182
Chương 9
Các sản phẩm chuyển hóa

Một trong những phát hiện có ý nghĩa quan trọng của vi sinh vật học
công nghiệp là việc nhận thức được rằng vi sinh vật có thể được sử dụng
để thực hiện các phản ứng hoá học đặc biệt vượt ra ngoài khả năng của
hoá học hữụ cơ. Quá trình sử dụng vi sinh vật cho mục đích này có tên là
sự chuyển hoá sinh học, nó bao gồm sự sinh trưởng của vi sinh vật trong
những nỗi lên men lớn theo sau là sự bổ sung hoá chất cần được chuyển
hoá tại một thời điểm thích hợp. Tiếp tục lên men thêm một thời gian nữa
để vỉ sinh vật tác động lên hoá chất rồi tách chiết dịch lên men, và cuối
cùng sản phẩm mong muốn được tinh khiết. Mặc dù về ngnyên lý chuyển
hoá sinh học có thể được sử dụng cho nhiều quá trình khác nhau song
trong thực tế nó chỉ được ứng dụng để sản xuất một số hormone nhất
định.
I. Sự chuyển hóa các steroid
Việc sử dụng vi sinh vật để thực hiện những sự chuyển hoá steroid
có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp dược phẩm. Steroid hormones điều
chỉnh những trạng thái trao đổi chất khác nhau ở động vật kể cả ở người.
Một trong những hormone đó, cortisone, có tác dụng làm giảm cơn đau có
liên quan đến bệnh viêm khớp. Các dẫn xuất cortisone khác làm dịu các
triệu chứng liên quan đến các bệnh dị ứng hoặc viêm.
Nhiều loại steroid hormones điều chỉnh hoạt động giới tính ở người
trong đó một số đã được sản xuất thành dạng thuôc uống để tránh thụ thai.
Các đặc tính sinh lý của một steroid phụ thuộc vào bản chất và vị trí chính
xác của các thành phần hoá học nằm trên cấu trúc vòng của steroid gốc.
Vào đầu những năm 1930, Kendall ở Trường Đại học Tổng hợp
Basel đã tách được cortisone, một steroid do tuyến thượng thận tiết ra.
Khoảng một thập kỷ sau Hench chỉ ra rằng việc uống cortisone có thể làm

dịu cơn đau ở các bênh nhân bị bệnh viêm khớp.
Nhu cầu thực tế của hormone trở nên cấp bách và các phương pháp
hoá tổng hợp steroid được phát triển vì thị trường tiềm tàng là rất lớn. Tuy
nhiên, hoá tổng hợp khá phức tạp yêu cầu tới 37 bước trong đó nhiều bước
xảy ra dưới các điều kiện cực trị. Cortisone tổng hợp được theo con đường
này trị giá 200 đôla một gam.

183
Một trong những điều phức tạp chủ yếu gặp trong hoá tổng hợp
cortisone là việc phải đưa một nguyên tử oxygen vào một vị trí trong cấu
trúc steroid 4 vòng được gọi là vị trí 11; đây là bước quyết định trong việc
tạo nên hoạt tính sinh lý của phân tử.
Vào năm 1952, Peterson và Murray thuộc hãng Upjohn đã phát hiện
ra rằng nấm mốc mọc trên bánh mì Rhizopus arrhizus có khả năng
hydroxyl hoá progesterone, một steroid khác, bằng cách đó đưa một
nguyên tử oxygen vào vị trí 11. Progesterone là một tiền chất trong hoá
tổng hợp cortisone, và bằng phương pháp hydroxyl hoá nhờ vi sinh vật
(trong công nghiệp thường dùng các chủng họ hàng với R. arrhizus) việc
tổng hợp đã được rút ngắn từ 37 xuống 11 bước. Nhờ vậy giá thành giảm
xuống còn 6 đôla một gam.
Sự hydroxyl hoá progesterone mang lại hiệu quả kinh tế do đã rút
ngắn được sự tổng hợp hoá học. Sự lên men có thể thực hiện ở 30
o
C với
nước là dung môi và ở áp suất của khí quyển. Các phản ứng dưới các điều
kiện này rẻ hơn nhiều so với các phản ứng diễn ra dưới các điều kiện cực
trị về nhiệt độ và áp suất và dung môi không phải là nước như trong hoá
tổng hợp cortisone. Đến nay đã có một số quá trình khác ứng dụng vi sinh
vật để tổng hợp công nghiệp các steroid. Nấm Cunninghamella
blakesleana cũng có khả năng hydroxyl hoá steroid cortesolon để tạo

