ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

ĐINH THỊ HUỆ
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GENE SYRB2 TỪ CHỦNG VI KHUẨN
PSEUDOMONAS SYRINGAE PV. SYRINGAE SINH TỔNG HỢP
SYRINGOMYCIN CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chun ngành : Cơng nghệ sinh học
Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011 - 2015

Thái Nguyên - 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

ĐINH THỊ HUỆ
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GENE SYRB2 TỪ CHỦNG VI KHUẨN
PSEUDOMONAS SYRINGAE PV. SYRINGAE SINH TỔNG HỢP
SYRINGOMYCIN CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chun ngành

: Cơng nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2011 - 2015

Giảng viên hƣớng dẫn : 1. TS. Đồng Văn Quyền
2. ThS. Bùi Đình Lãm
Khoa CNSH- CNTP, Trƣờng Đại học Nơng Lâm

Thái Ngun - 2015



i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hồn thành được khóa luận
tốt nghiệp này tơi đã nhận được sự quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ rất tận tình
của thầy cơ và bạn bè và gia đình. Nhân dịp hồn thành luận văn:
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Đồng Văn Quyền Phó viện
trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt Nam, ThS. Bùi Đình
Lãm giảng viên Khoa Cơng nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm –
Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, anh Nguyễn Hải Triều, chị Mai
Thùy Linh cán bộ phịng Vi sinh phân tử, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện
khoa học Việt Nam người đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện để tài cũng như trong q trình hồn chỉnh
luận văn tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học,
Viện khoa học Việt Nam, các cán bộ, anh chị làm việc tại Bộ môn Vi sinh vật
học Phân tử đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã
ln động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi vượt qua mọi khó khăn trong q trình học
tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 6 năm 2015
Sinh viên
Đinh Thị Huệ


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Độc tố thực vật sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas spp .............. 6
Bảng 3.1. Thành phần mơi trường LB (cho 1 lít mơi trường) ...................... 23
Bảng 3.2. Thành phần môi trường King’s B nuôi cấy vi khuẩn Pseudomonas
syringae pv syringae..................................................................... 23
Bảng 3.3. Thành phần các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid . 24
Bảng 3.4. Thành phần dung dịch dùng trong điện di DNA .......................... 24
Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR gene SyrB2 ...................................... 27
Bảng 3.6:

Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng ..... 29

Bảng 3.7: Các thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn ................... 31
Bảng 3.8: Các thành phần của hỗn hợp chất phản ứng A ............................. 32
Bảng 3.9: Các thành phần của hỗn hợp chất phản ứng B ............................. 33
Bảng 3.10: Thành phần các chất tham gia phản ứng real-time PCR .............. 34
Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng real-time PCR ..................................... 35
Bảng 4.1: Kết quả đo nồng độ DNA tổng số từ chủng P.syringae kiểu dại
và đột biến .................................................................................... 38
Bảng 4.2: Kết quả xác định tỉ lệ A260/A280 và nồng độ ARN(ng/μl) của chủng
P.syringae pv syringae kiểu dại và kiểu đột biến ........................ 38


iii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Pseudomonas dưới kính hiển vi điện tử [16] ................................... 3
Hình 2.2. Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp trên đĩa thạch (A) và
hình thái tế bào (B) [1] ..................................................................... 4
Hình 2.3. Cấu trúc Syringomycin E [29] ......................................................... 7
Hình 2.4: Cơ chế sinh tổng hợp peptide nonribosomal [10]............................ 9

Hình 2.5. Hoạt động của SyrB2 trong sinh tổng hợp syringomycin ............. 15
Hình 2.6. Vector tách dịng pGEM-T Easy .................................................. 20
Hình 4.1: DNA tổng số chủng Pseudomonas syringae pv. syringae ............ 37
Hình 4.2: Điện di sản phẩm PCR gen SyrB2 ở chủng PS kiểu dại và đột biến ..39
Hình 4.3: Đĩa petri chứa khuẩn lạc sau khi biến nạp ..................................... 40
Hình 4.4: Kết quả tách chiết DNA plasmid từ khuẩn lạc xanh và trắng ....... 41


iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Amp

Ampicillin

Bp

Base pair – cặp base nito

PDA

Potato Dextro Agar

BLAST

Basic Local Aligenment Search Tool

DNA


Deoxyribonucleic axit

dNTP

Deoxynucleotide Triphotphate

E. coli

Escherichia coli

Et al; cs

Cộng sự

IPTG

Isopropyl Thiogalactoside

Kb

Kilo base –kilo base nito

LB

Lauria Broth

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate


PCR

Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi
trùng hợp

SR-E

Syringomycin E

TAE

Tris- acetate- EDTA

TE

Tris- EDTA

X –gal

5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside


v

MỤC LỤC
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2
1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2

1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ........................................................................... 2
Phần 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ......................................................... 3
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae .................... 3
2.1.1. Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae ............................... 3
2.1.2. Khả năng gây bệnh chung của P. syringae ............................................ 5
2.1.3. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm ............................ 6
2.2. Khái quát về Syringomycin E .................................................................... 7
2.2.1. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE ................................................ 7
2.2.2. Cơ chế diệt vi sinh vật của Syringomycin E ......................................... 10
2.2.3. Phổ hoạt động của Syringomycin E ...................................................... 11
2.3. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trong và ngồi nước................... 12
2.3.1. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trên thế giới ............................ 12
2.3.2. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ở Việt Nam ............................. 14
2.4. Chức năng của protein SyrB2 .................................................................. 15
2.5. Phương pháp PCR, realtime PCR ............................................................ 16
2.5.1. Phương pháp PCR ................................................................................. 16
2.5.2. Real-time PCR ...................................................................................... 18
2.6. Vector tách dòng pGEM-T Easy ............................................................. 19
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.. 22
3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc ..................................................... 22
3.1.1. Chủng vi khuẩn ..................................................................................... 22


vi

3.1.2. Thiết bị, máy móc ................................................................................. 22
3.1.3. Hóa chất và sinh phẩm .......................................................................... 22
3.1.4. Môi trường và dung dịch ....................................................................... 23
3.2. Địa điểm và thời gian thực tập ................................................................. 25
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25

3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 25
3.4.1. Phương pháp tách DNA tổng số từ vi khuẩn ........................................ 25
3.4.2. Phương pháp PCR ................................................................................ 26
3.4.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ......................................... 27
3.4.4. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy... 28
3.4.5. Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α ................... 29
3.4.6.Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn ................................................. 30
3.4.7. Cắt kiểm tra pGEM-T Easy -SyrB2 với EcoRI .................................... 31
3.4.8. Kỹ thuật tách ARN từ vi khuẩn............................................................. 31
3.4.9. Phương pháp chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên............................... 32
3.4.10. Kỹ thuật Real-time PCR ..................................................................... 33
3.4.11. Tinh sạch sản phẩm PCR .................................................................... 35
3.4.12. Giải trình tự gene ................................................................................ 36
Phần 4: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC VÀ THẢO LUẬN.................................. 37
4.1. Tách chiết DNA, RNA tổng số vi khuẩn Pseudomonas syrringae PS120......37
4.2. Tạo dòng gen SyrB2................................................................................. 38
4.2.1. Khuếch đại gen SyrB2 của chủng vi khuẩn P. syringae PS 120 bằng cặp
mồi đặc hiệu .................................................................................................... 38
4.2.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy ..................................... 39
4.2.3. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli .............................................. 40
4.2.4. Kiểm tra kết quả tạo dòng ..................................................................... 41
4.3. Kết quả giải trình tự và phân tích gen Syrb2 ........................................... 43


vii

4.3.1. Kết quả giải trình tự gen........................................................................ 43
4.3.2. So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến và trình tự SyrB2
chuẩn trên NCBI.............................................................................................. 44
4.3.3. So sánh trình tự gen SyrB2 giữa chủng kiểu dại và chủng đột biến ..... 44

4.4. Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của gen SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ
thuật Real time PCR ........................................................................................ 44
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 46
5.1 Kết luận ..................................................................................................... 46
5.2 Kiến nghị ................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hằng năm trên thế giới, bệnh cây gây ra những tổn thất to lớn cho sản
xuất nông nghiệp. Chúng phá hủy 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu,
chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp trên thế giới. Trong các loại bệnh
thì bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium
và Rhizocronia gây ra với tỷ lệ lớn. Chúng gây bệnh trên nhiều loại rau quả
và cây lương thực như lạc, cà chua, khoai tây, cà phê,tiêu . Biện pháp phòng
trừ các bệnh hại cây trồng phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng các loại
thuốc hóa học. Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng, hiệu quả và tác dụng
nhanh, nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu
quả phòng trừ thấp đối với các loại nấm bệnh trong đất, nhanh bị ức chế bởi
nấm bệnh sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu
đến sức khỏe con người .
Hơn nữa, ngày càng gia tăng bệnh nhiễm nấm, ít các loại thuốc kháng
nấm có sẵn, và các loài nấm ngày càng kháng với thuốc chống nấm có sẵn,
đã dẫn đến việc mở rộng việc tìm kiếm chế phẩm sinh học chống nấm mới.
Chủng Pseudomonas syringae pv. syringae sản xuất lipodepsinonapeptides
với hoạt tính kháng nấm. Nghiên cứu trong ống nghiệm về cơ chế kháng nấm

và các hoạt động diệt nấm của ba lipodepsinonapeptides (syringomycin E,
syringotoxin B, và syringostatin A) cho thấy, cả ba hợp chất có khả năng
chống nấm phổ rộng và có hoạt tính diệt hầu hết các loài nấm thử nghiệm .
Syringomycin E (C53 H85CLN14O17) là một trong những hợp chất quan trọng
nhất được nghiên cứu. Syringomycin B2 là một enzyme quan trọng liên quan
chặt chẽ trong quá trình tiết ra Syringomycin E, một hoạt chất có phổ kháng
khuẩn và nấm rộng được sản sinh bởi Pseudomonas syringae pv.Syringae.


2

Việc nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm của SyrB2 là cần thiết. Xuất phát từ
thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu phân lập gene SyrB2
từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae sinh tổng hợp
Syringomycin cao”
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tách dòng và giải trình tự gen SyrB2, tìm kiếm đột biến trên SyrB2 ở
mức độ gen và protein.
- Tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên.
- Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật
RT- realtime PCR.
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã được học và
tham gia nghiên cứu khoa học, cách xử lí và phân tích số liệu, cách trình bày
một báo cáo khoa học. Quan trọng hơn là việc phân lập và tách dịng thành
cơng gen syrB2 là cơ sở cho các nghiên cứu tổng quát có liên quan về sản
xuất Syringomycin sau này.
1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
Sản phẩm của q trình tách dịng gen syrB2 sẽ cung cấp vật liệu và là

cơ sở cho các nghiên cứu nhằm đưa các gene mã hóa cho các enzyme tổng
hợp syringomycin vào vi sinh vật, tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có
khả năng sản xuất syringomycin cao đáp ứng nhu cầu thị trường và hạ mức
giá thành của sản phẩm.


3

Phần 2
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae
2.1.1. Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae
Căn cứ vào đặc điểm hình thái và sự phân bố địa lý Pseudomonas
Syringae pv. syringae được phân loại thuộc[28]:
Ngành (Phylum): Proteobacteria
Lớp (Class): Gamma Proteobacteria
Bộ (Order): Pseudomonadales
Họ (Family): Pseudomonadaceae
Chi (Genus): Pseudomonas
Lồi (Species): P. syringae

Hình 2.1: Pseudomonas dƣới kính hiển vi điện tử [16]
Pseudomonas syringae pv.syringae là một thành viên của chi
Pseudomonas, và dựa trên phân tích 16S rRNA, nó được đặt trong nhóm
P.syringae [28]. Nó được đặt tên theo tên của cây Tử đinh hương (Sơn mai
hoa), chúng được phân lập đầu tiên từ cây này [28]. Đặc điểm hình thái học
chung cho chi Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động


4


nhờ roi ở đầu và khơng có bào tử. Có kích thước 0,5-1 x 1,5-5 μm, có khả
năng chuyển động bằng một hay nhiều tiêm mao. Tính chất ni cấy:
Pseudomonas mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu
khí. Nhiệt độ thích hợp 37°C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5oC - 42°C, pH
thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0. [5] .

Hình 2.2. Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp trên đĩa thạch (A)
và hình thái tế bào (B) [1]
Trên mơi trường đặc có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt,
trung tâm hơi lồi. Có xu hướng mọc lan (Hình 2.2A) , 1 loại xù xì bờ khơng
đều, đơi khí có loại khuẩn lạc nhầy. Trên môi trường thạch máu đa số gây tan
máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất.
Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai [6].
Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên. Pseudomonas mọc
được ở trên môi trường SS (shigella salmonella), đây là đặc điểm để phân biệt
với trực khuẩn Whitmore. Tính chất đặc trưng của Pseudomonas là sinh sắc tố
và chất thơm. Có hai loại sắc tố chính pyocyanin: có màu xanh lá cây, tan
trong nước và chloroform, khuếch tán ra môi trường làm mơi trường có màu
xanh. Pyoverdin: là loại sắc tố huỳnh quang, tan trong nước nhưng không tan
trong chloroform, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím [1]. Sắc tố này không
bền vững dễ mất đi trong điều kiện nuôi cấy không tốt. Sắc tố của
Pseudomonas dưới ảnh hưởng của các nguyên tố hóa học có thể thay đổi


5

thành màu nâu, đen. Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi
trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có
thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các

động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những lồi tiêu biểu
có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học [7,25].
2.1.2. Khả năng gây bệnh chung của P. syringae
P. syringae được chứng minh gây ra một loạt các triệu chứng trên thực
vật, bao gồm cả cháy lá, đốm lá, lá sần sùi. Loài này được chia thành nhiều
biến thể gây bệnh (pathovars), trên nhiều cây chủ khác nhau. Khi
Pseudomonas xâm nhập vào mô thực vật, chúng tương tác tạo triệu chứng
ngậm nước, sau đó là quá trình tăng sinh và phát triển các triệu chứng nâng
cao hơn. Trong khi đó, các tế bào cây chủ phản ứng lại sự xâm nhập của vi
khuẩn bằng cơ chế hoại tử sau 12-24 giờ [8]. Nhóm gen HRP là cần thiết cho
khả năng gây bệnh của Pseudomonas syringae pv.syringae vì chúng mã hóa
cho sự điều hịa và hình thành con đường tiết độc tố ở thực vật. Chúng được
bảo tồn trong các chủng Pseudomonas syringae pv. syringae gây bệnh trên
thực vật. Ngoài ra, Pseudomonas syringae pv. syringare cũng sản sinh ra
nhiều tác nhân gây độc khác như các polysaccharide ngoại bào, các độc tố
thực vật, các enzyme phá hủy màng tế bào và các phytohormone [8]. Dựa trên
phân tích 16sRNA, Pseudomonas syringae pv. syringae được đặt trong loài
Pseudomonas syringae pv. syringae , là một trong các tác nhân gây bệnh quan
trọng ở hơn 180 loài thực vật trên toàn thế giới, đặc biệt, chúng gây bệnh đốm
nâu ở đậu với thiệt hại năng suất lên đến 55% ở Nam Phi [13].


6

Bảng 2.1: Độc tố thực vật sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas spp
Độc tố

Vi sinh vật sản xuất

Nhóm chất sinh tổng hợp


P.syringae pv. atropurpurea,
Coronatine

glycinea,maculicola,
morsprunorum, tomato

Polyketide

Corpeptin

P. corrugate

Lipodepsipeptide

Fuscopeptin

P. fuscovaginae

Lipodepsipeptide

Persicomycins

P. syringae pv. persicae

Chất béo

Phaseolotoxin

P.syringae pv. actinidiae,


Sulfodiaminophosphinyl

phaseolicola

peptide

P. andropogonis

Vinylglycine

Rhizobitoxine

Syringomycins P. syringae pv. syringae, aptata, Lipodepsinonapeptide
atrofaciens
Syringopeptins P. syringae pv. syringae

Lipodepsipeptide

Tabtoxin

β-Lactam

P.syringae pv. tabaci,
coronafaciens, garcae

Tolaasin

P. tolaasii


Lipodepsipeptide

Viscosin

P. marginalis ( P. fluorescens )

Lipodepsipeptide

2.1.3. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho rằng các chủng vi khuẩn
Pseudomonas sp đóng vai trị quan trọng trong việc hạn chế các bệnh cây
trồng [9, 15, 17]. Hiệu quả của một vi sinh vật kiểm sốt sinh học trong nhà
kính và trên đồng ruộng phụ thuộc vào sự sinh tổng hợp một hay nhiều chất
đối ức chế sinh trưởng nấm [14]. Các chủng Pseudomonas sinh tổng hợp
nhiều loại ức chế sinh khác nhau như phenazine [26, 27, ]. Henkes và cộng


7

sự cơng bố chủng P. fluorescens có khả năng ức chế hiệu quả với F.
graminearum gây bệnh trên cây lúa mạch [1]. Năm 2012, Seema và cộng sự
công bố chủng P.aeriginosa SD12 có khả năng sinh tổng hợp 1
hydrophenazine ức chế mạnh với nấm R. solani [1]. Chủng P. syringae sinh
tổng hợp syringomycin, syringostatin và syringotoxin, có các đặc tính chống
nấm tiềm năng. Syringomycin-E (SRE) là peptide phổ biến nhất. SRE diệt
nấm A.flavus, A. fumigatus, A. niger, F. moniliforme và F. oxysporum [3; 22].
2.2. Khái quát về Syringomycin E
2.2.1. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE
Các syringomycin (SR) gồm A1, E và G, trong đó syringomycin E (SRE) là nhóm chính và được nghiên cứu nhiều nhất [22]. SR-E là một peptide
tuần hồn khơng phải ribosom [11]. SR-E có khối lượng phân tử là 1240 kDa.

SR-E được tạo ra do sự trao đổi chất thứ cấp của vi khuẩn P. syringae pv
syringae. Cấu trúc của SR-E gồm một axit béo mạch dài khơng phân nhánh và
chín axid amin khép vịng, ưa nước, tích điện dương. Trình tự axit amin của
SR-E là Ser-Ser-Dab-Dab-Arg-Phe-Dhb-4(Cl)Thr-3(OH)Asp, được khép
vịng tại nhóm β-carboxy của đầu cùng C và nhóm OH của đầu cùng N nhờ
quá trình acetyl hóa được xúc tác bởi axit 3-hydroxydodecanoic[4; 21,]. Cơng
thức cấu tạo của SR-E (Hình 2.3) :

Hình 2.3. Cấu trúc Syringomycin E [29]


8

Syringomycin E(SR-E) tan trong nước và tan trong cồn nồng độ thấp,
không tan trong ether và chloroform. Điểm đẳng điện ở pH 7 [23]. Hoạt tính
kháng sinh của SR-E khơng bền trong dung dịch kiềm, đặc biệt tại pH 8 và
bền trong 1N HCl, bền ở nhiệt độ cao, không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím.
SR-E có hoạt tính kháng nhiều loại nấm mốc và nấm men. Khả năng kháng
nấm men của SR-E tốt hơn nấm mốc. Tuy nhiên, chúng khơng có khả năng
ức chế vi khuẩn [23].
Cụm gen syringomycin (syr) gồm một vùng trình tự DNA xấp xỉ 37kb
của bộ gen P.syringae pv syringae. Sáu khung đọc mở thuộc cụm gen syr
được dự đốn là mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
(syrB1, syrB2, syrC và syrE), quá trình tiết SRE phụ thuộc vào syringomycin
D (syrD) và q trình điều hịa phụ thuộc vào syringomycin P (syrP) [16].
Đặc điểm nổi bật nhất của cụm gen Syr đó chính là sự xuất hiện của một
khung đọc mở cực kì lớn (28.4kb) của gen SR-E. Phân tích trình tự axid amin
đã chỉ ra rằng SR-E mã hóa cho một chuỗi peptide với khối lượng phân tử lên
đến 1,039kDa với tám acid amin cấu thành. Do đó, SR-E được ghi nhận như
là một protein lớn nhất cho tới thời điểm hiện tại mà prokaryote tạo ra [16].

Sự sinh tổng hợp SR-E theo cơ chế thiotemplate hay cơ chế sinh tổng hợp
peptide nonribosomal [20].


9

Hình 2.4: Cơ chế sinh tổng hợp peptide nonribosomal [10]
Trong q trình này, có hai vùng trình tự quan trọng đó là Adenylation
domain và T domain. Vùng A domain thường có chiều dài khoảng 550 acid
amin, vùng A domain này xúc tác một vùng nhận biết cụ thể và hoạt hóa một
acid carboxyl giống như acyl adenylate bằng sự thủy phân ATP, tạo phức hệ
aminoacyl adenylate [8]. Đồng thời với q trình đó, ở vị trí T domain (T
domain có thể coi là PCP-peptide carrier protein – là vùng mà 4’-PP cofactor
bám vào), thì xúc tác 4’-PP-tranferase làm cho các nhóm hydroxyl của serine


10

liên kết với cầu pyrophosphate của CoA, dẫn đến việc chuyển giao 4’-PP
cofactor vào T domain và giải phóng 3’-5’- ADP (T domain chứa trình tự lõi
là serine). Phức hệ đó kết hợp với aminoacyl adenylate để tạo ra thioesterbound acid amin và giải phóng AMP. Các thioester- bound acid amin liên kết
và trao đổi với nhau hình thành nên chuỗi axit amin [8].
2.2.2. Cơ chế diệt vi sinh vật của Syringomycin E
Các nghiên cứu gần đây tập trung nhiều vào cơ chế kháng nấm của các
lipodepsinonapeptide mạch vòng nhỏ. Cấu trúc phân cức của SR-E thúc đẩy
sự tương tác với màng nguyên sinh chất. SR-E làm tăng sự thu nhận
tetraphenylphosphonium nên dẫn đến tăng điện thế màng [8]. Điều này gây
nhiều biến đổi như mất K+ và thêm H+ dẫn đến tế bào bị chết. Các nghiên cứu
khác chỉ ra rằng SR-E làm thay đổi pH gradient màng nguyên sinh chất do mất
K+ và thêm H+. Cùng với sự trao đổi K+ và H+, SR-E cũng kích thích sự thâm

nhập của Ca2+. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tập trung vào mơ tả
tính chất và sự hình thành kênh của SR-E bằng màng lipit nhân tạo [8]. Kết quả
nghiên cứu cho thấy SR-E tạo nên kênh phụ thuộc vào điện thế trong màng hai
lớp nhân tạo. SR-E tạo nên các lỗ dị (bán kính 1 nm) khơng đặc hiệu mà cation
hóa trị 1 và 2 đều thấm qua được. Nhờ cấu trúc lưỡng cực với một đầu acid amin
ưa nước và một đuôi acid béo kị nước nên SR-E có thể dễ dàng chèn vào màng
lipid của tế bào chủ và hình thành kênh của riêng nó [8]. Từ các phân tích lý sinh
học về sự hình thành các kênh trên lớp màng kép lipid, một bức tranh về sự hình
thành cũng như chức năng của các kênh syringomycin dần được sáng tỏ. Ngay
sau khi chèn vào lớp màng lipid, các monomer là các đơn phân tử SR-E tập hợp
lại hình thành lỗ xuyên qua lớp màng. Căn cứ vào điện áp của kênh ion, Feigin
và các cộng sự đã kết luận rằng các kênh được hình thành bởi ít nhất sáu phân tử
SR-E [8]. Các kênh này cho thấm tự do các cation như K+, H+, Ca2+. Hậu quả dễ
thấy nhất của sự hình thành kênh SR-E đó là sự vận chuyển nhanh chóng của các


11

ion Ca2+ sẽ làm kích hoạt một chuỗi các sự kiện liên quan đến tín hiệu của tế bào
ở thực vật [8].
2.2.3. Phổ hoạt động của Syringomycin E
Nấm là các mầm bệnh rất quan trọng trong y học mà hiện đang tăng dần
tính kháng với các chiến lược kiểm sốt nấm hiện tại. Điều đó đã thúc đẩy
việc tăng các nỗ lực nhằm tìm kiếm các chất kháng sinh mới. Các peptide từ
nhiều loài nấm mốc, vi khuẩn khác nhau được đầu tư nghiên cứu [2]. Và
Syringomycin nổi lên như một lớp peptide mới có khả năng kháng nấm
mạnh. Qua các thí nghiệm in vitro, Syringomycin E là độc tố có phổ hoạt
động mạnh, nó tiêu diệt được nhiều lồi nấm bệnh khác nhau như: SR-E được
sử dụng để tiêu diệt Asperigillus fumigatus, Mucor sp (nấm mốc gây bệnh
trên người), Trichophyton sp (nấm kí sinh ở da)[3] . Ngồi ra, SRE cũng cho

thấy tiềm năng ứng dụng trong việc bảo quản nông sản khỏi một số loại nấm
gây hại như nấm P.digitatum gây thối hỏng vải thiều, nấm mốc Aspergillus,
Rhizopus, Fusarium, và vi khuẩn Ervinia carotonova gây bệnh trên
cam,vải,xoài và thanh long . SRE diệt nấm A. flavus, A. fumigatus, A. niger,
F. moniliforme và F. oxysporum, có giá trị LD95 là 7,8 μg/ml đối với A.
flavus và các giá trị LD95 với 1,9 μg/ml đối với các chủng nấm khác [2; 22].
Độc tính của SRE đối với tế bào HeLa (dòng tế bào nghiên cứu ở người)
thường gấp 20 lần nồng độ SRE để diệt 95% các nấm gây bệnh. SRE có khả
năng diệt bào tử nấm đã nảy mầm của Aspergillus sp và Fusarium sp. Hiệu
quả hơn các peptide khác như cecropin A, cecropin B và dermaseptin. Kết
quả thử độc tính trên chuột và độc tính với tế bào đã chỉ ra rằng SRE có tiềm
năng phát triển thành sản phẩm thương mại [2].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh SRE có hoạt tính kháng nhiều loại
nấm sợi và nấm men gây bệnh trên thực vật như Candida, Cryptococcus,
Geotrichum candidum, Rhodotorula pilimance, Botrytis cinerea, Fusarium,


12

Pythium ultimum, Rhizoctonia, Greeneria uvicola , Aspergillus japonicus,
Mucor sp., Trichophyton sp., Curvularia brachyspora, Nigrospora sphaerica,
Penicillium thomii và Penicillium sclerotiorum [2]. Tuy nhiên SRE không ức
chế được vi khuẩn. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng khả năng kháng nấm men
của SRE tốt hơn nấm mốc. SRE không gây độc với tế bào động vật và không
gây bệnh trên thực vật [2].
2.3. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trong và ngồi nƣớc
2.3.1. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trên thế giới
Mỗi năm, bệnh nấm gây thiệt hại mùa màng trên thế giới đã lên đến hàng
trăm triệu dollar mặc dù đã sử dụng thuốc trừ sâu [1]. Những vấn đề về môi
trường và sự phát triển ức chế thuốc ở các nấm bệnh đã làm giảm hiệu quả

của các loại thuốc diệt nấm. Do vậy các chất ức chế nấm do các vi sinh vật
đất sản sinh ra là một nguồn thuốc sinh học mới, an toàn đầy tiềm năng. Do
những nguyên nhân này và các nguyên nhân khác mà người ta quan tâm đặc
biệt tới kiểm soát sinh học (nghĩa là sử dụng các vi sinh vật tự nhiên hoặc các
sản phẩm của chúng để hạn chế sự tấn công và gây hại bởi các mầm bệnh
thực vật) [1]. Vào thế kỷ 20, một số thuốc trừ sâu, dựa trên các phân tử
biocidal, là công cụ chủ yếu để tăng sản lượng và chất lượng thực phẩm và
sản phẩm sợi. Do các vấn đề về sức khỏe và môi trường nên việc sử dụng
nhiều hợp chất hóa học đã gây ra tranh cãi và cần khẩn cấp các chất thay thế
chúng. Ngoài việc tự ức chế bệnh của cây ngũ cốc, chủ yếu là các biện pháp
kiểm soát sinh học khác dựa vào toàn bộ cơ thể ức chế sâu bọ tự nhiên. Một
số cách tiếp cận khác về hoạt chất sinh học được thử nghiệm và số chế phẩm
thương mại tăng lên [1]. Ứng dụng của chế phẩm sinh học vẫn cịn rất hạn
chế, cần phải có nhiều các nghiên cứu hơn nữa để đưa việc sử dụng chúng trở
nên phổ biến hơn. Hiện nay chúng chưa thể so sánh được với các loại thuốc


13

có bản chất hóa học, do tính hiệu quả, thị trường và các yếu tố khác, tuy
nhiên, do tiềm năng lớn chúng vẫn hứa hẹn có một tương lai rộng mở hơn [1].
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn
Pseudomonas sp đóng vai trị quan trọng trong việc sản xuất các peptide hạn
chế các bệnh cây trồng [1]. Theo công bố của Makarand và cộng sự cho thấy
chủng P. aeruginosa sinh tổng hợp phenazine-1-cacboxylic acid có khả năng
ức chế nấm A. niger NCIM 1025, F. oxysporum NCIM 1008, S. rolfsii NCIM
1084, C.falcatum NCIM. Có giá trị MIC với nấm S. rolfsii NCIM 1084 ở
nồng độ 29 μg/ml. Ở nồng độ 50μg/ml ức chế nấm F. oxysporum NCIM
1008 đạt 95% [1]. Syringomycin được sản xuất bởi Pseudomonas syringae
pv. syringae, là một peptide kháng nấm mới được tìm thấy. Nó là những

lipodepsinonapeptides, trong đó Syringomycin E (SRE) là nhóm được quan
tâm nghiên cứu [2]. Theo De Lucca và cs (1999) SR-E có thể ngăn ngừa các
loại nấm: Aspergillus fumigatus , Mucor sp, và Trichophyton sp [2]. SR-E
hành động chịu ảnh hưởng của sterol và có thể liên quan đến việc hình thành
các kênh ion vận chuyển. Aspergillosis và fusariosis là nấm gây suy giảm
miễn dịch đe dọa tính mạng cho vật chủ [2]. Do đó, De Lucca và cs đã nghiên
cứu khả năng gây chết nấm của SR-E. Họ đã tìm hiểu sự tương tác lý hóa
giữa SR-E và thành tường nấm, cũng như khả năng gây độc của SR-E cho các
tế bào HeLa [2]. Họ đã làm thử nghiệm invitro để xác định khả năng diệt nấm
của SR-E như sau: Nâm Lethality được nuôi trên môi trường thạch nghiêng
khoai tây, nuôi trong 7 ngày ở 300C. Bào tử đích được thu hoạch trong 1%
dextrose PDA. Dịch huyền phù bào tử nấm (104 bào tử/ml) được ủ trong 8
giờ ở 300C để có được bào tử nảy mầm. Tỷ lệ bào tử nảy mầm sẽ được quan
sát thấy sớm hơn. Các mẫu đối chứng gồm 45ml bào tử cộng với 405ml môi
trường thạch khoai tây 1% (PDA). Kiểm tra mẫu bao gồm 45ml bào tử và thể
tích thích hợp của stock SR-E và PDA 1% để cho nồng độ peptide mong


14

muốn từ 0.05-6.4 mM, trong một thể tích 450ml. SR-E được tinh chế đồng
nhất dựa trên hiệu suất cao của phương pháp sắc ký lỏng và nguyên tử bắn
phá nhanh chóng khi phân tích quang phổ [2]. Qua một số thí nghiệm, SR-E
đã được chứng minh gây chết nấm đáng kể. Gần như tất cả các bào tử nảy
mầm của A. niger và A. fumigates đã bị chết ở nồng độ SR-E 1.9 mg/ml. Số
lượng CFU đã giảm 95% đạt 7.8 mg mỗi ml SR-E cho các bào tử nảy mầm
của A.flavus [2].
Chế phẩm nấm đối kháng P. syringae ESC-10 với tên thương mại là
BioSave® -10LP đã được Tổ chức Bảo vệ môi trường của Mỹ chứng nhận
và cho phép sử dụng để kiểm soát một số loại bệnh sau thu hoạch như bệnh

mốc xanh, mốc xám, bệnh bạc vảy trên cam, quýt, các loại quả hạch và
khoai tây [24]. Khả năng sinh SR-E của chủng P. syringae van Hall chủng
ESC-10 và ESC-11 đã được nghiên cứu. Cả 2 chủng đều có khả năng sinh
tổng hợp SR-E [24].
2.3.2. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ở Việt Nam
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về Syringomycin E còn rất hạn chế, chưa có
cơng trình nghiên cứu nào về Syringomycin được cơng bố. Tuy nhiên việc
nghiên cứu biện pháp sinh học phòng chống nấm bệnh cây đã được quan tâm
và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu trong nước trong những năm vừa qua
như ở Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh học nhiệt đới (Viện
KH&CNVN), Viện Bảo vệ thực vật (Bộ NN&PTNT), Viện Thổ nhưỡng và
Nơng hóa (Bộ NN&PTNT), Đại học Nông Lâm Tp HCM, Đại học Cần Thơ
[1]. Các cơng bố cho thấy, các nhóm vi sinh vật như Trichoderma (Trần Thị
Thuần, 1997; Đào Kiều Dung, 1999; Nguyễn Kim Vân, 2003; Trần Thị
Thuần, 2004), Bacillus (Nguyễn Ngọc Dũng, 2005; Nguyễn Ngọc Dũng,
Nguyễn Minh Anh, 2007; Trần Phương Thảo., 2007), Pseudomonas (Nguyễn
Minh Anh, 2003; Nguyễn Ngọc Dũng, 2003; Nguyễn Thị Tuyết Nhung,


15

2004; Nguyễn Thị Tuyết Nhung, 2006) và Serratia (Lê Thị Hồng Minh ,2005)
đã được phân lập, tuyển chọn và được đánh giá là những tác nhân tiềm tàng
cho phát triển các chế phẩm sinh học để phòng chống nấm bệnh cây [1]. Việc
nghiên cứu ứng dụng các vi sinh vật đối ức chế nấm bệnh cây đã được thực
hiện rất sớm ở Việt Nam và đạt được những thành tựu bước đầu như sử dụng
vi sinh vật đối ức chế nấm như một sinh vật chức năng trong sản xuất sinh
bón hữu cơ vi sinh; các chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm vi nấm
Trichoderma. Có vài chục cơng trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm
Trichoderma để phịng trừ nấm gây bệnh cây trồng.

2.4. Chức năng của protein SyrB2
SyrB2 là một enzyme không chứa nhân heme FeII, khối lượng khoảng
36kDa có hoạt tính xúc tác, chúng có khả năng gắn một nhóm methyl lên
threonyl bám protein [18]. SyrB2 là một enzyme gắn hoạt động trong vùng
trans trên nhóm threonyl hiện diện bởi domain T trong SyrB1 [18].

Hình 2.5. Hoạt động của SyrB2 trong sinh tổng hợp syringomycin


16

Gen SyrB2 có kích thước khoảng 1,3kb, chiều dài khung đọc mở là
932bp. SyrB2 được tìm thấy trong vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.
syringae tham gia vào con đường sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên và là một
trong những protein đóng vai trị quan trọng trong việc tạo nên một peptide
kháng nấm gọi là Syringomycin E [18]. Các axid amin thứ chín của SR-E là
một threonine clo (4-Cl-L-Thr). Các cơ chất cho SyrB2 L-Thr và 66kDa
protein SyrB1 trên nhóm threonyl hiện diện bởi vùng domain T trong SyrB1.
Khi phức hợp L-Thr-S-SyrB1 được đưa vào trung tâm vị trí hoạt động của
SyrB2, SyrB2 phản ứng với L-Thr để tạo ra 4-Cl-Thr-S-SyrB1, sau đó chúng
gắn kết với các axid amin cịn lại để tạo ra SR-E hoàn chỉnh [18].Trong
nghiên cứu của Megan L. Matthews và cs, đã chứng minh phản ứng của các
SyrB2, Fe (II), αKG, Cl phản ứng với O2 mạnh hơn 8 lần khi có mặt của
các chất nền tự nhiên ( l -Thr- S -SyrB1) hơn trong cả hai sự vắng mặt của
protein vận chuyển hoặc sự hiện diện của SyrB1 [19].
2.5. Phƣơng pháp PCR, realtime PCR
2.5.1. Phương pháp PCR
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR:
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng
hợp DNA dựa trên mạch khn là một trình tự đích ban đầu, khuếch đại, nhân

số lượng bản sao của khuôn này thành hang triệu bản sao nhờ hoạt động của
enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này.
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một
mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn
primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình
thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai
primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy
được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA