ĐẶT VẤN ĐÊ
Trở về với thiên nhiên đang là xu hướng chung của nhân loại trên nhiều lĩnh vực,
trong đó có dược phẩm. Chính vì lẽ đó, nghiên cứu về cây thuốc và các hoạt chất có
nguồn gốc thiên nhiên đang là một trong những vấn đề được quan tâm hàng đầu của
nhiều nhà khoa học trên thế giới.Trong đó, việc nghiên cứu về các hợp chất thiên
nhiên có tác dụng chống oxy hóa ngày càng được quan tâm và có tiềm năng ứng
dụng rất lớn.
Theo đông y, phúc bồn tử ( Rubus idaeus L.) là một trong những vị thuốc có tác
dụng chống oxy hóa rất tốt. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hợp chất
anthocyanin trong phúc bồn tử giữ vai trò chính trong tác dụng chống oxy hóa.
Anthocyanin trong quả phúc bồn tử có hàm lượng khá cao nên việc chiết xuất
anthocyanin là hoàn toàn khả thi và có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn.
Tuy nhiên, việc chiết xuất bằng dung môi với những kĩ thuật cổ điển thường tốn
nhiều thời gian và mang lại hiệu quả thấp. Hơn nữa, nhiệt độ chiết xuất trong một
thời gian dài có thể gây ra sự thay đổi cấu trúc các anthocyanin và làm giảm đi hoạt
tính chống oxy hoá của những dược chất này. Theo các nghiên cứu gần đây,
phương pháp chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm với nhiều tính năng ưu việt
đã được ứng dụng rộng rãi. Chính vì thế, trong phạm vi bài báo cáo này chúng tôi
quyết định chọn đề tài: “ Chiết xuất và phân lập các anthocyanin từ Rubus idaeus
với sự hỗ trợ của sóng siêu âm” với các mục tiêu:
-

Chiết xuất và phân lập anthocyanin bằng phương pháp chiết siêu âm.

-

Xác định các anthocyanin thu được bằng HPLC-MS.

-

So sánh kết quả thu được với phương pháp chiết xuất thông thường.

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Khái niệm về siêu âm:[1]

1.1.1. Định nghĩa siêu âm:
Sóng âm thanh là những dao động cơ học trong một chất rắn, chất lỏng, chất
khí. Siêu âm là sóng âm có tần số trên 20 KHz mà con người không thể nghe
thấy.Âm thanh mà con người nghe được có tần số từ 1–16 KHz.

Thiết bị tạo siêu âm (sừng siêu âm), thanh titan được ngâm vào trong
dung dịch phản ứng để truyền động thông qua sự rung.
1.1.2. Lợi ích của siêu âm trong chiết xuất:
Chiết xuất nhờ siêu âm là một cách hiệu quả để thu được một lượng đáng kể
những chất cần phân tích từ nhiều loại mẫu khác nhau. Nhiệt độ và áp suất rất cao
tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình hòa tan, khuếch tán, vận chuyển, thâm nhập
xảy ra dễ dàng hơn. Các quá trình trên phụ thuộc vào năng lượng siêu âm và một
chất nền rắn, kết hợp với năng lượng oxy hóa những gốc tự do (hydroxyl và
hydrogen peroxide) tạo ra trong suốt quá trình phân tích sẽ mang lại năng suất chiết
xuất cao.
Tác động cơ học của siêu âm làm cho dung môi thấm sâu hơn vào cấu trúc tế
bào và cải thiện khả năng chuyển khối. Siêu âm cũng có thể phá vỡ vách tế bào, tạo
điều kiện cho hoạt chất được giải phóng. Sự phá vỡ vách tế bào và khả năng chuyển


khối cao là hai yếu tố chính làm tăng hiệu quả chiết xuất khi sử dụng sóng siêu âm.
Những hình ảnh hiển vi điện tử đã chứng minh tác động cơ học của siêu âm, chủ
yếu là sự phá vỡ vách tế bào và giải phóng hoạt chất.

Sóng siêu âm đã được sử dụng để chiết xuất nhiều nhóm hợp chất từ dược
liệu, ví dụ như tinh dầu, chất béo, và những chất bổ sung dinh dưỡng. Mason và
cộng sự đã đưa ra một cái nhìn tổng quát về ứng dụng của siêu âm trong công nghệ
thực phẩm. Còn Vinatoru lại phác họa tổng quan về việc sử dụng siêu âm để chiết
xuất những chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu.
Chiết siêu âm được xem như là một phương pháp hiệu quả để chiết xuất
những chất có hoạt tính sinh học từ Solvia officinalis (Salisova và cộng sự, 1997) và
hoa Hibiscus tiliaceus L. (Melecchi và cộng sự, 2002), những chất chống oxi hóa từ
Rosmarinus officinalis (Albu và cộng sự, 2004), steroid và triterpenoid từ Chresta
spp (Schinor, Salvador, Turatti, Zucchi và Dias, 2004).
1.1.3. Cơ chế vật lí của siêu âm (Sonophysic):
Trong một chất lỏng, sự dãn nở của sóng âm tạo ra một áp suất âm. Nếu sóng
siêu âm đủ mạnh, nó sẽ tạo ra những bong bóng bên trong chất lỏng. Đó cũng là lúc
áp suất âm vượt quá sức căng cục bộ của chất lỏng, bình thường áp suất âm này phụ
thuộc vào bản chất và độ tinh khiết của chất lỏng. Quá trình sủi bong bóng này chỉ
kéo dài trong vòng 400 µ s. Hầu hết các chất lỏng đều bị nhiễm một lượng lớn
những phần tử nhỏ đủ để làm cho sự sủi bọt khởi đầu dễ dàng hơn ở một áp suất âm
thấp hơn.


