i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
---------------------------

HÀ THỊ UYÊN

XÁC ĐỊNH TẠP NHIỄM Salmonella TRONG THỊT LỢN TẠI THÀNH
PHỐ THÁI NGUYÊN BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011 - 2015

Giảng viên hƣớng dẫn : 1. TS. Dƣơng Văn Cƣờng
2. ThS. Ma Thị Trang

Thái Nguyên – năm 2015


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận
tốt nghiệp này với sự nỗ lực của cá nhân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn,
giúp đỡ, chỉ bảo động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn
thành luận văn:
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo: TS. Dƣơng Văn
Cƣờng giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm –
Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, ThS. Ma Thị Trang cán bộ tại
Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Gen - Viện Khoa học Sự sống Đại học Thái Nguyên người đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình
hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống Đại Học Thái Nguyên, ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công
nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các cán bộ, anh
chị làm việc tại Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Gen- Viện Khoa
học Sự sống - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập
và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã
luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình
học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, Ngày 02 tháng 6 năm 2015
Sinh viên

Hà Thị Uyên



iii

DANH MỤC CÁC TỪ, CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Từ, thuật ngữ đầy đủ

BPW

: Buffered Peptone Water

CIAA

: 24 Chloroform : 1 Isoamylacohol

CDC

: Centers for Disease Control and Prevention

Cs

: Cộng sự

DNA

: Deoxynucleotideacid


dNTP

: Deoxyribonucleic Acid

DCA

: Deoxycholate citrate agar

E.coli

: Escherichia coli

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Xét
nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

EU

: European Union - Liên minh châu Âu

FAO

: Food and Agriculture Organization - Tổ chức
Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

PCR

: Polymerase Chain Rection - Phản ứng chuỗi trùng
hợp


TE

: Tris EDTA

TCVN

: Tiêu Chuẩn Việt Nam

TT

: Tetrathionate Mueler Kauffman Broth

v/p

: Vòng/ phút

XLD

: Xylose Lysine Desoxycholate Agar

WHO

: Word Health Organization – Tổ chức Y tế Thế giới


ii

DANH MỤC BẢNG


Bảng 2.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo phân loại KauffmannWhite. ................................................................................................................ 7
Bảng 2.2: Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella ................................. 9
Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. .................................. 27
Bảng 3.2: Danh mục các thiết bị ..................................................................... 29
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR............................................................. 33
Bảng 3.4: Thành phần phản ứng PCR đa mồi. ............................................... 34
Bảng 4.1: So sánh hai quy trình phát hiện salmonella trong thịt lợn.............. 36
Bảng 4.2: Kết quả Sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella spp, S. enterica trong
thịt lợn ở địa bàn thành phố Thái Nguyên. ..................................................... 43


iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với một cặp mồi. ..................... 34
Hình 3.2: Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi ............................................ 35
Hình 4.1: Kết quả thử nghiệm hai quy trình phát hiện Salmonella trên thịt lợn. ... 37
Hình 4.2: Phát hiện Salmonella spp và S. enterica bằng PCR đa mồi .......... 39
Hình 4.3a: Kết quả phát hiện Salmonella trên thịt lợn tại chợ Sư phạm. ...... 40
Hình 4.3b: Kết quả phát hiện Salmonella trên thịt lợn tại chợ Túc Duyên ... 41
Hình 4.3c. Kết quả phát hiện Salmonella trên thịt lợn tại chợ Trung tâm ............ 42


v

MỤC LỤC
Trang
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1
1.2.Mục đích nghiên cứu................................................................................... 2

1.3.Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................... 2
1.4.Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài ........................................................ 3
1.4.1.Ý nghĩa khoa học ..................................................................................... 3
1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................... 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4
2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella. ................................ 4
2.1.1. Trên thế giới ............................................................................................ 4
2.1.2. Ở Việt nam .............................................................................................. 4
2.2. Tổng quan về Salmonella ........................................................................... 5
2.2.1. Lịch sử phát hiện .................................................................................... 5
2.2.2. Phân loại .................................................................................................. 6
2.2.3. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 7
2.2.4. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa................................................ 8
2.2.5. Sức đề kháng của vi khuẩn...................................................................... 9
2.2.6.Cấu trúc kháng nguyên và yếu tố độc lực .............................................. 10
2.2.7. Đặc điểm gây bệnh Salmonella ............................................................. 12
2.3. Các phương pháp phát hiện Salmonella .................................................. 15
2.3.1. Phát hiện Salmonella bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống.......... 15
2.3.2. Phát hiện Salmonella bằng phương pháp hiện đại ................................ 18
2.3.3. Tổng quan phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) ................. 21


vi

PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 26
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 26
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 26
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 26
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 26