thành hydrocortisone nhờ việc gắn oxygen vào vị trí số 11. Những sự
chuyển hoá nhân steroid khác do vi sinh vật thực hiện bao gồm sự hydro
hoá, sự loại hydro, sự epoxygent hoá, và sự loại hoặc thêm các chuỗi bên
(hình 9.1).
Các steroid ít có ý nghĩa thương mại là các cocticosteroid như
cortisone, hydrocortisone (hình 9.2, hình 9.3), prednison và dexametazon,
kích tố tính đực testosteron và hormone động dục estrađiol (hai loại sau
dùng cho các loại thuốc tránh thụ thai) và spironolacton (thuốc lợi tiểu).
Nguyên liệu dùng cho tất cả các quá trình trên là các loại rượu phức
tạp có tên là các sterol. Có hai nguồn sterol thông thường : Sản xuất dầu
đậu tương để lại một chất thải giàu stigmasterol và sitosterol; rễ của cây
barbasco ở Mêhicô chứa diosgenin. Ngoài ra, có thể sử dụng ergosterin lấy
từ nấm men hoặc các steroid sản xuất thuần tuý bằng con đường tổng hợp.
Nhiều vi sinh vật có khả năng thực hiền các phản ứng chuyển hoá
steroid. Tuy nhiên điều quan trọng là chúng có thể tiến hành phản ứng với
tốc độ chuyển hoá cao, hiệu suất lớn và không tạo thành sản phẩm phụ hay
không. Do yêu cầu này mà số chủng có thể sử dụng cho công nghiệp bị

184
thu hẹp lại rất nhiều. Để hydroxyl hóa người ta sử dụng xạ khuẩn và nấm
(đặc biệt là Fusarium và các loài Curvularia).
Để hydroxyl hoá vị trí 11-a của progesterone, thay cho hệ sợi nấm
người ta dùng bào tử trần của Aspergillus olivaceus. Việc hydro hoá được
tiến hành với các loài Saccharomyces, Streptomyces và Rhizopus. Để loại
hydro người ta dùng các vi khuẩn như Corynebacterium và nấm
(Fusarium, Calonectria, Cylindrocarpon) còn để cắt vòng có thể dùng
Penicillium chrysogenum hay Pseudomonas testosteroni chứa một
steroidizomerase đặc hiệu.
Trong một quá trình chuyển hoá steroid điển hình, vi sinh vật trước
hết được đưa vào một môi trường thích hợp không chứa steroid. Người ta

thường sử dụng các nồi lên men nhỏ (10-50m
3
). Thường vào cuối pha sinh
trưởng logarit thì steroid mới được đưa vào với nồng độ 0,05-0,1%. Vì các
steroid tan yếu trong nước nên người ta dùng các dung môi hữu cơ hoà tan
được trong nước (như methanol, propylenglycol, dimetylsulfoxygent) làm
chất hoà tan trung gian.
Thời gian chuyển hoá kéo dài từ 6 đến 48 giờ, thông thường thì quá
trình được kết thúc sau 20 giờ bằng cách tách tế bào và chiết sản phẩm.
Hiệu suất đạt được là 60-95%. Các sản phẩm của phản ứng nằm bên ngoài
tế bào.
Việc theo dõi phân tích sự chuyển hoá để xác định thời gian lên men
cực thích giữ vai trò rất quan trọng, vì nếu vượt ra ngoài thời gian đó sẽ
xảy ra các phản ứng kế tiếp không mong muốn. Nếu khống chế tốt thì có
thể tiến hành hai phản ứng chuyển hoá mong muốn kế tiếp nhau trong
cùng một nồi lên men. Chẳng hạn 6α-fluo-21-acetoxygen-16α-methyl-4-
pregnen-3,20-đion trước hết được hydroxyl hoá ở vị trí 11α nhờ
Aspergillus ochraceus và sau đó cũng trong môi trường ấy nhờ bổ sung
Bacillus lentus mà lại được loại hydro ở vị trí 1,2.
Vào năm 1980 giá cortisone ở Mỹ đã chỉ còn 46 cent một gam, rẻ
hơn 400 lần so với giá ban đầu. Việc tìm được các ứng dụng khác của các
steroid (dùng cho tránh thụ thai, bệnh thiếu hormone, các bệnh về da,
viêm và dị ứng) cùng với tính hiệu quả cao của phương pháp sản xuất đã
tạo ra một nhu cầu cấp thiết đối với các loại dược phẩm này. Doanh thu 4
loại steroid chính (cortisone, aldosteron, prednison và prednisolon) trên thị
trường thế giới vào năm 1987 là 300 triệu đô la.