Khi sự sủi bong bóng xảy ra trong một chất lỏng gần với bề mặt của một chất
rắn thì động lực học của những bọt nước thay đổi một cách đột ngột. Trong những
chất lỏng tinh khiết, bọt nước vẫn giữ được dạng hình cầu khi chúng xẹp lại, bề mặt
của chúng vẫn không thay đổi. Tuy nhiên, gần tới ranh giới chất rắn, chúng xẹp lại
không đối xứng, tạo ra những tia chất lỏng bắn ra với tốc độ cao. Năng lượng điện
thế của quá trình dãn nở bọt nước sẽ chuyển thành năng lượng động học trong một
tia chất lỏng, nó sẽ di chuyển suốt bên trong và xuyên qua thành đối diện của bọt
nước. Những tia chất lỏng bắn ra với tốc độ gần 400 km/giờ và va chạm mạnh với
bề mặt chất rắn. Điều này có thể gây ra những tổn thương nghiêm trọng tại vùng va
chạm và làm cho bề mặt tiếp xúc có khả năng phản ứng lại ở mức độ cao.


Ảnh được chụp bởi máy quay vi phim cảm ứng laser tốc độ cao. Sự tạovỡ bọt gần bề mặt phân cách rắn lỏng, một vòi rất nhỏ được hình thành, bắn
vào bề mặt rắn với vận tốc xấp xỉ 400Km/giờ (111 m/s)
Sự sủi bọt nhờ sóng siêu âm này cho ta thấy mối liên quan độc nhất vô nhị
giữa năng lượng và vật chất. Nhiệt độ và áp suất cao được tạo ra sẽ dẫn đến sự hình
thành của những gốc tự do và nhiều hợp chất khác.Tầm quan trọng của quá trình sủi
bong bóng đối với hóa học siêu âm không phải là làm thế nào mà hình thành được


những bọt nước mà ở chỗ điều gì sẽ xảy ra khi những bọt nước này xẹp lại. Chúng
có thể không hấp thu năng lượng từ sóng siêu âm nữa và sẽ nổ tung. Sự nén ép đoạn
nhiệt nhanh chóng của những chất khí và hơi bên trong những bọt nước tạo ra nhiệt
độ và áp suất cực lớn. Kích thước của những bọt nước rất nhỏ, tương ứng với thể
tích chất lỏng, vì vậy, nhiệt độ do nó sinh ra có thể biến mất một cách nhanh chóng
mà không cần có sự thay đổi đáng kể của điều kiện môi trường. Sau khi những bọt
nước xẹp lại, nhiệt độ hạ xuống với tốc độ khoảng 10 tỉ 0C/giây (nhanh hơn một
triệu lần khi chúng ta nhúng một thanh sắt nóng đỏ vào trong nước).

Hot spot có nhiệt độ xấp xỉ 5000oC, áp suất khoảng 1000atm, thời gian
sống ngắn hơn 1microsecond, tốc độ gia nhiệt và làm lạnh 10 tỉ độ C/giây.
1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu âm:
Sự phân phối sóng siêu âm trong máy chiết cũng là một thông số quan trọng
để thiết kế một máy chiết tốt. Năng lượng siêu âm đạt tối đa ở gần bề mặt của đầu
dò. Càng xa đầu dò, cường độ siêu âm giảm khá đột ngột. Sự hiện diện của những
tiểu phân rắn càng làm giảm cường độ của siêu âm. Vì vậy, để tránh việc cản trở


đường đi của sóng siêu âm hay sự hình thành những khối rắn, người ta thường
khuấy hoặc lắc dung dịch.
Để đạt được hiệu quả chiết xuất cao, chúng ta cần chú ý đến những đặc điểm

