XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁ NH TRÌNH TƢ̣ VÙ NG ĐIỀU KHIỂN DLOOP DNA TY THỂ CỦ A GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (611.49 KB, 31 trang )

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
................ ...................

VŨ THỊ NHƢ TRANG

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
................ ...................

VŨ THỊ NHƢ TRANG

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO

SO SÁNH TRÌ NH TƢ̣ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY

SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA

THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

Chuyên ngành : SINH HỌC THƢ̣C NGHIỆM
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS. TS Nguyễ n Trọng lạng

THÁI NGUYÊN, 2009

THÁI NGUYÊN, 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Lời cam đoan

LỜI CẢM ƠN
Tác giả chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của PGS .TS Nguyễn

Tôi xin cam đoan đây là công trì nh nghiên cứu của tôi . Các kết quả, số
liệu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ
công trì nh nào khác .

Trọng Lạng trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này .
Tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo Khoa
Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , phòng thí nghiệm của Khoa Hóa

Tác giả luận văn

an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam, phòng thí nghiệm
công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học

Vũ Thị Nhƣ Trang

và Công nghệ Việt Nam và một số gia đì nh ở Cao Thượng

- Tân Yên - Bắc

Giang đã tạo điều kiện giúp đỡ tận tì nh trong việc nghiên cứu t

hực nghiệm

của đề tài.
Cuối cùng tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban giám
hiệu, Khoa Sau đại học , Ban chủ nhiệm Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm
Thái Nguyên đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành bản
luận văn này .
Tác giả
Vũ Thị Nhƣ Trang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Nhƣ̃ng tƣ̀ viết tắt

Danh mục các bảng

Bảng

Tên bảng

DNA

Deoxyribonucleotide acid

RNA

Ribonucleotide acid

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleoside triphosphate

bp

Base pair

EDTA

Ethylene diamine tetra – acetic acid

3.2

Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu

33

EtBr

Ethidium bromide

3.3

Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so

43

Kb

Kilo base

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNase

Ribonuclease

gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

gallus gốc Nhật mã số AB114078

TAE

Tris- acetate-EDTA

COI

Cytochrome oxidase I

PBS

Phosphate Buffer Saline

epp

eppendorf

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.1

Trang

Kết quả c hiều cao và diện tí ch peak cholesterol chuẩn ở

20

các nồng độ khác nhau
3.1

Kết quả chiều cao và diện tí ch peak cholesterol trong trứng

32

của các mẫu nghiên cứu

với gà Ri
3.4

3.5

Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với

Hệ số tương đồng về tr

ình tự nucleotide vùng D -loop ở

43

45

mẫu nghiên cứu với một số mẫu trên GenBank

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Danh mục các hì nh

MỤC LỤC
Lời cam đoan

Hình

Tên hì nh

Trang

Lời cảm ơn

1.1

Cấu trúc hoá học của cholesterol

6

Danh mục các bảng

1.2

Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus

12

Danh mục các hì nh

2.1

Đường chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak

20

Mở đầu .......................................................................................................... 1

chuẩn cholesterol
2.2

1.Đặt vấn đề .................................................................................................. 1

Đường chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak

21

chuẩn cholesterol
3.1

2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2

Biểu đồ hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu

33

nghiên cứu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc gia cầm ................................................................................. 3

3.2

Kết quả điện di DNA tổng số

35

1.1.1 Gà Á ............................................................................................. 4

3.3

Kết quả điện di sản phẩm PCR

36

1.1.2 Gà Ri............................................................................................. 5

3.4

So sánh trình tự đoạn D -loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre

41

1.1.3 Gà Tre. .......................................................................................... 6

với gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà

1.2 Cholesterol .............................................................................................. 6

Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078
3.5

Quan hệ di truyền của một số giống gà

1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol của trứng gà ............................. 6
46

1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người ......................................................... 7
1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể ..................................................... 7
1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình
thường. .......................................................................................................... 8
1.3 Đặc điểm DNA ty thể .............................................................................. 10
1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể ............................... 10
1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể ...................................... 11
1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà....................................... 12
1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam ........... 14
1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới ........................ 14
1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ........................ 16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Mở đầu

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đặt vấn đề

2.1 Vật liệu .................................................................................................. 18

Hiện nay, ngành chăn nuôi có những bước phát triển mạnh mẽ với xu

2.1.1 Nguồn gốc mẫu ........................................................................... 18

hướng chăn nuôi theo con đường công nghiệp hoá. Đặc biệt, ngành chăn nuôi

2.1.2 Đị a điểm thí nghiệm .................................................................... 18

gia cầm đang được quan tâm hàng đầu vì nó có khả năng cung cấp một lượng

2.2 Hoá chất và thiết bị ................................................................................. 18

lớn sản phẩm trứng, thịt giàu chất dinh dưỡng, dễ chế biến và phù hợp với

2.2.1 Hóa chất ....................................................................................... 18
2.2.2 Thiết bị sử dụng .................................................................... 18
2.3 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 19
2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol ................ 19
2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử ..................................................... 22

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật ......... 22
2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................. 25

nhu cầu của tuyệt đại đa số người dân.
Sự phát triển nhanh chóng của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã
tác động đến ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta về cơ cấu, quy mô, loại
hình...chăn nuôi. Số đàn gia cầm có số lượng lớn và cơ sở chăn nuôi tập trung
với quy mô lớn tăng lên. Một số giống gà nước ta có nhiều ưu điểm như phẩm
chất thịt, trứng thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng thích nghi cao

2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR ............... 26

với nhiều điều kiện sống của địa phương, chống chịu tốt với điều kiện khí hậu

2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................... 29

khắc nghiệt.

2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA. ................................... 31

Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chất

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 31

và tinh thần của con người được nâng cao. Chất lượng bữa ăn trong gia đình

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

đã được cải thiện rất nhiều. Cũng chính vì lí do đó, hiện nay con người đã

3.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu .................. 33

mắc rất nhiều bệnh khác nhau. Trong đó, một trong những bệnh điển hình khi

3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng

chất lượng bữa ăn nâng cao đó là bệnh về tim mạch, xơ vỡ động mạch, huyết

di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu ............................................................... 35

áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não...

3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà ........................... 35

Những bệnh đó chiếm khoảng 25% tổng số nguyên nhân tử vong ở các nước

3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ............................. 36
3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ........... 37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận .................................................................................................... 48
2. Đề nghị ..................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................. 50
PHỤ LỤC .............................................. 54

phát triển thuộc thế giới tây phương. Có nhiều nguyên nhân k hác nhau dẫn tới
nhưng căn bệnh như trên , nhưng một nguyên nhân rất quan trọng đó là do
hàm lượng cholesterol trong cơ thể cao. Khi chế độ ăn uống thay đổi thì hàm
lượng cholesterol cũng thay đổi theo. Những nguồn thực phẩm giàu
cholesterol đó là những loại thức ăn có nguồn gốc động vật nhất là bầu dục,
não, tim, lòng đỏ trứng... Do sở thích và tình hình kinh tế, nhiều người rất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1

thích ăn trứng gà và coi đó là nguồn thực phẩm chính trong gia đình. Trong
trứng, đặc biệt là lòng đỏ có hàm lượng cholesterol rất cao. Có nhiều loại

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc gia cầm

trứng khác nhau như trứng gà, trứng chim, trứng vịt... Mỗi giống gà khác

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết

nhau thì trứng có hàm lượng cholesterol cũng khác nhau. Như vậy việc lựa

luận rằng: gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus. Gà

chọn loại trứng vừa đảm bảo dinh dưỡng vừa đáp ứng nhu cầu, sở thích của

rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa. Cơ

mỗi cá nhân mà vẫn bảo vệ sức khoẻ là rất quan trọng.

sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về đặc điểm

Đồng thời cùng với sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử, chúng tôi
muốn xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua
nghiên cứu trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của các giống gà đó.

hình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập
tính hoạt động.
Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu:

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Xác định
hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-

Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, mào và dái tai lớn, mỏ hơi
cong và nhọn.
Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ,

loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang”.

mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ.

2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 3 giống gà.

Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu

- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của
3 giống gà.

đỏ, mỏ tương đối ngắn.
Từ 3 loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các

- Đánh giá quan hệ di truyền giữa các giống gà.

giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày nay.
Theo Nguyễn Ân (1983) [1], vị trí của gà nhà được sắp xếp trong hệ

3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng gà Ri, gà Ác, gà Tre.

thống giới động vật như sau:

- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của gà Ri, gà Ác,

Giới động vật (Animal)

gà Tre.

Ngành động vật có xương sống (Chordata)

+ Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên.

Lớp chim (Aves)

+ Nhân vùng D-loop bằng kĩ thuật PCR.

Bộ gà (Galliformes)

+ Xác định trình tự vùng D-loop và so sánh trình tự đó giữa 3 giống gà

Họ Trĩ (Fasianidea)

trên.

Chủng Gallus (giống gà Bankip )

- Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu với một số

Loài Gallus gallus.

giống gà đã được công bố trình tự vùng D-loop.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3

Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba
Tư. Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của

lưng, ra mồ hôi trộm, chân tay yếu mỏi, tạng yếu, rất tốt cho người ốm dậy và
sau khi sinh.

châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước

Người ta đã thụ tinh nhân tạo thành công trên gà Ác để tạo ra giống gà

Anh, sau đó là Mỹ, các giống gà này được lai tạo thành nhiều giống gà có

cho nhiều trứng trong thời gian sớm nhất. Theo PGS.TS Trịnh Công Thành,

năng suất cao hơn.

Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, đây là lần đầu tiên người ta áp

Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú,

dụng biện pháp thụ tinh nhân tạo trên giống gà Ác giữa dòng gà Ác có lông

Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện nay

chân và dòng gà Ác không có lông chân. Kết quả, qua 5 thế hệ chọn lọc và tạo

nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà

dòng, nhóm nghiên cứu đã tạo ra 2 dòng gà Ác mới là gà Ác có lông chân và

Đông Tảo, gà Vàng …

gà Ác không có lông chân cho sản lượng trứng cao (38/100 con cho trứng) mà

1.1.1 Gà Ác

trước kia là 29/100 con cho trứng).

Gà Ác có tên khoa học là Gallus domestices brisson. Đây là loại gà cỡ
nhỏ đặc biệt được thuần hoá và nuôi dưỡng như các giống gà khác, lông trắng
mượt, toàn bộ da, mắt, thịt và xương, nội tạng đều đen, chân đen có 5 ngón.

1.1.2 Gà Ri
Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta chiếm 70% tổng số gà
trong nước, có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus Bankiva hay Gallus

Trước đây, gà Ác được nuôi chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long và

gallus. Gà có ngoại hình thon, nhỏ, mỏ nhỏ, mào cờ có răng cưa, mào đỏ tươi

miền tây Nam Bộ vì mặc dù là giống gà được coi là vị thuốc quý có thể chữa

rất phát triển ở con trống; dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng. Cổ thanh dài vừa

nhiều bệnh, nhưng không ai dám nuôi tràn lan vì khả năng cho thịt thấp mà

phải, ngực lép, bụng thon, mềm, chân có hai hàng vải màu vàng có khi xen

giá thành lại cao. Nhưng cuộc sống ngày càng đi lên, những đặc sản quý mới

lẫn màu đỏ tươi. Bàn chân có 4 ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống. Màu

được biết hết giá trị của nó. Gà Ác đã được nuôi nhiều ở miền Trung và miền

lông khác nhau ở con mái và con trống. Con mái có màu lông màu vàng rơm,

Bắc như Nghệ An, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Đông Anh, Hưng

vàng đất, nâu nhạt và đốm. Con trống có màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánh

Yên...Lúc này thì người nuôi mới thấy rằng đây là giống gà nhanh nhẹn, chăm

và lông đuôi, lông bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất. Ngoài ra còn có màu lông

chỉ chịu khó nhặt nhạnh kiếm mồi, chịu lạnh tốt và có sức sống cao. Như thế

khác như lông trắng, hoa mơ, đốm trắng...

có thể nuôi được cả quảng canh (nuôi chăn thả) hay nuôi thâm canh (nuôi

Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc nhanh hơn gà Mía, Đông Tảo nên có

chuồng) đều được cả. Phân tích dưới góc độ khoa học, thịt gà Ác rất giàu axit

khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh. Gà Ri đẻ trứng

amin, nhiều canxi, photpho, sắt, protit, lipit. Trứng của chúng tuy nhỏ (chỉ

sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi. Sản lượng trứng của gà mái trong một

khoảng 29-30 g) nhưng tỉ lệ lòng đỏ lại rất cao, đến 34,2% [12].

năm từ 80-120 quả. Khối lượng trứng bình quân là 38 – 42 g. Gà Ri có khối

Theo y học cổ truyền, thịt và xương gà Ác có vị ngọt, tính ấm, không

lượng cơ thể ở tuổi trưởng thành như sau: con trống từ 1,800 g đến 2,500 g,

độc, có tác dụng bổ dưỡng cao. Thịt gà Ác đặc trị các bệnh về phổi, thận, đau

con mái từ 1,300 g đến 1,800 g.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4

5

Đây là giống gà thích hợp với khí hậu và điều kiện chăn nuôi quảng

khác nhau như nội tạng động vật: tim, gan... và đặc biệt trứng gà là loại thực

canh ở nước ta. Gà chịu khó kiếm ăn khi nuôi trong điều kiện chăn thả trong

phẩm có chứa nhiều cholesterol, trong đó chủ yếu là lòng đỏ trứng gà còn

vườn hay ngoài đồng. Hàng ngày người nuôi chỉ phải cho ăn rất ít, một vài

lòng trắng thì tuyệt nhiên không có hoặc rất ít [15], [18], [28].

nắm thóc vãi cho cả đàn khi gọi chúng về chuồng, ngoài ra chúng tự kiếm đủ

1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở ngƣời

khi được thả ngoài vườn [4], [7], [8].

Cholesterol là chất béo steroid rất cần thiết cho cơ thể, có ở màng tế bào
của tất cả các mô trong cơ thể và được vận chuyển trong huyết tương của mọi

1.1.3 Gà Tre
Là giống gà địa phương được nuôi ở một số tỉnh Nam Bộ ở Việt Nam.
Kích thước của gà nhỏ con, gà trống có lông màu trắng, đuôi và cổ đen. Gà
mái màu vàng, thấp chân. Gà trống và gà mái nhỏ hơn gà Ri. Gà Tre có tập
tính là hay bay và đậu trên hàng rào. Người nuôi chủ yếu là nuôi làm cảnh.
Trong những năm gần đây, nhà nước có nhiều dự án nhằm gìn giữ và bảo tồn
quỹ gen của các loại gia cầm của nước ta.

động vật cũng như cơ thể người. Cholesterol trong cơ thể người có 2 nguồn
gốc:
- Cholesterol hấp thụ qua đường tiêu hoá (cholesterol từ thức ăn) hay còn
gọi là cholesterol ngoại sinh (exogenous cholesterol).
- Cholesterol hình thành trong tế bào hay cholesterol nội sinh
(endogenous cholesterol) và chủ yếu được hình thành từ gan [15], [28].
Tuy vậy, tất cả các tế bào trong cơ thể có khả năng tổng hợp một lượng

1.2 Cholesterol

nhỏ cholesterol. Chất này tham gia hình thành cấu trúc tế bào. Khi lượng

1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol của trứng gà
Cholesterol là chất béo steroid, nó kém tan trong nước nhưng tan nhiều

cholesterol hấp thu qua đường tiêu hoá tăng sẽ dẫn đến tăng nhẹ nồng độ

trong mỡ và có thể tạo este với axit béo, nó không thể tan và không di chuyển

cholesterol huyết tương. Tuy nhiên, khi lượng cholesterol hấp thụ tăng sẽ ức

ở dạng tự do ở trong máu. Cholesterol có công thức cấu tạo như sau:

chế một trong những enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp cholesterol nội
sinh. Đây là một yếu tố trong cơ chế điều hoà ngược để điều chỉnh nồng độ
cholesterol trong máu. Chính vì vậy nồng độ cholesterol trong máu dao động
khoảng 15% do ảnh hưởng của cholesterol trong thức ăn. Sự thay đổi lớn của
hàm lượng cholesterol trong khẩu phần có thể dẫn đến làm thay đổi nồng độ
cholesterol trong máu tới 30%. Đồng thời các chất béo bão hoà trong khẩu
phần ăn cũng làm tăng cholesterol từ 15 - 25%.

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của cholesterol

1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể

Nhìn vào công thức cấu tạo ta thấy, cấu trúc cơ bản của cholesterol là

Khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể được chuyển thành cholic

nhân sterol được tổng hợp từ các phân tử axetyl - CoA và một phần phân tử

axit tại gan. Cholic axit sẽ kết hợp với các thành phần khác hình thành muối

của cholesterol là rượi cồn (alcohol). Cholesterol có ở nhiều loại thực phẩm

mật có tác dụng xúc tác trong quá trình tiêu hoá và hấp thụ các chất béo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6

7

- Một tỷ lệ nhỏ cholesterol được sử dụng theo các con đường:

Xơ vữa thành mạch (xơ vữa động mạch) là hiện tượng bệnh lý của lớp

+ Được tuyến thượng thận sử dụng để tổng hợp hormon vỏ tuyến

nội mạc động mạch, đặc biệt là các động mạch lớn dẫn đến sự hình thành các

thượng thận.

mảnh có nguồn gốc chất béo, phá vỡ cấu trúc thành mạch, làm hẹp mạch máu

+ Hình thành estrogen và progesterol tại buồng trứng.

và ngăn cản sự lưu thông của dòng máu . Các biểu hiện bệnh lý

+ Được dịch hoàn sử dụng để tổng hợp testostereone.

đoạn đầu là tổn thương các tế bào nội mạc và lớp tế bào dưới nội mạc. Sự tổn

+ Cholesterol tham gia cấu trúc màng tế bào.

thương thành mạch còn có thể do tác động cơ học của dòng máu và áp lực của

+ Một lượng nhỏ cholesterol có mặt tại biểu bì của da. Cùng với các

động mạch nên vùng tổn thương.

chất béo khác, cholesterol tạo cho da các chức năng:

trong giai

Khi có hiện tượng tổn thương, các tế bào nội mạc sẽ giãn, sưng, phân

+) Kháng lại việc hấp thu các chất hoà tan trong nước

chia. Các tế bào cơ trơn thành mạch cũng có thể có phản ứng tương tự. Tại

+) Kháng tác động của nhiều hoá chất.

thành mạch máu có hiện tượng tập trung nhiều tế bào do sự di chuyển của các

+) Ngăn cản quá trình bốc hơi nước của da [15],[19], [28].

tế bào bình thường đến vùng tổn thương. Ngay sau đó, các thành phần lipit

Như vậy cholesterol có vai trò rất quan trọng trong cơ thể khi hàm lượng

trong máu, đặc biệt là cholesterol sẽ tích tụ lại trong các tế bào đang phân

của nó trong cơ thể ở mức phù hợp. Ở người trưởng thành, cholesterol toàn

chia, hình thành các mảnh xơ. Vì các mảnh này chứa một lượng lớn

phần ở mức bình thường vào khoảng 4-5,6 mmol/lít. Những người có mức

cholesterol nên chúng thường được gọi là chất cholesterol lắng đọng.

cholesterol cao hơn mức này sẽ dẫn đến nhiều bệnh khác nhau.

Tiếp theo sau của quá trình bệnh lý , các tế bào xơ xâm nhập vùng tổn
thương và hình thành các mảnh xơ trong mạch máu.

1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vƣợt quá mức bình thƣờng
Người ta thấy rằng, cholesterol là nguyên nhân gây nên các bệnh tim

Tiếp theo là quá trình lắng đọng canxi làm canxi hoá các mảnh xơ. Đến

mạch, xơ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim,

giai đoạn này, các tổ chức mạch vùng tổn thương trở nên cứng nên được mô

tai biến mạch máu não... Trên thế giới cũng như ở nước ta, các bệnh về tim

tả bởi từ “xơ cứng động mạch” hoặc gọi đơn giản hơn là “hiện tượng cứng

mạch ngày càng tăng và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước.

mạch máu”

Đàn ông có nguy cơ bị bệnh tim cao hơn đàn bà. Ở Mỹ, hàng năm có khoảng

Các động mạch bị xơ cứng gần như mất hoàn toàn khả năng tăng kích

6 triệu người bị bệnh tim và trong số này có khoảng 1,5 triệu bị đau tim và

thước (mất khả năng căng phồng) và dễ bị làm rách , làm thủng . Các phần tử

trong số này có khoảng 1/3 bị chết. Khoảng 1/5 trong số các trường hợp đau

mảnh xơ (có bề mặt thô nhám) có thể di chuyển theo dòng máu dẫn đến nguy

tim không hề có triệu trứng hay cảnh báo trước. Tần suất đàn ông Mỹ bị chết

cơ hình thành các cục máu và huyết khối. Khi các huyết khối có mặt trong

vì bệnh tim là khoảng 200/100.000 dân số. Ở Anh, tỉ suất này là khoảng

động mạch vành của tim hay các động mạch của não sẽ dẫn đến tắc động

250/100.000 dân số [16], [21].

mạch, rối loạn hoạt động của tim, não và gây tổn thương nặng nề cho cơ thể

*Cơ chế gây bệnh xơ vữa động mạch của cholesterol

thậm chí gây tử vong. Các ảnh hưởng tương tự cũng có thể xảy ra khi huyết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9

khối hình thành trong động mạch gan, động mạch thận, động mạch các chi,

năng của những vùng DNA được tăng thêm này chưa được xác định rõ ràng,

động mạch dạ dày, ruột... [16], [21].

nhưng dường như chúng chỉ là những vùng không mã hoá.
Kích thước của mtDNA ở động vật rất nhỏ nhưng tổ chức lại rất chặt

*Biện pháp điều chỉnh cholesterol trong máu

Để giảm hàm lượng cholesterol trong máu có nhiều biện pháp khác nhau

chẽ. mtDNA ở động vật không có vùng intron, có một số gen gối lên nhau và

như sử dụng các loại thuốc có chứa chất Simvastatine và chất Ezetimibe hay

hầu hết mỗi cặp bazơ đều có thể nằm trong một gen nào đó ngoại trừ vùng D-

các loại thuốc có chứa Statin. Nhưng một biện pháp hữu hiệu để điều chỉnh

loop. D-loop là vùng điều khiển của mtDNA trên đó có các promotor của quá

cholesterol trong máu là bằng chế độ ăn uống hợp lý.

trình sao chép và phiên mã của mtDNA [25].

Do sở thích và sự thiếu hiểu biết về thành phần dinh dưỡng của các loại

1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể

thực phẩm, một số người thường xuyên sử dụng một số lượng lớn các thực

DNA ty thể là vật chất di truyền nằm ngoài nhân di truyền theo dòng

phẩm có chứa nhiều cholesterol như óc, gan, các loại thịt có chứa nhiều chất

mẹ. Ở hầu hết động vật có xương sống bộ gen này có chiều dài khoảng 16800

béo (thịt heo, gà, vịt, cá) và đặc biệt là trứng. Có những người ăn thường

nucleotid, trong đó bao gồm những gen mã hoá protein, gen tRNA, gen rRNA

xuyên một lượng lớn trứng trong một thời gian dài mà không biết tới hậu quả

và vùng điều khiển – vùng không mã hoá duy nhất với các promoter để tái

mà nó sẽ gây ra. Trứng là thức ăn rất bổ dưỡng cho cơ thể. Tuy nhiên, chúng

bản và phiên mã mtDNA. DNA ty thể có những đặc tính đáng quan tâm như

ta chỉ nên ăn với một lượng hợp lý

sau:

để góp phần đề phòng và giảm lượng

cholesterol trong máu để tránh các bệnh về tim mạch.

(1) Tỷ lệ tiến hoá phân tử của chúng nhanh hơn khoảng 5 lần so với
bất kỳ một gen nhân nào.

1.3 Đặc điểm DNA ty thể

(2) mtDNA là một phân tử đơn bội mà không tái tổ hợp.

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể
DNA ty thể (mtDNA) ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng. Kích thước
của bộ gen ty thể thay đổi khác nhau ở mức phân loại Bộ trở lên.

Vùng điều khiển mtDNA là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA:

chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao hơn gấp 5 – 10 lần so với các gen

Ở tế bào động vật kích thước của mtDNA nhỏ, cho tới nay đã xác định

khác của mtDNA. Trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là một

được trình tự đầy đủ của bộ gen ty thể người, chuột, bò, tất cả đều có kích

công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hướng tiến

thước khoảng 16,5 kb. Mỗi tế bào có vào khoảng vài trăm ty thể. Mỗi ty thể

hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài [29].

có nhiều bản sao của DNA. Nấm men có kích thước bộ gen ty thể khoảng 84

1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà

kb (ở S.cerevisiae), trong đó rất nhiều vùng không mang intron dài xen kẽ

* Đặc điểm cấu trúc ty thể gà

giữa các vùng exon. Ở thực vật thì có sự biến động rất lớn về kích thước bộ

Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của

gen ty thể, mtDNA của thực vật có kích thước tối thiểu khoảng 100 kb. Chức

mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp, chúng mã hóa cho 13
protein, 2 rRNA và 22 tRNA (trình tự này đã được lưu trữ GenBank). Các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

11

protein tạo ra được sử dụng để vận chuyển điện tử và phosphoril hóa trong ty

*

Đặc điểm di truyền của ty thể: Di truyền ty thể là di truyền theo

thể. Gen ty thể gà có các đặc điểm riêng, khác với lớp thú và lưỡng cư đó là:

dòng mẹ. Trong thực tế có đến 99% ty thể của tế bào con thừa hưởng từ tế

một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa

bào mẹ. Đó là do bào quan này nằm trong tế bào chất, khi có sự kết hợp giữa

hai gen tRNA (Cys) và tRNA (Asn) đều có ở tất cả động vật có xương sống

trứng và tinh trùng tạo thành hợp tử (tế bào con) thì tế bào con nhận chủ yếu

đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà lại không có đặc điểm này.

tế bào chất từ trứng của mẹ, trong đó có chứa ty thể, còn ty thể của tinh trùng

Đồng thời gen COI (cytochrome oxidase I) có mã mở đầu là GTG thay vì

khi tham gia thụ tinh được loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc vào

ATG.

ubiquitin. Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt hai
Trình tự đầy đủ này của hệ gene ty thể gà nhà là cơ sở cho nhiều công

dòng ty thể của cả bố và mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này gọi là dị tế bào

trình nghiên cứu về DNA ty thể của các giống, các loài thuộc bộ gà

chất. DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp. Tốc

(Galliormes). Toàn bộ DNA ty thể gà nhà được lập thành sơ đồ như sau:

độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể
là do ty thể thiếu hụt cơ chế sửa chữa DNA. Tốc độ đột biến cao dẫn đến
nhiều biến dị trong ty thể. Đặc biệt là vùng điều khiển D-loop của mtDNA là
vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA: chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ
cao hơn gấp 5–10 lần so với các gen khác của mtDNA. Trình tự nucleotit của
vùng điều khiển mtDNA là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng
di truyền và sự phân hướng tiến hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài

[29].
* Vai trò vùng D-loop trong phân loại gà
Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn:
đoạn I, II và III. Trong đó đoạn II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vị

Hình 1.2. Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus

cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân

(Desjadins và Morais, 1990)

loại họ. Thông thường, vùng biến đổi nhiều nhất trong D-loop là đoạn III.

ND: NADH đehidrogenaza

Chính điều này đã làm cho vùng điều khiển của mtDNA có tốc độ tiến hóa

CO: cytocrom oxidaza

nhanh gấp 5-10 lần so với các gen khác của ty thể. Vì vậy mà trình tự

H (Heavy strand): chuỗi nặng

nucleotid của vùng D-loop là công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di

L (Light strand): chuỗi nhẹ.

truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa các quần thể cùng loài.
1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

13

Zhang và đồng tác giả (2002) [31] đã giải trình tự 539 nucleotid đầu

1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới
Hiện nay, trên thế giới ngành chăn nuôi gia cầm phát triển nhanh cả về

tiên trong vùng D-loop của sáu chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus)

số lượng và chất lượng. Mỹ là nước đi đầu thế giới về ngành chăn nuôi gia

Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus

cầm, đặc biệt trong lĩnh vực tạo ra những giống gà cơ bản. Sau Mỹ là Pháp,

gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố

Trung Quốc, Anh, Đức, Hà Lan… Ở các nước Đông Âu, chăn nuôi gia cầm

trên ngân hàng gen quốc tế. Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc của

cũng phát triển, điển hình là Hungari và Bungari.

chúng dựa trên trình tự vùng D-loop.

Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể trên một số loài thuộc bộ Gà:

Komiyama T và đồng tác giả (2004) [24] đã tiến hành phân tích trình tự

Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của

vùng D-loop ty thể từ máu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa

mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp. Với trình tự này, các nhà

phương của Nhật Bản, đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà lông đỏ

khoa học đã có cơ sở để tiến hành nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa

(Jungle Fowl) đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế làm nhóm ngoại.

các đối tượng thuộc bộ gà.

Trên cơ sở đó họ đã lập được cây phát sinh và kết quả cho thấy 3 chủng

Năm 1994-1995, Fumihito và cộng sự [20] đã nghiên cứu mối quan hệ

Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng

chủng loại giữa các loài gà rừng, công, trĩ, ... dựa trên phân tích đoạn điều

3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái

khiển ty thể. Kết quả phân tích đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP)

bên ngoài rất khác nhau. Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ

trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đưa ra một sơ đồ phân

các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc

loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định được trình tự của 400

và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả

nucleotid đầu tiên trên vùng điều khiển của mtDNA. Kết quả nhận được đã

thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi

chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60 nucleotide trên vùng điều khiển của

các vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á. Như vậy có

mtDNA là điểm đặc trưng của giống Gallus.

thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để

Randi và cộng sự (1997) [29] đã phân tích trình tự của một phần đoạn

đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa

điều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam và đã

các quần thể địa lý.

chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa hai giống này.

1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam

Năm 1999, Kimball và cộng sự [23] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ

Cho đến nay, ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử

của gen cytocrom b (1143bp) và đoạn siêu biến (350bp) của vùng điều khiển

trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu. Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng

mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà Gô. Hai

sự [11] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên

cây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trên hai đoạn

vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà Lôi Việt Nam gồm: gà Lôi lam đuôi

gen cho thấy sự khác nhau là rất ít.

trắng (L. hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà Lôi hông tía (L. diardi).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

15

Từ đó xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển D-loop của

Chƣơng 2

mtDNA của 3 loài gà Lôi. Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà Lôi nói trên.
Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn
gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam trong vector

2.1 Vật liệu
2.1.1 Nguồn gốc mẫu
Các mẫu trứng, máu được lấy từ các giống gà Ri, gà Ác, gà Tre được

pBluescript KS(-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide

nuôi tại gia đình ông Nguyễn Văn Vân

vùng D-loop.

Yên, Bắc Giang.

Năm 2006, Địch Thị Kim Hương và cộng sự [5] đã xác định được trình
tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 2 mẫu gà Ác Tiềm và Lương
Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucleotide giữa 2 đại diện
trên.

, thôn Đì nh Giã , Cao Thượng , Tân

2.1.2 Đị a điểm thí nghiệm
Các nghiên cứu về cholesterol được tiến hành tại phòng thí nghiệm của
Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam.
Các thí nghiệm sinh học phân tử tiến hành tại phòng thí nghiệm công

Năm 2007, Lê Đức Long và cộng sự [6] đã giải trình tự và so sánh trình

nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và

tự nucleotide vùng D-loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện

Công nghệ Việt Nam.

Biên, Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo

2.2 Hoá chất và thiết bị

dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm

2.2.1 Hóa chất

1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác
biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.

Các hoá chất tinh khiết sử dụng có nguồn gốc từ các nước Anh , Mỹ,
Trung Quốc , Thụy Điển, Nga… như Phosphate buffer saline (PBS), protein

Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và cộng sự [14] đã giải trình tự và so

K (20mg/ml), SDS, Tris HCl, EDTA, NaCl, CH3COONa, phenol:

sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Sao

chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), chloroform: isoamyl alcohol (24:1),

nuôi tại Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop

agarose 0,8%...

gồm 1220 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 16 vị trí

2.2.2 Thiết bị sử dụng

khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.

Máy li tâm lạnh của hãng Hettich (Đức), tủ sấy của hãng Carbolite

(Anh), cân điện tử (Thuỵ Sỹ, Anh), máy Gerhardht, tủ lạnh sâu – 20 oC
Sanyo (Nhật), lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc), máy PCR MJ Reseach, Inc
(Mỹ), máy xác định trình tự tự động ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyser
(Applied Biosystems, Mỹ), bể ổn nhiệt (Tempette Junior Tech), hệ thống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

17

sắc ký Alliance (hãng Waters, Mỹ), máy hút chân không Speed Vac Sc

+ Đun hồi lưu 30 phút trong cách thủy ở 600C.

110A- Savant (Mỹ), pipetman và một số máy móc thiết bị khác.

+ Thêm 10ml n- heptane, đun hồi lưu thêm 2-3 phút, để nguội đến nhiệt
độ phòng.

2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu

+ Chuyển toàn bộ dịch chiết sang một bình gạn, thêm 5 ml NaCL bão

2.3.1 Phƣơng pháp hoá sinh xác định hàm lƣợng cholesterol
* Cơ sở của phương pháp: chất béo trong thực phẩm (gồm cả cholesterol)

hòa, 10 ml nước.

được chiết bằng chloroform. Sau khi thủy phân lipit bằng KOH trong cồn,

+ Chiết 2 lần cùng với 10 ml petroleum ether.

cholesterol được chiết lại bằng petroleum ether. Dịch chiết được cô cạn bằng

+ Gộp dịch chiết và rửa 2 lần với 20 ml nước cất.

máy cất quay chân không, sau đó được hòa tan lại bằng methanol. Cholesterol

+ Loại nước bằng Na2SO4 khan, cô quay ở 300C đến khô.

trong dịch chiết methanol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC) bằng

+ Hòa tan và định mức 10 ml bằng methanol.

cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol trong mẫu với diện

+ Lọc qua màng lọc 0,45 m và bơm vào sắc kí lỏng.

tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol chuẩn (John Wiley and Sons, 2005)

Cột sắc ký LunaC18 với nhiệt độ cột là 300C, tốc độ dòng là 1 ml/ phút,

[22].

lượng mẫu bơm 10 l. Bộ phận phát hiện (detector) đo độ hấp thụ tia UV ở

* Xác định hàm lượng cholesterol theo quy trình sau: Lấy ngẫu nhiên trứng

bước sóng 208 nm của cholesterol chuyển thành tín hiệu ra máy tính đó là các

ở các giống gà thí nghiệm ở các lứa đẻ khác nhau và ở các con gà mái khác

peak, mỗi peak có độ cao và diện tích khác nhau, từ đó tính được hàm lượng

nhau trong cùng một giống. Sau khi lấy được mẫu, ở mỗi mẫu: đập 5 quả

cholesterol của mỗi mẫu [22].

trứng vào cốc thủy tinh. Sau đó đồng nhất lòng đỏ và lòng trắng. Tiếp theo là

Công thức tính hàm lượng cholesterol của mẫu nghiên cứu như sau :

các bước:

X =

+ Cân 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 25 ml.

Am  Cs
100
 D
As

m

+ Thêm 5 ml methanol, vortex 5 phút.

Trong đó:

+ Thêm 10 ml chloroform, vortex 3 phút.

X: Hàm lượng cholesterol (mg/ 100 g)

+ Ly tâm, gạn lấy dịch trong bình gạn 250 ml.

Am: Diện tích pic mẫu

+ Chiết lại mẫu bằng 5 ml methanol và 10 ml chloroform trong 3 phút.

As: Diện tích pic chuẩn

+ Gộp dịch chiết vào bình gạn.

Cs: Nồng độ chuẩn

+ Thêm 7 ml KCl 0,88%, lắc nhẹ và để tách lớp.

D: Độ pha loãng
m: khối lượng mẫu cân (g)

+ Lọc lớp chloroform qua phễu chứa Na 2SO4 khan vào bình cô quay.

100: Tính hàm lượng cholesterol trong 100 g mẫu [22].

0

+ Cô quay đến khô ở 30 C.
+ Thêm 20 ml KOH 0,5M trong ethanol.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

19

nghiệm thì trước hết ta phải xây dựng đường chuẩn cholesterol ở các nồng độ
khác nhau: 2,04 ppm, 20,4 ppm, 204 ppm, 1 mg/ml, 2,04 mg/ml. Để xây dựng
được đường chuẩn cholesterol thì ta phải xác định chiều cao và diện tích của
các peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau đó.
Kết quả về chiều cao và diện tích

của peak cholesterol chuẩn ở các

ChiÒu cao cña pic cholesterol

Như vậy, để xác định được hàm lượng cholesterol ở các mẫu thí

200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
20,4

nồng độ khác nhau được thể hiện qua bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kết quả chiều cao và diện tí ch peak cholesterol chuẩn ở

204

500

1000

1500

2040
2500
Nång ®é cholesterol (ppm)

Hình 2.2. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak chuẩn

các nồng độ khác nhau

cholesterol
Như vậy, dựa vào đường chuẩn cholesterol chúng ta có thể xác định

Nồng độ cholesterol

Thời gian chạy má y

(ppm)

(phút)

2,04

33,159

19502

543

2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử

20,4

33,190

69573

1946

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật

204

33,178

715249

17001

* Nguyên tắc chung

1000

33,054

3309741

91236

Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh kết hợp với biện

2040

33,329

7396448

181428

pháp cơ học, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein.

Diện tí ch

Chiều cao

được lượng cholesterol có trong các mẫu nghiên cứu cần xác định.

Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp

chúng ta có thể xây dựng đường chuẩn cholesterol theo diện tích hoặc theo

phenol: chloroform: isoamylalcohol với tỷ lệ thích hợp. Cuối cùng DNA được

chiều cao như sau:

kết tủa bằng cồn tuyệt đối 100% và để lạnh sau đó thu lại bằng ly tâm.

DiÖn tÝch cña pic cholesterol

Từ các kết quả về chiều cao và diện tích của các peak cholesterol chuẩn

* Quy trì nh tách chiết

8000000

Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA

7000000

6000000

là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Các phân tử DNA có

5000000
4000000

thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa

3000000
2000000

học (bị thủy phân bởi các enzyme phân giải thoát ra môi trường khi màng tế

1000000
0
20,4

204

500

1000

1500

bào bị phá vỡ). Để đạt hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một

2040
2500

Nång ®é cholesterol (ppm)

Hình 2.1. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak chuẩn
cholesterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

20

phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên
cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

21

chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tổng số của Sambrook và

hợp chloroform: isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong

Russell [30].

dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần.
0

Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 37 C trong một giờ. Trong

Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50l CH3COONa3M,

điều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ

pH=5,2 và 1 ml ethanol 100%. Ethanol có tác dụng hút lớp nước bao quanh

được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein

phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na + sẽ

như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng.

kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẫy giữa các chuỗi

Sau đó hút máu ra các eppendorf 1,5 ml rồi bổ sung đệm phosphate buffer

nucleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -200C trong 15 giờ

saline (PBS) và ly tâm. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu.

thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng ethanol 70%, làm khô tủa

Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và

trong máy sấy và hòa tan tủa trong nước cất 2 lần. Trong dung dịch này có

SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA

nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại bỏ RNA bằng RNAase, ủ ở 37 0C trong 2-

2+

ra ngoài môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với ion Mg , nhờ vậy mà
hoạt động của các nulease bị ức chế để bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các
nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ cắt đứt các liên kết

3 giờ.
Quy trình tách chiết DNA tổng số theo Sambrook và Russell [30] có
thể được tóm tắt như sau:

peptid trong phân tử protein làm cho protein bị phân hủy. Hơn nữa pH kiềm

(1): Ủ máu đông lạnh trong 37oC trong 1 giờ cho máu tan.

của dung dịch đệm chiết làm DNA trở lên ổn định cấu trúc hơn do bản chất

(2): Hút vào mỗi eppendorf (epp, loại 1,5 ml) 500 l máu.

tích điện âm của nó, đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với

(3): Bổ sung 500 l dung dịch PBS 1X, sau đó vortex và li tâm 6000

protein histon.

vòng/phút trong 15 - 20 phút, 40C, đổ dịch và thu cặn.

Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp
phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động
của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu

trúc của DNA. Đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha
nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá
trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3
pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein bị biến tính
và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, choloroform, isoamyl alcohol. Pha nước
được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

22

(4): Bổ sung 1ml dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 l protease K (20
mg/ml). Mẫu được ủ ở 650C trong 1 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng.
(5): Chia vào mỗi epp 500 l dịch.
(6): Bổ sung một lượng tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol
(tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút
pha trên cùng sang ống mới.
(7): Thêm một thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ
24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút pha trên
cùng sang ống mới.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

23

(8): Bổ sung 1/10 thể tích CH3COONa3M, pH 5,2 và 1ml cồn 100%, ủ
qua đêm ở - 20oC.

- Tra mẫu và điện di: mẫu DNA với một lượng thích hợp (3 - 8 l) được
trộn với 2,5 l đệm màu và được tra vào các giếng nhỏ trên gel. Chạy điện di

(9): Thu tủa bằng cách li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15-20 phút, 4oC.
Bổ sung 500 l cồn 70% để rửa vào mỗi epp.

với dòng điện một chiều có cường độ dòng điện 60 – 80 mA, hiệu điện thế
100-120 V. Quan sát sự di chuyển băng màu bromophenol blue để biết lúc

(10): Li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC. Bỏ dịch và thu cặn.
(11): Làm khô tủa trong máy sấy và hòa tủa vào 50 l nước khử ion vô

nào cần ngừng điện di.
Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm bản gel
trong dung dịch EtBr (ethidium bromide) với nồng độ 0,5 l/ml. Sau khi

trùng, búng nhẹ.
Kiểm tra sản phẩm tinh sạch DNA trên gel agarose 0,8%.

ngâm 10-15 phút, lấy bản gel ra, rửa trong nước sạch và chụp ảnh dưới ánh

2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose

sáng tử ngoại 254 nm (trên máy Bio-Rad).

* Nguyên tắc chung

2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR

Điện di là kỹ thuật để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước

Vào năm 1985, K.Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản khuếch

và hàm lượng khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit

đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà không qua tạo

nucleic là các đại phân tử tích điện âm do có sự có mặt của gốc PO43- trên bề

dòng. Kỹ thuật này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR,

mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng điện và

được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền. Kỹ thuật này được ứng dụng

hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được

nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và

sử dụng trong kỹ thuật điện di là gel agarose (với các phân tử DNA có kích

kỹ thuật di truyền [26].

thước lớn) hoặc polyacryamid (với các phân tử DNA có kích thước nhỏ).

* Nguyên tắc chung

Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose với nồng độ 0,8% bởi gel

PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro

agarose với nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn

do sự xúc tác của enzyme DNA taq polymerase. Enzyme này được chiết từ vi

DNA cần phân tích (1- 20kb) [2].

khuẩn Thermus aquaticus. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu

* Quy trình kỹ thuật

trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm đun nóng (950C), làm nguội (37-

- Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8 gam agarose vào 100 ml dung dịch TAE
o

650C) và ủ lâu ở 720C. Trong dung dịch có chứa 4 loại deoxynucleotide

1X. Đun trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50 – 60 C,

(dNTPs) và các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các

đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30 phút, khi gel

oligonucleotide, mỗi mồi sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn của DNA

đông cứng thì rút răng lược ra và đặt vào bể điện di có chứa sẵn dung dịch TAE

khuôn tương ứng, từ đó mạch được tổng hợp kéo dài.

1X sao cho dung dịch TAE 1X ngập mặt gel từ 1 – 2 mm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

* Nguyên liệu

24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

25

- DNA khuôn phải được tinh sạch và ít bị đứt gãy

, có chứa trì nh tự đí ch

cần nhân lên . Nồng độ DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là

10 - 100

ng/phản ứng.

dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng
tôi thấy, nồng độ của các dNTPs là 1mM là phù hợp.
- Taq DNA polymeaza của hãng Fermentas

- Mồi: là yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt
độ gắn mồi và nồng độ mồi có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm và chất
lượng sản phẩm PCR. Nồng độ mồi xuôi và mồi ngược sử dụng trong thí

- Nước khử ion vô trùng.
Thông thường phản ứng PCR cho một mẫu với tổng thể tích là 25 l, gồm
các thành phần sau:

nghiệm này là 10 pmol/l (pM/l). Cặp mồi được sử dụng đó là :

Nước

14,8 l

+ Mồi xuôi H1255: 5’- CATCTTGGCATCTTCACTGCC - 3’.

Buffer dream taq

2,5 l

+ Mồi ngược L16725: 5’- AGGACTACGGCTTGAAAGC - 3’.

dNTPs

2,5 l

H, L là chữ viết tắt cho chuỗi nặng (Heavy) và chuỗi nhẹ (Light), chữ

H1255 (mồi xuôi )

1 l

L16725 (mồi ngược)

1 l

Taq DNA polymeraza

0,2 l

DNA khuôn

3 l

Tổng thể tích

25 l

số là vị trí nucleotide trên mtDNA trong trình tự đầy đủ của gà mà đầu 3’ của
mồi tiếp hợp vào (Desjadins và Morais, 1990) [17]. Cặp mồi H1255- L16725
được lựa chọn vì đây là cặp mồi “bảo thủ”, nó có thể được dùng cho nhiều
loài, giống khác nhau trong bộ gà.
- Dung dịch đệm: PCR được thực hiện trong môi trường đệm phù hợp với
hoạt động của enzyme và nó có giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, chúng
tôi sử dụng đệm là buffer dream taq. Nó phù hợp với hoạt động của emzyme
taq polymerase và trong dung dịch đệm này có chứa Mg2+. Vai trò của ion

PCR là một quá trình lặp lại gồm nhiều chu kỳ (tổng số chu kỳ chúng
tôi tiến hành là 35 chu kì), mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94-950C trong

Mg2+ là tạo phức với các dNTPs và gắn chúng với enzyme, kích hoạt và tăng

khoảng một phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sẽ trở

cường sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm

thành một sợi khuôn cho mồi bám vào. Thời gian biến tính tùy thuộc vào

hoạt tính của enzyme. Tuy nhiên, nếu nồng độ quá cao sẽ ức chế hoạt động
của enzyme. Sau khi khảo sát chúng tôi sử dụng nồng độ Mg

2+

là 10 mM cho

hàm lượng G-C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến
tính là 940C trong một phút. Trước khi bước vào chu kì thứ nhất, nhiệt độ
biến tính được đặt ở 940C trong 4 phút để đảm bảo phân tử DNA được biến

kết quả PCR tốt nhất.
- 4 loại dNTPs: nồng độ của 4 loại dNTPs phải bằng nhau và phụ thuộc
nhiều vào kích thước của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng
độ các dNTPs lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị cô lập,

tính hoàn toàn.

- Giai đoạn gắn mồi: ở giai đoạn này, nhiệt độ của phản ứng được hạ
xuống trong khoảng 37- 650C để cho mồi kết hợp vào sợi khuôn. Nhiệt độ và
thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự mồi. Chúng tôi đã thử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

27

chạy phản ứng ở một số giá trị nhiệt độ khác nhau trong khoảng nhiệt độ này
0

và chọn được nhiệt độ gắn mồi là 55 C.

tiến hành thôi gel theo protocol của hãng Promega để thu sản phẩm PCR tinh
sạch. Quy trình được tiến hành như sau:

0

- Giai đoạn kéo dài mạch: nhiệt độ tăng lên 72 C để cho enzyme Taq

- Đổ gel và chạy điện di sản phẩm PCR.

polymerase hoạt động tốt nhất. Bước này cần 1-5 phút tùy thuộc chiều dài

- Cân ống eppendorf (epp) loại 1,5 ml.

đoạn DNA cần khuếch đại. Tốc độ tổng hợp của phản ứng khoảng 1000

- Cắt băng chứa sản phẩm PCR cho vào epp đã cân.

nuleotide/ phút. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước khoảng 1,3 kb
nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi là 1 phút 20 giây.

- Cân lại epp có chứa gel (mang sản phẩm PCR để biết được trọng lượng
của băng gel ta vừa cắt).

Sản phẩm cuối cùng của chu kỳ trước sẽ là khuôn mẫu cho chu kỳ tiếp
theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng DNA được tăng lên gấp đôi. Sau một thời

- Bổ sung dung dịch mambrane binding (dung dịch 1) với tỷ lệ 1 mg gel:
1 l dung dịch 1.

gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân nhờ đó mà có đủ lượng

- Ngâm trong nước nóng (nhiệt độ khoảng 50-650C) để gel tan hết.

DNA phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo. Sau khi kết thúc 35 chu kì, chúng tôi

- Chuyển sang cột và để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút.

0

đặt nhiệt độ ở 72 C trong mười phút để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc
0

hoàn toàn. Sản phẩm PCR được giữ 4 C.

- Ly tâm 12000 vòng/phút, 40C, trong 1 phút, sau đó loại bỏ dịch phí a
dưới.

* Quy trình nhiệt của phản ứng PCR có thể được tóm tắt như sau:

- Bổ sung 700 l manbrane wash (dung dịch 2) và ly tâm 12000 vòng/

o

Bước 1: 94 C - 4 phút

phút, 40C, trong một phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới.

o

Bước 2: 94 C - 1 phút

- Bổ sung thêm 500 l dung dịch 2 và ly tâm 12000 vòng/phút, 40C,

o

Bước 3: 55 C - 1 phút

trong 5 phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới.

Bước 4: 72oC - 1 phút 20 giây

- Ly tâm lại một phút, 12000 vòng/ phút, 40C.

Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 34 lần.

- Cho vào máy sấy 5 phút.

Bước 5: 72oC - 10 phút.

- Bổ sung thêm khoảng 30-50 l nước cất 2 lần, để ở nhiệt độ phòng

Sản phẩm PCR được giữ ở 4oC.

trong khoảng một phút.

Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 l sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên
gel agarose 0,8% để kiểm tra sản phẩm PCR.

- Ly tâm 12000 vòng/phút, 40C, trong một phút.
Sau khi đã thôi gel tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành điện di

2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR

để kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 0,8%. Nếu điện di xuất hiện

Sau khi điện di kiểm tra phản ứng PCR đã thành công, chúng tôi tiến

băng sáng rõ, tập trung, không bị smear, có kích thước trùng với kích thước

hành tinh sạch sản phẩm PCR. Để tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến

đoạn DNA cần nhân trong phản ứng PCR thì sản phẩm thôi gel đủ chất lượng

hành điện di toàn bộ sản phẩm PCR thu được ở mỗi mẫu. Sau đó chúng tôi

để tiến hành đọc trình tự.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

28

29

Giá trị trung bình mẫu

2.3.2.5 Phƣơng pháp xác định trình tự DNA
*Nguyên tắc chung

X 

Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của

phương pháp Sanger [2], [10] tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau

1 n
 Xi
n i 1

Độ lệch chuẩn:

một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo

SX 

1 n
 ( Xi  X )2 với n  30
n i 1

SX 

1 n
 ( Xi  X )2 với n < 30
n  1 i 1

ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành phản
ứng PCR sử dụng BigDye Terminaor v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa
sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như: dNTPs,

mX =

ddNTPs, DNA polymerase... Do đó chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sử
dụng sản phẩm thôi gel của phản ứng PCR) và mồi phù hợp (cặp mồi H1255-

m

L16725). Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được
đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuyếch đại
gene để đọc trình tự bao gồm: mồi 3.2 pM, DNA của sản phẩm PCR và nước

X

=

SX
n

( với n  30)

SX
n 1

( với n < 30)

Trong đó:
S X : Độ lệch chuẩn.

với tổng thể tích 15l. Vì đoạn gen cần xác định có chiều dài khoảng 1,3 kb

X : Là giá trị trung bình mẫu.

nên chúng tôi đã xác định trình tự nucleotide từ hai chiều của tất cả các đoạn

Xi: Là giá trị của từng mẫu.

DNA có trong sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 và nhờ máy xác

n: Là số lần lặp lại thí nghiệm.

định trình tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau đó sử dụng các phần

m X : Sai số trung bình

mềm Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu của hai chiều đọc, chúng tôi thu
được trình tự hoàn chỉnh của vùng D-loop của 3 giống gà Ri, Ác, Tre.
* Chu trình nhiệt
Chu trình nhiệt cho máy PCR trong máy luân nhiệt Genamp PCR
System 9700 như sau: 940C- 1 phút; (960C- 10 giây, 500C- 5 giây, 600C- 4
phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4 0C.
2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Những số liệu thu được, được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học
trên máy vi tính bằng chương trình Excel theo hướng dẫn của Chu Văn Mẫn
[9] với các thông số:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

30

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

31

nghiên cứu càng cao. Chúng tôi đã xác định được hàm lượng cholesterol ở

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

các mẫu thí nghiệm và được thể hiện qua bảng 3.2 và hình 3.1.

3.1 Hàm lƣợng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu
Chúng tôi thu thập mẫu trứng của các giống gà nghiên cứu đồng thời

Bảng 3.2. Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu

chúng tôi cũng thu thập thêm trứng của vịt Bầu và trứng gà Tam Hoàng mà

Các mẫu nghiên cứu

chúng ta hay sử dụng hàng ngày. Mục đích là để có thể so sánh hàm lượng

Hàm lượng cholesterol
(mg/100 g) X  mX

cholesterol của các mẫu gà nghiên cứu với hàm lượng cholesterol của các loại
trứng mà chúng ta hay sử dụng trong các bữa ăn hàng ngày để có thể rút ra kết
luận về việc sử dụng loại trứng mà không lo hàm lượng cholesterol cao. Sau
đó, chúng tôi tiến hành phân tích theo các bước trình bày ở chương 2 và cuối
cùng dung dịch chứa cholesterol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC)
bằng cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của peak cholesterol trong mẫu

Trứng gà Ri

438,1  0,09

Trứng gà Ác

340,6  0,11

Trứng gà Tre

465,9  0,15

Trứng gà Tam Hoàng

318,8  0,1

Trứng vịt Bầu

477,7  0,13

và diện tích của các peak cholesterol trong trứng của các mẫu gà nghiên cứu
được thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol trong trứng của các
mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu

Thời gian chạy máy

gà Ri

Diện tí ch

Chiều cao

31,508

1017035

25295

gà Ác

32,233

845304

20628

gà Tam Hoàng

31,836

819183

20477

gà Tre

32,418

1105818

26763

vịt Bầu

31,632

1195163

29586

(phút)

Trung ga Ri
Trung ga Ac
Trung Ga Tre
Trung ga Tam
Hoang
Trung vit Bau

Hình 3.1. Biểu đồ hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên

lượng cholesterol đã trình bày ở chương 2 thì hàm lượng cholesterol tỷ lệ
thuận với diện tích (hoặc chiều cao) của peak mẫu nghiên cứu . Nếu diện tích
(chiều cao) peak mẫu nghiên cứu càng lớn thì hàm lượng cholesterol của mẫu

500
450

400
350
300
250
200
150
100
50
0
Mẫu nghiên cƣ́u

Chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm 3 lần. Dựa vào công thức xác định hàm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Hàm lƣợng cholesterol (mg/100g)

với diện tích (hoặc chiều cao) của peak cholesterol chuẩn. Kết quả c hiều c ao

32

cứu
Qua bảng 3.2 và hình 3.1, chúng tôi nhận thấy hàm lượng cholesterol
trong trứng vịt Bầu là lớn nhất 477,7 mg/100 g, sau đó là trứng gà Tre 465,9
mg/100 g, trứng gà Ri 438 mg/100 g, trứng gà Ác 340 mg/100 g. Hàm lượng
cholesterol thấp nhất là trứng gà Tam Hoàng 318,8 mg/100 g. Tuy nhiên, hàm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

33

lượng cholesterol trong một quả trứng thì chủ yếu tập trung ở lòng đỏ, còn ở

sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên chúng tôi đã lựa chọn phương pháp

lòng trằng không đáng kể. Nhu cầu cholesterol tối đa của một người bình

tách chiết DNA tổng số của Sambrook và Russell [30]. Kiểm tra sản phẩm

thường/một ngày là 300 mg/một ngày. Như vậy, chúng ta thấy rằng hàm

tinh sạch trên gel agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện trên hình 3.2.

lượng cholesterol trong trứng gà là khá cao. Chính vì vậy, người sử dụng cần
phải c ăn cứ vào tì nh hì nh sức khỏe của bản thân
bệnh về tim mạ

ch liên quan đến cholesterol

M

1

2

3

(có hay không có những

) và dựa vào hàm lượng

21kb

cholesterol của các loại trứng mà chúng tôi đã xác định để ch ọn loại trứng và

5,1kb

số lượng trứ ng phù hợp để đảm bảo một ngày cung cấp cho cơ thể tối đa 300
mg cholesterol/một ngày . Đồng thời những người mà có hàm lượng
cholesterol trong máu cao hơn 5,6 mmol/lít thì mỗi tuần chỉ nên ăn tối đa 4
quả trứng/một tuần và cũng nên lựa chọn trứng gà Tam Hoàng để ăn, hạn chế
ăn các loại trứng vịt Bầu, trứng gà Tre và gà Ri để đảm bảo sức khỏe , ngăn
ngừa và hạn chế các bệnh về tim mạch .

Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số
M: marker; 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3. Gà Tre

3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di

Kết quả cho thấy, cả 3 băng DNA tổng số của mẫu gà Ri, Ác, Tre đều
sáng tập trung và tương đối rõ nét. Ba băng DNA thu được có kích thước

truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu
Để xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di

khoảng 21kb. Như vậy, có thể đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu

truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre, chúng tôi tiến hành tách

về nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.

chiết DNA tổng số, dùng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển trong ty thể

3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể

nhằm xác định trình tự của vùng D-loop. So sánh các trình tự này với mộ t số

Bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã khuyếch đại được vùng điều khiển D-

trình tự công bố trên GenBank để tìm ra sự đa dạng di truyền của chúng .

loop. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8% với thể tích là 8 l.

3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà

Kết quả PCR được thể hiện trên hình 3.3.

Hầu hết các nghiên cứu về sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu
nhận và tinh sạch DNA đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên vẹn cho các
thí nghiệm tiếp theo. Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật
tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Để đạt
hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có
nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

35

M

1

2

trình tự D-loop của gà Gallus gallus (gà rừng đỏ ) gốc Nhật mã số AB114078

3

[24] và gà Gallus gallus gallus (Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số
NC007236 [27], chúng tôi thu được kết quả hình 3.4.
10

1.5kb
1.0 kb

20

30

40

50

60

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

1.3kb

AB114078

aattttattt tttaacctaa ctcccctact aagtgtaccc cccctttccc ccccaggggg

AC

-......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

C......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

C......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR

70

M:Marker; 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3.Gà Tre

80

90

100

110

120

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

Kết quả cho thấy, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA có kí ch thước khoảng
1,3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung,
chứng tỏ sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng tôi đã nhân được vùng D-loop. Sản

AB114078

ggtatactat gcataatcgt gcatacattt atataccaca tatattatgg taccggtaat

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

phẩm PCR sẽ được sử dụng ở các thí nghiệm tiếp theo.

130

140

150

160

170

180

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể

AB114078

atatactata tatgtactaa acccattata tgtatacggg cattaaccta tattccacat

Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel sản phẩm PCR), chúng tôi

AC

.......... .......... .......... .......... ......t... ..........

tiến hành xác định trình tự đoạn D-loop trên máy đọc trình tự tự động trên cơ

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... .......... .......... .......... ......t... ..........

NC007236

.......... .......... .......... .......... ......t... ..........

sở của phương pháp Sanger. Nguyên tắc và cách thức đọc đã được mô tả

190

trong mục 2.3.2.5.

200

210

220

230

240

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

Xác định trình tự nucleotide từ hai chiều của tất cả các đoạn DNA có

AB114078

ttctcccaat gtccattcta tgcatgatcc aggacatact catttaccct ccccatagac

AC

.......... .......... .......... .a........ ....c..... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau đó sử dụng các phần mềm

TRE

.......... .......... .......... .a......T. ....c..... ..........

Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu của hai chiều đọc, chúng tôi thu được

NC007236

.......... .......... .......... .......... ....c..... ..........

trong sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 và nhờ máy xác định trình

250

trình tự hoàn chỉnh của vùng D-loop của 3 giống gà Ri, Ác, Tre.
Sau khi đã xác định được trình tự vùng D-loop của 3 mẫu gà nghiên
cứu là gà Ri, Ác ,Tre, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự vùng D -loop của
chúng với nhau và với hai trì nh tự D-loop đã được công bố trên GenBank là
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

260

270

280

290

300

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

36

AB114078

agttccaaac cactatcaag ccacctaact atgaatggtt acaggacata aatctcactc

AC

.....t.... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.....t.... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

..c....... .....c.... t......... .......... g......... .....t....

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

37

310

320

330

340

350

360

610

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

620

630

640

650

660

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078

tcatgttctc cccccaacaa gtcacctaac tatgaatggt tacaggacat acatctaact

AB114078

cttcccctct ttagtccgtg atcgcggcat cttctctctt ctattgctgt tggttccttc

AC

.......... ....t..... .......... .......... .......... ....T.....

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ....T.....

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... ....t..... .......... .......... .......... ....T.....

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

.....c...t .......... .......... .......... .......... ....T.....

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

370

380

390

400

410

420

670

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

680

690

700

710

720

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078

accatgttct aacccatttg gttatgctcg ccgtatcaga tggatttatt gatcgtccac

AB114078

tctttttggg gcttcttcac aggttgccct tcacagtgcg ggtgcggagt gctattcaag

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

.......... .......... .....a.... .......... .......... ..........
730

430

440

450

460

470

480

740

750

760

770

780

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078

tgaagcctgg actacacctg cgttgcgtcc tatcctagtc ctctcgtgtc cctcgatgag

AB114078

ctcacgagag atcagcaacc cctgcctgta atgtacttca tgaccagtct caggcccatt

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
490

500

510

520

530

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
.......... .......... .......... .......... .......... ..........
790

540

800

810

820

830

840

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078

acggtttgcg tgtatgggga atcatcttga cactgatgca ctttggatcg catttggtta

AB114078

ctttccccct acacccctcg cccaacttgc cttccaccgt acctctggtt cctcggtcag

AC

.......... .a........ .......... .......... .......... ..........

AC

.......... .......... ...t...... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... ...t...... .......... .......... ..........

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... .......... ...t...... .......... .......... ..........

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

.......... .......... ...t...... .......... .......... ..........
550

560

570

580

590

850

600

860

870

880

890

900

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078

tggttcttcc accccccc-g gtaaatggtg ctatttagtg aatgcttgtc ggacatattt

AB114078

gcacatccca tgcataactc ctgaactttc tcacttttca cgaagtcatc tgtggattat

AC

.......... ........-. .......... .......... .......... ..........

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... ........-. .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... ........c. .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

.......... ........c. .......... .......... .......... ..........

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

39

910

920

930

940

950

960

1210

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

1220

....|....| ....|....| ...

AB114078

ttatcaattt tcacttcctc tattttcttc acaaaactag gaaattcacc acaatttttt

AB114078

gcaaacacaa aacccgcctt cta

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

AC

.......... .....A.... ...

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... ...

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... .....A.... ...

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

.......... .......... ...

970

980

990

1000

1010

1020

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078

c-tttgttat tttttaattt tttttttatt tattaaaaac attttttaaa aaactaaatt

AC

.-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

RI

.-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

Hình 3.4. So sánh trình tự đoạn D-loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre với gà
Gallus gallus gallus mã số NC007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số
AB114078

TRE

.-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

* So sánh trình tự của gà Ri, gà Ác, gà Tre nuôi tại Bắc Giang với trình

NC007236

.t........ .......... .......... .T........ .......... ..........

tự tham khảo mã số NC007236, chúng tôi nhận thấy có 21 điểm đa hình/đột

1030

1040

1050

1060

1070

1080

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

biến (tức là khác biệt nucleotide). Mẫu gà Ác có 17 điểm (chiếm 1,39%), mẫu

AB114078

acatacaaac taccgcataa aatccctcaa actatacaaa cgtttatcgt ataatatata

gà Ri có 13 điểm (chiếm 1,06 %) và mẫu gà Tre có 15 điểm khác biệt so với

AC

.......... .g........ .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 (chiếm 1,23 %). Trong 21 điểm khác biệt này, phần lớn là đột biến

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

thay thế. Ngoài ra còn có đột biến mất nucleotid e tại 3 vị trí đó là : tại vị trí số

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
1090

1100

1110

1120

1130

1140

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB114078

tacattattg tttattctat cattattaga gaaactccac taccaaaacc atcattaaaa

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
1150

1160

1170

1180

1190

1200

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

1 bị mất nucleotide A ở gà Ác , tại vị trí 859 mất nucleotid e C ở gà Ác và gà
Ri, tại vị trí 962 mất nucleotid e T ở gà Ri, Ác, Tre. Những đột biến thay thế
làm cho trình tự nucleotide của các mẫu gà nghiên cứu khác với NC007236
như sau: thay thế A bằng C (AC) tại vị trí nucleotide số 1 của mẫu gà Ri và
gà Tre; thay thế T thành C (TC) tại vị trí 167 ở gà Ri, ở vị trí 261, 296, 310

ở gà Ri, Ác, Tre; thay thế G thành A (GA) tại vị trí 212, 1216 của gà Ác và

AB114078

caaaaattta catgccactt aactcccctc acaaacaatc gttatttata ttgttaatta

gà Tre, tại vị trí 281 ở gà Ri , Ác, Tre, tại vị trí 792 của mẫu gà Ác và 1193

AC

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

của mẫu gà Tre; thay thế C thành T (CT) tại vị trí 219 của gà Tre , tại vị trí

TRE

.......... .......... .......... .......... .......... ..A.......

NC007236

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

225 của gà Ri, tại vị trí 246, tại vị trí 315 của gà Ác và Tre, tại vị trí 243, tại vị
trí 306 ở gà Ri, Ác, Tre; thay thế A thành G (AG) tại vị trí 686 của gà Ác,
Ri, Tre, tại vị trí 1032 ở gà Ác.
* So sánh trình tự gà Ri, gà Ác, gà Tre với trình tự tham khảo mã số

AB114078 chúng tôi nhận thấy có 15 điểm đa hình/đột biến. Mẫu gà Ác có 11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

41

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁ NH TRÌNH TƢ̣ VÙ NG ĐIỀU KHIỂN DLOOP DNA TY THỂ CỦ A GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về