đã được nghiên cứu rộng rãi tại Việt Nam và trên thế
giới. Điển hình nhưBringmon R. L và cộng sự (1995) sử dụng các kháng thể
nguyên roi hay còn gọi là kháng nguyên H. Nguyễn Trí Nhân và cộng sự (