185

Hình 9.1: Sản xuất steroid bằng các biện pháp hoá học kết hợp với sự

chuyển hoá vi sinh vật


186

Acid Deoxycolic Cortisone

Hình 9.2: Coctisone được tổng hợp từ deoxycolic acide



Hình 9.3: Sự sản xuất 11 α-hydroxyprogesterone và hydrocortisone


187
II. Sự tạo thành phenyl-axetylcacbinol, tiền chất của epheđrin
Epheđrin là một alcaloit có trong cây Ephedra vulgaris. Giống như
ađrenalin, nó có tác dụng làm tăng huyết áp và được dùng làm thuốc để
điều trị các bệnh suy nhược tuần hoàn, hen, viêm phế quản v.v. .. Cấu tạo
hoá học của nó như sau :




Tách chất này từ thực vật là một công việc tốn kém. Hoá tổng hợp
nó cũng khó thực hiện bởi vì do hai nguyên tử C không đối xứng của phân
tử mà xuất hiện bốn đồng phân lập thể trong đó chỉ có dạng L là có dược
tính.
Nhờ Saccharomyces cerevisiae mà benzaldehyde có thể được
chuyển hoá thành phenyl-axetylcacbinol, tiền chất của epheđrin, với hiệu

suất 50-60% khi được bổ sung vào môi trường chứa một nồng độ tế bào là
0,8- 1% .
Trong sản phẩm chuyển hoá này, nhóm hydroxyl nằm ở cùng vị trí
như trong L-ephedrin. Trong phản ứng này, các tế bào nấm men gắn
"acetalđehyde hoạt động" được tạo thành trong sự đường phân vào
benzalđehyde vừa bổ sung vào môi trường (phản ứng cacboligase):




Benzaldehyde ''Acetaldehyde hoạt động'' L-phenyl-
acetylcacbinol
Sau đó phenyl-acetylcacbinol được chuyển thành L-epheđrin bằng
con đường hoá học nhờ một sự kết hợp hydro amin hoá.
III. Sản phẩm từ vi khuẩn acetic
Trong sự oxygen hoá ethanol thành acid acetic, chuyển hoá thực
chất là một sự sử dụng cơ chất. ở đây, NADPH
2
xuất hiện được chuyển
qua chuỗi hô hấp để thu nhận năng lượng, song cơ chất không bị phân giải

188
hoàn toàn do vậy quá trình cũng còn được gọi là sự oxygen hoá không
hoàn toàn. Loại chuyển hoá này có thể trải qua nhiều bước.
Các đại diện của vi khuẩn acetic (Acetobacter, Gluconobacter)
oxygen hoá không chỉ ethanol mà cả một phổ rộng các rượu bậc một và
rượu bậc hai cũng như các polyol.
Các loài vi khuẩn mà sản phẩm của chúng được giữ lại được gọi là
các loai oxygen hoá thấp (suboxygendant). Thuộc về nhóm này có vi
khuẩn acetic dùng trong công nghiệp là Acetobacter suboxygendans. Các

loài chỉ tích luỹ acid acetic tạm thời sau đó lại oxygen hoá tiếp được xếp
vào nhóm oxygen hoá cao (peroxygendant), chẳng hạn Acetobacter
peroxygendans, Acetobacter pasteurianum). Giữa hai nhóm này có các
dạng chuyển tiếp.
1. Sản xuất dấm ăn
Các phản ứng được dùng để sản xuất dấm ăn nhờ Acetobacter
suboxygendans là :
CH
3
CH
2
OH
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
− asedehydrogenalcohol
→
CH
3
− CHO + 2H
Sau sự hydrat hoá axetaldehyde sẽ diễn ra một sự loại hydro lần thứ hai :



Hydro được NADP nhận và qua các xitocrom được chuyển đến O
2

là chất nhận điện tử cuối cùng. Sự tạo thành acid acetic đồi hỏi cung cấp
oxygen mạnh. Khi thông khí không đầy đủ có thể xảy ra sự hoá hai của
axetaldehyde thành acid acetic và ethanol theo phương trình sau đây (phản
ứng Canizzaro) :


Ethanol lại đi vào phản ứng thứ nhất và cuối cùng cũng được oxygen
hoá thành acid acetic.
Ethanol hoặc acid acetic không thể được dùng làm nguồn cacbon
duy nhất vì người ta không tìm thấy các enzyme cần thiết của chu trình
glyoxylate ở Acetobacter xylinum. Vì vậy để sinh trưởng vi khuẩn cần
được bổ sung các nguồn C khác như glucose.

189
Sự cung cấp oxygen có tính chất quyết định đến kỹ thuật sản xuất
dấm. Trước kia quá trình được tiến hành bằng phương pháp nuôi bề mặt
nhờ một lớp váng của Acetobacter xylinum (phương pháp Orléans), trong
đó vi khuẩn được cố định trên các vỏ bào gỗ giẻ. Vỏ bào đựng trong một
thùng gỗ hình trụ (generator) được thông khí từ phía dưới và tưới các dung
dịch chứa rượu (ví dụ các loại rượu vang kém phẩm chất) từ phía trên
(hình 9.4).
Ngày nay các phương pháp chìm ngày càng có ý nghĩa hơn. Hiện tại
người ta dùng các nồi lên men đặc biệt (acetator) được thông khí rất mạnh
trong đó dịch dinh dưỡng được thay thế từng phần bằng dịch dinh dưỡng
bổ sung cũng đã được thông khí đầy đủ.
Sau khi ethanol đã được chuyển hoá thành acid acetic, phần lớn dịch
dinh dưỡng trong nồi được lấy đi và thay thế vào đó là dịch dinh dưỡng
mới. Nhờ đó có thể đạt được một phương thức giống như nuôi cấy liên
tục.
Quá trình lên men được tiến hành nhờ các chủng chọn lọc của
Acetobacter suboxygendans trong một dịch dinh dưỡng chứa glucose với
10-12% ethanol. Ethanol gần như được chuyển toàn bộ thành acid acetic.
Nồng độ acid acetic cao nhất đã đạt được là 13%. Quá trình diễn ra ở 28-
30
o
C và kéo dài khoảng 48 giờ. Trong phương pháp cổ điển Orléans, sự

lên men kéo dài tới 5 tuần lễ. Trong các phương pháp hiện đại với nồng độ
rượu hoặc acid acetic cao là 12%, thì một sự ngừng thông khí từ 10 đến 20
giây sẽ làm chết tới một phần ba số vi khuẩn. ở những nồng độ cơ chất
thấp hơn, sự phụ thuộc vào oxygen không đến nỗi khắt khe tới như vậy.
Vi sinh vật oxygen hóa ethanol thành acid acetic thường được gọi là
các vi khuẩn acetic, các vi khuẩn này thực hiện trao đổi chất ở pH môi
trường thấp, điều này phân biệt chúng với các vi khuẩn khác.
Các vi khuẩn acid acetic là bọn đa hình, tế bào từ hình elip tới hình
que thẳng hoặc hơi cong 0,5-0,8 × 0,9-4,2 μm, đứng một mình, thành cặp
hoặc thành chuỗi có dạng không chuyển động và dạng chuyển động với
tiên mao ở cực hoặc vòng quanh cơ thể. Chúng là bọn hiếu khí bắt buộc,
một số tạo thành sắc tố, một số tạo thành cellulose. Người đầu tiên tìm
cách phân loại các vi khuẩn acid acetic là Hansen (1894).
Ngày nay các vi khuẩn acid acetic mới phân lập được xếp vào hai
chi chính, Acetobacter, Gluconobacter. Các loài của Acetobacter (trên 60)
chứa 5 đặc điểm: có mặt catalase, oxygen hóa ethanol qua acid acetic tới
CO
2
và H
2
O, oxygen hóa lactate thành cacbonate, oxygen hoá glycerol