Mục Lục


LỜI MỞ ĐẦU
Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau. Các hợp chất này
bao gồm những đại phân tử như protein, acid nucleic, lipid,… cũng như các hợp chất có trọng
lượng phân tử nhỏ. Những hợp chất trên có hiện diện ở số lượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme)
hay ở số lượng nhiều (các protein cấu tạo). Người ta muốn biết các thành phần hóa học của tế
bào, nhằm hiểu rõ các quy trình biến đổi căn bản của nó, qua đó giúp cuộc sống ngày càng
thêm tốt đẹp. Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa
học. Từ đó kỹ thuật tách riêng các hợp chất ra đời, trong đó sắc ký là phương pháp hữu hiệu
nhất để tách các chất ra khỏi một hỗn hợp, ngay cả những hỗn hợp phức tạp về thành phần và
khác nhau về hàm lượng trong hỗn hợp như dịch chiết từ các hợp chất từ cây cỏ.
Từ khi ra đời (1903) cho tới nay rất nhiều kỹ thuật sắc ký cũng như các cải tiến về
thiết bị và phương pháp phát hiện được phát triển và áp dụng trong thực tế để phân tích định
tính, định lượng và chiết tách các chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay
lớn. Nhưng vì các phân tử sinh học thì muôn hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ
khác nhau, tính phân cực nhiều hay ít khác nhau nên có rất nhiều các kĩ thuật sắc ký khác
nhau.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nhiều năm
gần đây. Nó được áp dụng để tách nhận dạng và xác định hàng loạt các hợp chất mà một số
phương pháp trước đây gặp nhiều khó khăn như các hợp chất không bền với nhiệt, các hợp
chất có tính chất hóa học tương tự nhau. Phương pháp HPLC cũng có nhiều ưu điêm mà các
phương pháp khác không có như: xác định đồng thời được nhiều chất, tốn ít mẫu, thao tác đơn
giản… Qua đề tài này, nhóm sẽ đi sâu phân tích nhằm giúp thầy và các bạn hiểu rõ hơn về
phương pháp hiện đại này.


1. Giới thiệu khái quát
1.1.
Khái niệm

HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography),trước kia gọi là
phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ
phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và
hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện
nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho
nghành kiểm nghiệm thuốc. Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa
thành phần cho phép định tính và định lượng.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là
chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân
hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi
bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ
chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử).
1.2.

Quá trình hình thành và phát triển

Ra đời từ năm 1967-1968 tuy nhiên vào cuối những năm 1970, sắc ký lỏng hiệu
năng cao trở thành thuật ngữ phổ biến hơn(prefered), nhấn mạnh sự chia cắt có hiệu
quả đạt được (the effective separations achieved). Thực ra, cột mới hơn và vật liệu
đệm (packing materials) cung cấp hiệu suất cao tại áp suất vừa phải (moderate) ( mặc
dù áp lực cao vẫn liên quan đến dòng lưu lượng (gravity-flow) sắc ký lỏng). HPLC có
thể được áp dụng cho sự phân tích bất kì hợp chất nào mà tan được trong chất lỏng có
thể được dùng như là pha động. Mặc dù được sử dụng thường xuyên nhất như kỹ thuật
phân tích, HPLC cũng có thể được dùng trong chế độ chuẩn bị(preparative mode). Có
nhiều ưu điểm của HPLC vượt qua sắc ký lỏng cột cổ điển áp suất thấp:
- Tốc độ (nhiều phân tích có thể hoàn thành trong 30 phút hoặc ít hơn).
- Một loạt các pha tĩnh.Cách giải quyết được cải thiện.

- Độ nhạy lớn hơn (Nhiều máy dò có thể được tận dụng).
- Mẫu dễ phục hồi (easy sample recovery)(cần sử dụng ít chất rửa giải hơn
(less eluent volume to remove)).
Ứng dụng của HPLC vào phân tích thực phẩm bắt đầu vào cuối những năm
1960, và việc sử dụng nó được tăng lên cùng với sự phát triển của vật liệu đóng cột mà
sẽ tách các loại đường (separate sugars). Sử dụng HPLC để phân tích đường đã có hiệu
quả kinh tế như là kết quả của việc tăng giá đường giữa những năm 1970, thúc đẩy các
nhà sản xuất nước giải khát dùng syrup bắp có hàm lượng fructose cao thay thế cho
đường. Kiểm tra hàm lượng chất tạo ngọt bằng HPLC đảm bảo chất lượng sản phẩm
tốt. Những ứng dụng thực phẩm đầu vào(early food) khác bao gồm phân tích dư lượng
thuốc trừ sâu ở rau quả, acid hữu cơ, lipid, acid amin, độc tố ( như độc tố nấm
mốc(aflatoxins) trong đậu phộng), và vitamin. HPLC tiếp tục được ứng dụng vào
những chất này, và nhiều hơn, thực phẩm liên quan đến kỹ thuật phân tích ngày nay.

3


2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và
lọai sắc ký.
- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha
đảo.
- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion.
- Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết.
- Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử.
Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một
pha động.
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C…
Vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C... Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua

cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác.

F

Chất phân tích
A+B+C
Pha động

Pha tĩnh

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước
tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại.
Đối với mỗi chất,sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1,F2,F3.Trong đó F1 và
F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn.
Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với
chất phân tích ra khỏi cột.
Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất
khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi
cột (như hình dưới đây).

F
F

4


Hình 1:Phần minh hoạ quá trình tách các chất A và B trongcột tách sắc ký
3. Phân loại sắc ký

Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loại như sau:

3.1.

Sắc ký hấp phụ

Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh,yếu khác nhau của pha tĩnh đối với
các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột.Sự
tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong trường
hợp này có 2 loại hấp phụ:
- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP - HPLC): Pha tĩnh phân cực,pha động không
phân cực.
- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực,pha động
phân cực.
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách hỗn hợp các chất có tính
chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như
các vitamin,thuốc hạ nhiệt, giảm đau...
Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại sắc ký này, chủ yếu là sắc ký hấp phụ pha
đảo (RP).
Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau:
- L1: RP 18 kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm.
- L7: RP 8 kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm.
- L3: Si 60 kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm.
Và còn một số loại cột khác như cột Diol, cột NH2,CN ...
3.2.

Sắc kí trao đổi ion:
5


Sự trao đổi ion là sự gắn kết có tính chất thuận nghịch giữa các phân tử có
mang điện tích. Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang

điện tích. Giả sử cho đi ngang qua cột một hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều
lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan nào có mang điện tích ngược dấu với điện
tích của nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan sẽ đuổi đối ion hC ra thế chỗ vào, để
gắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong cột, trong khi đó những chất
khác của hỗn hợp mẫu chất ban đầu sẽ không bị giữ lại nên đi ra khỏi cột. Kỹ thuật
này tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu.
RG- + S+ ------> RG-S+ + C+
Hoặc RG+ +S- ---> RG+S- + C
Trong đó: R là pha tĩnh hay gọi là nhựa (resin), G là nhóm chức mang điện tích
được cố định trên pha tĩnh hay còn gọi là nhóm chức họat động của nhựa. C là
đối ion của G. S là chất hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G. Các loại hạt
nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate.
• Các bước trong sắc ký trao đổi ion:
- Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột: Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên
dưới cột. Nhựa trao đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa và
thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra những bọt khí
nằm giữ các hạt nhực. Để yên 5-10 phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột bằng
dung dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa lắng xuống. Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân
bằng cột bằng chách cho dung dịch đệm chày qua cột, cuối cùng kiểm tra pH của dung
dịch chảy ra khỏi cột.
- Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp
vào cỗt, lọc bằng tờ giấy lọc hay ngang qua một lớp celite. Lượng mẫu tùy vào lượng
nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa. Điều quan trọng nhất là làm sao để cho tất
cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất được hấp thu hết vào nhựa, tức là chú ý số
lượng mẫu hơn là thể tích của mẫu. Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ mức dung dịch
đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại. Dùng pipet hút và đặt dung dịch
mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên đầu cột. Để yên
10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa.
- Khi tất cả mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban
đầu chảy qua, nối cột với bình cung cấp dung dich giải ly.

- Giải ly bằng cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu đang gắn
vào nhựa trao đổi ion trong dung dịch đệm có nồng độ thấp. Để có thể tách mẫu chất
ra khỏi nhựa thường, cần phải gia tăng lực ion của dung dịch đệm bằng cách cho thêm
NaCl. Khi có thêm NaCl trong dung dịch đệm, ion của dung dịch đệm sẽ cạnh tranh
với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy những nhóm chức họat động cảu nhựa, đẩy hợp
chất ra khỏi nhựa, rồi theo dòng chảy đi ra khỏi cột.
• Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một
điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện
tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethylcellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương
tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương
(như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAEcellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm,
thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ
chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những
protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein
6


tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm
muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám
vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương
được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.
•

Phép sắc kí trao đổi ion của protein:
Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một
điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm
pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là phương
pháp sắc ký trao đổi ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một
điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện
tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethylcellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương

tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương
(như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm,
thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ
chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những
protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein
tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm
muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám
vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương
được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.

7


Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion

8


Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion.
(a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm. Protein
tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó.
(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như
hạt thay thế những ion dương tương tác với protein.
3.3.

Sắc kí ái lực:

Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh
sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa
học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh

sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị.
Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những
protein khác thì không. Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm
dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với
Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột.

9


Hình 3: minh họa cho cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái lực
Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã,
những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự
DNA. Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn
vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và
được giữ lại. Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với
dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu
giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng thể. Nhìn
chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biết
một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được
gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để
loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng
dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái
lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được
dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao.
Sắc kí phân bố lỏng-lỏng hay sắckí chiết:
Sự phân biệt giữa sắc kí phân bố lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ
sắc kí phân bố lỏng-lỏng còn được gọi là sắc kí chiết, pha tĩnh là chất lỏng pha động
cũng là chất lỏng, sự phân bố chất phân tích giữa hai pha lỏng giống như quá trình
chiết, còn sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào hai pha không cần
xét tới lỏng hay rắn.

3.4.

10


Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc kí phân bố lỏng-lỏng và sắc kí hấp phụ là ở
chỗ: sắc kí phân bố lỏng-lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn ,
phương pháp có độ nhạy cao nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững,
hiện tượng trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm.
3.5.
Sắc kí rây phân tử hay sắc kí gel:
Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong
lòng chất rắn, còn gọi là mao quản có kích thước cỡ phân tử. Các phân tử chất phân
tích có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Các
chất phân tích có kích thước lớn không thể đi sâu vào pha tĩnh được, sẽ bị rửa giải
nhanh còn các phân tử chất phân tích có kích thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ bị
rửa giải chậm. Thứ tự rửa giải là các chất có kích thước nhỏ đi ra sau và ngược lại.
Thời gian lưu của các chất tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử của chúng. Tuy nhiên
chất phân tích có thể có tương tác với pha tĩnh. Như vậy một phép sắc kí có thể tách
theo một hay nhiều cơ chế khác nhau.
4. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

11


Hình 2:Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký
đồ

T0 : Thời gian lưu chết
t’r1 : Thời gian lưu thực chất A

t’r2 : Thời gian lưu thực chất B
tr1 : Thời gian lưu chất A
tr2 : Thời gian lưu chất B
Từ các thông số của các đỉnh (peak) trên đây, nhiều đại lượng đặc trưngvề lý
thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký. Dưới đây là một số đại lượng
thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá trình phân
tích sắc ký.
4.1.

Thời gian lưu thực t’r : Retention time

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng địnhvà các
chất khác nhau thì thờigian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn.
Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
- Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của
pha động.
Trong một phép phân tích nếu t r nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu t r quá lớn thì
peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo
theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoáchất, độ chính xác của phép phân
tích kém.
Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày.
12


4.2.


Hệ số dung lượng K’: Capacity Factor

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai
pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trongpha tĩnh và lượng chất
tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.
K’ = ( tR– t0)/t0
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị doãng. Trong
thực tế K’ từ 1- 5 là tối ưu.
4.3.

Độ chọn lọc α

Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi 2 chất A, B có
K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở Độ chọn lọc α
α = K’B/ K’A Với điều kiện K’B> K’A với α càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng.

4.4.

Số đĩa lý thuyết N

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc
ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều
cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà
trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất
tan trong pha tĩnh và pha động.
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
- Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh.
- Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực)của pha động.
- Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột.

Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối
với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau:
N = 5,54 (tr / W0,5)2
Trong đó: tR: Thời gian lưu của chất phân tích.
W0,5: Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak.
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.
4.5.

Độ phân giải R: (Resolution)

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trênmột
điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của 2 peak cạnh nhau phải được tính theo công
thức sau:
13


R= 2( t’RB - t’RA)/ (WA + WB)
Trong thực tế nếu các peak cân đối (Gass) thì độ phân giải tối thiểu để 2 peak
tách là R=1,0.Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp.
 Nếu R nhỏ thì các peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak sẽ không
chính xác,lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau:
- Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động (Thay đổi
độphân cực nếu là RP - HPLC, thay đổi cường độ ion nếu là IE - HPLC...)
- Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có
kích thước nhỏ hơn.
- Làm tăng độ chọn lọc α bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá trình
tách hoặc thay đổi thành phần pha động.
 Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy sẽ
kém.

Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung
môi. Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi thì một số pha
động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến
thời gian lưu và diện tích của các peak ta phân tích.
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi mà chủ yếu là
chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong quá
trình phân tích.
4.6.

Hệ số không đối xứng T: ( Tailing factor)

Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc ký
đồ thu được.
T được tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa peak tại điểm 1/10 chiều cao peak:

Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm
đến hệ số không đối xứng T.
 Khi T ≤ 2.5 thì phép định lượng được chấp nhận.
 Khi T > 2.5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định,vì vậy phép định lượng cần
phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho peack cân đối hơn theo các cách sau:
- Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đến Detector.
- Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.
- Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm thể
tích tiêm mẫu.

14


5. Hệ thống HPLC


Máy HPLC gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trong sơ đồ sau:

Trong đó:
1- Bình chứa dung môi pha động
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4-Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample)
5-Cột sắc ký (Pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bể điều nhiệt)
6- Detector (nhận tín hiệu)
7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu và xử lý dữ liệu và điềukhiển hệ
thống HPLC.
8- In dữ liệu.
5.1.

Bình đựng dung môi

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp.Cho
phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỉ lệ mong
muốn và tổng tỉ lệ dung môi của 4 đường là 100 %.
Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng đường dung môi cùng
một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 3và 2 đường để cho hệ pha động luôn được
pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định. Hiện
4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradient dung môi theo thời gian
và công tác xây dựng tiêu chuẩn.
Lưu ý :
- Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và
cóghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích.
- Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu vàpha hệ đệm phải được sử dụng là
hóa chất tinh khiết phân tích.
15



Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp
trong quá trình phân tích .
5.2.

Bộ khử khí Degasse

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi
pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt
khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời
gian lưu của peak thay đổi .
- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì
có thể bơm sẽ không hút được dung môi (bị e), khi đó áp suất không lên và
máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động.
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai.
5.3.

Bơm Cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm
phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at (1at=0.98
bar) và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999ml/phút (hiện nay
đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar).
Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar. Tốc độ
dòng 0.1-9.999 ml/phút.
Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 pistone để
thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục.
5.4.


Bộ phận tiêm mẫu ( injection)

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương phápkhông ngừng dòng chảy. Với
dung tích của đường cong kín (loop) là 5-100 µl. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột:
Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample).
5.5.

Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30cm,
đường kính trong 1-10mm, hạt chất nhồi cỡ Ф= 5-10 µm (ngoài ra còn có một số
trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt...).
Với chất nhồi cột cỡ Ф = 1.8-5 µm có thể dùng cột ngắn (3-10 cm) và nhỏ
(đường kính trong 1-4.6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao.
Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23,24
có tiêu chuẩn hóa các lọai cột).
Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan
hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các
loại hạt khác như: Nhôm Oxit, Polyme xốp, chất trao đổi ion.
Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp
hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column).
16


5.6.

Detector


Là bộ phận Phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký
đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà
người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng
nồng độ nhất định của chất phân tích.
A=k.C
Trong đó : A là tín hiệu đo được
C Nồng độ chất phân tích
k là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn
Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế,
độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất...
Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau:
- Detector quang phổ tử ngoại 200-380 nm để phát hiện UV.
- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190-900 nm để phát hiện
các chất hấp thụ quang, đây là loại thông dụng nhất.
- Detector huỳnh quang đến phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự
nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang. Là loại Detector có độ chọn
lọc cao nhất.
- Loại hiện đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi)
các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ
hấp thu cực đại củacác chất.
Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là :
- Detector điện hóa: Đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng...).
- Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các
chất đường).
- Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt...
5.7.

Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang. Trong các máy thế hệ cũ thì

sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều
cao...
Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả
các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải...
trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của
người sử dụng như: nồng độ, RSD,...
5.8.

In kết quả

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy
để hoàn thiện hồ sơ .
6. Sắc kí lỏng ghép hai lần khối phổ:
17


Sắc ký ghép khối phổi hay tên tiếng Anh là Liquid chromatography–mass
spectrometry (LC-MS/ hoặc HPLC-MS) là một kỹ thuật hóa học mà gắn kết tiềm năng
phân tích lý học của sắc ký lỏng (hay HPLC) với một khả năng phân tích khối (mass
analysis) của cơ chế khối phổ (mass spectrometry). Thiết bị LC-MS là một kỹ thuật
đầy tiềm năng sử dụng trong nhiều ứng dụng có độ nhạy và tính chọn lọc cao. Nhìn
chung các ứng dụng đó có định hướng phát hiện chung và xác định các chất hóa học
trong sự có mặt của các chất hóa học khác (trong một hợp chất phức tạp).
Hệ thống chuẩn bị công việc của LC-MS có thể dùng làm tính khiết các khối và
nhanh của các chất chiết xuất trong tự nhiên và các phân tử mới quan trọng với thực
phẩm, dược phẩm, hóa chất nông nghiệp và ngành công nghiệp khác.
Hạn chế của LC-MS là phân tích/sàng lọc thuốc trong nước tiểu thường khó có thể
phân biệt giữa các chất chuyển hóa đặc biệt với nhau, đặc biệt với hydrocodone và các
chất chuyển hóa của nó. Phân tích nước tiểu bằng LC-MS được dùng để phát hiện các
phân loại đặc biệt cho thuốc. Tuy nhiên, sắc ký khí (Gas chromatography_GC-MS)

nên được sử dụng khi phát hiện các thuốc đặc hiệu và chất chuyển hóa khi yêu cầu.
Được ứng dụng trong:
- Phân tích và đánh giá chất lượng thuốc (thuốc giả và thuốc kém chất lượng)
- Nghiên cứu phân tích kháng thuốc điều trị.
- Phân tích và đánh giá dược động học trên súc vật thực nghiệm được thử
thuốc.
7. Chọn điều kiện sắc ký

Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất
cho một hỗn hợp mẫu. Các điều kiện đó bao gồm:
 Pha tĩnh:
- Loại pha tĩnh
- Kích thước cột
 Pha động :
- Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ... nếu là chương trình rửa
giải Isocratic.
- Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung môi...
nếu là chương trình rửa giải Gradient.
- Hệ thống trang bị:
• Loại Detector
• Van tiêm mẫu, thể tích tiêm
• Hệ đường dẫn
- Các yếu tố khác: nhiệt độ, độ nhạy của detector bước sóng phân tích.
7.1.

Lựa chọn pha tĩnh

Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong
mẫu phân tích... ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp. Thông thường dùng hai loại là cột pha
thuận (NP), cột pha đảo (RP). Ngoài ra có thể dùng một số loại cột khác như cột CN,

cột NH2,...
18


-

Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính
• Pha tĩnh:Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít
phân cực. Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực
ưa nước.

Ví dụ: cột Lichrosorb Si 40,Si 60... Cấu tạo cột như sau:

•

Pha động: dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít
phân cực như: Methanol, Benzen, Acetonitril, Chlorofoc...
- Cột pha đảo (RP): (Silicagel đã Alkyl hóa): Dùng để tách các chất không
phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp Ion. Trên bề mặt
hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng
các mạch Carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay các
mạch Carbon vòng (Phenyl- tương đương cột Phenyl) vì thế nó ít phân cực
hay phân cực rất ít. Ví dụ như cột Lichrosor -Lichrospher RP 8 ...... ODS,
cột Nucleosil C18...
• Pha Động: Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực
như: Methanol, Acetonitril, nước hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp
của các dung môi-đệm.
Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ
yếu trong phân tích dược phẩm. Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu.
Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào

nhóm thế của nguyên tử H, ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền oxit nhôm, trên
nền chất hữu cơ cao phân tử, trên nền mạch cacbon...
7.2.

Lựa chọn pha động

Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong
mẫu phân tích... ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn
các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày, đồng thời
phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian
phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị.
Pha động có thể làm thay đổi :
- Độ chọn lọc α
- Thời gian lưu
- Hiệu năng tách của cột
- Độ phân giải
- Tính đối xứng của Peak
Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần
19


phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân
tích. Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau :
- Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có.Không được làmcho pha tĩnh bị biến
đổi hóa học (vd giá trị pH: 2.5< pH <8.5).
- Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng
(đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù
hợp để không làm kết tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong
cột. Vd: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên
cột).

- Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất
là không bị phân hủy trong suốt thời gian phân tích mẫu).
- Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân
tích.
- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phải phù hợp với loại Detector: Vd UV - VIS thì dung môi không được hấp
thụ quang (vd acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm), Detector huỳnh
quang thì dung môi không được phát quang.
- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt. Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP HPLC) pha động có dung môi phân cực là: Nước, ACN, MeOH, acid hay
Base hữu cơ vàmột vài Amin hay Aminoacid ..
- Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực
hơn khi đứng một mình. Ví dụ thêm nước vào ACN hay MeOH... Sẽ tạo
được pha động phân cực hơn nó. Tất nhiên độ phân cực phụ thuộc vào tỷ lệ
nước được thêm vào.
- Ngòai các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều
trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định pH.
Chất tạo phức, tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất.
- Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo
bảng sau:
Stt
01
02
03
04
05
06

Dung môi
n Hexan
Tetra Chloro Carbon

Toluen
Methanol
Actenitril
Nước cất

Độ phân cực
0.1
1.6
2.4
5.11
5.8
10.20

Bảng 1: Bảng độ phân cực của một số dung môi
Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây
dựng chương trình sắc ký. Chỉ khi lựa chọn điều kiện sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta
mới có thể định tính, định lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách nhanh
chóng và hiệu quả cao.
Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc ký
tuy nhiên để chọn được chương trình sắc ký tốt đồi hỏi phải có thời gian, tài liệu và
một phần kinh nghiệm của những người làm sắc ký.
8. Kỹ thuật tiến hành sắc ký
20

10.20
5.11


Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt

cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng,
năng lượng đèn... đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.
Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi
có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký:
Ví dụ :
- Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: rửa bằng MeOH, không rửa bằng nước.
- Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì phải
rửa nước trước cho sạch muối, sau đó rửa với hỗn hợp ACN hay MeOH và nước (Tỷ lệ
ACN hay MeOH: nước (50:50) cho sạch hếtcác chất còn đọng lại trong cột đồng thời
để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để
cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được.
Lưu ý nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các
yêu cầu phân tích).
8.1.

8.2.

Chuẩn bị dung môi pha động

Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC.
Các hóa chất dùng phải là loại PA.
Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để dung môi ổn định
đúng thời gian theo yêu cầu. Lọc dung môi qua màng lọc 0.2- 0.45 µm. Siêu âm đuổi
bọt khí.
8.3.

Chuẩn bị mẫu đo HPLC
-

-


8.4.

Mẫu Thử : Qui trình xử lý mẫu thử đúng theo nguyên tắc:
• Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều
trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.
• Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được
bằng cách lọc hay chiết.
• Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0.2-0.45 µm.
• Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có
thể gây ra nghẽn cột.
Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong
cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt
nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng
tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.

Cách đo HPLC

Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm
sắc ký. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải tuân theo nguyên tắc sau:
- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí cótrong hệ thống ống
dẫn trước khi cho vào cột.
- Đạt đầy đủ các điều kiện sắc ký như :
• Cấu hình máy
• Tỷ lệ các dung môi pha động
21


•


Bước sóng,thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu
cầu.

9 . Ứng dụng của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính:
9.1. Định tính và khử độ tinh khiết
Thời gian lưu của chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
đối chiếu tên sắc ký đồ.
9.2. Sắc ký điều chế
Qua quá trình sắc ký, các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng riêng rồi cho
bốc hơi dung môi thu lấy chất. 9.3. Định lượng Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn
trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất. Các phương pháp định
lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỉ lệ với chiều cao hoặc điện
tích pic của nó. Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC:
9.2.1. Phương pháp chuẩn ngoại
Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều
được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so sánh diên tích (hoặc chiều cao) pic
thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ.
9.2.2. Phương pháp chuẩn nội (internal standard method)
Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất thứ hai có thời gian lưu
và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn
thứ hai gọi là chất chuẩn nội.
9.2.3. Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation)
Nguyên tắc: hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được
tính bằng tỉ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành
phần trên sắc đồ. Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được
phát hiện, và tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như nhau. + Áp dụng: ít dùng để
định lượng, chỉ dùng trong xác định hàm lượng tạp chất khi coi đáp ứng của các chất là như
nhau.
9.3. Một số ứng dụng khác

9.3.1. Ứng dụng HPLC trong phân tích mẫu tại CASE

Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân
tích định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược phẩm, thực phẩm, môi
trường, hóa chất,… Thiết bị HPLC cũng ngày càng phát triển và hiện đại hơn nhờ sự
phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo và sản xuất thiết bị phân tích.
Để đảm bảo chất lượng kết quả phân tích nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu
khác nhau, đáp ứng được nhu cầu phân tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã
đầu tư các hệ thống HPLC hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất
thiết bị phân tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex
(UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò như quang phổ tử ngoại
khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion-IC), khối
phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự động nhằm
nâng cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu.
Ứng dụng HPLC trong phân tích mẫu tại CASE
- Phân tích đa lượng vitamin, kháng sinh, kháng khuẩn, chất bảo quản phụ gia thực
phẩm, các loại đường,… trong thực phẩm, dược liệu, hóa chất, phân bón, thức ăn gia
súc,…
22


- Phân tích vi lượng các vitamin trong trái cây, sữa, bánh kẹo, nước, thủy hải sản.
- Phân tích dộc tố sinh học biển trong nghêu (ASP).
- Phân tích các hoạt chất, tạp chất trong dược phẩm theo các dược điển BP, USP, EP,
JP,…
- Phân tích các acid hữu cơ.
- Đặc biệt, hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang có độ nhạy và tính chọn lọc cao có
thể phân tích các độc tố Mycotoxin trong thực phẩm, nguyên liệu chế biến và thức ăn
gia súc như Aflatoxin, Orchatoxin, Zearalenone,…
9.3.2. Ứng dụng trong dược liệu


Sắc ký lỏng cao áp có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự
nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng. Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng
cao áp là có thể phân tích được rất nhiều loại hợp chất khác nhau. Tuy hiệu năng tách
của sắc ký lỏng cao áp không cao bằng sắc ký khí nhưng khả năng phân tích của nó
rộng hơn nhiều. Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích các chất từ chất phân cực
tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung
tính tới các chất điện ly. Tính linh hoạt của sắc ký lỏng cao áp cũng cao hơn các
phương pháp khác nhờ các cơ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng, phong phú. Với
hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như vậy, sắc ký lỏng cao áp hiện vẫn là
lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất.
Sắc ký lỏng cao áp thường được sử dụng nhất trong định lượng riêng lẻ các chất
trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu khi so sánh diện tích đỉnh với chất
chuẩn trong cùng điều kiện phân tích. Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi
mới để nâng cao hiệu năng tách, detectorngày càng nhạy, sắc ký cao ngày nay có thể
dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt.
Sắc ký lỏng cao áp hiện nay cũng đang được quan tâm trong phân tích điểm chỉ
các chất trong hỗn hợp. Với sắc ký điểm chỉ, người ta có thể xác định nguốn gốc xuất
xứ của dược liệu, phân biệt dược liệu với các loài tương cận, xác định các nguyên liệu
khác pha trộn vào dược liệu, xác định các sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn
hiệu… So với sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao áp có hiệu năng tách cao hơn nên cho
các kết quả điểm chỉ chi tiết và nhiều giá trị hơn. Khi kết hợp với các thiết bị quang
phổ hiện đại, sắc ký lỏng cao áp cung cấp nhiều thông tin giá trị trong việc xác định
các chất. Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các thiết bị ghép nối LC-MS-NMRCD để phân tích thành phần các dịch chiết và xác định cấu trúc các chất trong hỗn hợp
mà không cần tách riêng các chất.
Một ứng dụng khác của sắc ký lỏng cao áp là phân lập các chất tinh khiết
(HPLC điều chế). Về nguyên tắc, sắc ký lỏng cao áp điều chế chia sẻ mọi nguyên lý
của HPLC phân tích. Điểm khác biệt duy nhất là hệ thống sử dụng cột sắc ký lớn hơn,
với lượng pha tĩnh nhiều hơn để có thể phân tích được nhiều mẫu hơn và các chất tách
ra khỏi cột được thu lại để có được các chất tinh khiết. Theo truyền thống, các cột có

đường kính trong lớn hơn 4,7mm có thể được xem là cột bán điều chế. Các cột chế
điều chế quy mô phòng thí nghiệm có kích thước thay đổi từ 1 – 10 cm. Trong quy mô
công nghiệp, các cột sắc ký lỏng cao áp điều chế có thể có đường kính trong tới 100
cm. So với sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp có chi phí cao hơn nên thường chỉ sử
dụng trong các trường hợp không tác được bằng các phương pháp sắc ký cột thông
thường hay MPLC.
23


KẾT LUẬN:
Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế
giới. Việt Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện
cuộc sống ngày càng cao, nên đòi hỏi phải có những công nghệ kỹ thuật hiện đại để
đáp ứng nhu cầu. Bên cạnh đó cũng có một số ít người, vì lợi nhuận cá nhân mà bất
chấp tất cả. Ngày nay, để kiểm soát kiểm tra tình hình chất lượng hàng hoá để đáp ứng
nhu cầu cuộc sống như: thực phẩm, dược phẩm, hoá chất… Vì thế kỹ thuật sắc ký
càng có vai trò lớn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng mà kỹ thuật này hoàn
toàn đảm đương được nhưng yêu cầu trên. Ví dụ như: kiểm tra dư lượng kháng sinh
(nitrofuran, tetracycline…) trong thuỷ sản, kiểm tra dư lượng hoocmon (clenbuterol,
salbutamol…) kích thích tăng trưởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra dư lượng màu đã bị
cấm có trong thực phẩm và mỹ phẩm như: Sudan có trong trứng gia cầm và trong son
môi, 3 MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) có trong nước tương, formone có trong
bánh phở, xác định một số phương pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ sự phát triển
của các nấm mốc gây độc (có độc tố Aflatoxin) trong các lô hàng nông sản dự trữ và
xuất khẩu đặc biệt đậu tương và lạc …Trong công nghiệp dược phẩm, sơn: Kiểm tra
hàm lượng hoạt chất chính trong dược phẩm, dư luợng chất có thể gây độc hại…
Ngoài ra còn ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như quan trắc, môi trường… Vì vậy,
với từng mục đích sử dụng mà ta có thể chọn một phương pháp sắc ký phù hợp để
phân tích mẫu tương ứng.


24