3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 26
3.2.2. Thời gian thực hiện nghiên cứu ............................................................ 26
3.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu. .................................................... 26
3.3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 26
3.3.2. Hóa chất................................................................................................. 27
3.3.3. Thiết bị .................................................................................................. 29
3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 29
3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 30
3.5.1. Phương pháp thu mẫu ........................................................................... 30
3.5.2. So sánh hai quy trình phát hiện Salmonella trên thịt lợn. ..................... 30
3.5.3. Phản ứng PCR ....................................................................................... 33
3.5.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR ...................................... 35
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 36
4.1. Kết quả thử nghiệm hai quy trình phát hiện Salmonella trên thịt lợn. ........... 36
4.2. Sử dụng phối hợp hai cặp mồi invA và spvC trong PCR đa mồi. ........... 38
4.3. Kết quả phát hiện Salmonella nhiễm trên thịt lợn tại khu vực Thành Phố
Thái Nguyên. ................................................................................................... 40
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................... 47
5.1. Kết luận .................................................................................................... 47
5.2. Kiến nghị ................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm lớn của
nhiều quốc gia. Thực phẩm không đảm bảo yêu cầu sẽ ảnh hưởng trực tiếp

đến sức khoẻ và tính mạng của người tiêu dùng và chất lượng cuộc sống của
nhân dân cùng với sự phát triển kinh tế xã hội [4].
Theo số liệu thống kê của cục an toàn vệ sinh thực phẩm mỗi năm
nước ta có khoảng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn
nhân và 100 - 200 ca tử vong. Riêng tỉnh Thái nguyên, năm 2014 tỷ lệ mắc
4,7/100.000 dân, tháng 4/2014 có 04 vụ ngộ độc thực phẩm. Phần lớn các
vụ ngộ độc xảy ra với quy mô nhiều người mắc, nguyên nhân chủ yếu gây
ngộ độc là do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, chiếm tỷ lệ 43,2% [18]. Đặc
biệt vi khuẩn Salmonella là thủ phạm gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm.
Theo thống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm vụ ngộ độc xảy ra vào
ngày 4/10/2013 tại công ty MTV Wondo Vina (xã Long Bình Điền, huyện
Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang) do thịt viên bị nhiễm Salmonella làm hơn 400
công nhân mắc và phải nhập viện. Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra ngày
10/7/2013 khiến 232 công nhân của công ty Foremart Việt Nam thuộc tỉnh
Hưng Yên bị ngộ độc. Theo WHO/ FAO ngộ độc thực phẩm xảy ra ở nhiều
nơi ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và kinh tế.
Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm vẫn chủ yếu sử dụng
phương pháp nuôi cấy truyền thống. Phương pháp này bao gồm nhiều công
đoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra hoá sinh tốn nhiều thời gian 5
đến 7 ngày (ISO 6579: 2003), tốn nhiều công sức, gây khó khăn trong việc
phân tích nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên
nhân gây ngộ độc được nghi ngờ do Salmonella gây ra. Mặt khác quy trình


2

phân tích này không cho phép phân biệt các loài hay phân loài Salmonella
với nhau. Sự phát hiện chậm các vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm là
một trong những nguyên nhân làm tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan
trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khoẻ, tính mạng con người, gây thiệt

hại về kinh tế.
Những tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các kỹ thuật sinh học phân tử đã
cho phép phát triển phương pháp kiểm tra rất nhạy và nhanh sự hiện diện
của các dòng vi khuẩn mà không cần đến giai đoạn nuôi cấy dài [5]. Kỹ
thuật phản ứng chuỗi polymerase chain reaction (PCR) là một kỹ thuật đơn
giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian chẩn đoán ngắn và không yêu
cầu thiết bị phức tạp. Dựa vào viêc sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại
các đoạn DNA đặc hiệu cho từng chủng, kỹ thuật PCR cho phép phát hiện
đến mức độ chủng vi khuẩn gây bệnh [11]. Do đó, việc ứng dụng kỹ thuật
PCR trong phát hiện nhanh Salmonella là một đề tài có ý nghĩa thiết thực,
góp phần vào việc kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm do Salmonella gây
nên, đảm bảo sức khỏe cộng đồng.
Xuất phát từ thực tiễn đời sống, để đánh giá tình trạng nhiễm vi
khuẩn Salmonella trong thịt lợn tại các khu chợ xung quanh Thành Phố
Thái Nguyên tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xác định tạp nhiễm
Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái Nguyên bằng kĩ thuật
sinh học phân tử”
1.2.Mục đích nghiên cứu
Xác định tạp nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại Thành phố Thái
Nguyên bằng kỹ thuật PCR.
1.3.Mục tiêu nghiên cứu
Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Salmonella trong mẫu thịt bằng kỹ
thuật PCR.


3

Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp và S.enterica trong thịt lợn ở khu
vực thành phố Thái Nguyên.
1.4.Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài

1.4.1.Ý nghĩa khoa học
Hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh Salmonella trong thịt lợn.
Giúp sinh viên rèn luyện các kỹ năng thí nghiệm, nghiên cứu, tác phong
làm việc.
1.4.2.Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán nhanh
Salmonella tạp nhiễm trong thịt lợn.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella.
2.1.1. Trên thế giới
Ngộ độc thực phẩm là mối quan tâm đặc biệt ở mỗi quốc gia và là
mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. Mỗi năm thế giới đã ghi
nhận hàng triệu ca bệnh trên người và bệnh đã gây ra hàng nghìn ca tử vong.
Ngộ độc do nhiễm vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện cách
đây hơn 100 năm, Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh cho
người và súc vật truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt (lợn, bò, gia cầm…)
và các sản phẩm của thịt, trứng và các sản phẩm của trứng [21].
Ở Mỹ theo thống kê của trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch
bệnh CDC (Centers for Disease Control and Prevention) năm 2007 cả nước
Mỹ có 17,883 ca ngộ độc thực phẩm, trong số đó có 38% bệnh nhân nhiễm
Salmonella nhưng thực tế chỉ có khoảng 1 - 5% là được thống kê và có
khoảng 400 trường hợp tử vong do Salmonella, làm thiệt hại hơn 50 triệu
USD nên vi khuẩn này được liệt vào loại gây ngộ độc nguy hiểm nhất tại
Mỹ. Trong số ca nhiễm khuẩn Salmonella, phần lớn bệnh nhân bị nhiễm S.
enteritidis (24,7%) và S. typhimurium (23,5%). Cơ quan An toàn Thực phẩm

Châu Âu và Trung tâm phòng chống kiểm soát bệnh dịch Châu Âu đã thống
kê năm 2009 khu vực EU có tổng 108.614 người bị nhiễm Salmonella.
2.1.2. Ở Việt nam
Tại Việt Nam trong những năm gần đây tình hình ngộ độc thực phẩm
cũng gia tăng trở thành vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe cộng đồng và là
mối quan tâm hàng đầu hiện nay của các nhà dịch tễ, vi sinh và lâm sàng
trong cả nước. Theo thống kê ở Việt Nam mỗi năm có hàng trăm vụ ngộ độc
thực phẩm, trong đó số vụ do nhiễm vi sinh vật chiếm 33 - 49% và chủ yếu


5

là Salmonella chiếm 70% các vụ ngộ độc [1]. Theo báo cáo của Bộ Nông
nghiệp và phát triển nông thôn năm 2009 tại Hà Nội trong số 72 mẫu thịt lợn
được kiểm tra có 3 mẫu nhiễm Salmonella (chiếm 4,1%) và tại TP Hồ Chí
Minh, trong số 69 mẫu thịt lợn được kiểm tra có 4 mẫu nhiễm Salmonella
(chiếm 5,8%).
Tại Thành phố Hồ Chí Minh, Cục Quản lý chất lượng nông lâm sản
và thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) thực hiện kiểm tra
213 mẫu thịt lợn, 213 mẫu thịt gà và 213 mẫu cá biển vào tháng 5/2013 –
4/2014 tại chợ đầu mối Bình Điền, Hóc Môn,Thủ Đức trong đó thịt lợn có
71/213 mẫu kiểm nghiệm phát hiện nhiễm Salmonella (chiếm 30,74%) ,
thịt gà phát hiện Salmonella trong 105/231 mẫu kiểm nghiệm (chiếm
45,45%) và cá biển 13/ 213 mẫu kiểm nghiệm có nhiễm Salmonella (chiếm
6,103%) [18].
Thống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm vụ ngộ độc xảy ra vào
ngày 4/10/2013 tại công ty MTV Wondo Vina (xã Long Bình Điền, huyện
Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang) do thịt viên bị nhiễm Salmonella làm hơn 400
công nhân mắc và phải nhập viện. Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ra
ngày 10/7/2013 khiến 232 công nhân của công ty Foremart Việt Nam