của dược liệu (độ ẩm, kích thước tiểu phân) và dung môi chiết xuất. Thêm vào đó,
có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của sóng siêu âm như tần số, áp suất,
nhiệt độ và thời gian chiết xuất.
Tần số của sóng siêu âm ảnh hưởng lớn đến khối lượng dịch chiết, và nó phụ
thuộc vào bản chất của dược liệu. Một sự thay đổi tần số nhỏ thôi cũng có thể làm
tăng khối lượng dịch chiết khoảng 32% trong trường hợp chiết Pyrethrine từ hoa
Cúc với dung môi hexan rắn. Tuy nhiên, khi chiết xuất dầu hạt cây Tùng Lam thì
siêu âm lại có ảnh hưởng kém.
1.1.5. Ứng dụng của siêu âm trong phân tích:
Trong hóa học phân tích, sóng siêu âm được sử dụng như một công cụ gia
tốc cho quá trình phân tích. Do đó, sóng siêu âm sẽ giúp ích rất nhiều trong việc xử
lý những mẫu rắn. Chẳng hạn, nó sẽ tạo điều kiện dễ dàng và nhanh chóng trong
việc chiết xuất những hợp chấp hữu cơ và vô cơ, quá trình đồng nhất hóa, khí dung
hóa…
Sóng siêu âm có thể làm tăng khối lượng chiết xuất. Sharma và Gupta (2004)
tìm ra rằng việc xử lí trước với sóng siêu âm đã mang lại khối lượng lớn những chất
dầu từ quả hạnh, quả mơ và cám gạo. Sản lượng dầu chiết xuất từ hạt đậu tương
cũng tăng rõ rệt nếu sử dụng siêu âm (Li và cộng sự, 2004). Khi chiết saponin từ
nhân sâm bằng siêu âm, tổng lượng dịch chiết thu được tăng 15% và lượng saponin
thu được tăng 30% (Hui và cộng sự, 1994).
Sóng siêu âm còn làm tăng động học chiết xuất, nghĩa là quá trình chiết xuất
sẽ diễn ra nhanh hơn, và thậm chí còn cải thiện chất lượng dịch chiết. Cravotto và
cộng sự (2004) đã chỉ ra rằng việc chiết xuất dầu từ cám gạo được thực hiện một
cách hiệu quả trong vòng 30 phút dưới cường độ cao sóng siêu âm với dung môi là
hexan hoặc dung dịch kiềm. Tốc độ chiết xuất Carvone và Limonene bằng siêu âm


nhanh gấp 1,3 đến 2 lần so với những phương pháp cổ điển phụ thuộc nhiệt độ
(Chemat và cộng sự, 2004). Hơn nữa, khối lượng và chất lượng của Carvone khi
chiết bằng siêu âm cũng tốt hơn. Sóng siêu âm còn được áp dụng trong kỹ thuật

Soxhlet để chiết xuất chất béo từ những hạt có dầu như hướng dương, cải dầu và
đậu tương, thời gian chiết xuất giảm ít nhất một nửa so với các phương pháp cổ
điển mà thành phần dịch chiết thì không đổi (Luque-Garcia và Luque de Castro,
2004). Wu và cộng sự (2001) đã chiết xuất Saponin từ nhân sâm bằng siêu âm, thời
gian chiết xuất tăng gấp 3 lần so với phương pháp Soxhlet cổ điển.
1.1.6. Nhược điểm, ưu điểm của chiết siêu âm:
Ưu điểm:
 Đơn giản, rẻ tiền và hiệu quả cao hơn những phương pháp cổ điển.
 So với những kỹ thuật khác như chiết vi sóng thì chiết siêu âm rẻ tiền hơn và
vận hành dễ dàng hơn.
 Lợi ích chính của việc sử dụng siêu âm trong chiết lỏng-rắn là sự tăng khối
lượng dịch chiết và rút ngắn thời gian chiết.
 Hơn nữa, chiết siêu âm cũng giống như chiết bằng Soxhlet, có thể dùng bất
kì dung môi nào để chiết xuất những hợp chất thiên nhiên đa dạng.
 Giảm được nhiệt độ và áp suất khi chiết. Chẳng hạn khi chiết xuất Pyrethrine
từ hoa Cúc bằng hexan rắn mà không sử dụng siêu âm, khối lượng dịch chiết
sẽ tăng theo nhiệt độ chiết xuất và khối lượng tối đa thu được ở 66 oC. Trong
khi sử dụng sóng siêu âm, ảnh hưởng của nhiệt độ trong khoảng 40 – 60 oC
trên khối lượng dịch chiết là không đáng kể. Vì vậy, chiết siêu âm thích hợp
với những chất không chịu được nhiệt độ cao khi chiết bằng Soxhlet. Tuy
nhiên, bởi vì sóng siêu âm cũng có thể sinh ra nhiệt, nên chúng ta phải chú ý
điều chỉnh nhiệt độ chiết xuất cho phù hợp. Thời gian chiết xuất cũng nên
được xem xét cẩn thận, nếu vượt quá giới hạn cho phép có thể sẽ làm hỏng
chất lượng của dịch chiết.