thuộc tỉnh Hưng Yên bị ngộ độc. Nhìn chung tỷ lệ nhiễm Salmonella cao,
các vụ ngộ độc với quy mô nhiều người mắc thường xảy ra ở các bếp ăn
tập thể, các xí nghiệp [18].
2.2. Tổng quan về Salmonella
2.2.1. Lịch sử phát hiện
Năm 1885 Slamon và Smith (Mỹ) tìm được Salmonella từ lợn mắc
bệnh dịch tả và gọi tên Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella.
Nhưng sau đó Schweninittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là


6

do một loại virus gây nên và đã xác định S. choleraesui là vi khuẩn gây bệnh
thương hàn [13].
Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách
người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là S. enteritidis. Vi khuẩn này được gọi
nhiều tên khác như: Bacterium enteritidis, Bacillus gartner [2].
Năm 1889 Klein phân lập được S. gallinarum và Rettger cũng đã phân
lập được S. pullorum năm 1990. Trước đây người ta cho rằng đây là hai
loại vi khuẩn gây ra hai bệnh khác nhau nên đã gọi chung là bệnh phó
thương hàn gà (typhus avium) và căn bệnh có tên chung là S. gallinarum
– pullorum [1].
Năm 1896 C. Archard và Rbensauded đã phân lập được vi khuẩn S.
paratyphi equi và S. paratyphi bacillus. Ngày nay vi khuẩn này được gọi tên
là S. paratyphi B và đến năm 1898, S. paratyphi A đã tìm được do N. Guyn
và H. Keyser [13].
2.2.2. Phân loại
Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Họ vi
khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que và có thể di động được
[6]. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân loại Salmonella trong đó

Kauffmann - White là phương pháp định danh được công nhận và sử dụng
rộng rãi từ năm 2003 [24]. Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của huyết
thanh với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và
kháng nguyên H và kháng nguyên bề mặt Vi.
Theo phương pháp định danh Kauffmann – White Salmonella được
chia thành hai loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây
được xếp vào Salmonella enterica phân loài V). Salmonella enterica được
chia thành 6 phân loài qui định bằng tên hoặc số La Mã.


7

Bảng 2.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo phân loại
Kauffmann- White.
Loài và phân loài Salmonella

Số kiểu
huyết thanh

Vật chủ

S. enterica subsp. enterica (I)

1454

Động vật máu nóng

S. enterica subsp. salamae (II)

489


Động vật máu lạnh và môi trường

S. enterica subsp. arizonae (IIIa)

94

Động vật máu lạnh và môi trường

S.enterica subsp. diarizonae (IIIb)

324

Động vật máu lạnh và môi trường

S. enterica subsp.houtenae (IV)

70

Động vật máu lạnh và môi trường

S. enterica subsp. indica (VI)

12

Động vật máu lạnh và môi trường

S. bongori

20


Động vật máu lạnh và môi trường

Tổng

2463

Samonella enterica phân loài I chiếm 59% (1454/2463) trong tổng
số kiểu huyết thanh của Salmonella. Phân loài này gây ra khoảng 99%
sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và động vật máu nóng, trong đó
S. typhimurium và S. enteritidis là có hai kiểu huyết thanh quan trọng
gây bệnh cho người [19, 40]. Thống kê từ 1990 đến 1995, S. enteritidis,
S. typhimurium chiếm khoảng 70% tổng số Salmonella được phân lập
trên toàn thế giới [26].
2.2.3. Đặc điểm hình thái
Salmonella là trực khuẩn Gram âm, có kích thước 0,7 - 1,5 x 2-5µm,
sống kị khí tùy nghi, không có nha bào, có khả năng di động nhờ lông mao,
có khoảng 7 đến 12 lông mao xung quanh thân (trừ S. gallinarum và S.