Nhược điểm:
 Tuy nhiên, ảnh hưởng của siêu âm lên khối lượng dịch chiết có thể liên quan
đến bản chất của dược liệu.
 Sự hiện diện của pha phân tán góp phần làm yếu đi sóng siêu âm và hoạt

động của siêu âm bên trong máy chiết chỉ giới hạn ở vùng gần bộ phận phát
sóng. Vì vậy, hai yếu tố này cần được xem xét kỹ lưỡng khi thiết kế máy
chiết siêu âm.
1.1.7. So sánh với các phương pháp khác:
Trong nhiều trường hợp, chiết xuất nhờ siêu âm là một lựa chọn hiệu quả, rẻ
tiền, nhanh chóng hơn những kỹ thật chiết xuất cổ điển, và trong một vài trường
hợp, nó còn hơn cả các phương pháp khác như vi sóng hay dùng CO 2 siêu tới hạn.
Tuy nhiên siêu âm vẫn có những nhược điểm riêng của nó cần được cân nhắc trước
khi sử dụng.
1.1.7.1 Chiết siêu âm và vi sóng:
Ưu điểm của chiết siêu âm so với vi sóng:
 Đôi khi nhanh hơn.
 Chiết siêu âm an toàn hơn chiết vi sóng nếu ta có sử dụng acid vì nó không
đòi hỏi nhiệt độ hay áp suất cao.
 Quá trình vận hành đơn giản hơn.
Nhược điểm của chiết siêu âm so với vi sóng:
 Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất
chiết.
 Kích thước hạt là nhân tố quyết định trong chiết siêu âm.
1.7.1.2. Chiết siêu âm và chất lỏng siêu tới hạn:
Ưu điểm của siêu âm so với so với chất lỏng siêu tới hạn:


 Dụng cụ đơn giản hơn vì vậy chi phí tiêu hao sẽ thấp hơn.


Có thể áp dụng đối với nhiều hợp chất, kể cả phân cực và không phân cực, vì
vậy có thể sử dụng bất kì dung môi nào. Trái lại, CO 2 siêu tới hạn chỉ dùng
để chiết xuất những hợp chất không phân cực.


Nhược điểm của siêu âm so với chất lỏng siêu tới hạn:
 Trong vài trường hợp, chiết bằng CO2 siêu tới hạn sẽ đơn giản và nhanh hơn.
 Không giống những dung môi chiết siêu âm (cyclohexane, tetrahydrofuran,
hỗn hợp dichloromethane và acetone), CO2 siêu tới hạn không gây ô nhiễm
môi trường.
 Chiết siêu tới hạn thường rõ ràng, chính xác hơn có lẽ là do nó sử dụng một
bể chứa thay vì một đầu dò như chiết siêu âm.
1.7.1.3. Chiết siêu âm và Soxhlet:
Ưu điểm của siêu âm so với chiết bằng Soxhlet:
 Sự sủi bong bóng làm gia tăng sự phân cực của hệ thống, bao gồm dung môi,
chất phân tích và chất nền, điều này sẽ làm tăng hiệu quả chiết xuất.
 Có thể thêm một chất hỗ trợ để tăng hơn nữa độ phân cực của pha lỏng.
 Thích hợp với chất không chịu nhiệt, những chất này sẽ bị biến đổi nếu chiết
bằng Soxhlet.
 Thời gian chiết xuất ngắn hơn.
Nhược điểm của siêu âm so với chiết bằng Soxhlet:
 Dung môi không thể được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy
hiệu lực của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly.
 Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm
mất một lượng dịch chiết hoặc dịch chiết có thể bị nhiễm bẩn. Trong khi
chiết bằng Soxhlet chỉ tốn một lượng nhỏ dung môi.


1.1.8. Trang thiết bị:
Có hai thiết bị cơ bản dùng trong phương pháp siêu âm là bể nước và đầu dò.
Mặc dù bể nước đã được sử dụng rộng rãi hơn nhưng chúng vẫn có hai bất lợi chủ
yếu có thể làm giảm độ lặp lại và độ sao chép của thí nghiệm.
Thứ nhất là sự giảm năng lượng theo thời gian, vì vậy năng lượng cung cấp
cho bể nước sẽ lãng phí. Đầu dò siêu âm có một điểm thuận lợi hơn bể nước là nó
tập trung năng lượng trên một vùng cố định, vì vậy mà quá trình sủi bong bóng diễn

ra hiệu quả hơn.
Thứ hai là sự phân phối năng lượng siêu âm không đồng đều, chỉ có một
phần nhỏ thể tích chất lỏng tiếp xúc trực tiếp với nguồn năng lượng siêu âm mới
xảy ra sự sủi bong bóng.
1.1.9. Chiết siêu âm cải tiến:
Người ta cải tiến khả năng xử lí mẫu bằng cách chiết siêu âm liên tục. Ưu
điểm chính của quá trình chiết này là ít tốn mẫu và thuốc thử, đó là những hóa chất
cần cho sự hòa tan và liên quan đến tốc độ chiết xuất.
Sự hữu ích của chiết siêu âm liên tục đã được chứng minh bằng việc chiết
chất sắt trong nguyên liệu thực vật…Sự hình thành phức hợp giữa sắt và 1,10phenanthroline đã mang lại những kết quả phù hợp với phương pháp cổ điển sử
dụng phổ hấp thu nguyên tử sau khi xử lí bằng acid nóng. Thời gian chiết siêu âm
liên tục chỉ có 5 phút so với 40 phút của phương pháp cổ điển mà kết quả vẫn tương
tự.
Có 2 hệ thống chiết siêu âm liên tục:


Hệ thống kín: dung môi có thể tích nhất định chảy liên tục qua mẫu rắn.
Việc điều khiển dung môi có thể không đổi trong suốt quá trình chiết xuất
hoặc được thay đổi sau những khoảng thời gian nhất định bằng cách lập trình
sẵn. Với cách này, dung môi sẽ đi tới đi lui qua mẫu, vì vậy sẽ tránh được sự
kết hợp lại thành khối rắn chắc của mẫu và sự gia tăng áp suất bên trong


máy. Hệ thống này còn có ưu điểm là dịch chiết ít bị pha loãng. Trong một
hệ thống kín, một van có thể chệch hướng với dịch chiết để tập hợp dịch
chiết vào trong một lọ nhỏ bằng thủy tinh hoặc chuyển nó đến một ống góp
để tiếp tục phân tích (ví dụ như cô, phát hiện bằng detector…). Điều này làm
cho hệ thống vận hành hoàn toàn tự động.



Hệ thống mở: dung môi tinh khiết chảy liên tục qua mẫu, vì vậy trạng thái
cân bằng chuyển khối được thay thế bởi quá trình hòa tan những chất phân
tích vào pha lỏng. Quá trình này có nhược điểm là làm loãng dịch chiết. Việc
kết hợp dụng cụ chiết với những bước phân tích khác ví dụ như chiết pha rắn
vẫn chưa được thực hiện mặc dù sự kết hợp này có thể làm giảm sự pha
loãng dịch chiết.


Hình 1. Hai hệ thống chiết siêu âm liên tục.
LC, leaching carrier; PP, bơm nhu động; UP, đầu dò siêu âm; EC, bình
chiết; WB, bồn nước; W, chất thải; SV, van chọn lọc; EX, dịch chiết;
E, dung môi rửa giải; IV, van tiêm; SPC, cột pha rắn; DR,
derivatization reagent; RC reaction coil; D, detector.


1.2.
1.2.1
-

Tổng quan về phúc bồn tử:
Phúc bồn tử:
Tên khoa học: Rubus idaeus L.
Tên khác: Mâm xôi đỏ.
Họ: Hoa hồng ( Rosaceae).
1.2.1.1.
Hình thái[2]:

Cây nhỡ, thân bụi, cao khoảng 1.5 mét, lá kép có từ 3 đến 5 lá chét, lá chét
giữa thường lớn hơn và có cuống dài hơn so với các lá chét còn lại. Cụm hoa
hình chùm, nhiều nhị, nhiều lá noãn đỏ, khi chín tạo thành quả kép có mảu

đỏ tươi, vị chua, ăn được.
1.2.1.2. Phân bố sinh thái:
Rubus idaeus phân bố rộng khắp ở các khu rừng Châu Âu. Hiện nay được
trồng nhiều ở một số tỉnh Trung Quốc.
Ở Việt Nam, có một số loài như Rubus alceaefolius, Rubus cochinchinenis
mọc hoang ở các vùng rừng núi phía Bắc.
1.2.1.3.
Bộ phận dùng: quả, thu hái khoảng từ tháng 7 đến tháng 9.
1.2.1.4. Thành phần hoá học chính:
Quả phúc bồn tử chứa nhiều anthocyanin, Vitamin A, Vitamin C và các acid
amin.
1.3.
Tổng quan về Anthocyanin:[3]
1.3.1. Tính chất
Anthocyanin tồn tại đa số trong các thực vật bậc cao, được tìm thấy trong một số
loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá
tía tô, hoa hibicut, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ...
Thuộc nhóm euflavonoid, có cấu trúc 2 phenylbenzopyrilium.


Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực
nên tan tốt trong các dung môi phân cực
Trong cây hầu hết anthocyanin ở dạng glycosid nằm trong dịch tế bào, dễ bị thuỷ
phân cho ra phần aglycon khi đun với dung dịch HCl 20% ( được gọi là
anthocyanidin)
Màu sắc của anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào pH môi trường. Cấu trúc của
anthocyanidin là 1 cation, trong dung dịch acid có pH 1-4 tạo muối có màu đỏ.
Trong môi trường kiềm pH > 6 là anion cũng tạo được muối với các chất kiềm có
màu xanh.
Dung dịch anthoccyanidin mất màu bởi bisulfit kiềm và dễ bị oxy hoá.

1.3.2. Công dụng
- Chống oxy hoá: Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng anthocyanin có khả năng
chống oxy hoá cao. Theo Joseph et al[4] anthocyanin được chiết xuất từ các loại
trái cây có hiệu quả trong việc làm chậm sự lão hoá và làm giảm sự suy thoái
-

của các tế bào thần kinh.
Làm bền thành mạch và giảm tính thấm thành mạch[5]
Chống ung thư [6] : một nghiên cứu trên chuột cho thấy các anthocyanin chiết
xuất từ khoai tây tím và cải bắp đỏ có khả năng ngăn chặn ung thư ruột già gây
ra bởi 1,2-dimethylhydrazine (DMH) and 2-amino-1-methyl- 6-phenylimidazo

-

pyridine.
Ngoài ra, do có màu sắc tự nhiên và các tác dụng trong y học nên các
anthocyanin còn được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chế biến thực phẩm.



CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM
2.1 Chiết xuất Anthocyanin toàn phần từ quả phúc bồn tử:
2.1.1. Quy trình chiết xuất được hỗ trợ bởi sóng siêu âm
- 60 ± 0.5g mẫu quả ướp lạnh được làm nát thành những mảnh có kích thước 3-4
mm và cho vào bình 2 cổ có chứa sẵn dung môi chiết xuất HCl 1.5M : ethanol 95%
(15:85) với hệ thống làm lạnh (dung tích bình được chọn dựa vào khả năng hòa tan
của mẫu trong dung dịch chiết xuất).
- Bình được ngâm vào bể nước lạnh có kích thước 250 x 240 x 150mm trong buồng
siêu âm với nguồn phát sóng siêu âm có công suất 650W, đường kính đầu phát siêu
âm 8mm được đặt vào bể ở vị trí ½ chiều cao bể, tần số phát siêu âm 22kHz. Nhiệt

độ được duy trì dưới 400C bằng cách thay thế nước trong bể bằng nước lạnh (15 0C).
- Bình được lấy ra và làm nguội đến nhiệt độ phòng bằng nước lạnh. Lọc qua giấy
lọc Whatman No.1 dưới chân không và dung dịch được thu gom vào bình định
mức. Phần còn lại được chiết xuất lần nữa với cùng điều kiện. Các anthocyanin qua
2 lần chiết xuất sẽ được dùng để phân tích.
2.1.2. Quy trình chiết xuất truyền thống[8]:
- 60 ± 0.5 g mẫu quả được ướp lạnh được làm nát thành những mảnh có kích thước
3-4mm, hòa tan và điều chỉnh với 240ml HCl 1.5M : ethanol 95% (15:85) và đáy
bình được làm lạnh.
- Nhiệt độ chiết xuất được thiết đặt ở 71 ± 10C.
- Quá trình chiết xuất được lấy ra sau 12, 20, 30, 60 phút tương ứng. Các
anthocyanin chiết xuất được làm lạnh đến nhiệt độ phòng, lọc qua giấy lọc
Whatman No.1 dưới chân không và cho vào bình định mức.
- Phần còn lại được chiết tiếp với cùng điều kiện và toàn bộ được dùng để xác định
anthocyanin
2.1.3. Tinh khiết hóa các Anthocyanin[9]:
- Nhựa Amberlite CG-50 (50g mỗi lần) được hydrate hóa bằng cách cho vào becher
thêm ít nước và gạn, lặp lại vài lần. Nhựa sau khi trương nỡ được nạp vào cột kích
thước 26 x 400 mm.


- Bơm xấp xỉ 15ml dịch chiết xuất vào đầu cột, đợi cho đến khi nhựa chuyển sang
màu đỏ do hấp thu các anthocyanin.
- Đường, acid và hợp chất khác được loại ra khỏi cột bằng cách rửa cột với 100ml
nước.
- Chất màu được tách ra bằng cách rửa cột với ethanol có chứa HCl 0.01% (khoảng
50ml) cho đến khi nhựa trở lại màu sắc ban đầu. Dịch ethanol acid cho vào máy cô
quay ở 450C dưới chân không đến khi ethanol bay hơi, phần còn lại sẽ hòa tan với
acid HCl 0.5%. Dung dịch được bảo quản ở 200C để phân tích.
2.1.4. Tối ưu hóa điều kiện chiết siêu âm và chiết xuất các anthocyanin từ phúc

bồn tử bằng CCRD (a Central Composite Rotate Design)
Quá trình chiết xuất các anthocyanin có thể bị ảnh hưởng bởi 3 yếu tố: thể tích của
dung môi thêm vào có thể bay hơi dẫn đến không tương tác hoàn toàn với mẫu; thời
gian siêu âm cũng như năng lượng đặt vào sẽ tác động đến việc tạo ra các vi bọt
trong lòng chất lỏng, điều đó sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất. Kết quả điều tra
sơ bộ điều kiện chiết xuất siêu âm đã xác định rằng lượng anthocyanin toàn phần
chiết xuất từ phúc bồn tử phụ thuộc rất lớn vào tỉ lệ dung môi:mẫu, thời gian chiết
xuất, và năng lượng siêu âm, do đó một thiết kế mô hình phức hợp xoay quanh điểm
trung tâm (CCRD) để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất siêu âm và kiểm tra nhanh ảnh
hưởng của 3 biến số trên chiết xuất anthocyanin toàn phần từ phúc bồn tử. Một sơ
đồ hoàn chỉnh liên quan đến 20 điểm thử nghiệm thu được của các điểm chính
được mô tả ở bảng 1.


Các mô hình hồi qui đã được dự đoán (1) như sau
Y = 32.448 - 0.195115X1 + 2.189794X 2 + 7.847823X3 - 2.193626X12 - 5.400365X32 , R 2 = 0.8933 (1)

Ở đó, có thể thay đổi mã +1, 0 và -1, minh họa trong bảng 1, khi sử dụng nên thay
thế giá trị mã trên.
Việc phân tích phương sai cho các mô hình này đã được đưa ra trong bảng 2.


Theo mô hình này, giới hạn tuyến tính của năng lượng siêu âm ( X 2 , α < 0.05 ), thời
gian chiết xuất (X3, α < 0.01 ), giới hạn bậc hai của dung môi ( X12 , α < 0.05 ) và thời
gian chiết xuất ( X 32 , α < 0.01 ) rất có ý nghĩa. Kết quả đề nghị rằng việc thay đổi thời
gian chiết siêu âm và năng lượng siêu âm có ảnh hưởng quan trọng trong chiết xuất
các anthocyanin. Ngược lại, sự tương tác giữa tỉ lệ dung môi:mẫu và thời gian chiết
xuất (X1X3), tỉ lệ giữa dung môi:mẫu và năng lượng siêu âm (X 1X2) và năng lượng
siêu âm với thời gian chiết xuất (X 2X3), giới hạn phương trình bậc hai của năng
lượng siêu âm ( X 22 ) không có ý nghĩa.

Trong khi đó, các mô hình trọn vẹn bao gồm mức độ tuyến tính ( α < 0.01 ) và cấp
bậc hai ( α < 0.01 ) tất cả đều đạt mức có ý nghĩa, điều đó biểu thị đầy đủ giá trị kinh
nghiệm đã được dự đoán trước. Sự tối ưu hóa điều kiện chiết xuất siêu âm bao gồm
từ việc phân tích sơ bộ tương ứng như sau: thời gian chiết xuất 200s, năng lượng
siêu âm 400W và tỉ lệ dung môi:mẫu là 4/1. Dưới những điều kiện này, giá trị
anthocyanin toàn phần thực nghiệm (34.5mg/100g) gần với giá trị dự đoán ban đầu
(35.3mg/100g) tính toán từ đa thức tương ứng kiểu công thức đã cho. Do đó, CCRD
đã thành công trong việc dự đoán hiệu suất chiết xuất các anthocyanin từ quả phúc
bồn tử bằng kỹ thuật chiết siêu âm.
Ngoài ra, khi một trong những yếu tố đã được điều chỉnh đến giá trị tối ưu từ thực
nghiệm CCRD thì ảnh hưởng của các yếu tố khác được trình bày bởi biểu đồ đường
viền tối ưu.



Biểu đồ đường viền tối ưu xác định cho chúng ta thấy việc tăng giá trị năng lượng
siêu âm và thời gian chiết xuất sẽ mang lại hiệu quả trong chiết xuất anthocyanin
toàn phần. Tuy nhiên, sự thay đổi thời gian chiết xuất có ảnh hưởng quan trọng đến
hiệu suất hơn năng lượng siêu âm. Khi thời gian chiết xuất nhỏ hơn 120s thì sự tăng
năng lượng cũng khó có thể thúc đẩy hiệu suất tăng lên. Hiệu suất chiết tăng tỉ lệ
thuận với thời gian chiết xuất và đạt tối ưu tại thời điểm 200s và sau đó sẽ giảm
xuống. Điều này nói lên rằng thời gian chiết xuất quá dài thì sự phân hủy các
anthocyanin có thể xảy ra. Tương tự như vậy, khi thời gian chiết xuất được hiệu
chỉnh ví dụ ở 250s thì hiệu suất chiết sẽ tăng lên tỉ lệ thuận với năng lượng siêu âm
và đến một lúc nào đó thì giảm xuống bởi vì dưới tác động của năng lượng siêu âm
lớn thì ảnh hưởng hóa học sẽ xảy ra và mức độ ảnh hưởng đó được mô tả bởi nhiều
phương pháp như phép đo KI[10].
Sự tạo ra vi bọt khí xảy ra trong nước sản sinh gốc hydroxyl làm phân hủy hóa
học[11] [12], và nó là một sản phẩm cản trở trong nghiên cứu bởi vì sẽ làm giảm
hiệu suất chiết anthocyanin được quy cho sự phân hủy anthocyanin liên quan đến

sản sinh gốc tự do khi dùng siêu âm có năng lượng lớn trong thời gian dài, chúng ta


cần nghiên cứu kỹ hơn để xác định cơ chế. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi:mẫu và
thời gian chiết xuất đến hàm lượng anthocyanin toàn phần tại mức năng lượng
400W được phản ánh ở Fig.3. Chúng ta thấy rằng, khi tỷ lệ dung môi: mẫu được cố
định, với sự tăng thời gian chiết xuất, hiệu suất chiết tăng lên dần dần và đạt tới
đỉnh và sau đó giảm xuống. Tương tự như vậy khi thời gian chiết xuất được cố định.
Khi thời gian chiết xuất 200s và tỉ lệ dung môi:mẫu là 4/1 thì hiệu suất chiết thu
được là cao nhất. Do đó, có thể nói rằng thời gian chiết xuất và năng lượng siêu âm
đóng vai trò nổi bật trong hiệu suất chiết anthocyanin từ phúc bồn tử, liên quan đến
việc gia tốc sự phá vỡ mô và xâm nhập của chất tan từ mô dưới ảnh hưởng của bọt
khí sinh ra do sóng siêu âm.
2.1.5. Kết quả chiết xuất:
Tiến hành chiết xuất với những điều kiện tối ưu:
-

Tỉ lệ dung môi và dược liệu: 4:1(ml/g).
Thời gian chiết xuất: 200s

- Năng lượng siêu âm: 400W
Ta thu được 34,5 mg anthocyanidin từ 100g quả tươi. Khoảng 78.13% tổng số bột
màu đỏ. Các anthocyanin được xác định bởi HPLC-MS và kết quả là 12 loại
anthocyanin đã được xác định, trong đó có 8 loại anthocyanidin đặc trưng.
2.1.6. So sánh 2 phương pháp:
Comparison of optimum results between UAE and conventional solvent extraction
Solvent/sample(
Temperatur Extraction yield
Method
Time(min)

ml/g)
e(0C)
(mg/100g wet)
Conventional
5/1
53
71
35.1±0.5
Ultrasonication

4/1

3.3

-

34.5±0.5

Có thể thấy, hiệu suất chiết xuất (TAcys ) đã gần như bằng nhau với cả hai phương
pháp, tuy nhiên, phải mất 53 phút với phương pháp thông thường để chiết xuất 35,1
mg Acys từ 100 g phúc bồn tử đỏ và chỉ mất 3,3 phút với UAE để có được 34,5 mg
Acys. Hơn nữa, tỷ lệ dung môi và mẫu dược liệu trong phương pháp thông thường
lớn hơn phương pháp UAE. Vì vậy, chiết xuất thông thường mất nhiều thời gian và


dung môi hơn. Việc sử dụng siêu âm trong chất lưu xung quanh là nguyên nhân tạo
ra các hốc. Các hốc này dùng để hình thành phát triển và bị đè bẹp quá mức của các
vi bọt trong một chất lỏng đánh sóng do sự biến động áp suất.
Như vậy, So với chiết bằng dung môi thông thường thì kĩ thuật chiết siêu âm mang
lại hiệu quả cao và nhanh hơn đáng kể do sự tác động của sóng siêu âm lên cấu trúc

mô dược liệu.
So sánh sự khác nhau của cấu trúc vi mô của phúc bồn tử sau khi chiết xuất đã được
thực hiện nhờ kính hiển vi điện tử quét (SEE scanning electron microscopy). Để
quan sát được bằng SEE mẫu phải được chuẩn bị như sau, sau khi chiết bằng
phương pháp thông thường và siêu âm lần lượt tùng mẫu được thêm 2.5%
glutaraldehyde và 1% axit osmic (acid của osmi, có tính chất ăn da là một tác nhân
oxy hóa mạnh mẽ và dễ bay hơi, các dung dịch của đó được sử dụng như một chất
nhuộm cho chất béo và myelin và dùng như là một chất định hình cho kính hiển vi
điện tử) trong 12 h, và sau khi dehydrate bằng dung dịch đệm ethanol với nồng độ
lần lượt: 30%, 50%, 70%, 90%, 100% cho mỗi 15 phút. Sau đó, các mẫu đã được
làm khô tới điểm tới hạn, và quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét Hitachi S-5000
Cấu trúc của phúc bồn tử đỏ sau khi UAE đã lỏng lẻo hơn so với sau khi chiết bằng
phương pháp thông thường. Các hốc, sự tỏa nhiệt và các hoạt động cơ học hình
thành do sự chiếu xạ sóng siêu âm là nguyên nhân gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý
của dược liệu, dẫn đến việc di chuyển trực tiếp của các thành phần Acys mong
muốn vào dung môi xung quanh.
Trong quá trình chiết xuất thông thường một dung môi nóng khuyếch tán chậm qua
tế bào dược liệu hòa tan và mang theo hoạt chất. Từ so sánh trên cho thấy chiết
UAE hiệu quả hơn và nhanh hơn.


Hình chụp bằng kính hiển vi điện tử
quét sau khi chiết xuất phúc bồn tử
đỏ
a. Phương pháp thông thường
(rất ít tế bào bị phá vở bằng
cách đun nóng)
b. Chiết xuất với sự hổ trợ của
siêu âm (nhiều tế bào dược
liệu bị phá vở do sóng siêu

âm)