8

pullorum gây bệnh cho gia cầm). Salmonella dễ dàng nuôi cấy ở 370 C trên
môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển thành các khuẩn lạc có
đường kính 2 - 4 mm, trơn, sáng và đồng nhất [2].
2.2.4. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa
Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường.
Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể mọc
trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate
citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate) trong đó môi trường XLD

ít chất ức chế hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella. Khuẩn lạc
đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD là tròn, lồi, trong suốt, có
tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh
chuyển sang màu đỏ. Salmonella không lên men lactose, lên men đường
glucose và sinh hơi. Thường không lên men sucrose, salicin và inositol, sử
dụng được citrate ở môi trường simmons [6]. Các tính chất hóa sinh cơ bản
của Salmonella được thể hiện ở bảng 2.2.


9

Bảng 2.2: Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella
Tính chất

Kết quả

Khử Nitrate

(+)

Lên men Glucid

(+)

Lên men Glucose sinh khí

(+)

Sử dụng Citrate


(+)

Sinh H2S

(+)

Sử dụng Lactose

(-)

Sử dụng saccharose

(-)

Ghi chú

Kèm theo sự tổng hợp acid
Trừ một số chủng thuộc loài
S.typhi A và S. gallinarum
Trừ S. typhi và S. paratyphi A
Trừ một số chủng thuộc loài S.
paratyphi và S. choleraesuis
Trừ S.anizonae

Hệ enzyme
+ Catalase

(+)

+ Beta- galactosidase


(-)

+ Urease

(-)

+ Decarboxylase Lysine (LDC)

(+)

+ Arginine dihydrolase (ADH)

(-)

+Desaminase Phenylalanice

(-)

+ Tryptophane

(-)

+Tetrathionate reductase

(+)

Trừ một số loài phụ

Trừ S.paratyphi A


Các tính chất
+ Mannitol

(+)

+ Indole

(-)

+ Acetylmethylcarbinol (VP)

(-)

(+): Dương tính; (-): Âm tính
2.2.5. Sức đề kháng của vi khuẩn
Nhiệt độ phát triển của Salmonella từ 15 - 450C, nhiệt độ thích hợp
nhất là 370C, pH thích hợp ở 7,6 nhưng nó có thể phát triển pH từ 6 - 9.


10

Với pH lớn hơn 9 hoặc nhỏ hơn 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt, khả năng
chịu nhiệt của vi khuẩn kém: Ở 500C trong 1 giờ, ở 700C trong 15 phút và
1000C trong 5 phút. Ở nồng độ muối 6 - 8% vi khuẩn phát triển chậm và ở
nồng độ muối 8 - 19% thì sự phát triển của vi khuẩn bị ngừng lại [6].
Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng
Salmonella tồn tại khoảng 2 - 3 tháng, trong nước tự nhiên Salmonella có
thể sống 1 - 2 tháng. Salmonella bị tiêu diệt bởi thủy ngân 1%, fromol
0,5%, acid fenic 3 % trong 15 - 20 phút [1].

2.2.6.Cấu trúc kháng nguyên và yếu tố độc lực
*Cấu trúc kháng nguyên [3] : Salmonella có ba loại kháng nguyên,
đó là những chất khi xuất hiện trong cơ thể thì tạo ra kích thích miễn dịch và
kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của kích thích đó, gồm: Kháng nguyên
thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K. Vi khuẩn thương hàn
(S. typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho
vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu.
Kháng nguyên vách tế bào ( kháng nguyên thân O):
+ Thành phần cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp.
Trong cùng là lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và
tới lớp màng (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm
lipoprotein và lipopolysaccharide.
+ Bao bên trong lớp peptidoglycan là lớp phospholipid A và B (quyết
định độc tố của nội độc tố), sau đó là hai lớp polysaccharide (LPS). Tính đặc
hiệu của kháng nguyên O và LPS là một, nhưng tính miễn dịch thì khác nhau:
kháng nguyên O ngoài LPS bao gồm cả lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn
dịch nó mạnh hơn LPS. Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng
phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolusaccharide
dày khoảng 8 - 10 nm gồm 3 thành phần: Lipid A, polysaccharide lõi, kháng


11

nguyên O. Màng ngoài có thêm các protein: Protein cơ chất: Porin ở vi khuẩn
còn gọi protein lỗ xuyên màng với chức năng cho phép một số loại phân tử đi
qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ. Protein màng
ngoài: Chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa qua màng
ngoài. Lipoprotein: Đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong
với lớp màng ngoài [3].
Kháng nguyên lông (kháng nguyên H):

+ Kháng nguyên H (KN - H): Chỉ có ở Salmonella có lông. Hầu hết
Salmonella đều có lông chỉ trừ S. galilarum, S. pulorum gây bệnh cho gia
cầm. KN- H là một loại kháng nguyên có bản chất là protein, kém bề hơn
kháng nguyên O. KN - H rất dễ bị phá hủy ở nhiệt độ cao hoặc xử lý bằng
cồn, acid yếu.
+ Kháng nguyên H chia làm 2 phase:
Phase 1: Có tính chất đặc hiệu gồm 28 loại kháng nguyên lông được
biểu thị bằng chữ số latinh thường a, b, c…
Phase 2: Không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với
các loại khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở E. coli. Pha 2 gồm có 6
loại được biểu thị bằng chữ số Ả Rập 1 - 6 hay chữ số La Tinh e, n, x [3].
Kháng nguyên Vi:
Có ở 2 type huyết thanh S. typhi và S. paratyphi. Kháng nguyên Viangtigen được Felix và các cộng sự phát hiện năm 1935. Kháng nguyên Vi
gây hiện tượng ngưng kết chậm và xuất hiện các hạt vỏ, kháng nguyên Vi là
kháng nguyên vỏ bao bọc bên ngoài kháng nguyên O, kháng nguyên Vi
không tham gia vào quá trình gây bệnh [2].
* Yếu tố độc lực
Salmonella sản sinh hai loại độc tố : Ngoại độc tố và ngoại độc tố [2].


12

Nội độc Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn
loét, độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật.
Ngoại độc tố: Chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi
colodion rồi đặt vào ổ bụng của chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lại
cấy truyền như vậy từ 5 - 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng
gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều
kiện nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác dụng vào thần kinh và ruột [3].
2.2.7. Đặc điểm gây bệnh Salmonella

2.2.7.1 Điều kiện gây bệnh
Salmonella gây ngộ độc cho người phải có các điều kiện:
Thức ăn phải nhiễm một lượng lớn vi khuẩn sống, khoảng 106 – 107 để
có thể vượt qua được tính acid cao của dạ dày và cạnh tranh với quần thể vi
sinh vật tự nhiên trong ruột mới có khả năng biểu hiện bệnh. Còn nếu lượng
tế bào không đủ lớn thì sẽ bị cơ thể thải ra ngoài và không gây biểu hiện
bệnh [1].
Vi khuẩn trong thức ăn đi vào cơ thể sẽ phát triển và khi chết sẽ tiết ra
một lượng độc tố [2].
Tùy thuộc vào sức đề kháng của cơ thể vật chủ. Trẻ em, người già,
người ốm yếu, chức năng gan suy yếu và các bệnh về máu đều làm giảm sức
đề kháng bệnh [1].
Chủng Salmonella: Không phải mọi chủng Salmonella nhiễm vào đều
có biểu hiện bệnh mà chỉ một số chủng như: S. typhi, S. paratyphi, S.
enteritidis… Mới gây bệnh cho người, biểu hiện của bệnh cũng khác nhau
tùy từng kiểu huyết thanh.
2.2.7.2 Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, sau đó theo hệ thống bạch
huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết. Do đó trong thời


13

kỳ đầu lấy máu người bệnh truyền cấy sẽ phát hiện vi khuẩn. Vi khuẩn gây
viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, tiết ra độc tố. Độc tố này thấm
qua thành ruột vào máu [4].
Ngoài ra vi khuẩn trong hệ tuần hoàn cũng tiết ra độc tố. Nội độc tố
chủ yếu tác động lên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ
bền của thành mao quản và làm giảm chứng năng điều tiết thân nhiệt của cơ
thể [15].

2.2.7.3 Các kiểu bệnh chính do vi khuẩn Salmonella.
Các kiểu huyết thanh Salmonella gây ra bệnh với những triệu chứng
lâm sàng không giống nhau:
* Bệnh thương hàn: S. typhi gây ra bệnh sốt thương hàn, S .paratyphi
A, S. paratyphi B gây bệnh phó thương hàn triệu chứng bệnh giống bệnh sốt
thương hàn.
Triệu chứng: Sốt cao, đau đầu, mệt mỏi, chán ăn, nhịp tim chậm,
khoảng 26% có nốt hồng ban trên cơ thể. Người bệnh đau bụng, nôn, táo bón
hoặc tiêu chảy phân đen hoặc có máu. Nếu không được chẩn đoán và điều trị
kịp thời sẽ gây ra những biến chứng nguy hiểm như chảy máu ruột, thủng
ruột hoặc bị rối loạn chức năng não và dễ gây tử vong.
Điều trị: Thương hàn không gây tử vong ở hầu hết các ca bệnh.
Kháng sinh như Ampicilin, Chloramphenicol, Amoxicillin và Ciprofloxacin
Trimethoprum - sulfamethoxazole, được sử dụng phổ biến điều trị bệnh thương
hàn ở các nước phát triển. Điều trị kịp thời và kháng sinh giảm tỉ lệ từ vong
xuống xấp xỉ 1%. Nếu không được đều trị, thương hàn tồn tại trong ba tuần đến
một tháng [13].
* Bệnh nhiễm trùng máu: Do S. choleraesuis gây ra.
Triệu chứng: Buồn ngủ hoặc sốt li bì, sốt cao trên 380C hoặc hạ nhiệt
độ dưới 350C. Vàng da, tím tái hoặc xám, da xanh (do thiếu máu), suy hô


14

hấp làm cho trẻ thở nhanh hoặc chậm, rối loạn tiêu hóa (tiêu chảy, nôn, bụng
trướng căng) gan, lá lách to. Trong trường hợp nặng, bệnh nhân có thể suy
thận cấp.
Điều trị: Bao gồm các công tác chẩn đoán sớm, loại bỏ nguồn gốc
nhiễm trùng từ ổ nguyên phát, hỗ trợ tuần hoàn và hô hấp, điều trị thăng
bằng kiềm toan, chống rối loạn đông máu và kháng sinh. Trước khi sủ dụng

kháng sinh nên cấy máu vào bệnh phẩm khác để làm kháng sinh đồ chọn ra
kháng sinh phù hợp [6].
*Bệnh về tiêu hóa: Do S. typhimurium và S. enteritidis gây bệnh viêm
ruột, viêm dạ dày.
Triệu chứng: Hiện tượng ăn không tiêu, đầy hơi chướng bụng, buồn
nôn, đi lỏng hoặc táo bón, đau bụng âm ỉ hoặc từng cơn…
Điều trị: Trước hết vẫn phải tránh uống rượu, cà phê, thuốc lá (nếu
có dùng) vì những thứ này thường làm giảm trương lực co thắt dưới thực
quản. Hạn chế ăn các loại thức ăn nhiều mỡ, không ăn cay, chua, ăn chậm,
nhai kỹ [1].
2.2.7.4 Nguồn lây nhiễm
Các thực phẩm dễ nhiễm Salmonella gồm sản phẩm thịt gia cầm và
thịt lợn, trứng và các sản phẩm từ trứng, sữa và các sản phẩm từ sữa, nước bị
nhiễm phân, hoa quả và rau xanh, sản phẩm ngũ cốc, các thực phẩm ăn
nhanh [4].
Các sản phẩm thịt nói chung, nhất là thịt gia cầm và thịt lợn do vi
khuẩn này sống tự do trong ruột động vật và có ở trên lông.
Trứng và các sản phẩm từ trứng: Do gia cầm là nguồn mang
Salmonella nên vi khuẩn có thể xuyên qua vỏ và sinh sản trong lòng đỏ
trứng [3].


15

Nước bị nhiễm phân gia súc, hoa quả và rau xanh có thể bị nhiễm khi
rửa bằng nước đã bị nhiễm khuẩn hoặc bởi người mang vi khuẩn.
2.3. Các phƣơng pháp phát hiện Salmonella
2.3.1. Phát hiện Salmonella bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống
Đây là phương pháp định tính và kết quả là có hay không phát hiện
Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Do quy định không cho phép

có mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện nên mẫu lấy tối thiểu phải
25 g và quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng
sinh để đạt hiệu quả cao. Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong
mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng trong quá trình bảo quản chế biến và
sự tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae,
những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella. Để
phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: Tiền tăng sinh, tăng sinh
chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử
nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp [7].
Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment): Đây là khâu quan
trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm
nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm. Người ta thường sử dụng môi trường
tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế
đặc hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi
sinh vật hiện diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và
bảo quản thực phẩm. Ví dụ: Nước peptone đệm Buffered Peptone Water
(BPW) là môi trường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi
trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae
[12]. Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền
tăng sinh phù hợp, thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh
là 1:9 tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi [34].


16

Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment): Giai đoạn này
làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng cách ức chế
hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận
lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập.
Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng

là Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT),
Selenite Cystein Broth (SC) [37]… Thông thường môi trường TT được dùng
để phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống,
các mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc hay các loại
thực phẩm khác. Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi
trường tối ưu chung cho tất cả các dòng Salmonella. Mỗi loại môi trường tăng
sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau
của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi
trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác. Ví
dụ: Salmonella typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT,
Salmonella dublin không phát triển được trong môi trường RV. Ngoài ra,
mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt nuôi cấy khác nhau như
môi trường RV được ủ ở 42oC, môi trường TT và SC được ủ ở 37oC
trong 22 - 24 giờ [18].
Giai đoạn phân lập và nhận diện: Đây là bước tách biệt Salmonella
trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng. Một số môi trường phân lập
như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar
(BSA), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen
Entric Agar (HEP). Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình
thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau [12].
Trên các môi trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu
khuẩn lạc đặc trưng khác nhau. Trên môi trường XLD: Khuẩn lạc màu hồng


17

tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen. Trên môi trường BSA: Khuẩn lạc
Salmonella có màu nâu xám hay đen, có hay không có ánh kim tím trên bề
mặt khuẩn lạc, môi trường xung quanh có màu nâu chuyển sang đen khi tăng
thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho việc nhận biết khuẩn lạc vi khuẩn

Salmonella. Trên môi trường BPLS: Khuẩn lạc Salmonella điển hình trong
suốt và hơi đỏ trong môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc.
Trên môi trường HE: Khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu
xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số loài Salmonella có thể phát triển
thành khuẩn lạc có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc
hoàn toàn có màu đen. Có một số ít loài Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu
vàng có hoặc không có tâm đen [12].
Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa: Đây là bước xác nhận các
dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường phân lập bằng các thử
nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng. Các biểu hiện sinh hóa của
Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase
(+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+). Nếu các
biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các
thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá. Vi khuẩn
sau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa
nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella [6].
- Phương pháp nuôi cấy truyền thống vẫn đang được áp dụng tại Việt
Nam cũng như các nước khác trên thế giới để phát hiện Salmonella trong
thực phẩm, đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn được chấp nhận rộng
rãi. Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức lao động
cho các công việc như: chuẩn bị môi trường, dụng cụ, thực hiện quy trình,
thời gian để có kết quả phân tích phải mất từ 5 đến 7 ngày (ISO 6579: 2003).
Với thời gian này đã không đáp ứng được các yêu cầu kiểm nghiệm nhanh


18

trong việc phục vụ các chương trình giám sát chất lượng thực phẩm trên dây
chuyền sản xuất như hiện nay gây thiệt hại cho các nhà quản lí doanh nghiệp
vì các chi phí lưu kho để chờ kết quả phân tích.

2.3.2. Phát hiện Salmonella bằng phương pháp hiện đại
* Phƣơng pháp Phage Typing
Phage typing là phương pháp nhằm phân biệt Salmonella trong các
nghiên cứu về dịch tễ học cho hiệu quả khá tốt [23] .
Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại phage chỉ ly giải một
chủng vi khuẩn mà không thể ly giải chủng vi khuẩn khác trong cùng một
loài. Do đó các chủng của một loài vi khuẩn có thể được phân biệt dựa
trên tính nhạy khác nhau của chúng với một hỗn hợp nhiều loại phage khác
nhau [36].
Ưu điểm của phương pháp này là so với phương pháp kiểu gen,
phương pháp huyết thanh là có giá thành rẻ hơn, không tốn công lao động.
Nhược điểm là nặng về kỹ thuật và chỉ được thực hiện ở một số phòng thí
nghiệm chuẩn. Hiệu quả phân biệt của phương pháp còn hạn chế do độ đa
dạng của hỗn hợp phage không cao, đặc biệt khi chủng phân lập trong một
vùng địa phương [23].
Trong nhiều năm qua phương pháp Phage typing đã được sử dụng như
một công cụ hữu hiệu cho việc nghiên cứu sự bùng phát của Salmonella
Điển hình như: Ward L. R. et al (1987) đã mô tả phương pháp Phage typing
nhằm phát hiện ra vi khuẩn Salmonella enterica, Rabsch W (2007) [36], N.
De Lappe và cs (2009) [28].
* Phƣơng pháp ELISA.
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay - Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều
dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng